EA006433B1 - Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита b и содержащие его вакцинные композиции - Google Patents

Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита b и содержащие его вакцинные композиции Download PDF

Info

Publication number
EA006433B1
EA006433B1 EA200300129A EA200300129A EA006433B1 EA 006433 B1 EA006433 B1 EA 006433B1 EA 200300129 A EA200300129 A EA 200300129A EA 200300129 A EA200300129 A EA 200300129A EA 006433 B1 EA006433 B1 EA 006433B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antigen
hepatitis
thiomersal
virus
vaccine
Prior art date
Application number
EA200300129A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300129A1 (ru
Inventor
Коэн Де Хейдер
Петер Сху
Мишель Серантони
Омер Ван Опстел
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0019728.5A external-priority patent/GB0019728D0/en
Priority claimed from GB0101334A external-priority patent/GB0101334D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200300129A1 publication Critical patent/EA200300129A1/ru
Publication of EA006433B1 publication Critical patent/EA006433B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения поверхностного антигена вируса гепатита В, содержащего менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, предусматривающему получение указанного антигена очисткой в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -SH группу, а также к содержащим этот антиген вакцинным композициям и способу лечения и/или профилактики гепатита В у человека или животного путем введения таких композиций.

Description

Данное изобретение относится к новому способу производства вакцины против гепатита В для применения при лечении или профилактике вирусных инфекций гепатита В (ИВУ). Кроме того, оно относится к НВУ-вакцине, получаемой с помощью этого нового способа по изобретению.
Хроническая вирусная инфекция гепатита В (НВУ), для которой существующее в настоящее время лечение является ограниченным, составляет глобальную проблему здравоохранения огромной важности. Хронические носители НВУ, число которых оценивают как более чем 300 миллионов во всем мире, подвержены риску развития хронического активного гепатита, цирроза и первичной злокачественной гепатомы.
Многим вакцинам, которые доступны в настоящее время, для предотвращения разложения необходим консервант. Часто используемым консервантом является тиомерсал, который представляет собой ртутьсодержащее соединение. По поводу использования ртути в вакцинах возникли некоторые беспокойства, хотя комментаторы подчеркивают, что потенциальные опасности тиомерсалсодержащих вакцин не следует преувеличивать (Θίϊίΐ; Р.А. ΙΑΜΑ Уо1.283; Νο: 16). Тем не менее был бы полезным поиск новых и потенциально безопасных способов получения вакцин для того, чтобы заменить использование тиомерсала в процессе производства. Таким образом, существует необходимость в разработке вакцин, которые являются свободными от тиомерсала, в частности, вакцин против гепатита В.
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения вакцинной композиции против гепатита В, включающей очищенный поверхностный антиген вируса гепатита В, содержащий менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предусматривающий получение указанного антигена очисткой в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -8Н-группу, и смешивание полученного антигена с указанным наполнителем.
Предпочтительно получаемая заявленным способом вакцина не содержит консервант. Предпочтительно получаемая вакцина не содержит тиомерсал.
Предпочтительно антиген вируса гепатита адсорбируют на гидроксиде алюминия.
Предпочтительным воплощением заявленного способа является способ, при котором неочищенный препарат антигена вируса гепатита В (а) подвергают гель-проникающей хроматографии;
(б) подвергают ионообменной хроматографии и (в) смешивают с восстанавливающим агентом, имеющим свободную -8Н-группу.
Предпочтительно восстанавливающий агент представляет собой цистеин, глутатион, дитиотрейтол или β-меркаптоэтанол, причем наиболее предпочтительным является цистеин.
При реализации способа по изобретению цистеин предпочтительно добавляют до конечной концентрации от 1 до 10 мМ, более предпочтительно до конечной концентрации приблизительно 2 мМ.
Предпочтительным воплощением заявленного способа является способ, при котором антиген очищают в присутствии тиомерсала перед обработкой восстанавливающим агентом.
Наиболее предпочтительно очищенный антиген является полностью свободным от тиомерсала.
Согласно изобретению также предложена вакцинная композиция, содержащая очищенный антиген вируса гепатита В, содержащий менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, которая получена способом по изобретению, предпочтительно в сочетании с адъювантом.
Предпочтительно адъювант представляет собой соль алюминия, более предпочтительно гидроксид алюминия.
Целесообразно, чтобы вакцинная композиция по изобретению содержала ТН-1-индуцирующий адъювант, который предпочтительно выбран из группы, содержащей 3-ОМРЬ, Ц821. 3-ОМРЬ и Ц821. и олигонуклеотид СрС.
Целесообразно также, чтобы вышеописанная вакцинная композиция по изобретению дополнительно содержала один или более чем один антиген, выбранный из группы, состоящей из дифтерийного анатоксина (Ό), столбнячного анатоксина (Т), бесклеточных коклюшных антигенов (Ра), инактивированного вируса полиомиелита (1РУ), антигена НаеторЬИиз тПиспхас (Н1Ь), антигена вируса гепатита А, антигенов вируса простого герпеса (Н8У), хламидии, стрептококка группы В (СВ8), вируса папилломы человека (НРУ), 81гер1ососси5 рпеитошае и №Ь8епа.
Согласно изобретению также предложено применение поверхностного антигена вируса гепатита В, содержащего менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, полученного очисткой в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -8Н-группу, для приготовления вакцинной композиции по изобретению, не содержащей консерванта.
Согласно изобретению предложен также способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В, подходящего для применения в вакцинной композиции, содержащего менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, предусматривающий очистку антигена в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -8Н-группу, причем на стадиях очистки антигена перед обработкой восстанавливающим агентом используют тиомерсал.
Предпочтительным воплощением этого способа является способ получения антигена вируса гепатита В, при котором неочищенный препарат антигена вируса гепатита В (а) подвергают гель-проникающей хроматографии;
- 1 006433 (б) подвергают ионообменной хроматографии и (в) смешивают с восстанавливающим агентом, имеющим свободную -8Н-группу.
При этом восстанавливающий агент предпочтительно представляет собой цистеин, глутатион, дитиотрейтол или β-меркаптоэтанол.
Кроме того, согласно изобретению предложены иммуногенный антиген вируса гепатита В, содержащий менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, полученный вышеописанным способом, а также вакцинная композиция против гепатита В, содержащая такой антиген вируса гепатита В.
Согласно изобретению предложен также способ лечения и/или профилактики гепатита В, при котором человеку или животному, инфицированному вирусом гепатита В или восприимчивому к данной инфекции, вводят безопасное и эффективное количество вакцинной композиции по изобретению.
Обычно препарат антигена представляет собой препарат без следов тиомерсала, когда тиомерсал не обнаружим в очищенном антигенном продукте при использовании абсорбционной спектрофотометрии ртути, как описано в настоящем изобретении.
Антиген вируса гепатита В, получаемый способом по настоящему изобретению без использования тиомерсала, является стабильным, соответственно, по существу, таким же стабильным, как и антиген вируса гепатита В, очищенный в присутствии тиомерсала, как, например, изложено в примере 1 настоящего изобретения. Кроме того, он является, по меньшей мере, таким же иммуногенным и антигенным, как и антиген гепатита В, производимый в присутствии тиомерсала.
Соответственно одним из воплощений данного изобретения является иммуногенный антиген гепатита В, имеющий среднее отношение ЕЬ18А (иммуноферментный твердофазный анализ; епхуше-бпкеб 1штипо8ОгЬеи1 а88ау)/белок более чем 1,5 и содержание КР1 со значением ИК50, которое по меньшей мере в 3 раза ниже, чем для поверхностного антигена гепатита В, производимого в присутствии тиомерсала.
При использовании цистеина его добавляют в виде раствора или в порошкообразной форме.
Ионообменная хроматография предпочтительно представляет собой анионообменную хроматографию.
Как указывалось выше, в вакцинной композиции по настоящему изобретению можно комбинировать антигены, дающие защиту от других заболеваний.
Например, в одном конкретном воплощении вакцинная композиция содержит поверхностный антиген вируса гепатита В, получаемый способом по изобретению, вместе с адъювантом и инактивированным вирусом полиомиелита.
Получение поверхностного антигена гепатита В хорошо известно из литературы. См., например, НагГогб е! а1. ш Эеуе1ор. ΒίοΙ. 81апбагб 54, раде 125 (1983), Сгедд е! а1. ш Вю1ескпо1оду, 5, раде 479 (1987), ЕР-А-0226846, ЕР-А-0299108 и приведенные в этих документах ссылки.
Выражение «поверхностный антиген гепатита В» или «НВ8Ад», как оно использовано здесь, включает в себя любой НВ 8 Ад антиген или его фрагмент, проявляющий антигенность поверхностного антигена НВУ. Следует понимать, что в дополнение к 226 аминокислотной последовательности антигена НВ8Ад 8 (см. Тю11а18 е! а1. ИаФге, 317, 489 (1985) и приведенные там ссылки), НВ8Ад, как описано здесь, может, если желательно, содержать пре-8-последовательность полностью или часть ее, как описано в приведенных выше ссылках и в ЕР-А-0278940. НВ8Ад, как описано здесь, может также относиться к вариантам, например к «ускользнувшему» мутанту («е8саре тйай»), описанному в \УО 91/14703.
НВ8Ад может также относиться к полипептидам, описанным в ЕР 0198474 или ЕР 0304578.
Обычно НВ8Ад будет находиться в форме частицы. В особенно предпочтительном воплощении НВ8Ад будет состоять по существу из НВ8Ад 8-антигена, упомянутого выше.
Вакцина может преимущественно включать в себя фармацевтически приемлемый наполнитель, такой как подходящий адъювант. Подходящие адъюванты имеются в продаже, такие как, например, неполный адъювант Фрейнда (Егеипб'8 1исотр1е!е АбщтагИ) и полный адъювант Фрейнда (Егеипб'8 Сотр1е!е АбщтагИ) (ИгГсо ЬаЬога1ог1е8, Иекой, М1); адъювант 65 Мегск (Мегск апб Сотраиу, 1ис., Какгау, N1); А8-2 (8пШ111<1ше Веескат, Ркбабе1рк1а, РА); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилироваиного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно преобразованные полисахариды; полифосфазены; биологически распадающиеся микросферы; монофосфориллипид А и Ош1 А. Цитокины, такие как гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е) или интерлейкин-2, -7 или -12, можно также использовать в качестве адъювантов.
В композициях по данному изобретению предпочтительно, чтобы адъювантная композиция индуцировала иммунный ответ преимущественно ТН1-типа. Высокие уровни цитокинов Тк1-типа (например, ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-2 и ИЛ-12) имеют тенденцию к преимущественной индукции клеточноопосредованных иммунных ответов на введенный антиген. В предпочтительном воплощении, в котором ответ представляет собой ответ преимущественно Тк1-типа, уровень цитокинов Тк1 -типа будет возрастать в большей степени, чем уровень цитокинов Тк2-типа. Уровни этих цитокинов легко оценить, ис
- 2 006433 пользуя стандартные анализы. В качестве обзора семейств цитокинов см. Моктаии аиб СоГГтап. Апп. Ксу. 1ттипо1. 7:145-173. 1989.
Соответственно, подходящие адъюванты для применения при индукции ответа преимущественно ТМ-типа включают в себя, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-дез-Оацилированного монофосфориллипида А (3Ό-ΜΡΕ). вместе с солью алюминия. Другие известные адъюванты, которые преимущественно индуцируют иммунный ответ ТН1-типа, включают в себя СрСсодержащие олигонуклеотиды. Эти олигонуклеотиды характеризуются тем, что динуклеотид СрС является неметилированным. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в XVО 96/02555. Иммуностимуляторные последовательности ДНК также описаны, например, 8а1о е( а1.. 8с1епсе 273:352. 1996. Другим предпочтительным адъювантом является сапонин, предпочтительно 0821 (Ациба ВюрНатшасеибсаН 1пс.. Етатшдйат. МА). который можно использовать отдельно или в комбинации с другими адъювантами. Например, в усиленную систему включена комбинация монофосфориллипида А и производного сапонина, такая как комбинация 0821 и 3Ό-ΜΡΕ. как описано в νθ 94/00153. или менее реактогенная композиция, где 0821 блокирован холестерином, как описано в νθ 96/33739. Другие предпочтительные препараты содержат эмульсию «масло в воде» и токоферол. Особенно сильный адъювантный препарат, в который включены 0821. 3Ό-ΜΡΕ и токоферол в эмульсии «масло в воде», описан в νθ 95/17210.
Особенно эффективный адъювантный препарат, в который включены 0821. 3Ό-ΜΡΕ и токоферол в эмульсии «масло в воде», описан в νθ 95/17210 и является предпочтительным препаратом.
Предпочтительно вакцина дополнительно содержит сапонин, более предпочтительно 0821. Другой конкретный подходящий адъювантный препарат, включающий СрС и сапонин, описан в νθ 00/09159 и является предпочтительным препаратом. Наиболее предпочтительно сапонин в данном конкретном препарате представляет собой 0821. Предпочтительно этот препарат дополнительно содержит эмульсию «масло в воде» и токоферол.
Вакцинный препарат в целом описан в Ρйа^тасеиΐ^са1 Вю1есйпо1о§у. Уо1.61 Уассше Эебдп - (Не 8иЬиш1 апб абщуагИ арргоасН. ебйеб Ьу Бо^е11 апб Ые^тап. Ρ1епит Ριόκκ. 1995. Ыете Тгепбк апб Эете1ортеп18 ш Уассшек. ебйеб Ьу Уо11ег е( а1.. ишуегкйу Багк Ггекк. ВаШтоте. Магу1апб. И8А. 1978. Инкапсуляция в липосомы описана, например, Еи11ебои. патент США 4235877. Конъюгация белков с макромолекулами раскрыта, например, Ыкййе. патент США 4372945. и Агтог е( а1.. патент США 4474757. Применение Оиб А раскрыто ЭаЕдаагб е( а1.. Ас1а Уе1 8сапб. 18:349 (1977). 3Ό-ΜΡΕ доступен от К1Ы 1ттипосНет. И8А. и раскрыт в заявке на патент Великобритании № 2220211 и в патенте США 4912094. 0821 раскрыт в патенте США № 5057540.
Настоящее изобретение проиллюстрировано, но не ограничено следующими примерами, где на фиг. 1 проиллюстрирован процесс получения Епдебх В™, свободный от тиомерсала;
на фиг. 2 проиллюстрирован электрофоретический анализ в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8^8-ΡАСЕ) серий из общей массы антигена; и на фиг. 3 показаны остаточные дрожжевые белки в сериях из общей массы антигена, полученного с помощью процесса, свободного от тиомерсала.
Пример 1. Процесс получения поверхностного антигена гепатита В в присутствии тиомерсала.
Поверхностный антиген гепатита В (НВкАд) моновалентной вакцины гепатита В от 8В Вю1ощса1к (Епдебх В™) экспрессируется в виде рекомбинантного белка в 8ассйатотусек сетеу181ае (см. НагГогб е( а1. 1ос. сй). Белок 24 кД продуцируется внутриклеточно и накапливается в рекомбинантных дрожжевых клетках. В конце ферментации дрожжевые клетки собирали и разрушали в присутствии мягкого сурфактанта, такого как Твин 20. для высвобождения желаемого белка. После этого клеточный гомогенат, содержащий растворимые частицы поверхностного антигена, повторно очищали в серии осаждений, а затем концентрировали ультрафильтрацией.
Дальнейшую очистку рекомбинантного антигена проводили в последовательных хроматографических разделениях. На первой стадии неочищенный концентрат антигена подвергали гель-проникающей хроматографии на среде сефароза 4В. Тиомерсал присутствовал в буфере для элюции на стадии гельпроникающей хроматографии 4В. Буфер для элюции имел следующий состав: 10 мМ Трис, 5% этиленгликоль, рН 7.0. 50 мг/л тиомерсала. Тиомерсал включали в данный буфер для контроля биологических загрязнений. Большую часть этого тиомерсала удаляли во время последующих стадий очистки, включая ионообменную хроматографию, ультрацентрифугирование и обессоливание (гель-проникающая хроматография), так чтобы препараты очищенной массы антигена, полученные с помощью основного процесса, содержали примерно 1.2 мкг и менее чем 2 мкг тиомерсала на 20 мкг белка.
Стадию ионообменной хроматографии проводили, используя ДЭАЭ-матрицу, а затем этот пул подвергали ультрацентрифугированию в градиенте цезия на 4 предварительно установленных слоях различных концентраций хлорида цезия. Частицы антигена отделяли от загрязняющих клеточных составных частей в соответствии с их плотностью в указанном градиенте и элюировали в конце процесса центрифугирования. Затем хлорид цезия удаляли из данного пула с помощью второй гель-проникающей хроматографии на сефарозном геле.
- 3 006433
Когда НВзАд получали с помощью процесса, содержащего тиомерсал в буфере для гельпроникающей хроматографии на 4В, концентрации белка более 30 мг/мл выделяли в виде объединенного НВзАд, содержащего фракции из градиента СзС1, соответствующие эквивалентной концентрации НВзАд, как оценивали с помощью набора ΑυδΖΥΜΕ отАЬЬоЦ ЬаЬогаФпев.
Стадия ультрацентрифугирования в СзС1 успешно элиминирует остаточные липиды, ДНК и минорные белковые загрязнения из препарата НВзАд. Ее проводили путем зонального центрифугирования в роторе Τι 15 от Весктап 1и81гитеи18, ЕиНейои, СаШогша, со скоростью 30000 об./мин в течение примерно от 40 до 60 ч. Образец, подлежащий очистке, наносили на слои раствора СзС1 с конечными концентрациями 0,75, 1,5, 2,5 и 3,25 М СзС1. В конце центрифугирования этот градиент элюировали в виде фракций. Фракции, содержащие НВзАд, можно идентифицировать по поглощению УФ при 280 нм или тестированием разведений этих фракций с использованием набора Αυ8ΖΥΜΕ. Полоса НВзАд присутствует при плотности от 1,17 до 1,23 г/см3.
Раствор, содержащий очищенный НВзАд, стерильно фильтровали перед использованием для получения вакцинного препарата.
Очистка из дрожжевого клеточного лизата является сложной, поскольку антиген продуцируется внутриклеточно, и для получения очищенной массы антигена необходим ряд методик разделения, предназначенных для элиминации различных типов (дрожжевых) загрязняющих веществ. Стадии очистки являются важными, поскольку продукт, подлежащий очистке, представляет собой липопротеиновую частицу, содержащую множественные копии поверхностного антигенного полипептида, и эта структура должна быть сохранена на протяжении всего процесса очистки. Особенность данного процесса состоит в том, что он дает частицы поверхностного антигена, которые являются полностью иммуногенными, без необходимости дальнейшей химической обработки для усиления иммуногенности (по сравнению с ЕР 0135435).
Детали этого процесса получения дополнительно описаны в Европейском патенте 0199698.
Пример 2. Получение и характеристика НВзАд дрожжевого происхождения с помощью процесса, свободного от тиомерсала.
1. Получение и очистка НВзАд дрожжевого происхождения.
1.1. Описание процесса получения.
Поверхностный антиген гепатита В можно получить путем ферментации соответствующего штамма 8ассйаготусез сегеу181ае, например, описанного в НагГогб е! а1. (1ос. сй.).
В конце крупномасштабного процесса ферментации рекомбинантного штамма дрожжей клетки собирали и разрушали в присутствии мягкого сурфактанта, такого как Твин 20. Затем поверхностный антиген выделяли с помощью многостадийной процедуры экстракции и очистки, точно так же как описано выше в примере 1, вплоть до стадии первой гель-проникающей хроматографии на сефарозе 4В.
1.2. Процесс очистки, свободный от тиомерсала.
В процесс, свободный от тиомерсала, внесли следующие два изменения по сравнению с процессом, описанным в примере 1.
1. Буфер для элюции на стадии гель-проникающей хроматографии на 4В больше не содержал тиомерсал.
2. Цистеин (конечная концентрация 2 мМ) добавляли к пулу элюата со стадии анионообменной хроматографии.
Обнаружено, что исключение тиомерсала из буфера для гель-проникающей хроматографии на 4В может привести в результате к осаждению частиц НВзАд во время стадии центрифугирования в градиенте плотности СзС1 с потерей продукта и агрегацией или комкованием выделенного антигена.
Добавление цистеина в конечной концентрации 2 мМ в пул элюата с предшествующей стадии анионообменной хроматографии предотвращает осаждение и потерю антигена во время центрифугирования в градиенте плотности СзС1.
Цистеин является предпочтительным веществом для данной обработки, поскольку он представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту, и его можно удалить на последующей стадии обессоливания на колонке для гель-проникающей хроматографии, используя в качестве матрицы колонки сефарозу 4ВСБЕЕ.
Никаких других изменений в процесс производства по сравнению с процессом, описанным в примере 1, не вносилось.
Процесс, свободный от тиомерсала, дает общую массу антигена со степенью чистоты и свойствами, сравнимыми с антигеном, полученным в процессе примера 1.
1.2а.
Полагают, что тиомерсал, добавленный в буфер 4В в концентрации 50 мкг/мл, разлагается, и полученная в результате этилртуть может ковалентно присоединяться к свободным сульфгидрильным группам на цистеиновых остатках белка. Этот белок содержит 14 цистеиновых остатков, из которых 7 локализованы между положениями 101 и 150.
Считают, что данный участок белка локализован на поверхности частицы и содержит главный антигенный участок НВзАд, включающий иммунодоминантный участок а и сайт распознавания для моно
- 4 006433 клонального антитела КЕ1 (А'щегз 1. е! а1., Роз!дгай. Мей. 1., 1987:63 (8ирр1. 2): 51-56 и А8Й!оп-К1скагй! апй Миггау, 1. Мей. У1го1о§у, 1989: 29: 196). Антиген, очищенный с использованием тиомерсала, присутствующего в буфере для гель-проникающей хроматографии на 4В, содержит примерно 0,5-0,6 мкг ртути в конце процесса очистки. Эта ртуть полностью не удаляется простым диализом.
В одном эксперименте на препарате из общей массы антигена определили 0,56 мкг ртути на 20 мкг белка. Этот препарат подвергали диализу в течение 16 ч при комнатной температуре против 150 мМ ИаС1, 10 мМ ХаРО| буфера с рН 6,9. В конце диализа определили концентрацию 0,33 мкг Нд на 20 мкг белка.
Напротив, диализ в присутствии восстанавливающего агента, такого как Ь-цистеин в концентрации от 0,1 до 5,0 мг/мл, дитиотрейтол (ДТТ) в концентрации 50 мМ или 2-меркаптоэтанол в концентрации 0,5 М, с последующим вторым диализом для удаления восстанавливающего агента приводил в результате к снижению содержания ртути в препарате антигена до концентрации менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка. Эта концентрация является самым низким пределом обнаружения данного способа.
Содержание ртути определяли абсорбционной спектрофотометрией. Антиген разбавляли в растворе, содержащем 0,01% мас./об. бихромата калия (К2Сг2О7) и 5% об./об. азотной кислоты. Стандартные растворы готовили с тиомерсалом в качестве источника ртути. Атомную абсорбцию образца и стандартных растворов измеряли после испарения в парогенераторе с ртуть-специфичным катодом при 253,7 нм. Атомную абсорбцию разбавляющей жидкости измеряли в качестве контроля. Содержание ртути в образце вычисляли посредством калибровочных кривых, полученных на основании стандартных растворов. Результаты выражали в мкг ртути на 20 мкг белка.
1.3. Получение общей массы антигена, свободного от тиомерсала.
Стадии процесса очистки общей массы антигена показаны на фиг. 1.
1.4. Состав вакцинного препарата, изготовленного без тиомерсала.
Типичный количественный состав для вакцины гепатита В без консерванта, изготовленной из антигена, полученного с помощью процесса, свободного от тиомерсала, представлен в табл. 1.
Таблица 1
Составная часть Количество на мл
Активная составная часть - белок, по меньшей мере 95% которого составляет НВвАд 20 мкг
Гидроксид алюминия (адсорбент) (выражен в виде А12О3) 0,95 мг
Хлорид натрия 9,0 мг (максимум)
Дигидрат гидрофосфата натрия 0,98 мг
Дигидрат дигидрофосфата натрия 0,71 мг
Вода для инъекций, сколько требуется до 1,0 мл
Этот состав можно варьировать добавлением 3И-МРЕ и/или других адъювантов.
2. Характеристика антигена из общей массы и вакцины, полученных с помощью процесса, свободного от тиомерсала.
2.1. Тесты и анализы очищенной массы антигена.
2.1.1. Основа для сравнения.
Три серии из общей массы антигена были получены с помощью процесса, свободного от тиомерсала, в соответствии с данным примером (пример 1.2) и идентифицированы как НЕР001, НЕР002 и НЕР003. Эти серии сравнили с серией из общей массы антигена (НЕР2055), полученного с помощью предыдущего процесса (как описано в примере 1) в присутствии тиомерсала.
2.1.2. Тесты и анализы антигена из общей массы.
Три серии из общей массы антигена, полученные с помощью процесса, свободного от тиомерсала, были протестировали и результаты суммированы в табл. 2.
Содержание белка измеряли методом ЬоАгу е! а1. (1. Вю1. СЪет. 1951:193:265).
Содержание эндотоксина измеряли с помощью методики образования геля Е1ши1и§, используя имеющийся в продаже набор от Саре Сой А88ос1а!ез, 704 Мат 8!., Еа1тои!й, МА 02540, ϋ8Α. Этот реагент стандартизован по эталонному стандарту эндотоксина ϋ8 РЪагт. Епйо!ох1п КеЕегепсе 8!апйагй.
Твин 20 измеряли методом Нийй1ез!оп апй А11гей (1. Атег. Ой СЪет18! 8ос., 1965:42:983).
Содержание НВзАд измеряли с помощью имеющегося в продаже набора Аиз/УМЕ от АЬЬо!! ЬаЬогаЮпез, Опе АЬЬоП Рагк Коай, АЬЬоП Рагк, ΙΕ 60064, и8А. Использовали методику В от изготовителя. Серию из общей массы антигена, очищенного с помощью процесса, содержащего тиомерсал, использовали в качестве стандарта для построения кривой доза-ответ.
Полисахариды измеряли методом ИиЬохз е! а1. (Апа1. СЪет. 1956:28:350).
- 5 006433
Липиды измеряли, используя имеющийся в продаже набор (Мегко1е81 То1а1 Εΐρΐάδ 3321) от Е.Мегск, В.Р. 4119, Пагш81ай Ό-6100, Оегшапу.
Содержание ДНК измеряли методом Тйге8Йо1й, используя аппарат и реагенты, доступные от Мо1еси1аг 1)е\1се8 Согр., Ои1епЬегд81га8е 10, Ешашпд, Мишсй, Оегшапу.
Значения, определенные в этих тестах и анализах, находятся в диапазоне, наблюдаемом для серий из общей массы антигена, произведенного с использованием тиомерсала в буфере для элюции на стадии гель-проникающей хроматографии на сефарозе 4В, за исключением антигенной активности согласно ЕБ18А. Значения для данного измерения для трех препаратов НЕЕ выше (1,63-2,25), чем обнаруженные для серии из общей массы антигена НЕР2055, которая имеет соотношение ЕЕ18А/белок 1,13. Соотношения ЕЕ18А/белок, измеренные с помощью набора АИ8/УМЕ для тиомерсалсодержащих серий из общей массы антигена, как правило, равны примерно 1,0 и находятся в пределах диапазона 0,8-1,2 и очень редко превышают 1,4.
2.1.3. Электрофоретический анализ в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Ό8РАОЕ).
Препараты из общей массы антигена анализировали с помощью электрофоретического анализа в полиакриламидном геле с 8Ό8 в восстанавливающих условиях и при окрашивании Кумасси синим. Во всех образцах выявлена основная полоса при 24 К со следами димерного белка. Чистоту образцов оценили как высокую (степень очистки >99%), что определили на основании отсутствия видимых полос загрязняющих белков.
Образцы (1 мкг) препаратов из общей массы антигена анализировали с помощью электрофоретического анализа в полиакриламидном геле с 8Ό8 в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях и при окрашивании серебром (фиг. 2). В восстанавливающих условиях в образцах выявили интенсивную полосу, мигрирующую при 24 К, со следами димерных и мультимерных форм. Картины гелей неотличимы от картины НЕР2055 в качестве сравнения. Пробег образцов также проводили в не восстанавливающих условиях. В этих условиях меньшее количество материала мигрировало при 24 К, и количество полипептида, мигрирующего в димерных и мультимерных положениях, увеличилось. Серии из общей массы антигена, свободного от тиомерсала, по-видимому, обладают несколько более высокой степенью полимеризации, чем сравнительная серия НЕР2055.
Идентичность 24 К полипептида, выявленного окрашиванием Кумасси синим или серебром, подтвердили с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител кролика, индуцированных против НВ8Ад плазмы. В препаратах из общей массы антигена выявлена основная полоса при 24 К вместе с димерными и тримерными формами. Эта методика позволила выявить минорные следы продуктов распада белка поверхностного антигена. Не имелось различий между антигеном из общей массы, полученного с помощью процесса, свободного от тиомерсала, и серией НЕР2055.
Присутствие остаточных дрожжевых белков анализировали с помощью электрофоретического анализа в полиакриламидном геле с 8Ό8 в восстанавливающих условиях и Вестерн-блоттинга с кроличьей поликлональной антисывороткой, индуцированной против дрожжевых белков (фиг. 3). Эта методика является качественной и не позволяет осуществить количественное определение примесей.
Одинаковая картина полос выявлена для всех трех серий из общей массы антигена, полученных с помощью процесса, свободного от тиомерсала, и серии НЕР2055 за одним исключением.
Более тяжелая полоса окрашивания, присутствующая при ±23 К в НЕР2055 из общей массы антигена, практически отсутствует в 3 препаратах НЕЕ. Вестерн-блоттинг показал, что результатом процесса очистки, свободного от тиомерсала, является более чистый антигенный продукт.
Таблица 2 Результаты тестов и анализов очищенной, свободной от тиомерсала общей массы антигена
ТЕСТ РЕЗУЛЬТАТ
НЕЕ001 НЕЕ002 НЕЕ003 НЕР2055
РН 6,8 6,8 6,8 6,8
Содержание белка по Лоури 1312 мкг/мл 888 мкг/мл 913 мкг/мл 995 мкг/мл
Содержание эндотоксина <0,25 ευ <0,25 Еи <0,25 Еи <0,25 Еи
Содержание Твин 20 7,1 мкг 6,6 мкг 7,4 мкг 5,8 мкг
Антигенная активность по ЕИ5А 2957 мкг/мл 1505 мкг/мл 1486 мкг/мл 1128 мкг/мл
Соотношение ЕИ8А/белок 2,25 1,69 1,63 1,13
Содержание полисахаридов 0,33 мкг 0,35 мкг 0,33 мкг 0,34 мкг
Содержание липидов 13,7 мкг 12,8 мкг 12,9 мкг 11,8 мкг
Содержание ДНК по ТЬгезпои < 1 пкг < 1 пкг < 1 пкг < 1 пкг
- 6 006433
2.1.4. Другие биохимические тесты и анализы.
2.1.4.1. Содержание ДНК.
Содержание ДНК в 3 сериях из общей массы антигена измеряли методом ΤΙιιΌιοΙά (Мо1еси1аг ЭеУ1се8 Согр.). Измеренные количества были менее чем 10 пкг ДНК на 20 мкг белка (табл. 2); тот же уровень содержания ДНК наблюдали для антигена из общей массы, произведенного с помощью апробированного в настоящее время процесса.
2.1.4.2. Аминокислотный состав.
Аминокислотный состав трех серий НЕЕ из общей массы антигена определяли после кислотного гидролиза с использованием 6н. НС1 путем хроматографии аминокислот на ионообменной колонке с обнаружением нингидриновым методом после колонки. Пролин и триптофан не определяли. Результаты представлены в табл. 3.
Обнаруженные составы находятся в хорошем соответствии с определенными на НЕР2055 и с ожидаемым составом, выведенным на основании последовательности ДНК. Хотя число глициновых остатков, определенное для НЕР2055, близко к ожидаемому составу, для препаратов из общей массы антигена более обычного определяли значение от 16 до 17 остатков. Среднее число обнаруженных цистеиновых остатков равно ожидаемому числу 14, показывающему, что дополнительные цистеины не связываются с частицей в результате обработки на стадии градиента плотности С§С1.
2.1.4.3. Количественное определение свободного цистеина.
Количество свободного цистеина, присутствующего в препаратах из общей массы антигена, полученных согласно описанному способу, определяли после окисления частиц пероксимуравьиной кислотой без предварительного кислотного гидролиза. Окисленные свободные цистеиновые остатки разделяли на ионообменной колонке с обнаружением нингидриновым методом после колонки. Предел обнаружения цистеина этим способом составляет 1 мкг на мл.
В 3 препаратах антигена НЕЕ невозможно было измерить свободный цистеин при тестировании в исходных концентрациях белка, данных в табл. 2.
По этой методике измеряют как свободные цистеиновые остатки, присутствующие в буфере, так и цистеиновые остатки, которые присоединены к белку НВкЛд посредством дисульфидной связи, но которые не составляют часть полипептидной последовательности.
2.1.4.4. Анализ Ν-концевой последовательности.
Наличие возможных белковых загрязнений и продуктов распада в трех сериях из общей массы антигена, полученных с помощью модифицированного процесса, оценивали с помощью анализа Νконцевой последовательности, основанного на деградации по Эдману. В Ν-концевой последовательности ΜΕΝΙΤ8... белка НВкАд не обнаружили интерференции с другими последовательностями. Также подтвердили, что Ν-концевой метионин на 60-75% блокирован ацетилированием, как ранее наблюдали для полипептида НВкАд, полученного с помощью общепринятого процесса.
Таблица 3 Аминокислотный состав НВкАд
Амино- Кислота НЕЕ001 НЕР002 НЕЕ003 Средний состав НЕР2055 Ожидаемый состав
Асп 11,3 11,3 11,3 11,3 11,5 10
Тре 17,5 17,4 17,2 17,4 17,8 17
Сер 21,4 21,6 21,4 21,5 20,9 23
Глу 11 11 11 11,0 10,5 9
Про НД нд нд нд 24
Гли 17,1 16,8 16,7 16,9 14,6 14
Ала 7,5 7,4 7,4 7,4 7,2 6
Цис 12,3 14,95 14,9 14,1 13,2 14
Вал 10,9 11 10,9 10,9 10,7 11
Мет 6,8 6,7 7,1 6,9 7,1 6
Иле 12,3 12,4 12,5 12,4 12,2 16
Лей 26,3 26,6 26,2 26,4 26,7 33
Тир 6,8 6,8 6,8 6,8 7 6
Фен 13,8 13,9 13,8 13,8 13,9 15
Гис 3 2,8 3,3 3,0 3,3 1
Лиз 4 4 3,9 4,0 4,2 3
Арг 5,7 5,8 5,7 5,7 6,1 5
Трп НД нд нд нд 13
- 7 006433
2.1.4.5. Анализ лазерного светорассеяния.
Сравнение размеров частиц между частицами НВкАд, полученными при использовании модифицированного процесса, и эталонной серией НЕР2055 проводили с помощью лазерного светорассеяния (табл. 4). Определенные средние молекулярные массы показали хорошее соответствие между этими препаратами.
Таблица 4 Молекулярные массы частиц НВкАд на основании лазерного светорассеяния
Серия антигена ММ (Дальтоны)
НЕР001 3,07x10°
НЕЕ002 2,76x106
НЕЕ003 2,76x106
НЕР2055 3,34x106
2.1.4.6. Электронная микроскопия.
Препараты из общей массы антигена исследовали с помощью электронной микроскопии после фиксации и окрашивания уранилацетатом.
Наблюдаемые частицы были аналогичны во всех образцах и имели конформацию частиц ±20 нм полусферической формы или формы булыжника, типичную для НВкАд. Частицы, наблюдаемые в 3 сериях НЕЕ, были неотличимы от НЕР2055.
2.1.5. Иммунологические анализы.
2.1.5.1. Реактивность с моноклональным антителом КЕ1.
Три препарата из общей массы антигена тестировали на их реактивность с моноклональным антителом ВЕ1 с использованием анализа ингибирования ЕЬ18А. Показано, что моноклональное антитело КЕ1 защищает шимпанзе от контрольного заражения НВУ, и, как считают, оно распознает защитный конформационный эпитоп на частице НВкАд (1\\аг5оп 8. с1 а1., 1985, 1. Меб. νίτοί., 16: 89-96).
Гибридому КЕ1 можно культивировать в брюшной полости мышей Ва1ЬС или в культуре ткани.
Асцитическую жидкость, разведенную в концентрации 1/50000 в буфере насыщения (фосфатносолевой буфер (ФСБ), содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,1% Твин 20), смешивали 1:1 с различными разведениями образцов НВ 5Ад, подлежащих тестированию, в ФСБ (конечные концентрации, находящиеся в диапазоне от 100 мкг до 0,05 мкг/мл).
Смеси инкубировали в иммунологических планшетах Кипе (96 лунок) в течение 1 ч при 37°С, после чего их переносили на 1 ч при 37°С на планшеты, покрытые стандартным препаратом НВкАд. Этот стандартный препарат НВкАд представлял собой серию из общей массы антигена (Нер 286), очищенного с помощью процесса, содержащего тиомерсал. После стадии отмывки ФСБ, содержащим 0,1% Твин 20, добавляли конъюгированный с биотином бараний антимышиный 1дО, разведенный 1/1000 в буфере насыщения, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После стадии отмывки в те же лунки добавляли стрептавидин-биотинилированный пероксидазный комплекс, разведенный 1/1000 в буфере насыщения, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Планшеты отмывали и инкубировали с раствором ОРЭЛ 0,04%, Н2О2 0,03% в 0,1 М цитратном буфере с рН 4,5 в течение 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2н. Н28О4 и измеряли оптические плотности (О.Э.) при 490/630 нм и наносили их на график.
ИК50, определенную как концентрация антигена (ингибирующая концентрация), которая ингибирует 50% связывания антитела с покрытым НВкАд, вычисляли, используя уравнение с 4 параметрами, и выражали в нг/мл.
Также тестировали ряд серий антигена НЕР вместе с антигеном дЭ вируса простого герпеса в качестве отрицательного контроля. В этом анализе измеряют способность каждого тестируемого антигена ингибировать связывание КЕ1 со стандартным препаратом антигена (НЕР286), связанным с титрационными микропланшетами.
В табл. 5 даны концентрации каждого антигена, для которого обнаружено ингибирование 50% связывания КЕ1 с фиксированным антигеном.
- 8 006433
Таблица 5
Ингибирование связывания моноклонального антитела КЕ1 с НВзАд
Общая масса антигена ИК50 (нг/мл)*
НЕР286 3834
НЕР673 3437
НЕР720 3150
НЕР2055 2384
НЕЕ001 468
НЕЕ002 574
ΗΕΕ003 540
*ИК50 = концентрация антигена (нг/мл), ингибирующая 50% связывания
КЕ1 с фиксированным антигеном
Результаты показывают, что для ингибирования связывания КЕ1 необходимо в 4-7 раз меньше антигена НЕЕ (табл. 5). Это свидетельствует о том, что антиген, полученный с помощью модифицированного процесса, обладает повышенной презентацией эпитопа КЕ1 по сравнению с НЕР из общей массы антигена.
Такой же тип анализа ингибирования проводили, используя человеческую сыворотку от вакцинированных Епдепх В™ вместо КЕ1 шЛЬ, и не выявили различий между антигенами серий НЕР и антигенами НЕЕ.
2.1.5.2. Аффинность связывания с моноклональным КЕ1.
Кинетические параметры связывания моноклонального антитела КЕ1 с 3 сериями антигена НЕЕ и с НЕР2055 измеряли на основании резонанса поверхностного плазмона, используя аппарат В1асоге 2000 от АтегзКат РКагтасча ВкДесК, АтегзКат Р1асе, 1аИ1е СКаИот, Вискз, ИК. Измеренные кинетические параметры были следующими:
ка: константа скорости ассоциации (М-18-1);
кд: константа скорости диссоциации (8-1);
Ка: константа равновесия или аффинности (М-1), где Ка = ка/кд.
Обнаруженные значения даны в табл. 6.
Таблица 6
Константы аффинности связывания КЕ1 с НВзАд
Общая масса антигена ка (х10*3) кд (х105) Ка (хЮ7)
НЕЕ001 6,81 3,21 21,97
НЕЕ002 6,89 3,73 18,83
НЕЕ003 7,39 4,67 15,80
НЕР2055 3,31 6,30 5,31
Три серии антигена НЕЕ дали аналогичные значения констант ассоциации/диссоциации и аффинности связывания. Напротив, НЕР2055 обладает более слабой аффинностью связывания с КЕ1.
Эти результаты находятся в соответствии с результатами анализа ингибирования ЕБ18А, который показал, что антиген, полученный с помощью процесса, свободного от тиомерсала, обладает повышенной презентацией эпитопа КЕ1.
2.2. Тест и анализы вакцинного препарата с антигеном, полученным с помощью модифицированного процесса.
Три серии антигена НЕЕ адсорбировали на гидроксиде алюминия и включали в препарат в виде вакцины согласно составу, приведенному в табл. 1. Эта вакцина была представлена в виде взрослой дозы во флаконах (20 мкг антигенного белка в 1 мл). Серии идентифицировали как ЭЕЫ8001А4, ЭЕЫ8002А4 и ПЕЫ8003А4.
Эффективность вакцины определяли на основании ΐη νίίτο анализа содержания антигена, используя набор АИ87УМЕ ЕЕ18А от АЬЬоН ЕаЬога^пез и классическую серию вакцины, в препарат которой включено 50 мкг/мл тиомерсала, в качестве стандарта. Эффективность вакцины определяли, используя способ В, как описано в РКагтаЕигора 8рес1а1 Езие Вю97-2 (ЭесетЬег 1997). Три серии НЕЕ дали высокие значения содержания антигена, почти в два раза выше установленного содержания 20 мкг антигенного белка.
- 9 006433
2.2.1. Реактивность вакцины ΌΕΝ8 с моноклональным антителом КЕ1.
Антигенность адсорбированной вакцины дополнительно тестировали в анализе ингибирования с моноклональным антителом КЕ1. В этом анализе измеряют способность образца вакцины ингибировать связывание КЕ1 с фиксированным антигеном из общей массы (НЕР 286).
Асцитическую жидкость, разведенную в концентрации 1/50000 в буфере насыщения (ФСБ, содержащий 1% БСА, 0,1% Твин 20), смешивали 1:1 с различными разведениями образцов вакцины, подлежащих тестированию, в ФСБ (концентрация, находящаяся в диапазоне от 20 мкг до 0,05 мкг/мл).
Смеси инкубировали в иммунологических планшетах Νπηε (96 лунок) в течение 2 ч при 37°С при встряхивании, после чего их переносили на планшеты, покрытые НВ 8 Ад. Препарат НВ 8 Ад, используемый для покрытия, представлял собой серию из общей массы антигена (Нер 286), очищенного с помощью процесса, содержащего тиомерсал. Затем эти планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С при встряхивании. После стадии отмывки ФСБ, содержащим 0,1% Твин 20, добавляли конъюгированный с биотином бараний антимышиный 1дС, разведенный 1/1000 в буфере насыщения, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После стадии отмывки в эти лунки добавляли стрептавидин-биотинилированный пероксидазный комплекс, разведенный 1/1000 в буфере насыщения, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Планшеты отмывали и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с раствором, содержащим ΟΡΌΑ 0,04%, Н2О2 0,03% в 0,1 М цитратном буфере рН 4,5. Реакцию останавливали добавлением 2н. Н28О4 и измеряли оптические плотности (Ο.Ό.) при 490/630 нм и наносили их на график.
ИК50, определенную как концентрация антигена (ингибирующая концентрация), которая ингибирует 50% связывания антитела с покрытым НВ8Ад, вычисляли, используя уравнение с 4 параметрами, и выражали в нг/мл.
Вакцину, изготовленную из общей массы антигена, полученного с помощью модифицированного процесса, сравнивали с вакциной Епдепх В™, в препарат которой включен классический антиген из общей массы НЕР, и без тиомерсала в качестве консерванта.
Анализы проводили в трех повторностях.
Результаты даны в табл. 7, и они показывают, что примерно половина количества вакцины ΌΕΝ8 необходима для достижения 50% ингибирования связывания КЕ1 по сравнению со свободной от консерванта вакциной Епдепх В™. Эти результаты отражают повышенную презентацию эпитопа КЕ1 на антигене НЕЕТ)Е\8, что находится в соответствии с тестами, проведенными с антителом КЕ1 на очищенной массе антигена.
Таблица 7
Ингибирование связывания КЕ1 препаратом вакцины
Серия вакцины ИК-50 (нг/мл)(1)
1 Эксперимент 2 3 Среднее
ΏΕΝ8001Ά4 913 662 603 726
ϋΕ№002Α4 888 715 521 708
ΏΕΝ8003Α4 817 685 582 695
ΕΝ05100Α2 1606 1514 1481 1534
ΕΝ63199Β9 1329 1170 1286 1262
ΕΝΟ3328Α9 1417 1194 1334 1315
(1) концентрация вакцины, ингибирующая 50% связывания антитела КЕ1 с фиксированным антигеном
2.2.2. Иммуногенность вакцины ΌΕΝ8 на мышах.
Исследование проводили на мышах Ва1Ь/С с целью сравнения иммуногенности трех серий консистенции ΌΕΝ8 с Епдепх В™, полученной в соответствии с обычным процессом производства антигена, в препарат которой включен тиомерсал.
Тестировали следующие серии:
# ΌΕΝ8001Α4 # ΌΕΝ8002Α4 # ΌΕΝ8003Α4 # ΕΝΟ2953Α4/Ρ в качестве сравнения
В кратком изложении, группы из 12 мышей иммунизировали внутримышечно дважды с 2недельным интервалом дозами вакцины, соответствующими 1/10 (2 мкг) или 1/50 (0,4 мкг) взрослой дозы для человека.
Мониторинг антительного ответа на НВ8Αд и изотипического профиля, индуцированного вакцинацией, проводили на сыворотках, взятых на сутки 28.
- 10 006433
Схема эксперимента
Группы из 12 мышей Ва1Ъ/С иммунизировали внутримышечно в обе лапы (2x50 мкл) на сутки 0 и 15 следующими дозами вакцины:
Таблица 8
Группы и дозы вакцины
Группа Вакцина Объем Доза антигена
1 ΏΕΝ8001Α4 100 мкл 2 мкг
2 -►Разведение 5х в РО4/№С1 100 мкл 0,4 мкг
3 ΏΕΝ8002Α4 100 мкл 2 мкг
4 -►Разведение 5х в РО4/№С1 100 мкл 0,4 мкг
5 ΏΕΝ8003Α4 100 мкл 2 мкг
6 -►Разведение 5х в РО4/ЫаС1 100 мкл 0,4 мкг
7 ΕΝΟ2953Α4/Ω 100 мкл 2 мкг
8 -►Разведение 5х в РО4/№С! 100 мкл 0,4 мкг
На сутки 15 (2 недели после I) и 28 (2 недели после II) кровь брали из ретроорбитального синуса.
Для схемы данного эксперимента (4 препарата х 2 дозы с 12 мышами на группу) иммуногенность оценивали априори с использованием статистической программы РА88. Статистическую программу РА88 (РоАег апб 8атр1е 8ϊζθ) получили от ЫС88, 329 ΝοτίΙι 1000 Баз!, КаузуШе, И1ай 84037. Для 2факторного дисперсионного анализа 2,5-кратное различие СМТ (среднегеометрические титры) между препаратами с ошибкой альфа 5% должно быть обнаружено при иммуногенности >90%.
Результаты
Серология.
Гуморальные ответы (суммарные 1д и изотипы) измеряли с помощью анализа Ε 1.18 А, используя НВзАд (Нер286) в качестве покрывающего антигена и конъюгированные с биотином антимышиные антитела для выявления связывания анти-111% антитела. Анализировали только сыворотки после II.
В табл. 9 показаны среднее и СМТ (среднегеометрические титры) ответов анти-НВз1§ антител, измеренные на индивидуальных сыворотках через 2 недели после II.
Сравнимые антительные ответы были индуцированы ΌΕΝ8 и классическими препаратами гепатита В: СМТ, находящееся в диапазоне от 2304 до 3976 ЕИ/мл для серий ΌΕΝ8 по сравнению с 2882 ЕИ/мл для моновалентной вакцины гепатита В от 8В Вю1од1еа1з (Минеях В™), при дозе 2 мкг, и СМТ, находящееся в диапазоне от 696 до 1182 ЕИ/мл для серий ΌΕΝ8 по сравнению с 627 ЕИ/мл для моновалентной вакцины гепатита В от 8В Вю1од1еа1з (Εη^ηχ В™), при дозе 0,4 мкг.
Как ожидалось, эффект диапазона дозировки чистого антигена наблюдали для всех препаратов при дозах 2 и 0,4 мкг с 3-6-кратным различием в СМТ.
Наблюдалось четыре мыши, не индуцировавшие ответа (титры <50ЕИ/мл), без четкой связи с дозами или сериями антигена, используемыми для инъекции (группы 1, 2, 3 и 8; одна мышь на группу).
На основании статистического анализа (тест Граббса) эти мыши были исключены из дальнейшего анализа.
Таблица 9
Антительный ответ у мышей на сутки 28 (2 недели после II)
Г руппа Вакцина Доза Число ТИТРЫ ЕИ8А (1д)
Среднее смт
1 □ΕΝ8001Α4 2 мкг 11 3466 2971
2 0,4 мкг 11 1283 1182
3 ΟΕΝ3002Α4 2 мкг 11 2436 2304
4 0,4 мкг 12 984 786
5 ϋΕΝ8003Α4 2 мкг 12 4583 3976
6 0,4 мкг 12 997 696
7 ΕΝ02953Α4/0 2 мкг 12 3999 2882
0,4 мкг 11 737 627
Статистический анализ.
2-Факторный дисперсионный анализ проводили на титрах анти-НВз после преобразования в 1од данных после II, используя вакцины (4 серии) и дозы антигена (2 мкг и 0,4 мкг) в качестве факторов. Данный анализ подтвердил, что наблюдается статистически значимое различие между двумя дозами ан
- 11 006433 тигена (значение р<0,001), и не показал какого-либо значимого различия между сериями вакцины (значение р = 0,2674). Как упомянуто ранее, иммуногенность оценивали априори, и схема эксперимента была такой, что 2,5-кратное различие ОМТ с ошибкой альфа 5% может быть обнаружено между препаратами при иммуногенности >90%.
Изотипический профиль.
В табл. 10 показано перераспределение изотипов (1дО1, 1дО2а и 1§О2Ъ), вычисленное на основании анализа объединенных сывороток после II.
Как ожидалось, этими вакцинами на основе квасцов индуцирован четкий ТН2-ответ, поскольку наблюдались главным образом антитела 1дО1.
В отношении изотипического профиля не наблюдали различия между сериями ΌΕΝ8 или моновалентной вакциной гепатита В от 8В Вю1ощса18.
Таблица 10
Перераспределение изотипов Ι§Ο в объединенной сыворотке на сутки 28
Группа Вакцина Доза Изотип (%)
1д<31 1д62а 1д62Ь
1 ϋΕΝ8001Α4 2 мкг 91 4 5
2 0,4 мкг 87 8 5
3 ΟΕΝ8002Α4 2 мкг 97 2 1
4 0,4 мкг 87 6 7
5 ΟΕΝ8003Α4 2 мкг 98 1 1
6 0,4 мкг 93 4 3
7 ΕΝΟ2953Α4/Ω 2 мкг 88 8 4
0,4 мкг 88 9 3
Пример 3. Препарат комбинированных вакцин.
Общая масса антигена по данному изобретению является особенно подходящей для приготовления препарата в виде комбинированной вакцины, содержащей инактивированный вирус полиомиелита (ΙΡν).
Исследования стабильности, проведенные на исходных сериях комбинированной вакцины ОТРаΗΒν-ΙΡν, показали снижение эффективности 1РУ-компонента, в частности антигена полиомиелита типа 1, при использовании в иммунологическом анализе ίη νότο (определение содержания Ό-антигена с помощью ΕΕΙ8Ά) и в тесте на эффективность ίη νίνο у крыс. Не наблюдалось потери эффективности для типа 3. Для типа 2 потеря эффективности находилась в пределах ожидаемого диапазона (не более чем 10% потерь на год хранения).
Были предприняты исследования для определения причины указанной потери эффективности в комбинированной вакцине ОТРа-ΗΒν-ΙΡν. На основании наблюдения того факта, что стабильность ΙΡν в вакцине ОТРа-ΙΡν от 8В Вю1ощса18 является удовлетворительной (потеря не более чем 10% содержания антигена на год хранения), сделали вывод, что НВУ-компонент, вероятно, ответственен за нестабильность ΙΡν в вакцине ОТРа-1 [ВУ-П’У.
НВУ-компонент, используемый в исходном препарате ^ΤΡа-ΗΒV-IΡV, представляет собой очищенный НВзАд, полученный методом рекомбинантной ДНК из культуры дрожжей, который также использовали для производства моновалентной вакцины гепатита В от 8В Вю1ощса18 и получили, как описано в примере 1.
В качестве первой попытки определить, какой элемент в НВУ-компоненте является неблагоприятным для ΙΡν, общую массу НВзАд анализировали на присутствие тиомерсала. Ранее было обнаружено (^аν^88οη е! а1., 1956, I. БаЪ. Ο1ΐη. Мед. 47:8-19), что тиомерсал, используемый в качестве консерванта в ΌΤΡ-вакцинах, «является неблагоприятным для вируса полиомиелита» в комбинации ΌΤΡ-ΙΡν. Это наблюдение было учтено производителями вакцины, которые заменили тиомерсал другими консервантами для изготовления препаратов 1РУ-содержащих вакцин. Совсем недавно воздействие тиомерсала на эффективность ΙΡν в условиях длительного хранения при +4°С исследовали повторно. Сообщали о потере эффективности антигена вируса полиомиелита типа 1 до необнаружимых уровней после 4-6 месяцев (8а^уег Б.А. е! а1. 1994, Vасс^ηе 12: 851-856).
Используя атомно-адсорбционную спектроскопию, обнаружили примерно 0,5 мкг ртути (Нд) на 20 мкг НВзАд в антигене, очищенном в соответствии с примером 1.
Указанное количество ртути (в виде тиомерсала и хлорида этилртути, продукта разложения тиомерсала) может снизить до необнаружимых уровней ответ ΕΕΙ8Α на содержание Ό-антигена типа 1 в концентрате ΙΡν из общей массы, инкубированном при 37°С в течение 7 суток.
Установлен способ высвобождения ртути, присутствующей в общей массе НВзАд. Предположили, что ртуть может быть связана с тиоловыми группами на частице НВзАд и может, следовательно, высвобождаться в присутствии восстанавливающих агентов. После экспериментирования с другими восстанавливающими агентами был выбран Б-цистеин в качестве агента для высвобождения ртути из частицы
- 12 006433
НВзАд. После диализа общей массы НВзАд против физиологического раствора, содержащего 5,7 мМ Ьцистеина, в удержанном растворе не обнаружили ртути (предел обнаружения этого способа тестирования: 25 нг Нд/20 мкг НВзАд). Диализованный антиген смешивали с концентратом 1РУ из общей массы и оценивали стабильность вируса типа 1 путем измерения содержания Ό-антигена после инкубации при 37°С в течение 7 суток. Концентрат 1РУ из общей массы, не смешанный и смешанный с НВзАд, не обработанным цистеином, использовали в качестве контролей. Сравнительный титр ЕЬ18А получили на образцах, хранившихся при температуре от +2 до +8°С в течение 7 суток.
Результаты суммированы в табл. 11.
Таблица 11
Образец Содержание О-антигена (тип 1)ιυ Потеря
7 суток/4°С 7 суток/37°С
1РУ (не смешанный) 31,6 24,2 23%
ΙΡν+НВвАд без обработки 31,1 18,1 42%
1РУ+НВзАд обработка цистеином 31,4 27,6 12%
1РУ+тиомерсал (1 мкг/мл) 30,5 11,0 74%
выражено в единицах Ο-антигена (ϋΙΙ)
Данные, полученные на этих лабораторных препаратах, четко демонстрируют, что стабильность вируса полиомиелита типа 1 значительно улучшается, если НВзАд обработан цистеином для удаления остаточной ртути перед смешиванием с 1РУ.
Данные, представленные выше, также показывают потерю содержания Ό-антигена на 23% по сравнению с препаратом 1РУ после инкубации в течение 7 суток при 37°С. Эти данные подтверждают нестабильность, свойственную вирусу полиомиелита Майопеу типа 1, как сообщали ранее (8а\\ует Ь.А. е1 а1. (1994), Уассте 12: 851-856).
Хотя коммерческие серии вакцин ЭТРа-НВУ-1РУ и ЭТРа-НВУ-1РУ/Н1Ь получили, используя процесс диализа с 5,7 мМ Ь-цистеином для удаления остаточной ртути и сохранения стабильности 1РУ, этот процесс диализа не подходит для крупномасштабного производства и включает в себя серию дополнительных стадий для получения НВзАд, свободного от тиомерсала или ртути.
Напротив, НВзАд по настоящему изобретению, полученный без тиомерсала, можно непосредственно использовать в препаратах комбинированных вакцин, особенно содержащих 1РУ.
4. Выводы.
Ранее используемый процесс очистки поверхностного антигена дрожжевого происхождения содержит стадию гель-проникающей хроматографии, где содержащее ртуть противомикробное соединение тиомерсал включено в буфер для элюции для контроля биологических загрязнений.
От тиомерсала не полностью очищаются во время последующих стадий процесса, так что примерно 1,2 мкг тиомерсала на 20 мкг белка присутствует в очищенной массе антигена.
С целью получения массы антигена, полностью свободного от тиомерсала (ртути), процесс очистки изменили на двух стадиях.
Тиомерсал исключили из буфера для элюции на стадии гель-проникающей хроматографии на сефарозе 4В.
Цистеин (конечная концентрация 2 мМ) добавляли в пул элюата со стадии анионообменной хроматографии. Это предотвращает осаждение антигена во время центрифугирования в градиенте плотности СзС1.
Других изменений в процесс производства не вносилось.
Охарактеризован антиген из общей массы, полученный с помощью этого модифицированного процесса. Физико-химические тесты и анализы показывают, что антиген, свободный от тиомерсала, не отличим по своим свойствам от антигена, полученного с помощью ранее используемого процесса. Частицы антигена имеют те же составные части.
Этот модифицированный процесс не оказывает воздействия на идентичность и целостность полипептида НВзАд, о чем можно судить на основании электрофоретического анализа в полиакриламидном геле с 8Ό8, Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных анти-НВзАд антител, анализа Νконцевой последовательности и аминокислотного состава. Электронная микроскопия и анализ лазерного светорассеяния показывают, что эти частицы представляют собой частицы типичной формы и размера, ожидаемых для НВзАд дрожжевого происхождения. Анализ с помощью Вестерн-блоттинга с сывороткой против дрожжевых белков показывает, что антиген, полученный с помощью свободного от тиомерсала процесса, имеет аналогичную картину загрязняющих дрожжевых белков. Однако количество загрязняющей полосы, мигрирующей при 23 К, значительно снижено в 3 сериях НВзАд, полученных при использовании данного модифицированного процесса.
Иммунологические анализы показывают, что частицы, свободные от тиомерсала, обладают повышенной антигенностью. Эти частицы являются более реактивными при использовании набора АЬЬоН
- 13 006433
ΆυδΖΎΜΕ (содержащего смесь моноклональных антител), давая соотношения ЕЬ18Л/белок от 1,6 до 2,25. Такая повышенная антигенность также показана с защитным антителом КЕ1. Для ингибирования связывания КЕ1 со стандартным фиксированным антигеном необходимо примерно в 4-7 раз меньше антигена, свободного от тиомерсала. Кривые ингибирования связывания свободного от тиомерсала и классического антигена попадают в два различных семейства. Такое различие также показано с помощью измерений константы аффинности связывания для КЕ1 при использовании резонанса поверхностного плазмона. Аффинности связывания препаратов, свободных от тиомерсала, в 3-4 раза выше по сравнению с серией классического антигена из общей массы.
Препараты антигена из общей массы включали в препарат в виде вакцины путем адсорбции на гидроксиде алюминия и без консерванта.
Тестирование на эффективность ίη νίίτο при использовании набора для ЕБ18А ЛЬЬоН Αυ8ΖΥΜΕ и содержащей тиомерсал моновалентной вакцины гепатита В от 8В Βίοίοβίοαίδ в качестве стандарта показало, что получены высокие значения эффективности ίη νίίτο. Содержание антигена, измеренное с помощью этого теста, было почти в два раза выше установленного значения 20 мкг белка на мл.
Повышенную реактивность вакцины, полученной на основе антигена, свободного от тиомерсала, также наблюдали в анализе ингибирования с моноклональным антителом КР1 на связывание с фиксированным антигеном. Для получения 50% ингибирования связывания КЕ1 с фиксированным антигеном требовалась примерно половина количества вакцины, свободной от тиомерсала, по сравнению с антигеном, очищенным с помощью ранее используемого процесса и включенным в препарат без консерванта.
Такая повышенная антигенность вакцины, свободной от тиомерсала, в отношении КЕ1 находится в соответствии с результатами теста на эффективность ίη νίίτο (содержание антигена) и с тестами с использованием антитела КР1, проведенными на препаратах антигена из общей массы.
Тест на иммуногенность на мышах проводили, используя прайминг и бустерные вакцинации с интервалом 2 недели и дозами 2 и 0,4 мкг антигена. У мышей брали кровь на сутки 28, через 14 суток после бустерной вакцинации. Сыворотки анализировали на титр антител и изотипический состав. Эффект дозы чистого антигена наблюдали для этих двух введенных доз, но не наблюдали статистически достоверного различия в ответе в отношении титров антител (СМТ) между свободной от тиомерсала и свободной от консерванта вакцинами.
В изотипических профилях не наблюдали никаких существенных различий.

Claims (25)

1. Способ получения вакцинной композиции против гепатита В, включающей очищенный поверхностный антиген вируса гепатита В, содержащий менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предусматривающий получение указанного антигена очисткой в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -8Н-группу, и смешивание полученного антигена с указанным наполнителем.
2. Способ по п. 1, при котором вакцина не содержит консервант.
3. Способ по п. 1, при котором вакцина не содержит тиомерсал.
4. Способ по любому из пп.1-3, при котором антиген вируса гепатита адсорбируют на гидроксиде алюминия.
5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором неочищенный препарат антигена вируса гепатита В (а) подвергают гель-проникающей хроматографии;
(б) подвергают ионообменной хроматографии и (в) смешивают с восстанавливающим агентом, имеющим свободную -8Н-группу.
6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором восстанавливающий агент представляет собой цистеин, глутатион, дитиотрейтол или β-меркаптоэтанол.
7. Способ по п.6, при котором восстанавливающий агент представляет собой цистеин.
8. Способ по п.7, при котором цистеин добавляют до конечной концентрации от 1 до 10 мМ.
9. Способ по п.8, при котором цистеин добавляют до конечной концентрации приблизительно 2 мМ.
10. Способ по любому из пп.1-9, при котором антиген очищают в присутствии тиомерсала перед обработкой восстанавливающим агентом.
11. Способ по любому из пп.1-9, при котором очищенный антиген является полностью свободным от тиомерсала.
12. Вакцинная композиция, содержащая очищенный антиген вируса гепатита В, содержащий менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, которая получена способом по любому из пп. 1-11.
13. Вакцинная композиция по п.12 в сочетании с адъювантом.
14. Вакцинная композиция по п.13, где адъювант представляет собой соль алюминия.
15. Вакцинная композиция по п.14, где соль алюминия представляет собой гидроксид алюминия.
16. Вакцинная композиция по пп. 12-15, которая содержит ТН-1-индуцирующий адъювант.
- 14 006433
17. Вакцинная композиция по п. 16, где ТН-1-индуцирующий адъювант выбран из группы, содержащей З-ОМРЬ, 0821, 3-ЭМРЬ и 0821 и олигонуклеотид СрС.
18. Вакцинная композиция по любому из пп. 12-17, которая дополнительно содержит один или более чем один антиген, выбранный из группы, состоящей из дифтерийного анатоксина (Ό), столбнячного анатоксина (Т), бесклеточных коклюшных антигенов (Ра), инактивированного вируса полиомиелита (1РУ), антигена Наешорййик шПиспхас (Н1Ь), антигена вируса гепатита А, антигенов вируса простого герпеса (Н8У), хламидии, стрептококка группы В (СВ8), вируса папилломы человека (НРУ), 81гер1оеоееи8 рпеитошае и Ыещкепа.
19. Применение поверхностного антигена вируса гепатита В, содержащего менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, полученного очисткой в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -8Н-группу, для приготовления вакцинной композиции по п.2.
20. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В, подходящего для применения в вакцинной композиции, содержащего менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, предусматривающий очистку антигена в присутствии восстанавливающего агента, имеющего свободную -8Н-группу, причем на стадиях очистки антигена перед обработкой восстанавливающим агентом используют тиомерсал.
21. Способ получения антигена вируса гепатита В по п. 20, при котором неочищенный препарат антигена вируса гепатита В (а) подвергают гель-проникающей хроматографии;
(б) подвергают ионообменной хроматографии и (в) смешивают с восстанавливающим агентом, имеющим свободную -8Н-группу.
22. Способ получения антигена вируса гепатита В по пп. 20-21, при котором восстанавливающий агент представляет собой цистеин, глутатион, дитиотрейтол или β-меркаптоэтанол.
23. Иммуногенный антиген вируса гепатита В, содержащий менее чем 0,025 мкг ртути на 20 мкг белка, полученный способом по п.20.
24. Вакцинная композиция против гепатита В, содержащая антиген вируса гепатита В по п.23.
25. Способ лечения и/или профилактики гепатита В, при котором человеку или животному, инфицированному вирусом гепатита В или восприимчивому к данной инфекции, вводят безопасное и эффективное количество вакцинной композиции по любому из пп. 12-18 и 24.
Схема последовательности операции процесса получения Епдепх В™, свободного от тиомерсала
Культура дрожжей
Фиг. 1 фильтрация | Очищенная масса антигена ]
Центрифугирование
ΞΖΖ
Ультрафильтрация ]
Центрифугирование | Конечная масса вакцины |
Измельчение в шаровой мельнице
Центрифугирование
Супернатант | д
Осаждение СаС12
Супернатант
Ультрафильтрат
Гель-проникающая хроматография
Анионообменная хроматография
Ультрацентрифугирование
Обессоливание путем гель-проникающей хроматографии
EA200300129A 2000-08-10 2001-08-07 Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита b и содержащие его вакцинные композиции EA006433B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) 2000-08-10 2000-08-10 Novel treatment
GB0101334A GB0101334D0 (en) 2001-01-18 2001-01-18 Novel compounds
PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) 2000-08-10 2001-08-07 Purification of hbv antigens for use in vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300129A1 EA200300129A1 (ru) 2003-10-30
EA006433B1 true EA006433B1 (ru) 2005-12-29

Family

ID=26244821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300129A EA006433B1 (ru) 2000-08-10 2001-08-07 Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита b и содержащие его вакцинные композиции

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20030235590A1 (ru)
EP (2) EP1666487B1 (ru)
JP (2) JP2004505992A (ru)
KR (1) KR100804922B1 (ru)
CN (1) CN1468256B (ru)
AP (1) AP2003002734A0 (ru)
AR (1) AR030325A1 (ru)
AT (2) ATE313558T1 (ru)
AU (2) AU2001282073B2 (ru)
BG (1) BG66038B1 (ru)
BR (1) BRPI0113155C1 (ru)
CA (2) CA2740282A1 (ru)
CY (2) CY1106310T1 (ru)
CZ (1) CZ303217B6 (ru)
DE (2) DE60116107T2 (ru)
DK (2) DK1307473T3 (ru)
DZ (1) DZ3470A1 (ru)
EA (1) EA006433B1 (ru)
EG (1) EG25829A (ru)
ES (2) ES2254464T3 (ru)
HK (1) HK1056884A1 (ru)
HU (1) HU228932B1 (ru)
IL (2) IL154301A0 (ru)
MX (1) MXPA03001235A (ru)
MY (1) MY128999A (ru)
NO (1) NO20030635L (ru)
NZ (1) NZ524012A (ru)
OA (1) OA12361A (ru)
PE (1) PE20020287A1 (ru)
PL (1) PL204736B1 (ru)
PT (1) PT1666487E (ru)
SI (2) SI1307473T1 (ru)
SK (2) SK288069B6 (ru)
UA (1) UA79735C2 (ru)
UY (1) UY26882A1 (ru)
WO (1) WO2002012287A1 (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA79735C2 (ru) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищение антигенов вируса гепатита b (hbv) для использования в вакцинах
GB0202901D0 (en) * 2002-02-07 2002-03-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
CA2614884A1 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Globeimmune, Inc Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies
EA014314B1 (ru) * 2005-08-02 2010-10-29 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл Пониженная интерференция между маслосодержащими адъювантами и антигенами, содержащими поверхностно-активные вещества
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0612142D0 (en) 2006-06-20 2006-08-02 Secr Defence Spreading modulation spectrum control
AU2007293673B2 (en) 2006-09-07 2013-06-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
EP2142211A1 (en) 2007-05-02 2010-01-13 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine
WO2009057699A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kyocera Corporation 弾性波装置
US8250102B2 (en) * 2008-03-14 2012-08-21 Microsoft Corporation Remote storage and management of binary object data
KR100959145B1 (ko) 2008-03-21 2010-05-25 중앙대학교 산학협력단 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법
US9415006B2 (en) * 2008-05-23 2016-08-16 The Regents Of The University Of Michigan Immunogenic compositions comprising nanoemulsion and hepatitis B virus immunogen and methods of using the same
JP2012528106A (ja) * 2009-05-27 2012-11-12 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｃａｓｂ７４３９構築物
ES2594895T3 (es) * 2011-01-14 2016-12-23 Hal Allergy Holding B.V. Inmunoensayo para la determinación directa de contenido de antígeno en productos que comprenden partículas de antígeno acoplado a un adyuvante
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CN111032078A (zh) 2017-07-18 2020-04-17 血清研究所印度私人有限公司 具有改善的稳定性、增强的免疫原性和降低的反应原性的免疫原性组合物及其制备方法
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
CN113573730A (zh) 2019-03-05 2021-10-29 葛兰素史密斯克莱生物公司 乙型肝炎免疫方案和组合物
CA3161638A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 Jun Ge Pharmaceutical composition and use thereof

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1030777A (en) * 1963-12-06 1966-05-25 Ciba Ltd Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4720385A (en) * 1983-03-29 1988-01-19 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
JPS6013718A (ja) 1983-07-05 1985-01-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｂ型肝炎ワクチン
KR850001534A (ko) 1983-08-22 1985-03-30 제임스 에프. 나우톤 형질전환된 효모로 부터 유도된 면역원성 HBsAg
US4683294A (en) 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
US4895800A (en) 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
EP0278940A3 (en) 1987-01-30 1988-12-07 Smithkline Biologicals S.A. Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
EP0299108B1 (en) 1987-07-17 1994-05-18 Rhein Biotech Gesellschaft für biotechnologische Prozesse und Produkte mbH DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses
EP0314240A3 (en) * 1987-10-26 1990-03-28 Merck & Co. Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
JPH085804B2 (ja) 1988-04-28 1996-01-24 財団法人化学及血清療法研究所 Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5274081A (en) * 1989-09-20 1993-12-28 Immuno A.G. Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen
GB9007024D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
WO1992011291A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
JP3026029B2 (ja) 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法
AU657168B2 (en) 1991-09-18 1995-03-02 Amgen, Inc. Hepatitis B vaccine with bile salt adjuvant
US6620414B2 (en) * 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
BR9509903A (pt) * 1994-10-24 1997-11-25 Ophidian Pharm Inc Proteína de fusão proteína de fus o solúvel composição de matéria célula hospedeira processo para gerar uma antiotoxina neutralizante dirigida contra toxina tipo a de clostridium botulinum anticorpo processo para purificar uma proteina de fusão recombinante derivada de uma toxina tipo a de clostridium botulinum processo para gerar uma antitoxina neutralizante dirigida contra toxina tipo b de clostridium difficile anticorpo processo de tratemento processo para gerar uma antitoxina neutralizante dirigida contra toxina tipo a de clostridium difficile composição processo para vacinar um individuo para produzir antitoxina neutralizante dirigida contra toxina de clostridium difficile processo a detecção de antigenos de clostridium difficile em uma amosta processo de purificação de toxinas de clostridium difficile de uma cultura e processo de generação de uma forma dosagem sólida de uma antitoxina de ave dirigida contra uma proteina de toxina clostridial
KR960023066A (ko) * 1994-12-10 1996-07-18 성재갑 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
DE69933200T2 (de) * 1998-03-09 2007-02-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Kombinierte impfstoffzusammensetzungen
DE69929444T2 (de) 1998-08-10 2006-09-28 Antigenics Inc., Woburn Cpg-zusammensetzungen, saponin-adjuvantien und verfahren zu deren verwendung
EP1140155A4 (en) * 1998-12-23 2004-11-03 Merck & Co Inc IMPROVED RECOMBINATION HEPATITIS B ENVELOPE ANTIGEN
UA79735C2 (ru) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищение антигенов вируса гепатита b (hbv) для использования в вакцинах

Also Published As

Publication number Publication date
DE60116107D1 (de) 2006-01-26
CY1108789T1 (el) 2014-04-09
BRPI0113155B1 (pt) 2018-11-21
CA2740282A1 (en) 2002-02-11
WO2002012287A1 (en) 2002-02-14
NZ524012A (en) 2004-02-27
DZ3470A1 (fr) 2002-02-14
PT1666487E (pt) 2008-12-26
CA2427475A1 (en) 2002-02-11
KR20030029127A (ko) 2003-04-11
BRPI0113155C1 (pt) 2021-05-25
SK1692003A3 (en) 2003-08-05
ATE412665T1 (de) 2008-11-15
UA79735C2 (ru) 2007-07-25
PE20020287A1 (es) 2002-06-20
EG25829A (en) 2012-09-02
AP2003002734A0 (en) 2003-03-31
EP1666487B1 (en) 2008-10-29
CA2427475C (en) 2011-07-05
CY1106310T1 (el) 2011-10-12
HK1056884A1 (en) 2004-03-05
DE60116107T2 (de) 2006-08-03
HU228932B1 (en) 2013-06-28
NO20030635D0 (no) 2003-02-07
AU8207301A (en) 2002-02-18
DE60136400D1 (de) 2008-12-11
DK1666487T3 (da) 2009-01-12
DK1307473T3 (da) 2006-05-01
AU2001282073B2 (en) 2005-01-20
UY26882A1 (es) 2002-03-22
NO20030635L (no) 2003-04-01
US8624004B2 (en) 2014-01-07
JP5559847B2 (ja) 2014-07-23
MY128999A (en) 2007-03-30
EP1307473B1 (en) 2005-12-21
ATE313558T1 (de) 2006-01-15
HUP0302951A2 (hu) 2003-12-29
KR100804922B1 (ko) 2008-02-20
JP2004505992A (ja) 2004-02-26
AR030325A1 (es) 2003-08-20
SI1666487T1 (sl) 2009-02-28
HUP0302951A3 (en) 2004-10-28
PL204736B1 (pl) 2010-02-26
OA12361A (en) 2004-04-13
US20060159705A1 (en) 2006-07-20
EP1666487A1 (en) 2006-06-07
SK288079B6 (sk) 2013-06-03
EP1307473A1 (en) 2003-05-07
US20090123496A1 (en) 2009-05-14
EA200300129A1 (ru) 2003-10-30
BR0113155A (pt) 2003-07-08
SK288069B6 (sk) 2013-05-03
CN1468256B (zh) 2010-10-27
IL154301A (en) 2009-11-18
CN1468256A (zh) 2004-01-14
MXPA03001235A (es) 2004-07-16
CZ2003385A3 (cs) 2003-06-18
BRPI0113155B8 (pt) 2019-08-13
CZ303217B6 (cs) 2012-05-30
ES2254464T3 (es) 2006-06-16
US20030235590A1 (en) 2003-12-25
SI1307473T1 (sl) 2006-04-30
BG107545A (bg) 2004-01-30
PL362322A1 (en) 2004-10-18
IL154301A0 (en) 2003-09-17
JP2012255015A (ja) 2012-12-27
ES2314555T3 (es) 2009-03-16
BG66038B1 (bg) 2010-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5559847B2 (ja) ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製
AU2001282073A1 (en) Purification of HBV antigens for use in vaccines
US8591908B2 (en) Immunogen for preparation of therapeutic vaccines or drugs for treatment of hepatitis B and the producing method and use thereof
US20090104223A1 (en) Method for Obtaining Antigenic Aggregates and the Use Thereof in Formulations
Gerlich et al. Functions of hepatitis B surface proteins
NO20130773L (no) Metode for fremstilling av en vaksine
TWI311563B (en) Method for production a stable,immunogenic hepatitis b vaccine without trace of thiomersal
Lobaina et al. Comparison of the immune response induced in mice by five commercial vaccines based on recombinant HBsAg from different sources, implications on their therapeutic use

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MK4A Patent expired

Designated state(s): BY KZ RU