DE60111613T2

DE60111613T2 - Verfahren zum herstellen von glyphosat-toleranten pflanzen

Info

Publication number: DE60111613T2
Application number: DE60111613T
Authority: DE
Inventors: R. Scott BAERSON; J. Gregory HECK; J. Damian RODRIGUEZ
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2000-03-09
Filing date: 2001-03-06
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: AU4200501A; EP1261695A2; CA2401093A1; US6803501B2; AU2001242005B2; US20030188346A1; AR028243A1; WO2001066704A2; DE60111613D1; ATE298364T1; EP1261695B1; WO2001066704A3; BR0109118A; ZA200206788B; AR068711A2; US20040148650A1; US20030192072A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Pflanzenmolekularbiologie und Pflanzengentechnik im Hinblick auf Herbizidresistenz und insbesondere auf eine neue glyphosatresistente 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase aus Eleusine indica. Pflanzengentechnikmethoden können verwendet werden, um das aus Eleusine indica isolierte und gereinigt Gen für die glyphosatresistente 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase auf Kultur- und Zierpflanzen von ökonomischer Bedeutung zu übertragen.
Hintergrund der Erfindung
N-Phosphonomethylglycin, das auch als Glyphosat bekannt ist, ist ein wohlbekanntes Herbizid, das seine Wirkung auf ein breites Spektrum von Pflanzenspezies ausübt. Glyphosat ist der Wirkstoff von Roundup^® (Monsanto Co.), einem unbedenklichen Herbizid, das eine wünschenswert kurze Halbwertszeit in der Umwelt hat. Wenn man es auf eine Pflanzenoberfläche aufbringt, bewegt sich Glyphosat systemisch durch die Pflanze. Glyphosat ist toxisch gegenüber Pflanzen, indem es den Shikimisäure-Stoffwechselweg hemmt, der eine Vorstufe für die Synthese von aromatischen Aminosäuren liefert. Insbesondere beeinflusst Glyphosat die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat und 3-Phosphoshikimisäure zu 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimisäure, indem es das Enzym 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimat-Synthase (Im Folgenden als EPSP-Synthase oder EPSPS bezeichnet) hemmt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Glyphosat" jede herbizid wirksame Form von N-Phosphonomethylglycin (einschließlich jedes Salzes davon) und anderer Formen, die in Pflanzen zur Produktion des Glyphosat-Anions führen, umfassen.
Durch Pflanzengentechnikmethoden ist es möglich, glyphosattolerante Pflanzen zu erzeugen, indem man in das Pflanzengenom ein DNA-Molekül einsetzt, das die Produktion von größeren Mengen an Wildtyp-EPSPS bewirkt (Shah et al., Science 233: 478–481 (1986)). Glyphosattoleranz kann auch durch die Expression von EPSPS-Varianten erreicht werden, die eine geringere Affinität zu Glyphosat haben und daher ihre katalytische Wirkung in Gegenwart von Glyphosat beibehalten (US-Patent Nr. 4,940,835, US-Patent Nr. 5,094,945, US-Patent Nr. 5,633,435). Enzyme, die in Pflanzengeweben Glyphosat abbauen (US-Patent Nr. 5,463,175), sind auch in der Lage, zelluläre Toleranz gegenüber Glyphosat zu verleihen. Solche Gene ermöglichen daher die Produktion von transgenen Kulturpflanzen, die gegenüber Glyphosat tolerant sind, so dass man Glyphosat für eine effektive Unkrautbekämpfung mit minimalen Bedenken wegen einer Schädigung der Kulturpflanze verwenden kann. Zum Beispiel wurde bei Mais (US-Patent Nr. 5,554,798), Weizen (Zhou et al., Plant Cell Rep. 15: 159–163 (1995)), Sojabohnen (WO 92/00377) und Canola (WO 92/04449) gentechnisch eine Glyphosattoleranz erzeugt.
Varianten des Wildtyp-EPSPS-Enzyms sind als Folge von Veränderungen in der EPSPS-aminosäurecodierenden Sequenz glyphosatresistent (Kishore et al., Annu. Rev. Biochem. 57: 627–663 (1988); Schulz et al., Arch. Microbiol. 137: 121–123 (1984); Sost et al., FEBS Lett. 173: 238–241 (1984); Kishore et al., in "Biotechnology for Crop Protection", ACS Symposium Series No. 379, Hrsg. Hedlin et al., 37–48 (1988)). Diese Varianten haben typischerweise ein höheres K_i für Glyphosat als das Wildtyp-EPSPS-Enzym, das zum glyphosattoleranten Phänotyp führt, aber diese Varianten sind auch durch ein hohes K_m für PEP charakterisiert, aufgrund dessen das Enzym kinetisch weniger effizient ist. Zum Beispiel betragen das scheinbare K_m für PEP und das scheinbare K_i für Glyphosat bei dem nativen EPSPS aus E. coli 10 μM bzw. 0,5 μM, während diese Werte bei einem glyphosatresistenten Isolat, das eine einzige Aminosäuresubstitution von Alanin für Glycin auf Position 96 aufweist, 220 μM bzw. 4,0 mM betragen. Mehrere variance EPSPS-Gene von glyphosatresistenten Pflanzen wurden durch Mutagenese aufgebaut.
Eine Vielzahl von nativen und varianten EPSPS-Enzymen wurden in transgenen Pflanzen exprimiert, um ihnen Glyphosattoleranz zu verleihen (Singh et al., in "Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants", Amer. Soc. Plant Phys. Pubs (1992)). Beispiele für einige dieser EPSPS-Enzyme und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die gegenüber Glyphosat resistent sind, sind diejenigen, die in US-Patent Nr. 4,940,835, US-Patent Nr. 4,971,908, US-Patent Nr. 5,145,783, US-Patent Nr. 5,188,642, US-Patent Nr. 5,310,667, US-Patent Nr. 5,312,910 und US-Patent Nr. 6,40,497 beschrieben sind oder im Einklang damit isoliert wurden. Sie können auch von einer strukturell unterschiedlichen Klasse von nichthomologen EPSPS-Genen abgeleitet sein, wie den natürlich vorkommenden Klasse-II-EPSPS-Genen, die aus dem Agrobacterium-sp.-Stamm CP4 isoliert wurden, wie in US-Patent Nr. 5,633,435 und US-Patent Nr. 5,627,061 beschrieben ist.
Eleusine indica (Indische Eleusine) wird häufig als "goose grass" bezeichnet und ist zuweilen auch als "yard grass" bekannt. Es ist eine häufige Einkeimblättrige Pflanze, die man weltweit findet. Als Mitglied der Familie der Poaceae, der Familie der Gräser, ist es mit vielen wohlbekannten Kulturpflanzen verwandt. Eleusine indica ist am engsten mit den Hirsen verwandt; dazu gehören Sorghum bicolor (Sorghum oder Mohrenhirse), Zea mays (Mais), Pennisetum americanum (Perlhirse), Eleusine coracana (Fingerhirse), Setaria italica (Borsten- oder Kolbenhirse), Paspalum scrobiculatum (Kodohirse), Echinochloa frumentacea (Japanhirse) und Eragrostis tef (Teff) (Chennaveeraiah et al., in "Chromosome engineering in plants: genetics, breeding and evolution", Cytogenetics of Minor Millets, in Tsuchiya et al. (Hrsg.), Elsevier Sci Pub Amsterdam, 613–627 (1991)). Es wurde gezeigt, dass Eleusine indica mit Eleusine coracana (Fingerhirse), einer wichtigen Kulturhirse in Indien und Ostafrika, hybridisiert (Chennaveeraiah et al., Euphytica 2–3: 489–495 (1974)). Klassische Pflanzenzuchtverfahren können verwendet werden, um die interessierenden Gene und Eigenschaften von Eleusine indica auf agronomische Kulturpflanzen innerhalb der Familie der Poaceae zu übertragen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
In ihrem breitesten Umfang stellt die vorliegende Erfindung hier ein Verfahren bereit, um Pflanzen durch die Expression eines isolierten DNA-Moleküls, das ein natürlich vorkommendes glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, Toleranz gegenüber dem Herbizid Glyphosat zu verleihen, wobei das EPSPS-Enzym SEQ ID Nr. 7 umfasst. Das Enzym und die DNA werden aus Eleusine-Spezies, insbesondere Eleusine indica (E. indica) isoliert.
Im ersten Aspekt der vorliegenden, hier beschriebenen Erfindung wird Folgendes bereitgestellt:
Verfahren zur Herstellung von Glyphosat-toleranten Pflanzen, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Einsetzen eines rekombinanten DNA-Moleküls in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei das DNA-Molekül Folgendes umfasst: einen Promotor, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Produktion einer RNA-Sequenz zu bewirken, und der operabel mit einer Struktur-DNA-Sequenz verknüpft ist, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein EPSPS-Enzym codiert, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 aufweist, und die operabel mit einem 3'-untranslatierten Bereich verknüpft ist, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken, wobei der Promotor heterolog in Bezug auf die Struktur-DNA-Sequenz ist und geeignet ist, eine ausreichende Expression des Polypeptids zu bewirken, so dass die Glyphosat-Toleranz einer mit dem DNA-Molekül transformierten Pflanzenzelle verstärkt wird;
b) Auswählen einer Pflanzenzelle, die im obigen Schritt (a) transformiert wurde; und
c) Regenerieren einer genetisch transformierten Pflanze, die eine erhöhte Toleranz gegenüber dem Herbizid Glyphosat aufweist, aus der transformierten Pflanze.

Typischerweise wird der im DNA-Molekül verwendete Promotor konstitutiv exprimiert. Beispiele für geeignete Promotoren, die diese Funktion effektiv ausüben, sind der Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-19S-Promotor, der Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor, der Figwort-Mosaic-Virus-34S-Promotor, der Zuckerrohr-Bacilliform-Virus-Promotor, der Commelina-Yellow-Mottle-Virus-Promotor, der Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase, der Reis-Cytosol-Triosephosphat-Isomerase-Promotor, der Adenin-Phosphoribosyltransferase-Promotor, der Reis-Actin-1-Promotor, der Mais-Ubichitin-Promotor, der Mannopin-Synthase-Promotor und der Octopin-Synthase-Promotor. Ein Promotor kann auch für die Erfindung geeignete Leadersequenzen und Intronsequenzen umfassen.
Ein DNA-Molekül, das eine Chloroplasten-Transitpeptid-Sequenz codiert, kann aus EPSPS-Genen, die aus verschiedenen Pflanzenspezies einschließlich E. indica gereinigt wurden, sowie aus verschiedenen Pflanzengenen, von denen gezeigt wurde, dass ihre Proteinprodukte in den Chloroplasten transportiert werden, isoliert werden.
Ein DNA-Molekül, das ein natürlich vorkommendes glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, welches von einer glyphosattoleranten Pflanzenspezies abgeleitet ist und insbesondere aus Eleusine-Spezies, insbesondere aus E. indica, isoliert wurde und ein K_m für Phosphoenolpyruvat von weniger als 10 μM aufweist und SEQ ID Nr. 7 umfasst, ist Gegenstand der Erfindung, wie auch ein DNA-Molekül, das dem aus E. indica isolierten DNA-Molekül oder einem als SEQ ID Nr. 6 identifizierten Teil davon im Wesentlichen homolog ist.
Der 3'-untranslatierte Bereich kann aus verschiedenen Genen erhalten werden, die in Pflanzenzellen exprimiert werden. Der 3'-untranslatierte Bereich der Nopalin-Synthase, der 3'-untranslatierte Bereich aus dem Gen für die kleine Untereinheit von Rubisco der Erbse, der 3'-untranslatierte Bereich des Weizenhitzeschockproteins 17.9, der 3'-untranslatierte Bereich aus dem Soja-7S-Samenspeicherprotein-Gen werden häufig in dieser Funktion verwendet.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine glyphosattolerante transgene Kulturpflanzenzelle, eine glyphosattolerante Kulturpflanze sowie Kulturpflanzenteile, Kulturpflanzensamen und deren Nachkommen, die das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfassen.
Ein DNA-Molekül, das ein natürlich vorkommendes, aus Pflanzen stammendes glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, wobei das EPSPS-Enzym SEQ ID Nr. 7 umfasst, wobei das glyphosatresistente EPSPS-Enzym ein K_m für Phosphoenolpyruvat (PEP) von weniger als 10 μM hat. Vorzugsweise ein DNA-Molekül, das ein natürlich vorkommendes, aus Pflanzen stammendes glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, das SEQ ID Nr. 7 umfasst, wobei das glyphosatresistente EPSPS-Enzym ein K_m für PEP von weniger als 10 μM hat und das K_m für PEP nicht größer als etwa doppelt so groß wie dasjenige eines natürlich vorkommenden, von einer Pflanze stammenden glyphosatempfindlichen EPSPS-Enzyms ist.
Ein DNA-Molekül, das ein natürlich vorkommendes glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, das von Eleusine-Spezies stammt, wobei das glyphosatresistente EPSPS-Enzym ein K_m für Phosphoenolpyruvat (PEP) von weniger als 10 μM hat und das EPSPS-Enzym SEQ ID Nr. 7 umfasst. Vorzugsweise ein DNA-Molekül, das ein natürlich vorkommendes glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, das von Eleusine-Spezies stammt, wobei das glyphosatresistente EPSPS-Enzym, das SEQ ID Nr. 7 umfasst, ein K_m für PEP von weniger als 10 μM hat und das K_m für PEP nicht größer als etwa doppelt so groß wie dasjenige eines natürlich vorkommenden, von einer Pflanze stammenden glyphosatempfindlichen EPSPS-Enzyms ist.
Das DNA-Molekül der Erfindung kann weiterhin homologe Elemente enthalten, die die Expression des Gens für glyphosatresistente EPSPS von E. indica regulieren. Zu diesen Elementen gehören unter anderem die DNA-Sequenzen eines Promotors, eines 5'-untranslatierten Bereichs, eines Chloroplasten-Transitpep tids, eines Introns und eines 3'-untranslatierten Bereichs eines E.-indica-EPSPS-Glyphosatresistenz-Gens. Ein DNA-Molekül, das ein glyphosatresistentes EPSPS-Enzym codiert, das aus dem Genom von Eleusine-Spezies, insbesondere aus dem glyphosatresistenten E.-indica-Biotyp, das unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. PTA-2177 hinterlegt wurde, gereinigt wurde, ist Gegenstand der Erfindung.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Bestandteil der vorliegenden Patentschrift und sind mit aufgenommen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung näher aufzuzeigen. Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der hier vorgestellten ausführlichen Beschreibung spezieller Ausführungsformen besser verstanden werden.
1. DNA-Sequenz der EPSP-Synthase von Eleusine indica (glyphosattolerant) (SEQ ID Nr. 6).
2. Abgeleitete Aminosäuresequenz für den das reife Protein codierenden Bereich des Gens für die EPSP-Synthase von Eleusine indica (glyphosattoleranter Biotyp) (SEQ ID Nr. 7).
3. Wachstumsraten von transgenem E. coli in glyphosathaltigen Medien bei Expression des glyphosatempfindlichen EPSPS-Enzyms von E. indica und des glyphosatresistenten EPSPS-Enzyms von E. indica.
4. Glyphosathemmungsstudie, die die EPSP-Synthase-Aktivitäten umfasst, die in Extrakten nachweisbar sind, die aus dem glyphosatempfindlichen und -toleranten E.-indica-Biotyp hergestellt wurden.
5. Plasmidkarte von pMON45364.
6. Plasmidkarte von pMON45365.
7. Plasmidkarte von pMON45367.
8. Plasmidkarte von pMON45369.
9. Die Aminosäuresequenz, die aus der cDNA-Sequenz des reifen EPSP-Synthase-Proteins, das vom glyphosattoleranten E.-indica-Biotyp (obere Reihe) stammt, abgeleitet wurde und parallel zu der des glyphosatempfindlichen E.-indica-Biotyp (untere Reihe) angeordnet ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Definitionen und Verfahren werden angegeben, um die vorliegende Erfindung besser zu definieren und den Fachmann bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung anzuleiten. Wenn nichts anderes gesagt wird, sind die Ausdrücke gemäß der herkömmlichen Praxis des Fachmanns zu verstehen. Definitionen von häufigen Ausdrücken in der Molekularbiologie sind auch zu finden in Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5. Auflage, Springer-Verlag: New York (1991); und Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York (1994). Die Nomenklatur für DNA-Basen, wie sie in 37 CFR § 1.822 dargelegt ist, wird verwendet. Die Standard-Ein- und -Drei-Buchstaben-Nomenklatur für Aminosäurereste wird verwendet.
"cDNA-Bibliothek" bezieht sich auf eine Sammlung von cDNA-Fragmenten, die jeweils in ein getrenntes Vektormolekül einklaniert sind.
Der Ausdruck "chimärisch" bezieht sich auf eine fusionierte Nucleinsäure- oder Proteinsequenz. Eine chimärische nucleinsäurecodierende Sequenz besteht aus zwei oder mehr Sequenzen, die rastergleich miteinander verknüpft sind und ein chimärisches Protein codieren. "Chimärisches Gen" bezieht sich auf die mehrfachen genetischen Elemente, die von heterologen Quellen abgeleitet sind, die ein Gen umfassen.
Die Ausdrücke "codierende Sequenz", "offenes Leseraster" und "strukturelle Sequenz" beziehen sich auf den Bereich von kontinuierlichen aufeinanderfolgenden Nucleinsäuretripletts, die ein Protein, Polypeptid oder eine Peptidsequenz codieren.
"Codon" bezieht sich auf eine Sequenz aus drei Nucleotiden, die eine besondere Aminosäure spezifiziert.
"Komplementarität" und "Komplement" in Bezug auf Nucleinsäuresequenzen bezieht sich auf die spezifische Bindung von Adenin an Thymin (oder Uracil in RNA) und Cytosin an Guanin an gegenüberliegenden DNA- oder RNA-Strängen.
"Konstrukt" bezieht sich auf die heterologen genetischen Elemente, die operabel miteinander verknüpft sind und so ein rekombinantes DNA-Molekül bilden.
"C-terminaler Bereich" bezieht sich auf den Bereich einer Peptid-, Polypeptid- oder Proteinkette von der Mitte bis zum Ende, das die Aminosäure mit einer freien Carboxygruppe trägt.
Der Ausdruck "codierende DNA" bezieht sich auf chromosomale DNA, Plasmid-DNA, cDNA oder synthetische DNA, die eines der hier diskutierten Proteine codiert.
Der Ausdruck "endogen" bezieht sich auf Materialien, die von innerhalb eines Organismus oder einer Zelle stammen.
"Endonuclease" bezieht sich auf ein Enzym, dass doppelsträngige DNA an internen Stellen hydrolysiert.
"Exogen" bezieht sich auf Materialien, die von außerhalb eines Organismus oder einer Zelle stammen. Dies gilt typischerweise für Nucleinsäuremoleküle, die bei der Herstellung von transformierten oder transgenen Wirtszellen und -pflanzen verwendet werden.
"Exon" bezieht sich auf den Teil eines Gens, der tatsächlich zu einem Protein translatiert wird, d.h. eine codierende Sequenz.
Der Ausdruck "Expression" bezieht sich auf die Transcription eines Gens unter Bildung der entsprechenden mRNA.
"Fragmente". Ein Fragment eines EPSPS-Gens ist ein Teil der vollen Länge der Nucleinsäure eines EPSPS-Gens, das wenigstens eine minimale Länge hat, bei der es noch in der Lage ist, ein Protein mit EPSPS-Aktivität zu exprimieren.
Der Ausdruck "Gen" bezieht sich auf chromosomale DNA, Plasmid-DNA, cDNA, synthetische DNA oder andere DNA, die ein Peptid, Polypeptid, Protein oder RNA-Molekül codiert, und Bereiche, die die codierende Sequenz flankieren und an der Regulation der Expression beteiligt sind.
Der Ausdruck "Genom", auf Viren angewandt, umfasst die gesamte Nucleinsäuresequenz, die innerhalb des Capsids des Virus enthalten ist. Der Ausdruck "Genom", auf Bakterien angewandt, umfasst sowohl das Chromosom als auch die Plasmide innerhalb einer bakteriellen Wirtszelle. Codierende Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die in bakterielle Wirtszellen eingeführt werden, können daher entweder in das Chromosom integriert sein oder sich im Plasmid befinden. Der Ausdruck "Genom", auf Pflanzenzellen angewandt, umfasst nicht nur chromosomale DNA, die sich innerhalb des Zellkerns befindet, sondern auch Organellen-DNA, die sich innerhalb von subzellulären Komponenten der Zelle befindet. Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die in Pflanzenzellen eingeführt werden, können daher entweder in das Chromosom integriert sein oder sich in Organellen befinden.
"Glyphosat" bezieht sich auf N-Phosphonomethylglycin und seine Salze; Glyphosat ist der Wirkstoff des Herbizids Roundup^® (Monsanto Co.). Pflanzenbehandlungen mit "Glyphosat" beziehen sich auf Behandlungen mit der Herbizidzubereitung Roundup^® oder Roundup Ultra^®, wenn nichts anderes gesagt ist. Glyphosat als N-Phosphonomethylglycin und seine Salze (nicht zubereitetes Roundup^®-Herbizid) sind Komponenten von synthetischen Kulturmedien, die für die Selektion in Bezug auf Bakterien- und Pflanzentoleranz gegenüber Glyphosat oder zur Bestimmung der Enzymresistenz in biochemischen in-vitro-Assays verwendet werden.
"Heterologe DNA" bezieht sich auf DNA aus einer anderen Quelle als diejenige der Empfängerzelle.
"Homologe DNA" bezieht sich auf DNA aus derselben Quelle wie diejenige der Empfängerzelle.
"Hybridisierung" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Nucleinsäurestrangs, durch Basenpaarung mit einem komplementären Strang zusammenzutreten. Hybridisierung findet statt, wenn komplementäre Sequenzen in den beiden Nucleinsäuresträngen aneinander binden.
"Identität" bezieht sich auf den Grad der Ähnlichkeit zwischen zwei Nucleinsäure- oder Proteinsequenzen. Ein Abgleich zwischen den beiden Sequenzen wird mit einem geeigneten Computerprogramm durchgeführt. Ein verbreitet verwendetes und akzeptiertes Computerprogramm für die Durchführung von Sequenzabgleichen ist CLUSTALW v1.6 (Thompson et al., Nucl. Acids Res., 22: 4673–4680, 1994). Die Zahl der übereinstimmenden Basen oder Aminosäuren wird durch die Gesamtzahl der Basen oder Aminosäuren dividiert und mit 100 multipliziert, um eine prozentuale Identität zu erhalten. Wenn zum Beispiel zwei Sequenzen mit jeweils 580 Basenpaaren 145 übereinstimmende Basen hätten, wären sie zu 25% identisch. Wenn die beiden einander gegenübergestellten Sequenzen unterschiedliche Längen haben, wird die Zahl der Übereinstimmungen durch die kürzere der beiden Längen dividiert. Wenn es zum Beispiel 100 übereinstimmende Aminosäuren zwischen zwei Proteine mit 200 bzw. 400 Aminosäuren gibt, so sind sie zu 50% identisch in Bezug auf die kürzere Sequenz. Wenn die kürzere Sequenz eine kleinere Länge als 150 Basen oder 50 Aminosäuren hat, wird die Zahl der Übereinstimmungen durch 150 (für Nucleinsäurebasen) bzw. 50 (für Aminosäuren) dividiert und mit 100 multipliziert, um eine prozentuale Identität zu erhalten.
"Intron" bezieht sich auf einen Teil eines Gens, das nicht zu einem Protein translatiert wird, obwohl es zu RNA transcribiert wird.
"Isoliert". Eine "isolierte" Nucleinsäure ist eine, die durch herkömmliche Nucleinsäurereinigungsverfahren von anderen Nucleinsäuresequenzen in der Zelle des Organismus, in dem die Nucleinsäure natürlicherweise vorkommt, d.h., anderer chromosomaler und extrachromosomaler DNA und RNA, im Wesentlichen abge trennt oder gereinigt wurde. Der Ausdruck umfasst auch rekombinante Nucleinsäuren und chemisch synthetisierte Nucleinsäuren.
"Native". Der Ausdruck "nativ" bezieht sich auf eine natürlich vorkommende ("Wildtyp-") Nucleinsäure oder ein natürlich vorkommendes ("Wildtyp-") Polypeptid.
"N-terminaler Bereich" bezieht sich auf den Bereich einer Peptid-, Polypeptid- oder Proteinkette von der Aminosäure mit einer freien Aminogruppe bis zur Mitte der Kette.
"Nucleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA).
Nucleinsäurecodes: A = Adenosin; C = Cytosin; G = Guanosin; T = Thymidin. Für die Synthese von Oligonucleotiden verwendete Codes: N = äquimolare A, C, G und T; I = Desoxyinosin; K = äquimolare G und T; R = äquimolare A und G; S = äquimolare C und G; W = äquimolare A und T; Y = äquimolare C und T.
Ein "Nucleinsäuresegment" oder ein "Nucleinsäuremolekülsegment" ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus gesamtgenomischer DNA einer bestimmten Spezies isoliert oder synthetisiert wurde. Der Ausdruck "Nucleinsäuresegment" umfasst auch DNA-Segmente, rekombinante Vektoren, Piasmide, Cosmide, Phagemide, Phagen, Viren usw.
"Nucleinsäurehybridisierung"; "stringente Bedingungen"; "spezifisch". Der Ausdruck "stringente Bedingungen" ist funktionell definiert in Bezug auf die Hybridisierung einer Nucleinsäuresonde mit einer Zielnucleinsäure (d.h. mit einer bestimmten interessierenden Nucleinsäuresequenz) durch das spezifische Hybridisierungsverfahren, das diskutiert wird in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), unter 9.52–9.55. Siehe auch Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), unter 9.47–9.52, 9.56–9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12: 203–213, 1984; sowie Wetmur und Davidson, J. Mol. Biol. 31: 349–370, 1968.
"Nucleotidsequenzvarianten". Unter Verwendung wohlbekannter Verfahren kann der Fachmann leicht Nucleotid- und Aminosäuresequenzvarianten von EPSPS-Genen bzw. -Proteinen produzieren. "Variante" DNA-Moleküle sind DNA-Moleküle, die kleinere Änderungen in einer nativen EPSPS-Gensequenz enthaften, d.h. Änderungen der Art, dass ein oder mehrere Nucleotide einer nativen EPSPS-Gensequenz deletiert, addiert und/oder substituiert sind, so dass das variante EPSPS-Gen ein Protein codiert, das die EPSPS-Aktivität beibehält. Variante DNA-Moleküle können zum Beispiel durch Standard-DNA-Mutagenesetechniken hergestellt werden, oder indem man das variante DNA-Molekül oder einen Teil davon chemisch synthetisiert. Verfahren zur chemischen Synthese von Nucleinsäuren sind zum Beispiel diskutiert in Beaucage et al., Tetra. Letts. 22: 1859–1862 (1981), und Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185- (1981). Die chemische Synthese von Nucleinsäuren kann zum Beispiel mit automatischen Oligonucteotid-Synthesizern durchgeführt werden. Solche Varianten ändern vorzugsweise nicht das Leseraster des proteincodierenden Bereichs der Nucleinsäure und codieren vorzugsweise ein Protein, das keine Aminosäureänderungen aufweist. Nucleinsäuresequenzvarianten werden am häufigsten erzeugt, um die Sequenz so zu modifizieren, dass Restriktionsendonuclease-Stellen hinzugefügt oder entfernt werden oder die Transcription oder Translation des Nucleinsäuremoleküls beeinflusst wird.
"Offenes Leseraster (ORF)" bezieht sich auf einen Bereich von DNA oder RNA, der ein Peptid, Polypeptid oder Protein codiert.
"Operabel verknüpft". Eine erste Nucleinsäuresequenz ist "operabel" mit einer zweiten Nucleinsäuresequenz verknüpft, wenn die erste Nucleinsäuresequenz in einer funktionellen Beziehung zur zweiten Nucleinsäuresequenz angeordnet ist. Ein Promotor ist zum Beispiel operabel mit einer proteincodierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor die Transcription oder Expression der codierenden Sequenz bewirkt. Operabel verknüpfte DNA-Sequenzen sind im Allgemeinen fortlaufend, und wenn es notwendig ist, zwei proteincodierende Bereiche miteinander zu verknüpfen, befinden sie sich in demselben Leseraster.
"Überexpression" bezieht sich auf die Expression eines Polypeptids oder Proteins, das durch eine in eine Wirtszelle eingeschleuste DNA codiert wird, wobei das Polypeptid oder Protein entweder normalerweise nicht in der Wirtszelle vorhanden ist oder wobei das Polypeptid oder Protein in einer größeren Konzentration in der Wirtszelle vorhanden ist, als es normalerweise vom dem endogenen Gen, das das Polypeptid oder Protein codiert, exprimiert wird.
"Pflanzenexpressionsvektor" bezieht sich auf chimärische DNA-Moleküle, die die regulatorischen Elemente umfassen, die operabel miteinander verknüpft sind, so dass man die Expression eines Transgenprodukts in Pflanzen erhält.
"Plasmid" bezieht sich auf ein zirkuläres, extrachromosomales, selbstreplizierendes Stück DNA.
"Polyadenylierungssignal" oder "PolyA-Signal" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die sich 3' von einem codierenden Bereich befindet und die Addition von Adenylatnucleotiden an das 3'-Ende der von diesem codierenden Bereich transcribierten mRNA bewirkt.
"Polymerase-Kettenreaktion (PCR)" bezieht sich auf eine enzymatische Technik zur Herstellung von mehrfachen Kopien einer Nucleinsäuresequenz. Kopien einer DNA-Sequenz werden hergestellt, indem man eine DNA-Polymerase sich zwischen zwei Amplimeren hin und her bewegen lässt. Die Grundlage dieses Amplifikationsverfahrens sind mehrfache Cyclen von Temperaturänderungen, so dass die Amplimere denaturiert und dann reassoziiert werden, gefolgt von einer Verlängerung, so dass in dem Bereich, der sich zwischen den flankierenden Amplimeren befindet, neue DNA-Stränge synthetisiert werden.
Der Ausdruck "Promotor" oder "Promotorbereich" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die sich gewöhnlich stromaufwärts (5') von einer codierenden Sequenz befindet und die Expression der codierenden Sequenz durch Steuerung der Produktion von Boten-RNA (mRNA) steuert, indem sie die Erkennungsstelle für RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren, die für den Beginn der Transcription an der richtigen Stelle notwendig sind, bereitstellt. Es wird hier in Betracht gezogen, dass ein Promotor oder Promotorbereich Variationen von Promotoren umfasst, die mittels Ligierung an verschiedene regulatorische Sequenzen, statistische oder gesteuerte Mutagenese und Addition oder Duplikation von Enhancer-Sequenzen erreicht werden. Der hier offenbarte Promotorbereich und biologisch funktionelle Äquivalente davon sind dafür verantwortlich, die Transcription von codierenden Sequenzen, die sich unter ihrer Kontrolle befinden, anzutreiben, wenn sie als Bestandteil eines geeigneten rekombinanten Vektors, was anhand seiner Fähigkeit, mRNA zu produzieren, aufgezeigt wird, in einen Wirt eingeführt werden.
"Rekombinant". Eine "rekombinante" Nucleinsäure wird durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Sequenzabschnitten hergestellt, z.B. durch chemische Synthese oder durch die Manipulation von isolierten Nucleinsäuresegmenten durch gentechnische Methoden.
Der Ausdruck "rekombinantes DNA-Konstrukt" oder "rekombinanter Vektor" bezieht sich auf jedes Agens, wie ein Plasmid, Cosmid, Virus, autonom replizierende Sequenz, Phage oder lineare oder zirkuläre einsträngige oder doppelsträngige DNA- oder RNA-Nucleotidsequenz, das von einer beliebigen Quelle stammt, zur Integration in das Genom oder zur autonomen Replikation befähigt ist und ein DNA-Molekül umfasst, bei dem eine oder mehrere DNA-Sequenzen in funktioneller Weise miteinander verknüpft wurden. Solche rekombinanten DNA-Konstrukte oder Vektoren sind in der Lage, eine 5'-regulatorische Sequenz oder einen Promotorbereich und eine DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt so in eine Zelle einzuführen, dass die DNA-Sequenz zu einer funktionellen mRNA transcribiert wird, die translatiert und daher exprimiert wird. Rekombinante DNA-Konstrukte oder rekombinante Vektoren können so aufgebaut sein, dass sie Antisense-mRNAs exprimieren, um die Translation einer interessierenden speziellen RNA zu hemmen.
"Regeneration" bezieht sich auf den Vorgang des Aufziehens einer Pflanze aus einer Pflanzenzelle (z.B. Pflanzenprotoplast oder -explantat).
"Reporter" bezieht sich auf ein Gen und das entsprechende Genprodukt, das bei Expression in transgenen Organismen ein Produkt, das durch chemische oder molekulare Methoden nachweisbar ist, erzeugt oder einen erkennbaren Phänotyp erzeugt.
"Restriktionsenzym" bezieht sich auf ein Enzym, das eine spezifische palindromische Sequenz von Nucleotiden in doppelsträngiger DNA erkennt und beide Stränge spaltet; es wird auch "Restriktionsendonuclease" genannt. Die Spaltung erfolgt typischerweise innerhalb der Restriktionsstelle.
"Selektionsmarker" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, deren Expression zu einem Phänotyp führt, der die Identifizierung von Zellen, die die Nucleinsäuresequenz enthält, erleichtert. Zu den Selektionsmarkern gehören solche, die Resistenz gegen toxische Chemikalien (z.B. Ampicillin-Resistenz, Kanamycin-Resistenz) verleihen, einen Ernährungsmangel ausgleichen (z.B. Uracil, Histidin, Leucin) oder ein visuell unterscheidendes Merkmal verleihen (z.B. Farbänderungen oder Fluoreszenz). Zu den geeigneten dominanten Selektionsmarker-Genen gehören Gene, die Antibiotikum-Resistenz-Gene (z.B. Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin, Bleomycin, G418, Streptomycin oder Spectinomycin), und Herbizid-Resistenz-Gene (z.B. Phosphinothricin-Acetyltransferase) codieren. Eine nützliche Strategie für die Selektion von Transformanten anhand von Herbizidresistenz ist z.B. beschrieben in Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Band I-III, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York (1984).
Der Ausdruck "spezifisch für (eine Zielsequenz)" weist darauf hin, dass eine Sonde oder ein Primer in einer Probe, die die Zielsequenz umfasst, unter gegebenen Hybridisierungsbedingungen nur mit der Zielsequenz hybridisiert.
"Tolerant" bezieht sich auf eine reduzierte toxische Wirkung von Glyphosat auf das Wachstum und die Entwicklung Von Mikroorganismen und Pflanzen.
"Transcription" bezieht sich auf den Vorgang der Produktion einer RNA-Kopie aus einer DNA-Matrize.
"Transformation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung einer exogenen Nucleinsäuresequenz (z.B. eines Vektors, rekombinanten Nucleinsäuremoleküls) in eine Zelle oder einen Protoplasten, wobei die exogene Nucleinsäure in ein Chromosom eingebaut wird oder zur autonomen Replikation befähigt ist.
"Transformiert" oder "transgen" bezieht sich auf eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder einen Organismus, in die, das bzw. den eine fremde Nucleinsäure, wie ein rekombinanter Vektor, eingeführt wurde. Eine "transgene" oder "transformierte" Zelle bzw. Organismus beinhaltet auch Nachkommenschaft der Zelle oder des Organismus sowie Nachkommenschaft, die durch ein Züchtungsprogramm entstanden ist, bei dem eine solche "transgene" Pflanze als Stammpflanze bei einer Kreuzung eingesetzt wurde, und einen veränderten Phänotyp aufweist, der aus der Anwesenheit der fremden Nucleinsäure resultiert.
Der Ausdruck "transgen" bezieht sich auf jede Nucleinsäuresequenz, die in einer Zelle oder einem Organismus nicht nativ vorhanden ist und durch Transformation in die Zelle oder den Organismus eingeführt wird. "Transgen" umfasst auch die Bestandteile eines nativen Pflanzengens, die durch Insertion einer nichtnativen Nucleinsäuresequenz durch gezielte Rekombination modifiziert wurden.
Der Ausdruck "Translation" bezieht sich auf die Produktion des entsprechenden Genprodukts, d.h. eines Peptids, Polypeptids oder Proteins, aus einer mRNA.
"Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid, Cosmid, einen Bakteriophagen oder ein Virus, das bzw. der Fremd-DNA in einen Wirtsorganismus trägt.
"Isolierte", "gereinigte", "homogene" Polypeptide. Ein Polypeptid ist "isoliert", wenn es von den Zellkomponenten (Nucleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate und andere Polypeptide), die es natürlicherweise begleiten, getrennt wurde oder chemisch synthetisiert wurde oder rekombinant ist. Ein monomeres Polypeptid ist isoliert, wenn wenigstens 60 Gew.-% einer Probe aus dem Polypeptid bestehen, vorzugsweise 90% oder mehr, besonders bevorzugt 95% oder mehr und am meisten bevorzugt mehr als 99%. Die Reinheit oder Homogenität eines Proteins wird zum Beispiel durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese einer Proteinprobe und anschließendes Sichtbarwerden einer einzigen Polypeptidbande beim Anfärben des Polyacrylamid-Gels, HPLC (high pressure liquid chromatography) oder andere herkömmliche Verfahren angezeigt. Hüllproteine können durch eine der in der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden, zum Beispiel gemäß der Beschreibung in Guide to Protein Purification, Hrsg. Deutscher, Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982.
"Markierung". Es gibt eine Vielzahl von herkömmlichen Verfahren und Reagentien für die Markierung von Polypeptiden und Fragmenten davon. Zu den typischen Markern gehören radioaktive Isotope, Liganden oder Ligandenrezeptoren, Fluorophore, chemilumineszente Agentien und Enzyme. Verfahren zur Markierung und Anleitungen bei der Auswahl von Markern, die für verschiedene Zwecke geeignet sind, sind z.B. diskutiert in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), und Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1992).
"Reifes Protein codierender Bereich". Dieser Ausdruck bezieht sich auf die Sequenz des prozessierten Proteinprodukts von EPSPS, die zurückbleibt, nachdem die Chloroplasten-Transitpeptidsequenz entfernt wurde.
"Transitpeptid oder Zielsteuerungs-Peptidsequenz". Diese Ausdrücke beziehen sich allgemein auf Peptidsequenzen, die, wenn sie mit einem interessierenden Protein verknüpft sind, dieses Protein zu einem bestimmten Gewebe, einer bestimmten Zelle, subzellulären Lokalität oder Zellorganell lenken. Beispiele dafür sind unter anderem Chloroplasten-Transitpeptide, Zellkern-Zielsteuerungssignale und Vakuolensignale. Das Chloroplasten-Transitpeptid ist in der vorliegenden Erfindung von besonderem Nutzen, um die Expression des EPSPS-Enzyms zum Chlorplasten zu lenken.
Der Ausdruck "Pflanze" umfasst jede höhere Pflanze und deren Nachkommen, einschließlich Einkeimblättriger (z.B. Mais, Reis, Weizen, Gerste usw.), Zweikeimblättriger (z.B. Sojabohne, Baumwolle, Tomate, Kartoffel, Arabidopsis, Tabak usw.) und Nacktsamern (Kiefern, Tannen, Zedern usw.), und umfasst auch Teile von Pflanzen, einschließlich Reproduktionseinheiten einer Pflanze (z.B. Samen, Zwiebeln, Knollen oder andere Teile oder Gewebe, aus denen die Pflanze reproduziert werden kann), Früchten und Blüten.
Exogenes genetisches Material kann durch die Verwendung eines DNA-Vektors, der für einen solchen Zweck vorgesehen ist, mit Verfahren, bei denen Agrobacterium verwendet wird, Teilchenbombardierung oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in eine Pflanze übertragen werden. Eine besonders bevorzugte Untergruppe von exogenem Material umfasst ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung. Die Gestaltung eines solchen Vektors liegt im Allgemeinen im Bereich des fachmännischen Könnens (Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Hrsg. Clark, Springer, New York (1997)). Beispiele für solche Pflanzen, in die exogenes genetisches Material übertragen werden kann, sind unter anderem Luzerne, Arabidopsis, Gerste, Brassica, Broccoli, Kohl, Zitrus, Baumwolle, Knoblauch, Hafer, Raps, Zwiebel, Canola, Flachs, Mais, eine einjährige Zierpflanze und eine Zierstaude, Erbse, Erdnuss, Pfeffer, Kartoffel, Reis, Roggen, Sorghum, Soja, Erdbeere, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Tomate, Weizen, Pappel, Kiefer, Tanne, Eukalyptus, Apfel, Kopfsalat, Linsen, Weintrauben, Bananen; Tee, Rasengräser, Sonnenblume, Ölpalme, Phaseolus usw.
Die besonderen Promotoren, die zur Verwendung in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden, sollten in der Lage sein, eine ausreichende Expression zu bewirken, so dass es im Falle des DNA-Moleküls zu einer Proteinexpression in vegetativen und reproduktiven Geweben einer transformierten Pflanze kommt. Das DNA-Molekül enthält typischerweise einen konstitutiven Promotor, eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein herbizidresistentes Enzym codiert, und einen 3'-untranslatierten Bereich. Es wurden mehrere konstitutive Promotoren beschrieben, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Zu den geeigneten Promotoren für die konstitutive Expression von Herbizidtoleranz in Pflanzen für das DNA-Molekül gehören unter anderem der Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-35S-Promotor (Odell et al., Nature, 313: 801–812 (1985)), der Figwort-Mosaic-Virus(FMV)-35S-Promotor (Sanger et al., Plant Mol. Biol. 14: 433–443 (1990)), der Zuckerrohr-Bacilliform-Virus-Promotor (Bouhida et al., J. Gen. Virol. 74: 15–22 (1993)), der Commelina-Yellow-Mottle-Virus-Promotor (Medberry et al., Plant J. 3: 619–626 (1993)), der lichtinduzierbare Promotor von der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO) (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671–1679 (1984)), der Reis-Cytosol-Triosephosphat-Isomerase(TPI)-Promotor (Xu et al., Plant Physiol. 106: 459–467 (1994)), der Adenin-Phosphoribosyltransferase(APRT)-Promotor von Arabidopsis (Moffatt et al., Gene 143: 211–216 (1994)), der Reis-Actin-1-Gen-Promotor (Zhong et al., Plant Sci. 116: 73–84 (1996)), der Mannopin-Synthase- und der Octopin-Synthase-Promotor (Ni et al., Plant J. 7: 661–676 (1995)), der Adh-Promotor (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6624–6628 (1987)), der Sucrose-Synthase-Promotor (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 4144–4148 (1990)), der R-Gen-Komplex-Promotor (Chandler et al., The Plant Cell 1: 1175–1183 (1989)) und der Chlorophyll-α/β-Bindungsprotein-Gen-Promotor usw. Diese Promotoren werden verwendet, um DNA-Vektoren zu erzeugen, die in Pflanzen exprimiert werden; siehe z.B. PCT-Veröffentlichung WO 84/02913. Alle diese Promotoren werden verwendet, um verschiedene Typen von pflanzenexprimierbaren rekombinanten DNA-Vektoren zu erzeugen. Eine vergleichende Analyse von konstitutiven Promotoren durch die Expression von Reporter-Genen, wie des uidA-(β-Glucuronidase)-Gens von E. coli wurde mit vielen von diesen und anderen Promotoren durchgeführt (Li et al., Mol. Breeding, 3: 1–14 (1997); Wen et al., Chinese J. of Bot. 5: 102–109 (1993)). Promotoren, von denen bekannt ist oder sich herausstellt, dass sie eine Transcription von DNA in Pflanzenzellen bewirken, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Promotoren können aus einer Vielzahl von Quellen, wie Pflanzen und Pflanzenviren, erhalten werden. Außer Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie eine Transcription von DNA in Pflanzenzellen bewirken, können auch andere Promotoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, indem man eine Pflanzen-cDNA-Bibliothek auf Gene durchmustert, die in den Zielgeweben oder -zellen selektiv oder bevorzugt exprimiert werden. Für die Zwecke der Expression in Quellgeweben der Pflanze, wie Blatt, Samen, Wurzel oder Stängel, wird bevorzugt, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotoren eine relativ hohe Expression in diesen speziellen Geweben aufweisen. Zu diesem Zweck kann man aus mehreren Promotoren für Gene mit gewebe- oder zellspezifischer oder -verstärkter Expression auswählen. Beispiele für solche Promotoren, die in der Literatur angegeben sind, sind der Chloroplasten-Glutamin-Synthetase-GS2-Promotor aus der Erbse (Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 3459–3463 (1990)), der Chloroplasten-Fructose-1,6-biphosphatase(FBPase)-Promotor aus Weizen (Lloyd et al., Mol. Gen. Genet. 225: 209–216 (1991)), der Zellkern-Photosynthese-ST-LS1-Promotor aus der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8: 2445–2451 (1989)), der Serin/Threonin-Kinase-(PAL)-Promotor und der Glucoamylase-(CHS)-Promotor aus Arabidopsis thaliana. Ebenso als aktiv in photosynthetisch aktiven Geweben angegeben werden der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase(RBCS)-Promotor aus der Ostamerikanischen Lärche (Larix laricina), der Promotor für das Cab-Gen, Cab6, aus der Kiefer (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773–778 (1994)), der Promotor für das Cab-1-Gen aus Weizen (Fejes et al., Plant Mol. Biol. 15: 921–932 (1990)), der Promotor für das Cab-1-Gen aus Spinat (Lubberstedt et al., Plant Physiol. 104: 997–1006 (1994)), der Promotor für das Cab1R-Gen aus Reis (Luan et al., Plant Cell. 4: 971–981 (1992)), der Pyruvatorthophosphat-Dikinase(PPDK)-Promotor aus Zea mays (Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 9586–9590 (1993)), der Promotor für das Tabak-Lhcb1·2-Gen (Cerdan et al., Plant Mol. Biol. 33: 245–255 (1997)), der Promotor des Arabidopsis-thaliana-Suc2-Sucrose-N⁺-Symporters (Truernit et al., Planta, 196: 564–570 (1995)) und der Promotor für die Thylakoid-Membran-Protein-Gene von Spinat (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS).
Andere Promotoren für die Chlorophyll-α/β-Bindungsproteine können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden, wie die Promotoren für das LhcB-Gen und das PsbP-Gen von Weißem Senf (Sinapis alba) (Kretsch et al., Plant Mol. Biol. 28: 219–229 (1995)). Eine Vielzahl von Pflanzen-Gen-Promotoren, die als Reaktion auf Umgebungs-, hormonelle, chemische und/oder Entwicklungssignale reguliert werden, können ebenfalls für die Expression von RNA-Bindungsprotein-Genen in Pflanzenzellen verwendet werden, einschließlich Promotoren, die reguliert werden durch (1) Wärme (Callis et al., Plant Physiol. 88: 965–968 (1988)), (2) Licht (z.B. der RbcS-3A-Promotor der Erbse, Kuhlemeier et al., Plant Cell 1: 471–478 (1989)); der RbcS-Promotor des Mais, Schaffner et al., Plant Cell 3: 997–1012 (1991)), (3) Hormone, wie Abscisinsäure (Marcotte et al., Plant Cell 1: 969–976 (1989)), (4) Verwundung (z.B. WunI, Siebertz et al., Plant Cell 1: 961–968 (1989)); oder (5) Chemikalien, wie Methyljasminat, Salicylsäure, Steroidhormone, Alkohol, Safener (Gatz, Curr. Opin. Biotech 7: 168–172 (1996), WO 97/06269), oder es kann auch vorteilhaft sein, (6) organspezifische Promotoren einzusetzen (z.B. Roshal et al., EMBO J. 6: 1155- (1987); Schernthaner et al., EMBO J. 7: 1249–1255 (1988); Bustos et al., Plant Cell 1: 839–853 (1989)).
Zum Zwecke der Expression in Sink-Geweben der Pflanze, wie der Knolle der Kartoffelpflanze, der Frucht der Tomate oder dem Samen von Soja, Canola, Baumwolle, Zea mays, Weizen, Reis und Gerste, weisen die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotoren vorzugsweise eine relativ hohe Expression in diesen speziellen Geweben auf. Mehrere Promotoren für Gene mit knollenspezifischer oder -verstärkter Expression sind bekannt; dazu gehören der Klasse-I-Patatin-Promotor (Bevan et al., EMBO J. 8: 1899–1906 (1986); Jefferson et al., Plant Mol. Biol. 14: 995–1006 (1990)), der Promotor für die ADPGPP-Gene der Kartoffelknolle, sowohl die große als auch die kleine Untereinheit, der Sucrose-Synthase-Promotor (Salanoubat et al., Gene 60: 47–56 (1987); Salanoubat et al., Gene 84: 181–185 (1989)), der Promotor für die Hauptknollenproteine einschließlich der 22-kD-Proteinkomplexe und Proteinase-Inhibitoren (Hannapel, Plant Physiol. 101: 703–704 (1993)), der Promotor für das Gen der stärkekorngebundenen Stärke-Synthase (GBSS) (Visser et al., Plant Mol. Biol. 17: 691–699 (1991)) und andere Klasse-I- und -II-Patatin-Promotoren (Koster-Topfer et al., Mol. Gen. Genet. 219: 390–396 (1989); Mignery et al., Gene 62: 27–44 (1988)). Andere Promotoren können ebenfalls verwendet werden, um ein Protein in speziellen Geweben, wie Samen oder Früchten, zu exprimieren. Der Promotor für β-Conglycinin (Chen et al., Dev. Genet. 10: 112–122 (1989)) oder andere samenspezi fische Promotoren, wie der Napin- und der Phaseolin-Promotor, können verwendet werden. Die Zeine sind eine Gruppe von Speicherproteinen, die man in Zeamays-Endosperm findet. Genomische Klone für Zein-Gene wurden isoliert (Pedersen et al., Cell 29: 1015–1026 (1982)), und die Promotoren aus diesen Klonen, einschließlich des 15-kD-, 16-kD-, 19-kD-, 22-kD-, 27-kD- und gamma-Gens, können ebenfalls verwendet werden. Weitere Promotoren, die bekanntermaßen zum Beispiel in Zea mays funktionieren, sind die Promotoren für die folgenden Gene: waxy, Brittle, Shrunken 2, Verzweigungsenzyme I und II, Stärke-Synthasen, Debranching-Enzyme, Oleosine, Gluteline und Sucrose-Synthasen. Ein besonders bevorzugter Promotor für die Expression im Endosperm von Zea mays ist der Promotor für das Glutelin-Gen von Reis, insbesondere der Osgt-1-Promotor (Zheng et al., Mol. Cell Biol. 13: 5829–5842 (1993)). Beispiele für Promotoren, die für die Expression in Weizen geeignet sind, sind die Promotoren für die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase(ADPGPP)-Untereinheiten, die stärkekorngebundene und andere Stärke-Synthase, die Verzweigungs- und Debranching-Enzyme, die LEA-Proteine (late embryogenesis abundant proteins), die Gliadine und die Glutenine. Beispiele für solche Promotoren in Reis sind solche Promotoren für die ADPGPP-Untereinheiten, die stärkekorngebundene und andere Stärke-Synthase, die Verzweigungsenzyme, die Debranching-Enzyme, die Sucrose-Synthasen und die Gluteline. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der Promotor für das Gen für Reis-Glutelin, Osgt-1. Beispiele für solche Promotoren für Gerste sind solche für die ADPGPP-Untereinheiten, die stärkekorngebundene und andere Stärke-Synthase, die Verzweigungsenzyme, die Debranching-Enzyme, die Sucrose-Synthasen, die Hordeine, die Embryo-Globuline und die aleuronspezifischen Proteine.
Wurzelspezifische Promotoren können ebenfalls verwendet werden. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist der Promotor für das Säure-Chitinase-Gen (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25: 587–596 (1994)). Die Expression in Wurzelgewebe könnte auch bewerkstelligt werden, indem man die wurzelspezifischen Unterdomänen des CaMV-35S-Promotors verwendet, die identifiziert wurden (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 7890–7894 (1989)). Weitere wurzelzellspezifi sche Promotoren sind diejenigen, die von Conkling et al. beschrieben wurden (Plant Physiol. 93: 1203–1211 (1990)).
Die 5'-untranslatierte Leadersequenz kann von dem Promotor abgeleitet sein, der so ausgewählt wird, dass er die heterologe Gensequenz des DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung exprimiert, und kann, falls gewünscht, speziell so modifiziert werden, dass die Translation von mRNA verstärkt wird. Wegen einer Übersicht zur Optimierung der Expression von Transgenen, siehe Koziel et al. (Plant Mol. Biol. 32: 393–405 (1996)). Die 5'-untranslatierten Bereiche können auch von Pflanzenvirus-RNAs (Tabakmosaikvirus, Tobacco Etch Virus, Maisverzwergungsmosaik-Virus, Luzernemosaikvirus, und andere), von geeigneten eukaryontischen Genen, Pflanzengenen (Weizen- und Mais-Chlorophyll-α/β-Bindungsprotein-Gen-Leadersequenz) oder von einer synthetischen Gensequenz erhalten werden. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Konstrukte beschränkt, bei denen der untranslatierte Bereich von der 5'-untranslatierten Sequenz abgeleitet ist, die die Promotorsequenz begleitet. Die Leadersequenz könnte auch von einer nicht verwandten Promotor- oder codierenden Sequenz stammen. Leadersequenzen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen die Mais-Hsp70-Leadersequenz (US-Patent Nr. 5,362,865 und US-Patent Nr. 5,859,347) und das TMV-Omegaelement (Gallie et al., The Plant Cell 1.: 301–311 (1989)).
Ein Vektor oder Konstrukt kann auch verschiedene regulatorische Elemente umfassen. In der Technik ist bekannt, dass Intronsequenzen die Expression von Transgenen in den Zellen von Einkeimblättrigen Pflanzen unterstützen. Beispiele für solche Introns sind das Adh-Intron 1 (Callis et al., Genes and Develop. 1: 1183–1200 (1987)), das Sucrose-Synthase-Intron (Vasil et al., Plant Physiol. 91: 1575–1579 (1989), US-Patent Nr. 5,955,330), das erste Intron des Reis-Actin-Gens (US-Patent Nr. 5,641,876).
Ein Vektor kann auch eine Transitpeptid-Nucleinsäuresequenz umfassen. Das Glyphosat-Target in Pflanzen, das 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-(EPSPS)-Enzym, ist im Chloroplasten lokalisiert. Viele im Chloroplasten lokali sierte Proteine, einschließlich EPSPS, werden von Genen des Zellkerns aus als Vorstufen exprimiert und durch ein Chloroplasten-Transitpeptid (CTP), das während der Importschritte wieder entfernt wird, zum Chloroplasten zielgesteuert. Beispiele für andere solche Chloroplastenproteine sind die kleine Untereinheit (SSU) von Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase, Ferredoxin, Ferredoxin-Oxidoreductase, das Lichtsammelkomplex-Protein I und -Protein II sowie Thioredoxin F. Es wurde in vivo und in vitro nachgewiesen, dass Nichtchloroplastenproteine durch Verwendung von Proteinfusionen mit einem CTP zum Chloroplasten zielgesteuert werden können und dass eine CTP-Sequenz ausreicht, um ein Protein zum Chloroplasten zielzusteuern. Es hat sich gezeigt, dass durch den Einbau eines geeigneten Chloroplasten-Transitpeptids, wie des Arabidopsis-thaliana-EPSPS-CTP (Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210: 437–442 (1987)) und des Petunia-hybrida-EPSPS-CTP (della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6873–6877 (1986)), heterologe EPSPS-Proteinsequenzen in transgenen Pflanzen zu Chloroplasten zielgesteuert werden. Die Erzeugung von glyphosattoleranten Pflanzen durch Expression eines Fusionsproteins, das ein aminoterminales CTP umfasst, mit einem glyphosatresistenten EPSPS-Enzym ist dem Fachmann wohlbekannt (US-Patent Nr. 5,627,061, US-Patent Nr. 5,633,435, US-Patent Nr. 5,312,910, EP 0 218 571 , EP 189 707 , EP 508 909 und EP 924 299 ). Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass verschiedene chimärische Konstrukte hergestellt werden können, die sich die Funktionalität eines besonderen CTP zu Nutze machen, um glyphosatresistente EPSPS-Enzyme in den Chloroplasten einer Pflanzenzelle zu importieren.
Der Abbruch der Transcription wird durch eine 3'-untranslatierte DNA-Sequenz erreicht, die in dem chimärischen Vektor operabel mit dem interessierenden Gen verknüpft ist. Der 3'-untranslatierte Bereich eines rekombinanten DNA-Moleküls enthält ein Polyadenylierungssignal, das in Pflanzen die Funktion hat, die Addition von Adenylatnucleotiden an das 3'-Ende der RNA zu bewirken. Der 3'-untranslatierte Bereich kann von verschiedenen Genen, die in Pflanzenzellen exprimiert werden, erhalten werden. Der 3'-untranslatierte Bereich der Nopalin-Synthase (Fraley et al., Proc: Natl. Acad. Sci. 80: 4803–4807 (1983), der 3'-untranslatierte Bereich des Gens für die kleine Untereinheit von Rubisco der Erbse (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671–1679 (1994)) und der 3'-untranslatierte Bereich des Gens für das 7S-Samenspeicherprotein der Sojabohne (Schuler et al., Nucl. Acids Res. 10: 8225–8244 (1982)) werden häufig in dieser Funktion verwendet. Die 3'-transcribierten, untranslatierten Bereiche, die das Polyadenylat-Signal von tumorinduzierenden (Ti) Plasmidgenen von Agrobacterium enthalten, sind ebenfalls geeignet.
Die oben beschriebenen genetischen Elemente und andere regulatorische Elemente mit ähnlicher Funktion können vom Fachmann auf dem Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie gegebenenfalls verwendet werden, um die Pflanzenexpressionscassette mit einer notwendigen Funktion zu versehen. DNA-Konstrukte für Glyphosattoleranz, die für die Expression in Plastiden vorgesehen sind, enthalten notwendigerweise genetische Elemente, die in Plastiden funktionieren.
Ein Vektor kann auch ein Marker-Gen enthalten, das als Kriterium beim Screening oder zur Einstufung verwendet werden kann. Als Kriterium beim Screening oder zur Einstufung verwendbare Marker können verwendet werden, um die Expression zu überwachen. Beispielhafte Marker sind ein β-Glucuronidase- oder uidA-Gen (GUS), das ein Enzym cadiert, für das verschiedene chromogene Substrate bekannt sind (Jefferson, Plant Mol. Biol., Rep. 5: 387–405 (1987); Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987)), ein R-Locus-Gen, das ein Produkt codiert, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Farbe) in Pflanzengeweben reguliert (Dellaporta et al., Stadler Symposium 11: 263–282 (1988)); ein β-Lactamase-Gen (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 75: 3737–3741 (1978)); ein Gen, das ein Enzym codiert, für das verschiedene chromogene Substrate bekannt sind (z.B. PADAC, ein chromogenes Cephalosporin); ein Luciferase-Gen (Ow et al., Science 234: 856–859 (1986)); ein xylE-Gen (Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80: 1101–1105 (1983), das eine Catechol-Dioxygenase codiert, die chromogene Brenzkatechine umwandeln kann, ein α-Amylase-Gen (Ikatu et al., Bio/Technol. 8: 241–242 (1990)), ein Tyrosinase-Gen (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129: 2703–2714 (1983)), das ein Enzym codiert, das Tyrosin zu DOPA und Dopachinon oxidieren kann, welches wiederum zu Melanin kondensiert, Grünes Fluoreszentes Protein (Elliot et al., Plant Cell Rep. 18: 707–714 (1999)) und eine α-Galactosidase.
Mitumfasst von den Ausdrücken "selektierbare oder als Kriterium beim Screening verwendbare Marker-Gene" sind auch Gene, die einen sezernierbaren Marker codieren, dessen Sekretion als Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von transformierten Zellen nachgewiesen werden kann. Beispiele dafür sind Marker, die ein sezernierbares Antigen codieren, das durch Wechselwirkung mit einem Antikörper identifiziert werden kann, oder sogar sezernierbare Enzyme, die katalytisch nachgewiesen werden können. Sezernierbare Proteine fallen in mehrere Klassen, einschließlich kleiner diffusionsfähiger Proteine, die (z.B. durch ELISA) nachweisbar sind, kleine aktive Enzyme, die in der extrazellulären Lösung nachweisbar sind (z.B. α-Amylase, β-Lactamase, Phosphinothricin-Transferase), oder Proteine, die in die Zellwand eingeführt oder dort eingefangen werden (wie Proteine, die eine Leadersequenz enthalten, wie diejenige, die man bei der Expressionseinheit der Verlängerung oder Tabak-PR-S findet). Weitere mögliche selektierbare und/oder als Kriterium beim Screening verwendbare Marker-Gene werden dem Fachmann geläufig sein.
Es gibt viele Verfahren, um transformierende Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen einzuführen. Zu den geeigneten Verfahren gehören vermutlich praktisch alle Verfahren, die sich als effektiv beim Einführen der Nucleinsäuremoleküle in eine Pflanzenzelle erwiesen haben, wie etwa durch Agrobacterium-Infektion oder direkte Abgabe von Nucleinsäuremolekülen.
Vier allgemeine Verfahren für die direkte Abgabe eines Gens in Zellen wurden beschrieben: (1) chemische Verfahren (Graham et al., Virology 54: 536–539 (1973); (2) physikalische Verfahren, wie Mikroinjektion (Capecchi, Cell 22: 479–488 (1980); Elektroporation (Wong et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584–587 (1982); Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 5824–5828 (1985); ( US 5,384,253 ); und die Genkanone (Johnston et al, Methods Cell Biol. 43: 353–365 (1994); (3) virale Vektoren (Clapp, Clin. Perinatol. 20: 155–168 (1993); Lu et al., J. Exp. Med. 178: 2089–2096 (1993); Eglitis et al., Biotechniques 6: 608–614 (1988); und (4) rezeptorvermittelte Mechanismen (Curie) et al., Hum. Gen. Ther. 3: 147–154 (1992), Wagner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 6099–6103 (1992).
Zu den Beschleunigungsverfahren, die verwendet werden können, gehören zum Beispiel die Mikroprojektil-Bombardierung und dergleichen. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Abgabe von transformierenden Nucleinsäuremolekülen an Pflanzenzellen ist die Mikroprojektil-Bombardierung. Eine Übersicht über dieses Verfahren gibt es von Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Nichtbiologische Teilchen (Mikroprojektile) können mit Nucleinsäuren überzogen und durch eine Antriebskraft in Zellen abgegeben werden. Beispielhafte Teilchen sind solche, die aus Wolfram, Gold, Platin und dergleichen bestehen. Ein besonderer Vorteil der Mikroprojektil-Bombardierung, außer dass es sich um ein effektives Mittel zum reproduzierbaren Transformieren von Einkeimblättrigen handelt, besteht darin, dass weder die Isolierung von Protoplasten (Cristou et al., Plant Physiol. 87: 671–674 (1988)) noch die Empfänglichkeit für eine Agrobacterium-Infektion erforderlich sind. Eine beispielhafte Ausführungsform eines Verfahrens zur Abgabe von DNA in Zea-mays-Zellen durch Beschleunigung ist ein Biolistik-α-Teilchen-Abgabesystem, das verwendet werden kann, um mit DNA beschichtete Teilchen durch ein Sieb, wie ein Edelstahl- oder Nytex-Sieb, auf eine Filteroberfläche zu treiben, die mit in Suspension kultivierten Maiszellen bedeckt ist. Gordon-Kamm et al. beschreiben das grundlegende Verfahren zur Beschichtung von Wolframteilchen mit DNA (Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990)). Das Sieb dispergiert die Wolfram-Nucleinsäure-Teilchen, so dass sie nicht in großen Aggregaten an die Empfängerzellen abgegeben werden. Ein Teilchenabgabesystem, das zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist die Helium-Beschleunigungs-PDS-1000/He-Kanone, die von Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien) erhältlich ist (Sanford et al., Technique 3: 3–16 (1991)).
Für die Bombardierung können in Suspension befindliche Zellen auf Filtern konzentriert werden. Filter, die die zu bombardierenden Zellen enthalten, werden in einem geeigneten Abstand unterhalb der Mikroprojektil-Abstoppplatte positioniert.
Falls gewünscht, werden auch ein oder mehrere Siebe zwischen der Kanone und den zu bombardierenden Zellen positioniert.
Alternativ dazu können auch unreife Embryos oder andere Targetzellen auf einem festen Kulturmedium angeordnet sein. Die zu bombardierenden Zellen werden in einem geeigneten Abstand unterhalb der Mikroprojektil-Abstoppplatte positioniert. Falls gewünscht, werden auch ein oder mehrere Siebe zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu bombardierenden Zellen positioniert. Durch die Verwendung der hier dargelegten Techniken kann man bis zu 1000 oder mehr Brennpunkte von Zellen erhalten, die ein Marker-Gen transient exprimieren. Die Zahl der Zellen in einem Brennpunkt, die 48 Stunden nach der Bombardierung das exogene Genprodukt exprimieren, liegt häufig in einem Bereich von eins bis zehn und im Mittel eins bis drei.
Bei der Bombardierungstransformation kann man die Kulturbedingungen vor der Bombardierung und die Bombardierungsparameter optimieren, um die maximale Anzahl von stabilen Transformanten zu erhalten. Sowohl die physikalischen als auch die biologischen Parameter für die Bombardierung sind bei dieser Technologie wichtig. Physikalische Faktoren sind solche, die die Manipulation des DNA-Mikroprojektil-Präzipitats beinhalten, oder solche, die den Flug und die Geschwindigkeit entweder der Makro- oder der Mikroprojektile beeinflussen. Biologische Faktoren beinhalten alle Schritte, die bei der Manipulation von Zellen vor und unmittelbar nach der Bombardierung beteiligt sind, die osmotische Anpassung von Targetzellen, um die Linderung der mit der Bombardierung verbundenen Verletzung zu unterstützen, und auch die Natur der transformierenden DNA, wie linearisierte DNA oder intakte, zu Superspiralen gewundene Plasmide. Manipulationen vor der Bombardierung sind für die erfolgreiche Transformation von unreifen Embryos vermutlich besonders wichtig.
In einer anderen alternativen Ausführungsform können Plastide stabil transformiert werden. Zu den Verfahren, die für die Plastidentransformation bei höheren Pflanzen offenbart sind, gehören die Abgabe von DNA, die einen Selektionsmarker enthält, mit der Teilchenkanone und die Zielsteuerung der DNA zum Plastidenge nom durch homologe Rekombination (Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 87: 8526–8530 (1990); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 90: 913–917 (1993); Staub et al., EMBO J. 12: 601–606 (1993)), sowie die Verfahren, die in US-Patent Nr. 5,451,513, US-Patent Nr. 5,545,818, US-Patent Nr. 5,877,402, US-Patent Nr. 5,932,479 und WO 99/05265 offenbart sind.
Dementsprechend wird in betracht gezogen, dass man möglicherweise verschiedene Aspekte der Bombardierungsparameter bei in kleinem Maßstab durchgeführten Studien anpassen möchte, um die Bedingungen voll zu optimieren. Man könnte insbesondere wünschen, physikalische Parameter, wie den Lückenabstand, die Flugstrecke, den Gewebeabstand und den Heliumdruck, anzupassen. Man kann auch die Verletzungsreduktionsfaktoren minimieren, indem man Bedingungen modifiziert, die den physiologischen Zustand der Empfängerzellen beeinflussen und die daher die Transformations- und Integrationseffizienz beeinflussen können. Zum Beispiel können der osmotische Zustand, die Gewebehydratisierung und das Subkulturstadium oder der Zellcyclus der Empfängerzellen im Sinne einer optimalen Transformation angepasst werden. Die Durchführung anderer routinemäßiger Anpassungen wird dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
Die durch Agrobacterium vermittelte Übertragung ist ein breit anwendbares System für die Einführung von Genen in Pfanzenzellen, da die DNA so in ganze Pflanzengewebe eingeführt werden kann, wodurch man die Notwendigkeit der Regeneration einer intakten Pflanze aus einem Protoplasten umgeht. Die Verwendung von durch Agrobacterium vermittelten Pflanzenintegrationsvektoren, um DNA in Pflanzenzellen einzuführen, ist in der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel die Verfahren, die von Fraley et al., Bio/Technology 3: 629–635 (1985), und Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253–277 (1987), beschrieben wurden. Weiterhin ist die Integration der T-DNA ein relativ präziser Vorgang, der nur zu wenigen Umlagerungen führt. Der zu übertragende DNA-Bereich ist durch die Randsequenzen definiert, und die dazwischenliegende DNA wird gewöhnlich in das Pflanzengenom eingebaut, wie es beschrieben ist (Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 34 (1986)).
Moderne Agrobacterium-Transformationsvektoren sind zur Replikation in E. coli sowie in Agrobacterium befähigt, was bequeme Manipulationen ermöglicht, wie es beschrieben ist (Klee et al. in: Plant DNA Infectious Agents, Hohn und Schell (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 179–203 (1985)). Außerdem haben technologische Fortschritte bei Vektoren für die durch Agrobacterium vermittelte Gen-Übertragung die Anordnung von Genen und Restriktionsstellen in den Vektoren verbessert, was den Aufbau von Vektoren, die zum Exprimieren verschiedener Polypeptid-codierender Gene befähigt sind, erleichtert. Die beschriebenen Vektoren weisen bequeme Multilinker-Bereiche auf, die von einem Promotor und einer Polyadenylierungsstelle für die direkte Expression von eingesetzten Polypeptid-codierenden Genen flankiert sind und für die vorliegenden Zwecke geeignet sind (Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253–277 (1987). Außerdem kann Agrobacterium, das sowohl funktionelle als auch unschädlich gemachte (disarmed) Ti-Gene enthält, für die Transformationen verwendet werden. In denjenigen Pflanzenvarietäten, bei denen eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation effizient ist, ist sie wegen der leichten und definierten Natur der Genübertragung das Verfahren der Wahl.
Eine transgene Pflanze, die unter Verwendung von Agrobacterium-Transformationsverfahren gebildet wurde, enthält typischerweise einen einzigen genetischen Locus auf einem einzigen Chromosom. Solche transgenen Pflanzen können als hemizygot für das hinzugefügte Gen bezeichnet werden. Besonders bevorzugt ist eine transgene Pflanze, die homozygot in Bezug auf das hinzugefügte strukturelle Gen ist, d.h. eine transgene Pflanze, die zwei hinzugefügte Gene enthält, jeweils ein Gen auf demselben Locus jedes Chromosoms eines Chromosomenpaars. Eine homozygote transgene Pflanze kann erhalten werden, indem man eine unabhängige segregante transgene Pflanze, die ein einziges hinzugefügtes Gen enthält, geschlechtlich mit sich selbst paart (Selbstbestäubung), einige der erzeugten Samen keimen lässt und die resultierenden Pflanzen auf das interessierende Gen hin analysiert.
Man sollte sich auch darüber im Klaren sein, dass auch zwei verschiedene transgene Pflanzen miteinander gepaart werden können, wobei Nachkommen entstehen, die zwei unabhängig segregierende exogene Gene enthalten. Durch Selbstbestäubung von geeigneten Nachkommen können Pflanzen entstehen, die in Bezug auf beide exogenen Gene homozygot sind. Die Rückkreuzung mit einer Elternpflanze und die Kreuzung mit einer nicht verwandten, nichttransgenen Pflanze werden ebenfalls in betracht gezogen, ebenso wie vegetative Vermehrung. Beschreibungen anderer Zuchtverfahren, die üblicherweise für verschiedene Eigenschaften und Kulturpflanzen verwendet werden, findet man bei Fehr in: Breeding Methods for Cultivar Development, J. Wilcox (Hrsg.), American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
Die Transformation von Pflanzenprotoplasten kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf Calciumphosphat-Fällung, Polyethylenglycol-Behandlung, Elektroporation und Kombinationen dieser Behandlungen beruhen (siehe z.B. Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193–200 (1986); Lorz et al., Mol, Gen. Genet. 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature 319: 791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet. 204: 204 (1986); Marcotte et al., Nature 335: 454–457 (1988). Die Anwendung dieser Systeme auf verschiedene Pflanzenvarietäten hängt von der Möglichkeit ab, diesen besonderen Pflanzenstamm aus Protoplasten zu regenerieren. Beispielhafte Verfahren zur Regeneration von Getreiden aus Protoplasten sind beschrieben (Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters 2: 74 (1985); Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep. 4: 85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology 4: 1087 (1986)).
Andere Verfahren der Zelttransformation können ebenfalls verwendet werden; dazu gehören unter anderem die Einführung von DNA in Pflanzen durch direkte DNA-Übertragung in Pollen (Hess et al., Intern. Rev. Cytol. 107: 367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter 6: 165 (1988); durch direkte Injektion von DNA in die Reproduktionsorgane einer Pflanze (Pena et al., Nature 325: 274 (1987)); oder durch direkte Injektion von DNA in die Zellen von unreifen Embryos und anschließende Rehydratisierung von eingetrockneten Embryos (Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987).
Die Regeneration, Entwicklung und Kultivierung von Pflanzen aus einzelnen Pflanzenprotoplasten-Transformanten oder aus verschiedenen transformierten Explantaten ist in der Technik wohlbekannt (Weissbach et al. in: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA (1988). Dieser Regenerations- und Wachstumsvorgang beinhaltet typischerweise die Schritte der Selektion von transformierten Zellen, der Kultivierung dieser individualisierten Zellen durch die üblichen Stadien der Embryonalentwicklung hindurch und durch das Stadium des bewurzelten Pflänzchens hindurch. Transgene Embryos und Samen werden ähnlich regeneriert. Die resultierenden transgenen bewurzelten Schösslinge werden danach in ein geeignetes Pflanzenwachstumsmedium, wie Erde, gepflanzt.
Die Entwicklung oder Regeneration von Pflanzen, die das exogene Gen (Fremd-Gen) enthalten, ist in der Technik wohlbekannt. Vorzugsweise werden die regenerierten Pflanzen einer Selbstbestäubung unterzogen, um homozygote transgene Pflanzen zu erhalten. Ansonsten wird Pollen, der von den regenerierten Pflanzen erhalten wird, mit aus Samen aufgezogenen Pflanzen von agronomisch wichtigen Linien gekreuzt. Umgekehrt wird Pollen von Pflanzen dieser wichtigen Linien verwendet, um regenerierte Pflanzen zu bestäuben. Eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, die eine gewünschte exogene Nucleinsäure enthält, wird mit Hilfe von Verfahren kultiviert, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Verfahren zum Transformieren von Zweikeimblättrigen, primär durch Verwendung von Agrobacterium tumefaciens, und die Gewinnung von transgenen Pflanzen wurden veröffentlicht für Baumwolle (US-Patent Nr. 5,004,863, US-Patent Nr. 5,159,135, US-Patent Nr. 5,518,908), Sojabohne (US-Patent Nr. 5,569,834, US-Patent Nr. 5,416,011, McCabe et. al., Bio/Technology 6: 923 (1988), Christou et al, Plant Physiol. 87: 671–674 (1988)), Brassica ( US 5,463,174 ), Erdnuss (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653–657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14: 699–703 (1995)) and Erbse (Grant et al., Plant Cell Rep. 15: 254–258, (1995)).
Die Transformation von Einkeimblättrigen mit Hilfe von Elektroporation, Teilchenbombardierung und Agrobacterium wurde ebenfalls beschrieben. Transformation und Pflanzenregeneration wurden erreicht bei Spargel (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 5354–5349 (1987)), Gerste (Wan et al., Plant Physiol. 104: 37–48 (1994)), Zea mays (Rhodes et al., Science 240: 204–207 (1988), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990), Fromm et al., Bio/Technology 8: 833–839 (1990), Koziel et al., Bio/Technology 11: 194–200 (1993), Armstrong et al, Crop Science 35: 550–557 (1995)), Hafer (Somers et al., Bio/Technology 10: 1589–1594 (1992)), Knäuelgras (Horn et al., Plant Cell Rep. 7: 469–472 (1988)), Reis (Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34- (1986), Part et al., Plant Mol. Biol. 32: 1135–1148 (1996), Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24: 133–141 (1997), Bartraw et al, Plant Mol. Biol. 15: 527–538 (1990), Christou et al., Bio/Technology 9: 957–962 (1991)), Roggen (De la Pena et al., Nature 325: 274–276 (1987)), Zuckerrohr (Bower et al., Plant J. 2: 409–416 (1992)), Rohrschwingel (Wang et al., Bio/Technology 10: 691–696 (1992)) und Weizen (Vasil et al., Bio/Technology 10: 667–674 (1992), US-Patent Nr. 5,631,152).
Assays für die Genexpression auf der Basis der transienten Expression von klonierten Nucleinsäurevektoren wurden entwickelt durch die Einführung der Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen durch Polyethylenglycol-Behandlung, Elektroporation oder Teilchenbombardierung (Marcotte et al., Nature 335: 454–457 (1988); Marcotte et al., Plant Cell 1: 523–532 (1989); McCarty et al., Cell 66: 895–905 (1991); Hattori et al., Genes Dev. 6: 609–618 (1992); Goff et al., EMBO J. 9: 2517–2522 (1990). Transiente Expressionssysteme können verwendet werden, um Genkonstrukte funktionell zu zerschneiden (siehe allgemein Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Es ist klar, dass beliebige der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung permanent oder transient in Kombination mit anderen genetischen Elementen, wie Promotoren, Leadersequenzen, Transitpeptid-Sequenzen, Enhancern, Introns, 3'-untranslatierten Bereichen und anderen Elementen, die dem Fachmann bekannt und zur Steuerung der transgenen Expression in Pflanzen geeignet sind, in eine Pflanzenzelle eingeführt werden können.
Es wurde gezeigt, dass Eleusine indica mit Eleusine coracana (Fingerhirse), einer wichtigen Kulturhirse in Indien und Ostafrika, hybridisiert (Chennaveeraiah et al., Euphytica 2–3: 489–495 (1974)). Klassische Pflanzenzuchtverfahren können verwendet werden, um das Gen und den glyphosattoleranten Phänotyp auf Kulturpflanzen innerhalb der Familie der Poaceae zu übertragen. Die DNA-Moleküle des EPSPS-Glyphosat-Resistenz-Gens von E. indica (SEQ ID Nr. 6) können als Sonde verwendet werden, um andere, ähnliche DNA-Moleküle durch Standardverfahren zu identifizieren. Oligonucleotid-DNA-Moleküle, die zu dem EPSPS-Glyphosat-Resistenz-Gen von E. indica homolog oder komplementär sind, können in einem markergestützten Zuchtverfahren verwendet werden (Simple sequence repeat DNA marker analysis, in "DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173–185, Cregan et al. (Hrsg.) Wiley-Liss NY), das das Einzüchten dieses Gens in verwandte und heterologe Kulturpflanzenspezies unterstützt.
Außer den oben diskutierten Verfahren sind in der Praxis Erfahrene mit den Standard-Ressourcenmaterialien vertraut, die die speziellen Bedingungen und Verfahren zum Aufbau, zur Manipulation und Isolierung von Makromolekülen (z.B. DNA-Moleküle, Plasmide usw.), die Erzeugung von rekombinanten Organismen und die Suche nach Klonen durch Screening und deren Isolierung beschreiben (siehe zum Beispiel Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, New York (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, New York (1998); Clark et al., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Springer, New York (1997); und Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego (1990).
Pflanzenspezies, die ein natürlich vorkommendes EPSPS-Enzym enthalten, das resistent gegenüber Glyphosat ist, wurden bisher nicht beschrieben. Der Gegenstand dieser Erfindung ist das aus Eleusine indica isolierte EPSPS-Enzym, von dem gezeigt wurde, dass es resistent gegenüber Glyphosat ist, und die Expression des DNA-Moleküls, das dieses EPSPS-Enzym codiert, in anderen Pflanzen, so dass diesen Empfängerpflanzen dann die Glyphosattoleranz verliehen wird. Das aus dem glyphosattoleranten Biotyp von Eleusine indica isolierte glyphosatresistente EPSPS-Enzym hat ein neues K_m in Bezug auf die Bindung von PEP im Vergleich zu anderen Pflanzen-EPSPS, die durch eine Substitution von Prolin durch Serin im aktiven Zentrum des Enzyms im Sinne einer Glyphosatresistenz modifiziert wurden. Das K_m für PEP des glyphosatresistenten Enzyms von E. indica ist gegenüber dem glyphosatempfindlichen EPSPS-Enzym von E. indica nur wenig verändert. Außerdem stammt dieses Gen aus einer Einkeimblättrigen Pflanze und benötigt daher möglicherweise keine Modifikation der Nucleinsäuresequenz, um die Expression in transgenen Einkeimblättrigen Kulturpflanzen zu beeinflussen. Die Aminosäuresequenz des glyphosattoleranten EPSPS-Enzyms von E. indica kann durch eine ortsspezifische Mutation so modifiziert werden, dass es andere bekannte Substitutionen beinhaltet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Teile der Pflanzen der vorliegenden Erfindung bereit. Zu den Pflanzenteilen gehören unter anderem Samen, Endosperm, Samenanlage und Pollen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Pflanzenteil ein Samen.
Die folgenden Beispiele sind mit aufgenommen, um Beispiele für bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung aufzuzeigen. Der Fachmann sollte sich darüber im Klaren sein, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Ansätze darstellen, von denen die Erfinder herausgefunden haben, dass sie bei der praktischen Ausführung der Erfindung gut funktionieren, und diese können daher als Beispiele für bevorzugte praktische Ausführungsweisen derselben gelten. Der Fachmann sollte jedoch im Lichte der vorliegenden Offenbarung anerkennen, dass vielerlei Veränderungen in den speziellen offenbarten Ausführungsformen vorgenommen werden können und man dennoch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhält, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen. Auf alle hier zitierten Literaturstellen wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Samen von glyphosattoleranten Eleusine-indica-Pflanzen wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd, Manassas, Virginia, USA, 20110–2209) hinterlegt und erhielten die ATCC-Nr. PTA-2177. Die Hinterlegung wird 30 Jahre lang oder 5 Jahre nach dem letzten Antrag oder während der Wirkungsdauer des Patents, je nachdem, was länger dauert, im Depot aufrechterhalten und während dieser Zeit ersetzt, falls es notwendig ist.
Beispiel 1
Glyphosattolerante Eleusine-indica-Pflanzen wurden an einer Stelle in der Nähe von Johor, Malaysia, gesammelt. Glyphosattolerante Biotypen von E. indica werden identifiziert und nummeriert. Von jedem Biotyp werden Samen gesammelt und im Treibhaus in Töpfe gepflanzt. Von jeder Pflanze werden Klone erzeugt, indem man 10–20 Schösslinge herausschneidet und diese in getrennte Töpfe verpflanzt. Dann werden glyphosatempfindliche und -tolerante einzelne Pflanzen durch Behandlung mit Glyphosat in einer Menge von entweder 0,5 kg Wirkstoff (WS)/Hektar (ha) oder 2,0 kg WS/ha identifiziert. Ein entsprechender Klon des glyphosattoleranten und glyphosatempfindlichen E.-indica-Biotyps wird unbehandelt gelassen. Diese Klone werden als Quelle für frisches Gewebe für die Enzymanalyse und Genisolierung verwendet.
Der Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus dem glyphosattoleranten E.-indica-Biotyp und dem glyphosatempfindlichen E.-indica-Biotyp erfolgt durch Isolierung von Gesamt-RNA aus den Wurzelhalsgeweben. Die Wurzelhalsgewebe werden aus den Pflanzen herausgeschnitten, dann mit flüssigem Stickstoff blitzgefrieren gelassen und auf –80°C gehalten, bis sie benötigt wurden. Gesamt-RNA wird aus gefrorenen Wurzelhalsproben extrahiert, indem man den RNeasy Plant Mini Kit (Kat.-Nr. 74904, Qiagen Inc., Valencia, CA) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Mit Oligo-dT als Primer behandelte cDNAs des ersten Strangs werden aus 5-μg-Proben von Gesamt-RNA hergestellt, wobei man das Superscript Pre-Amplification System (Kat.-Nr. 18089-011, Life Technologies, Rockville, MD) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Zwei μl der cDNA des ersten Strangs werden dann verwendet, um durch Polymerase-Kettenreaktion partielle E.-indica-EPSP-Synthase-cDNAs zu erzeugen, wobei man eine Modifikation der "Touchdown-PCR"-Technik verwendet (Don et al., Nucl. Acids Res. 19: 4008, 1991). Degenerierte Oligonucleotid-Pools von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 werden in einer Endkonzentration von 25 μM zu einer 50-μl-RT-PCR-Reaktion gegeben.
5'-TNWSNGTNGARGCNGAYAARGT-3' (SEQ ID NO: 1)
5'-GCCATNGCCATNCKRTGRTCRTC-3' (SEQ ID NO: 2)
Dann wurden PCR-Amplifikationen durchgeführt, wobei man das Expand High Fidelity PCR System (Kat.-Nr. 1 732 641, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Ein thermisches Profil von 94°C während 20 Sekunden, dann 60°C während 1 Minute und dann 72°C während 1 Minute 30 Sekunden wird für die ersten 30 Cyclen verwendet, wobei die Reassoziationstemperatur um 0,5°C pro Cyclus gesenkt wird. Daraufhin folgen 10 zusätzliche Cyclen von 94°C während 20 Sekunden, 45°C während 1 Minute, dann 72°C während 1 Minute 30 Sekunden.
Dann werden die RT-PCR-Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt, wobei man einen QIAquick Gel Extraction Kit (Kat.-Nr. 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) verwendet, und dann direkt in den pCR2.1-TOPO-Vektor einkloniert (Kat.-Nr. K4500-40, Invitrogen, Carlsbad, CA). Die Identität der klonierten RT-PCR-Produkte wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt (ABI Prism^TM 377, Perkin Elmer, Foster City, CA).
Der Rest des 3'-Endes des EPSP-Synthase-codierenden Bereichs wird unter Verwendung des 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Kat.-Nr. 18373-027, Life Technologies, Rockville, MD) erzeugt, wobei man das genspezifische Oligonucleotid der SEQ ID Nr. 3 verwendet. Die cDNA wird nach den Angaben des Herstellers hergestellt, wobei man 5 μg Gesamt-RNA verwendet, die aus Wurzelhalsgeweben isoliert wurde, wie es oben beschrieben ist,
5'-GTGAAAGCAGAGCATTCTGATAGC-3' (SEQ ID NO: 3)
PCR-Amplifikationen werden in 50-μl-Reaktionen durchgeführt, die 5 μl cDNA-Reaktion des ersten Strangs, 20 pmol von jedem Primer, 10 mM TrisHCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthalten. Ein thermisches Profil von 94°C während 20 Sekunden, dann 57°C während 1 Minute und dann 72°C während 1 Minute 30 Sekunden wird in 35 Cyclen verwendet. Die Identität der 3'-RACE-Produkte wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt (ABI Prism^TM 377, Perkin Elmer, Foster, CA).
Der Rest des 5'-Endes des codierenden Bereichs für das reife Protein der E.-indica-EPSP-Synthase wird unter Verwendung des SMART RACE cDNA Amplification Kit (Kat.-Nr. K1811-1, Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) erzeugt, wobei man die genspezifischen Oligonucleotide der SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 verwendet. Die cDNA wird nach den Angaben des Herstellers hergestellt, wobei man 150 ng PolyA⁺-mRNA, die aus Wurzelhalsgeweben isoliert wurde, verwendet, wobei man einen Oligotex mRNA Midi Kit (Kat.-Nr. 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) verwendet.
5'-GGCTGCTGTCAATGTCGCATTGCAGTTCC-3' (SEQ ID NO: 4)
5'-CTCTTTCGCATCCTTCTCAACTGGGAACTTGC-3' (SEQ ID NO: 5)
PCR-Reaktionen werden so durchgeführt, wie es vom Hersteller empfohlen wird, außer dass das Expand High Fidelity PCR System (Kat.-Nr. 1 732 641, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) verwendet wird und bei allen Reaktionen DMSO in einer Endkonzentration von 5,0% mitverwendet wird, um die Amplifikation von GC-reichen Sequenzen zu erleichtern. Das in SEQ ID Nr. 4 beschriebene synthetische DNA-Oligonucleotid wird in den primären Amplifikationen verwendet, dann werden Amplifikationen der zweiten Runde ("nested") durchgeführt, wobei man das in SEQ ID Nr. 5 beschriebene Oligonucleotid mit einem 1-μl-Aliquot einer 1:100-Verdünnung der primären PCR-Reaktionen verwendet. Die Identität der 5'-RACE-Produkte wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt (ABI Prism^TM 377, Perkin Elmer, Foster City, CA).
Die signifikante Überlappung von Sequenzen, die durch RT-PCR, 3' RACE und 5' RACE erzeugt werden, ermöglicht das eindeutige Zusammenfügen der Sequenzen zu einer einzigen DNA-Sequenz, die das gesamte offene Leseraster für das reife Protein enthält, wobei man das Softwarepaket SEQMan II (DNASTAR Inc., Madison, WI) verwendet. Die DNA-Sequenz, die dem das reife Protein codierenden Bereich des EPSP-Synthase-Gens von Eleusine indica (glyphosattoleranter Biotyp) entspricht (SEQ ID Nr. 6), ist in 1 gezeigt.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz für den das reife Protein codierenden Bereich des EPSP-Synthase-Gens von Eleusine indica (glyphosattoleranter Biotyp) für dieses Protein (SEQ ID Nr. 7) ist in 2 gezeigt.
Beispiel 2
Das EPSP-Synthase-Enzym aus dem glyphosattoleranten E.-indica-Biotyp verleiht transgenem E. coli eine erhöhte Glyphosattoleranz. E. coli ist als heterologes Expressionssystem zum Testen von glyphosatresistenten Enzymen geeignet. Die aus dem glyphosattoleranten und dem glyphosatempfindlichen E.-indica-Biotyp isolierten, das reife Protein der EPSP-Synthase codierenden Bereiche können direkt in Bezug auf ihre Fähigkeit, transgenen Wirten Glyphosattoleranz zu verleihen, miteinander verglichen werden. E. coli (Stamm SR481) werden mit dem Gen für glyphosatresistentes EPSPS (Ei.EPSPS:glyR) und dem Gen für glyphosatempfindliches EPSPS (Ei.EPSPS:glyS), die aus E. indica gereinigt wurden, transformiert. Der Unterschied in der Wachstumsrate von transformierten Zelllinien, die in Gegenwart von im Kulturmedium enthaltenem Glyphosat gezüchtet wurden, wird als Maß für die Resistenz des EPSPS-Enzyms gegenüber den hemmenden Wirkungen von Glyphosat verwendet (Rogers et al., Appl. Enviro. Microbiol. 46: 37–43 (1983)). Ein geeigneter E.-coli-Expressionsvektor, der die native Promotor- und Operatorsequenz aus dem lac-Operon von E. coli (Dickson et al., Science 187: 27–35 (1975)) einschließlich der Sequenz
5'-AGATCTCCTAGGGCTTAATTAATTAAGCACTAGTCACACAGG AGGTAATTCATATG- 3' (SEQ ID NO:8)
trägt, ist in pMON45337 enthalten. Diese Nucleotidsequenz beinhaltet 1) flankierende BglII- und NdeI-Endonuclease-Stellen, 2) eine Ribosomen-Bindungsstelle und 3) einen unstrukturierten Bereich 5' vom Ribosomen-Bindungselement (Balbas, P. et al., in "Methods in Enzymology" (D.V. Goeddel (Hrsg.) 185: 15–37, 1990). Sie wurde durch Ligierung eingefügt, um die Expression und Klonierung am ATG-Startcodon eines offenen Leserasters zu erleichtern. Eine mehrfache Klonierungsstelle befindet sich unmittelbar stromabwärts dieser NdeI-Stelle, und dann folgt das rho-unabhängige Transcriptionsterminatorelement des E.-coli-trpA-Gens (T. Sato et al., J. Biochem. (Tokyo), 101: 525–534 (1987)). Wenn dieser Vektor die EPSP-Synthase codierenden Sequenzen der vorliegenden Erfindung operabel enthält, wird für die induzierbare Expression von cDNAs für glyphosatresistente und glyphosatempfindliche EPSP-Synthase in E. coli verwendet. Auch andere kommerziell erhältliche induzierbare E.-coli-Expressionsvektoren sind zum Testen der EPSP-Synthasen aus E. indica geeignet.
DNA-Manipulationen und Transformationen von E. coli werden gemäß Standardverfahren durchgeführt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)). Um E.-coli-Expressionsvektoren aufzubauen, die die das reife Protein von EPSP-Synthase codierenden Sequenzen aus dem toleranten und dem empfindlichen E.-indica-Biotyp tragen, werden die Oligonucleotid-Primer von SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10 verwendet.
5'- GCAATTCCATATGGCGGGCGCGGAGGAGGTGGTGCT – 3' (SEQ ID NO: 9)
5'-GACTAGGAATTCTTAGTTCTTTTGACGAAAGTGCTCAGCACGTCGAAG-3' (SEQ ID NO: 10)
Diese Sequenzen werden in RT-PCR-Reaktionen eingesetzt, um Expressionscassetten zu erzeugen, die zum Einklonieren in pMON45337, das mit den Restriktionsenzymen NdeI und EcoRI aufgeschnitten wurde, geeignet sind. RT-PCR-Reaktionen werden mit Gesamt-RNA durchgeführt, die aus eingefrorenen Wurzelhalsproben extrahiert wurde, wobei man den RNeasy Plant Mini Kit (Kat.-Nr. 74904, Qiagen Inc., Valencia, CA) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Mit Oligo-dT als Primer behandelte cDNAs des ersten Strangs werden aus 5-μg-Proben von Gesamt-RNA hergestellt, wobei man das Superscript Pre-Amplification System (Kat.-Nr. 18089-011, Life Technologies, Rockville, MD) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Zwei μl der cDNA des ersten Strangs werden dann verwendet, um durch Polymerase-Kettenreaktion E.-indica-EPSP-Synthase-Expressionscassetten zu erzeugen. Die Oligonucleotide werden in einer Endkonzentration von 0,4 μM in 50-μl-RT-PCR-Reaktionen gegeben. Dann werden PCR-Amplifikationen durchgeführt, wobei man das Expand High Fidelity PCR System (Kat.-Nr. 1 732 641, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet und ein thermisches Profil von 94°C während 30 Sekunden, dann 57°C während 2 Minuten und dann 75°C während 3 Minuten für insgesamt 35 Cyclen verwendet. Die resultierenden PCR-Produkte werden mit NdeI und EcoRI abgebaut, dann in pMON45337 ligiert, was zu den E.-coli-Expressionsvektoren pMON45364 (5) und pMON45365 (6) führt, die den das reife Protein codierenden Bereich für E.-indica-EPSP-Synthase enthalten, der aus dem resistenten bzw. dem empfindlichen Biotyp isoliert wurde. Die Expression der beiden Enzyme in E. coli wird also vom Lac-Operon und genetischen Elementen des trpA-Gens, die oben für pMON45337 beschrieben wurden, gesteuert. Die Richtigkeit der klonierten Sequenzen wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt (ABI Prism^TM 377, Perkin Elmer, Foster City, CA). pMON45337, pMON45364 und pMON45365 werden alle durch Transformation in den E.-coli-Stamm SR481 eingeführt, einen aroA-negativen Stamm, dem die endogene EPSP-Synthase-Aktivität fehlt (Padgette et al., Arch. Biochem. Biophys. 258: 564–573 (1987)).
Um die Glyphosattoleranz von aroA-negativen E.-coli-Zellen, die das aus dem glyphosatempfindlichen E.-indica-Biotyp isolierte EPSP-Synthase-Gen exprimieren, direkt mit Zellen zu vergleichen, die das aus dem glyphosattoleranten Biotyp isolierte EPSP-Synthase-Gen exprimieren, werden die Wachstumsraten für die beiden Zelllinien in Gegenwart von steigenden Glyphosatkonzentrationen miteinander verglichen (3). Wachstumsraten werden auch für E.-coli-SR481-Zellen, die mit pMON45337 (leerer Vektor) transformiert sind, in Abwesenheit von Glyphosat als negative Kontrolle überwacht. Frische Über-Nacht-Kulturen von E.-coli-SR481-Zellen, die mit pMON45337, pMON45364 (Ei.EPSPS:glypR) und pMON45365 (Ei.EPSPS:glypS) transformiert sind, werden in Terrific Broth (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)) gezüchtet, die mit 1,0 mM IPTG, 50 μg/ml Ampicillin und jeweils 100 μg/ml L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan ergänzt war. OD₅₉₅-Messungen werden an allen Über-Nacht-Kulturen vorgenommen, um gleiche Zelldichten zu bestätigen. Für E.-coli-SR481-pMON45364- und -SR481-pMON45365-Zellen wurden 14-ml-Kulturröhrchen (Kat.-Nr. 60818–725, VWR Scientific, West Chester, PA), die jeweils 3,0 ml M9-Minimalmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)) enthielten, das mit 50 μg/ml Ampicillin, 1,0 mM IPTG und entweder 0,0, 0,5, 1,5 oder 5,0 mM Glyphosat (N-Phosphonomethylglycin oder ein Salz davon) ergänzt war, mit 100 μl unverdünnter Über-Nacht-Kultur pro Röhrchen geimpft. Alle experimentellen Bedingungen wurden jeweils in dreifachen Parallelansätzen verwendet, um die Reproduzierbarkeit des Experiments zu bestätigen. Nach t = 0, 12, 24, 28, 32 und 48 Stunden nach dem Einsetzen des Wachstums in Minimalmedium werden 100-μl-Aliquote aus jedem Röhrchen entnommen, und sofort werden OD₅₉₅-Messungen vorgenommen. Ein typisches Ergebnis dieser Analysen ist in 3 gezeigt, wo eine Erhöhung der Glyphosattoleranz auf ungefähr das Dreifache aufgrund der Expression des EPSP-Synthase-Enzyms aus dem glyphosattoleranten E.-indica-Biotyp beobachtet wird.
Beispiel 3
Kinetische Charakterisierung der Aktivität der glyphosatresistenten EPSP-Synthase von E. indica in Pflanzen- und Bakterienextrakten. Die kinetische Charakterisierung des glyphosatresistenten E. indica-Enzyms erfolgt unter Verwendung sowohl von partiell gereinigten Pflanzenextrakten als auch Bakterienextrakten, die aus Zellen hergestellt werden, die die klonierte Sequenz auf einem geeigneten Vektor, wie pMON45365, exprimieren. Parameter, die die Resistenz des Enzyms gegenüber glyphosatvermittelter Hemmung und die Affinität zu dem Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP) beschreiben, sind von besonderem Interesse, da Glyphosat ein kompetitiver Inhibitor von EPSP-Synthase in Bezug auf PEP ist (Boocock, M. et al., FEBS Letts. 154: 127–133 (1983)).
Die Herstellung von Extrakten und radiometrische EPSP-Synthase-Assays werden unter Verwendung von Methoden in Analogie zu veröffentlichten Verfahren durchgeführt (Padgette et al., J. Biol. Chem. 266: 22364–22369 (1991)). Wurzelhalsbereiche werden aus ganzen Pflanzen ausgeschnitten, unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill pulverisiert und dann vor der Extraktion bei –80°C aufbewahrt. Homogenisate werden aus 0,5 g Gewebe pro Probe in 25 ml Extraktionspuffer (100 mM Tris·HCl, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM Benzamidin, 1 mM Dithiothreit, 1 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid·HCl, 0,1 mM Leupeptin, pH 7,4) bei 4°C unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators Modell PT3000 (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY) hergestellt. Zelltrümmer werden durch 0,2-μm-Filtration entfernt, und dann wird der resultierende Überstand konzentriert und entsalzt, wobei man eine Ultrafree-15-Zentrifugenfiltrationseinheit (Kat.-Nr. UFV2-BGC-10, Millipore Corp., Bedford, MA) verwendet. Die endgültigen Probevolumina betragen ungefähr 0,5 ml. Proteinkonzentrationen werden spektrophotometrisch bestimmt, wobei man das Proteinassayreagens von Bio-Rad (Kat.-Nr. 500-0006, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) verwendet. EPSPS-spezifische Aktivitäten werden bestimmt, indem man 10 μl Extrakt bei 25°C während 5 bis 15 min einem Assay unterzieht. (50-μl-Reaktionen beinhalten 50 mM HEPES, pH 7,0, 5 mM Kaliumfluorid, 1 mM Shikimat-3-phosphat, 0,5 mM [1-¹⁴C]-Phosphoenolpyruvat (29,0 mCi/mmol Cyclohexylammoniumsalz; Nr. CFQ10004, Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL) und 0,1 mM Ammoniummolybdat.) Die Reaktionen werden durch Zugabe von 50 μl 9:1 Ethanol : 0,1 M Essigsäure abgebrochen. Dann werden 30 μl abgebrochene Reaktion auf eine Anionenaustauschersäule des Typs Synchropak AX100 (Kat.-Nr. 942804, P.J. Cobert Associates, Inc., St. Louis, MO), die mit 0,235 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, äquilibriert worden war, injiziert und mit demselben Puffer isokratisch eluiert. Ein Radioaktivitäts-Durchflussdetektor Modell D525 (Packard Instrument Co., Downer's Grove, IL) wird verwendet, um die Erzeugung von [¹⁴C]-EPSP in der Reaktion zu bestimmen.
Zur Bestimmung der I₅₀(Glyphosat)-Werte werden die beschriebenen Assays in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von Giyphosat durchgeführt, und die resultierenden Aktivitäten werden analysiert und unter Verwendung von GraFit-Software, Version 3.0 (Erithacus Software Ltd., Staines, UK), aufgetragen. 4 zeigt Daten, die für eine typische Glyphosat-Hemmungsstudie erzeugt wurden, wobei die EPSP-Synthase-Aktivitäten, die in aus dem glyphosatempfindlichen und -toleranten E.-indica-Biotyp hergestellten Extrakten nachweisbar sind, miteinander verglichen wurden. Diese Daten zeigen den Unterschied in Bezug auf die Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat für die Aktivitäten, die in den beiden Biotypen vorhanden sind, wobei die EPSPS-Aktivität des empfindlichen Biotyps ein I₅₀(Glyphosat) von ungefähr 3,0 μM und die EPSPS des toleranten Biotyps eines von ungefähr 16 μM aufwies.
Aktivitäten der Enzyme, die aus mehreren verschiedenen toleranten und empfindlichen E.-indica-Individuen extrahiert wurden, werden in Bezug auf die Anwesenheit und Abwesenheit von 1,6 μM Glyphosat miteinander verglichen (Tabelle 1), was eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat und eine sehr geringe Variation von Pflanze zu Pflanze unter Individuen desselben Biotyps zeigt.
Tabelle 1. Prozentuale maximale EPSPS-Aktivität in Extrakten aus verschiedenen E.-indica-Individuen, die in Gegenwart von 1,6 μM Glyphosat bestimmt wurde
Ähnliche Analysen werden unter Verwendung von Extrakten durchgeführt, die aus Zellen des E.-coli-Stamms SR481 hergestellt wurden, die das klonierte empfindliche bzw. resistente EPSPS-Enzym von E. indica mit Hilfe der Expressionsvektoren pMON45365 bzw. pMON45364 exprimieren. Frische Über-Nacht-Bakterienkulturen werden bei 37°C in Terrific Broth (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)) gezüchtet, die mit 50 μg/ml Ampicillin und jeweils 100 μg/ml L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan ergänzt war. Über-Nacht-Kulturen werden verwendet, um im großen Maßstab angesetzte Kulturen, die dasselbe Medium in einer Verdünnung von 1:100 enthalten, zu impfen, dann bei 37°C unter kräftigem Schütteln bis zu einer OD₅₉₅ von 0,6 gezüchtet. Die Kultur wird durch die Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM induziert, und dann wird die Inkubation weitere 4 Stunden lang fortgesetzt. Dann werden die Zellen durch 5 Minuten Zentrifugation mit 10 000 × g sedimentiert, dann zweimal in eiskaltem 0,9%igem NaCl gewaschen. Überschüssiger Waschpuffer wird abgesaugt, und dann werden die Sedimente in flüssigem Stickstoff blitzgefrieren gelassen und vor der Verwendung bei –80°C aufbewahrt. Bakterielle Extrakte werden unter Verwendung desselben Extraktionspuffers hergestellt, wie er für Pflanzenextrakte verwendet wird, wobei 3 ml Puffer pro Gramm sedimentierte Zellen hinzugefügt wird. Die Zellen werden unter Verwendung einer French-Presse (Modell Nr. J5-598A, American Instrument Co., Silver Springs, MD) lysiert, und dann werden die Extrakte 10 Minuten lang mit 14 000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Dann werden die Überstände entsalzt, wobei man eine PD-10-Säule (Kat.-Nr. 17-0851-01, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) verwendet. EPSP-Synthase-Assays werden so durchgeführt, wie es oben für von Pflanzen stammende Extrakte beschrieben ist. Tabelle 2 zeigt ein typisches Ergebnis für bakterielle Extrakte, die das empfindliche und das resistente E.-indica-EPSP-Synthase-Enzym exprimieren, die in Anwesenheit und Abwesenheit von 1,6 μM Glyphosat bestimmt wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine ähnliche Hemmungskinetik erhalten wird, wenn diese Ergebnisse mit den jeweiligen Aktivitäten verglichen werden, die in Pflanzenextrakten nachgewiesen werden.
Tabelle 2. EPSPS-Aktivität in Extrakten von aroA-negativen Bakterien, die mit pMON45364 bzw. pMON45365 transformiert wurden, in Anwesenheit und Abwesenheit von Glyphosat
Beispiel 4
Die Verwendung des Gens für die glyphosatresistente EPSP-Synthase von E. indica (Ei.EPSPS:glypR) für die Entwicklung von glyphosattoleranten Kulturpflanzen beinhaltet den Aufbau von Pflanzentransformationsvektoren, die eine geeignete Kombination von genetischen Elementen beinhalten, die notwendig sind, um in Zielgeweben ausreichende Expressionsniveaus zu steuern. Eine geeignete Wahl für Einkeimblättrige Kulturpflanzen wäre ein Einkeimblättrigen-Vektor, der eine Pflanzenexpressionscassette verwendet, welche einen Promotor (P) und ein erstes Intron (I) aus dem Actin-Gen von Reis (Os) (P-Os.Act1/I-Os.Act1) (US-Patent Nr. 5,641,876), die Plastiden-Transitpeptidsequenz (TS) aus dem EPSP-Synthase-Gen von Arabidopsis thaliana (At) (TS-At.EPSPS:CTP) (Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210: 437–442), eine codierende Sequenz für glyphosatresistentes EPSPS von E. indica und den Polyadenylierungs/Terminierungs(T)-Bereich aus dem Nopalin-Synthase-Gen von Agrobacterium tumefaciens (T-AGRTU.nos) enthält. Diese Expressionscassette kann mit einer zweiten Transgen-Expressionscassette kombiniert werden, und zwar durch Pflanzenzüchtung, Pflanzentransformation, oder indem man ein DNA-Konstrukt hinzufügt, das einen Pflanzen-DNA-Virus-Promotor umfasst, zum Beispiel den Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-35S-Promotor, der eine Tandemduplikation des Enhancerbereichs enthält und operabel mit einem Zeamays-Hsp70-Intron verknüpft ist, das operabel mit einer Nucleinsäuresequenz verknüpft ist, die eine EPSPS-Chloroplasten-Transitpeptidsequenz von Arabidopsis thaliana codiert und operabel mit einer codierenden Sequenz für glyphosatresistentes EPSPS von E. indica verknüpft ist, die operabel mit einem Nopalin-Synthase-Transcriptionsterminator verknüpft ist. Weitere Kombinationen von genetischen Elementen sind bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie kann leicht Pflanzenexpressionsvektoren aufbauen, die das glyphosatresistente EPSPS-Enzym von E. indica auf ausreichend hohem Niveau exprimieren, um der transformierten Pflanze Glyphosattoleranz zu verleihen.
Für spezielle Zweikeimblättrige Spezies kann ein Pflanzenexpressionsvektor verwendet werden, der den Promotor und den 5'-untranslatierten Bereich (einschließlich Intron I) des Gens für den Pflanzenverlängerungsfaktor 1α (Elfα-A1) gemäß der Beschreibung im US-Patent Nr. 5,177,011 verwendet, oder insbesondere der Zweikeimblättrigen-Vektor der vorliegenden Erfindung, der die Elfα-A1-Promotor- und -Intronsequenz von Arabidopsis thaliana (P-At.Elf1a/I-At.Elf1a) (Axelos et al., Mol. Gen. Genet. 219: 106–112 (1989), Genbank-Zugriffs-Nr. U63815), das Chloroplasten-Transitpeptid vom Gen für die EPSP-Synthase von Arabidopsis thaliana (TS-At.EPSPS:CTP2) und den Polyadenylierungs/3'-Terminierungs-Bereich vom Gen für die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase von Pisum sativum (T-Ps.RbcS:E9) verwendet. Diese Expressionscassette kann mit einer zweiten Transgen-Expressionscassette kombiniert werden, und zwar durch Pflanzenzüchtung, Pflanzentransformation, oder indem man ein DNA-Konstrukt hinzufügt, das einen Pflanzen-DNA-Virus-Promotor umfasst, zum Beispiel den Figwort-Mosaic-Virus(FMV)-34S-Promotor, der operabel mit einer Nucleinsäuresequenz verknüpft ist, die eine EPSPS-Chloroplasten-Transitpeptidsequenz von Arabidopsis thaliana Codiert und operabel mit einer codierenden Sequenz für glyphosatresistentes EPSPS von E. indica verknüpft ist, die operabel mit einem Nopalin-Synthase-Transcriptionsterminator verknüpft ist. Weitere Kombinationen von genetischen Elementen sind bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie kann leicht Pflanzenexpressionsvektoren aufbauen, die das glyphosatresistente EPSPS-Enzym von E. indica auf ausreichend hohem Niveau exprimieren, um der transformierten Pflanze Glyphosattoleranz zu verleihen.
Um Einkeimblättrigen- und Zweikeimblättrigen-Pflanzenexpressionsvektoren aufzubauen, die die DNA tragen, die die das reife Protein codierende Sequenz der EPSP-Synthase codieren, die aus dem glyphosattoleranten E.-indica-Biotyp isoliert wurde (SEQ ID Nr. 6, 1), werden die Oligonucleotidprimer der SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 in PCR-Reaktionen eingesetzt, um eine Expressionscassette zu erzeugen, die für die direkte Klonierung in einem Einkeimblättrigen-Vektor und einen Zweikeimblättrigen-Vektor geeignet ist.
5'-GCAATTCGCATGCCGGGCGCGGAGGAGGTGGTGCT-3' (SEQ ID NO: 11)
5'-GACTAGGAATTCTTAGTTCTTTTGACGAAAGTGCTCAGCACGTCGAAG – 3' (SEQ ID NO: 12)
Die PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von 300–500 ng pMON45364-Plasmid-DNA als Matrize durchgeführt, um den das reife Protein der EPSP-Synthase codierenden Bereich von E. indica zu amplifizieren, der von SphI- und EcoRI-Restriktionsspaltungsstellen flankiert ist. Die Oligonucleotide werden in 50-μl-PCR-Reaktionen in einer endgültigen Konzentration von 0,4 μM hinzugefügt. Dann werden PCR-Amplifikationen durchgeführt, wobei man das Expand High Fidelity PCR System (Kat.-Nr. 1 732 641, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet und ein thermisches Profil von 94°C während 30 Sekunden, dann 57°C während 2 Minuten und dann 75°C während 3 Minuten für insgesamt 20–35 Cyclen verwendet. Die resultierenden PCR-Produkte werden mit SphI und EcoRI abgebaut, dann in pMON45366 und pMON45368 ligiert, was zu den Pflanzenexpressionsvektoren pMON45367 (7) bzw. pMON45369 (8) führt. Die Richtigkeit der klonierten Sequenzen wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt (ABI Prism^TM 377, Perkin Elmer, Foster City, CA).
Beispiel 5
Transgener Mais kann durch Teilchenbombardierungs-Transformationsverfahren hergestellt werden, wie es im US-Patent Nr. 5,424,412 beschrieben ist. Der Pflanzenexpressionsvektor (pMON45367) enthält die das reife Protein des glyphosatresistenten EPSPS von E. indica codierende Sequenz in einer Expressionscassette, die für die Expression in Einkeimblättrigen Pflanzen geeignet ist. Die pMON45367-Plasmid-DNA wird mit den Restriktionsendonucleasen NotI und PmeI bis zur vollständigen Spaltung abgebaut. Die 3,3-kb-Expressionscassette wird auf Agarose-Gel gereinigt, dann durch Bombardierung in embryogene Maisgewebekulturzellen eingeführt, wobei man eine Teilchenkanone des Typs Biolistic^® (Dupont, Wilmington, DE) mit gereinigtem isoliertem DNA-Fragment verwendet. Transformierte Zellen werden auf Glyphosat (N-Phosphonomethylglycin und seine Salze) enthaltendem Medium selektiert, und ganze Pflanzen werden regeneriert und dann unter Treibhausbedingungen aufgezogen. Fruchtbare Samen werden gesammelt, eingepflanzt, und der glyphosattolerante Phänotyp wird mit Verfahren, die auf dem Gebiet der Maiszucht bekannt sind, mit kommerziell annehmbarem Maiskeimplasma rückgekreuzt (Sprague et al., Corn and Corn Improvement 3rd Edition, Am. Soc. Agron. Publ. (1988).
Transgene Maispflanzen können mit einem durch Agrobacterium vermittelten Transformationsverfahren hergestellt werden. Für alle Experimente wird ein Agrobacterium-Stamm C58 (ABI) mit unschädlich gemachtem Ti-Gen (disarmed), der einen binären Vektor (pMON45367) beherbergt, verwendet. Das pMON45367 wird durch ein triparentales Paarungsverfahren in Agrobacterium übertragen (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 7347–7351). Agrobacterium-Flüssigkulturen werden aus Glycerin-Stammkulturen oder aus einer frisch ausgestrichenen Platte angesetzt und über Nacht bei 26°C bis 28°C unter Schütteln (ungefähr 150 U/min) in flüssigem LB-Medium, pH 7,0, das 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Streptomycin und Spectinomycin sowie 25 mg/l Chloramphenicol mit 200 μM Acetosyringon (AS) enthält, bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die Agrobacterium-Zellen werden im Impfmedium (flüssigem CM4C) resuspendiert, und die Dichte wird auf ein OD₆₆₀ von 1 eingestellt. Frisch isolierte unreife Typ-II-HiIIxLH198- und -HiII-Maisembryos werden mit Agrobacterium, das pMON45367 enthält, geimpft und 2–3 Tage lang im Dunkeln bei 23°C cokultiviert.
Dann werden die Embryos in Verzögerungsmedium (N6 1-100-12/micro/Carb 500/20 μM AgNO₃) übergeführt und 4 bis 5 Tage lang bei 28°C inkubiert. Alle anschließenden Kulturen werden auf dieser Temperatur gehalten. Eine Woche nach der Impfung werden die Keimblattscheiden entfernt. Die Embryos werden in das erste Selektionsmedium (N61-0-12/Carb 500/0,5 mM Glyphosat) übergeführt. Zwei Wochen später wird überlebendes Gewebe in das zweite Selektionsmedium (N61-0-12/Carb 500/1,0 mM Glyphosat) übergeführt. Überlebenden Kallus alle 2 Wochen subkultivieren, bis Transformationsereignisse identifiziert werden können. Dafür werden 3 Subkulturen auf 1,0 mM Glyphosat benötigt. Sobald Transformationsereignisse identifiziert werden, vereinige man das Gewebe zum Regenerieren zu einer Masse. Für die Regeneration werden Kallusgewebe in das Regenerationsmedium (MSOD 0,1 μM ABA) übertragen und zwei Wochen lang inkubiert. Die regenerierenden Kalli werden in ein Medium mit hohem Saccharosegehalt übergeführt und zwei Wochen lang inkubiert. Die Pflänzchen werden in MSOD-Medium in einem Kulturgefäß übergeführt und zwei Wochen lang darin gelassen. Dann werden die Pflanzen mit Wurzeln in Erde übergeführt.
Für jedes gegebene transgene Ereignis werden drei R₀-Pflanzen regeneriert. Von diesen drei Pflanzen wird erwartet, dass sie fast isogen sind, da sie vermutlich von einer einzigen transgenen Pflanzenzelle stammen. So wird eine Pflanze als unbesprühte Kontrolle verwendet, und die übrigen beiden Pflanzen werden mit Glyphosat (als Roundup^®-Herbizid) behandelt. Die Pflanzen werden am effektivsten im Stadium V2-V6 mit Glyphosat behandelt. Glyphosat (als Roundup^®-Herbizid) wird unter Verwendung eines Linearbahn-Sprühgeräts verabreicht, wobei Glyphosat in einer Menge von 16, 32 bzw. 64 oz/A abgegeben wird. Die vegetative Toleranz gegenüber dem Glyphosat wird eine Woche nach dem Besprühen auf der Basis einer Skala von 0 bis 5 visuell bewertet (0 = keine beobachtbare/vegetative Wirkung des Glyphosats; 1 = Chlorose beobachtet; 2 = fortgeschrittene Chlorose, geringfügige Nekrose; 3 = fortgeschrittene Chlorose, mäßig starke Nekrose; 4 = fortgeschrittene Chlorose, schwere Nekrose; 5 = kein lebendes Gewebe bleibt übrig). Man lässt die erzeugten R₀-Pflanzen sich selbst bestäuben, dann werden R₁-Pflanzen einem Screening unter Verwendung von Sprühauftragungen von Glyphosat und des Bewertungssystems, wie es für das R₀-Screening beschrieben ist, unterzogen. Eine Zunahme der Toleranz der ganzen Pflanze gegenüber dem Herbizid im Vergleich zu nichttransgenen Kontrollpflanzen wird verwendet, um die Nützlichkeit des EPSP-Synthase-Enzyms von E. indica für die Erzeugung von Glyphosattoleranz bei Pflanzen zu bewerten.
Beispiel 6
Unreife Weizenembryos (Triticum aestivum L.), Kulturvarietät Bobwhite, werden 13–15 Tage nach der Bestäubung aus der unreifen Kornfrucht isoliert und 3–4 Tage lang auf CM4C kultiviert (Tabelle 3). Die Embryos, die eine aktive Zellteilung, aber keine sichtbare Kallusbildung zeigen, werden für die Agrobacterium-Infektion ausgewählt.
Tabelle 3. Ergänzungskomponenten in Basismedien¹

¹ Alle Medien enthalten Basissalze (MS-Basissalze) und Vitamine (MS-Vitamine) von Murashige und Skoog (1962). Der pH-Wert in jedem Medium wird auf 5,8 eingestellt.
² Sterilfiltriert und nach Autoklavierung zu dem Medium gegeben.
3 Phytagel^TM (P) oder Gelrite^® (G).

Für alle Experimente wird ein Agrobacterium-Stamm C58 (ABI) mit unschädlich gemachtem Ti-Gen (disarmed), der einen interessierenden binären Vektor (pMON45367) beherbergt, verwendet. Das pMON45367 wird durch ein triparentales Paarungsverfahren in Agrobacterium übertragen (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 7347–7351). Agrobacterium-Flüssigkulturen werden aus Glycerin-Stammkulturen oder aus einer frisch ausgestrichenen Platte angesetzt und über Nacht bei 26°C bis 28°C unter Schütteln (ungefähr 150 U/min) in flüssigem LB-Medium, pH 7,0, das 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Streptomycin und Spectinomycin sowie 25 mg/l Chloramphenicol mit 200 μM Acetosyringon (AS) enthält, bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die Agrobacterium-Zellen werden im Impfmedium (flüssigem CM4C) resuspendiert, und die Dichte wird auf ein OD₆₆₀ von 1 eingestellt. Die in CM4C-Medium kultivierten unreifen Embryos werden auf sterile Petri-Schalen (16 × 20 mm) oder Näpfe einer 6-Napf-Zellkulturplatte (Costar Corporation, Cambridge, MA), die 10 ml Impfmedium pro Petri-Schale bzw. 5 ml pro Zellkulturhaufenplatte enthalten, übergeführt. Eine gleiche Menge der Agrobacterium-Zellsuspension wird so hinzugefügt, dass die endgültige Konzentration der Agrobacterium-Zellen einer OD₆₀₀ von 0,5 entspricht. In den meisten Experimenten wird Pluronic F68 in einer Endkonzentration von 0,01% zu dem Impfgemisch gegeben. Das Verhältnis zwischen dem Agrobacterium und den unreifen Embryos beträgt etwa 10 ml : 20–200 unreife Embryos. Man lässt die Impfung 5–60 Minuten lang bei 23°C bis 26°C fortschreiten.
Nach der Impfzeit werden die übrigen Agrobacterium-Zellen mit Hilfe eines Absauggeräts aus den Explantaten entfernt. Ein Stück steriles Filterpapier What-man Nr. 1 (das zur Größe der Petri-Schale passt) wird in jede Petri-Schale von 60 × 15 mm oder 60 × 20 mm gegeben. 200 μl steriles Wasser werden in die Mitte des Filterpapiers gegeben. Nach 2–3 Minuten werden die geimpften unreifen Embryos in die Schalen gegeben. Gewöhnlich werden 20–50 Explantate zu einem Haufen (etwa 1 cm groß und 60–80 mg/Haufen) gruppiert, wobei 4–5 Haufen auf jeder Schale sind. Die Schalen werden sofort mit Parafilm^® abgedeckt und dann 2–3 Tage lang im Dunkeln bei 24°C bis 26°C cokultiviert.
Die cokultivierten PCIEs werden im Dunkeln auf ein Medium CM4C + 500 mg/l Carbenicillin (Verzögerungsmedium) übergeführt. Nach 7 Tagen auf dem Verzögerungsmedium werden die unreifen Embryos eine Woche lang zur Selektion auf CM4C übergeführt, das mit 2 mM Glyphosat und 500 mg/l Carbenicillin ergänzt ist. Dann werden Kalli zur weiteren Selektion 2 Wochen lang unter Licht auf ein Medium MMS0.2C + 0,1 mM Glyphosat + 250 mg/l Carbenicillin übergeführt. Embryogene Kalli werden zur Pflanzenregeneration auf ein zweites Regenerationsmedium MMS0C mit einer geringeren Glyphosatkonzentration (0,02 mM) und 500 mg/l Carbenicillin übergeführt. Diese embryogenen Kalli werden alle zwei Wochen auf frisches Medium übergeführt. Die regenerierten Pflänzchen werden zum weiteren Wachstum und zur Selektion auf Sundae-Becher (Sweetheart Cup Company, Chicago, IL) übergeführt, die das zweite Regenerationsmedium enthalten. Wenn Wurzeln von transgenen Pflanzen gut ausgebildet sind, werden die Pflanzen für die weitere Bewertung in Erde übergeführt.
Beispiel 7
Neue glyphosatresistente EPSP-Synthasen können auf der Basis des glyphosatresistenten EPSPS von E. indica entworfen werden. Die von der cDNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt, dass zwei Aminosäuresubstitutionen die reife EPSP-Proteinsequenz, die von dem glyphosattoleranten E.-indica-Biotyp abgeleitet ist (obere Reihe, 9), von der EPSPS-Proteinsequenz des glyphosatempfindlichen E.-indica-Biotyps (untere Reihe, 9) unterscheiden. Die Substitution eines Prolins durch ein Serin auf Position 107 der E.-indica-EPSPS-Aminosäuresequenz und auf der entsprechenden Aminosäureposition von EPSP-Synthase-Enzymen sowohl von höheren Pflanzen als auch von Bakterien führt bekanntermaßen dazu, dass das Enzym eine Resistenz gegen Glyphosat aufweist (Padgette et al., J. Biol. Chem. 266: 22364–22369 (1991); US-Patent Nr. 4,535,060). Alle bisher charakterisierten EPSP-Synthase-Varianten mit einer einzigen Aminosäuresubstitution in der katalytischen Domäne, die eine erhöhte Toleranz gegenüber Glyphosat aufweisen, haben ein höheres K_i für Glyphosat, aber auch eine Erhöhung des scheinbaren K_m für PEP und ein reduziertes V_max, wodurch die katalytische Effizienz (V_ma _x/K_m) des Enzyms gesenkt wird (Kishore et al., Annu. Rev. Biochem. 57: 627–663 (1988); Glyphosat (Padgette et al., J. Biol. Chem. 266: 22364–22369 (1991)). Dagegen weist die glyphosatresistente EPSP-Synthase von E. indica (E. indica glypR) eine hohe Affinität zu PEP auf, während sie eine erhebliche katalytische Effizienz in Gegenwart von Glyphosat beibehält (Tabelle 4). Die gentechnisch veränderten glyphosatresistenten (glypR) Varianten von Petunie (Petunia hybrida) und Mais (Zea mays), von denen in von anderen durchgeführten Studien (US-Patent Nr. 5,866,774; US-Patent Nr. 6,040,497) gezeigt wurde, dass sie transgenen Pflanzen ein hohes Maß an Glyphosattoleranz verleihen, wurden in Bezug auf ihre Affinität zu PEP und Hemmung durch Glyphosat untersucht. Alle natürlich vorkommenden glyphosatempfindlichen Wildtyp(wt)-Z.-mays- (Z. mays glypS), glyphosatempfindlichen Wildtyp-P.-hybrida- (P. hybrida glypS) und die E.-indica-glypS- und E.-indica-glypR-Wildtyp-EPSPS-Enzyme haben sehr ähnliche K_m-Werte für PEP. Die einzelnen Aminosäuresubstitutionen, die gentechnisch in die katalytische Domäne des P.-hybrida-EPSPS-Enzyms eingeführt wurden, erhöhen das K_m, für PEP drastisch. Es zeigte sich, dass die einzelne Aminosäuresubstitution, die man in dieser Domäne in der natürlich vorkommenden Variante von E. indica glypR findet, keine größere Auswirkung auf K_m hat, was darauf hinweist, dass dieses Enzym weiterhin gut im Pflanzenchloroplasten funktioniert. Es erforderte eine doppelte Mutation im Z.-mays-EPSPS-Enzym, um ein niedriges K_m für PEP zu erreichen.
Tabelle 4. Vergleich des scheinbaren K_m für PEP und des scheinbaren K_i für Glyphosat des glyphosatresistenten EPSPS von E. indica mit anderen bekannten Pflanzen-EPSPS, die im Sinne einer Glyphosatresistenz modifiziert sind.
K_m(PEP)-Bestimmungen für die verschiedenen Enzyme werden bei sättigenden Shikimate-3-phosphat(S3P)-Konzentrationen durchgeführt, und zwar gemäß Standardverfahren (Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, W.H. Freeman and Co., Ltd., San Francisco, CA, 1977). Eine Reihe von PEP-Konzentrationen werden getestet, so dass der endgültige Bereich der Konzentrationen eine Größenordnung oberhalb und unterhalb des experimentell bestimmten K_m überspannt. K_i(Glyphosat) in Bezug auf PEP wird in ähnlicher Weise bei sättigenden S3P-Konzentrationen bestimmt, außer dass die Geschwindigkeit als Funktion von [PEP] für einen Bereich von Glyphosatkonzentrationen bestimmt wird (Orsi in "Methods in Enzymology" (Purich, Hrsg.), Vol. 63, S. 159–183, 1979). Die Berechnungen, die graphische Darstellung und die statistische Analyse der enzymkinetischen Daten erfolgen unter Verwendung der GraFit-Software, Version 3.0 (Erithacus Software Ltd., Staines, UK).
Aufgrund dieser Studie ist zu erwarten, dass gegen Glyphosat resistente transgene Pflanzen durch Transformation mit einem Genkonstrukt für glyphosatresistentes EPSPS-Gen von E. indica hergestellt werden, das eine zusätzliche Modifikation der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz aufweisen kann. Diese Änderungen können durch ortsspezifische Mutagenese der Codons der DNA-Sequenz vorgenommen werden, wobei andere bekannte Aminosäuresubstitutionen in glyphosatresistente Pflanzen-EPSPS eingebaut werden, wie die Substitution von Threonin durch Isoleucin (US-Patent Nr. 6,040,497) und die Substitution von Glycin durch Alanin (US-Patent Nr. 5,188,642) in der katalytischen Domäne. Weiterhin ist zu erwarten, dass die katalytische Domäne des E.-indica-EPSPS sowie der EPSPS anderer Pflanzen mit denselben Verfahren zur Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne des glyphosatresistenten EPSPS des Agrobacterium-Stamms CP4 modifiziert werden können (US-Patent Nr. 5,633,435). Frühere statistische und ortsspezifische Mutationen im konservierten Bereich (katalytische Domäne) des EPSPS von Bakterien und Pflanzen haben gezeigt, dass Modifikationen, die das K_i für Glyphosat erhöhen und zugleich das K_m für PEP niedrig halten, für ein Enzym wichtig sind, das zum genetischen Modifizieren von Pflanzen im Sinne einer Glyphosattoleranz geeignet sein sollen (US-Patent Nr. 5,866,775).
Aus dem Vorstehenden erkennt man, dass diese Erfindung gut geeignet ist, um alle oben dargelegten Ziele zu erreichen und Probleme zu lösen, und zwar mit Vorteilen, die offensichtlich und der Erfindung inhärent sind.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen werden angegeben, um die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung besser zu erhellen. Viele mögliche Ausführungsformen der Erfindung können ausgebildet werden, ohne von deren Umfang abzuweichen, und man sollte sich darüber im Klaren sein, dass diese Ausführungsformen nur zu veranschaulichenden Zwecken angegeben werden und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass bestimmte Merkmale und Subkombinationen von Nutzen sind und ohne Bezugnahme auf andere Merkmale und Subkombinationen eingesetzt werden können. Dies ist in den Ansprüchen in Betracht gezogen und liegt innerhalb von deren Umfang.
Sequenzprotokoll

Claims

DNA-Molekül, das ein natürlich vorkommendes Glyphosat-resistentes EPSPS-Enzym codiert, das von einer Glyphosat-toleranten Pflanzenart stammt, wobei das Glyphosat-resistente EPSPS-Enzym ein K_m für Phosphoenolpyruvat (PEP) von weniger als 10 μM hat und wobei das EPSPS-Enzym SEQ ID Nr. 7 umfasst.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, das ein natürlich vorkommendes Glyphosat-resistentes EPSPS-Enzym codiert, das von einer Glyphosattoleranten Pflanzenart stammt, wobei das Glyphosat-resistente EPSPS-Enzym ein K_m für PEP von weniger als 10 μM hat und das K_m für PEP nicht größer als etwa doppelt so groß wie das K_m für PEP eines natürlich vorkommenden Glyphosat-empfindlichen EPSPS-Enzyms, das von einer Glyphosat-empfindlichen Pflanze stammt, ist.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei der Pflanze um eine Eleusine-Spezies handelt.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, das ein natürlich vorkommendes Glyphosat-resistentes EPSPS-Enzym mit der SEQ ID Nr. 7 codiert, wobei das DNA-Molekül zu SEQ ID Nr. 6 im Wesentlichen homolog ist.
Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend: einen Promotor, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Produktion einer RNA-Sequenz zu bewirken, und der operabel mit einer Struktur-DNA-Sequenz verknüpft ist, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein EPSPS-Enzym codiert, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 umfasst, und die operabel mit einem 3'-untranslatierten Bereich verknüpft ist, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken, wobei der Promotor heterolog in Bezug auf die Struktur-DNA-Sequenz ist und so gewählt wird, dass er eine ausreichende Expression des Polypeptids bewirkt, so dass die Glyphosat-Toleranz einer transgenen Pflanzenzelle, die das rekombinante DNA-Molekül enthält, verstärkt wird.
Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 5, wobei die Struktur-DNA-Sequenz ein Fusionspolypeptid codiert, das ein aminoterminales Chloroplast-Transit-Peptid und ein EPSPS-Enzym, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 umfasst, umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Glyphosat-toleranten Pflanzen, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einsetzen eines rekombinanten DNA-Moleküls in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei das DNA-Molekül Folgendes umfasst: einen Promotor, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Produktion einer RNA-Sequenz zu bewirken, und der operabel mit einer Struktur-DNA-Sequenz verknüpft ist, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein EPSPS-Enzym codiert, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 aufweist, und die operabel mit einem 3'-untranslatierten Bereich verknüpft ist, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken, wobei der Promotor heterolog in Bezug auf die Struktur-DNA-Sequenz ist und geeignet ist, eine ausreichende Expression des Polypeptids zu bewirken, so dass die Glyphosat-Toleranz einer mit dem DNA-Molekül transformierten Pflanzenzelle verstärkt wird; b) Auswählen einer Pflanzenzelle, die im obigen Schritt (a) transformiert wurde; und c) Regenerieren einer genetisch transformierten Pflanze, die eine erhöhte Toleranz gegenüber dem Herbizid Glyphosat aufweist, aus der transformierten Pflanze.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Struktur-DNA-Sequenz ein Fusionspolypeptid codiert, das ein aminoterminales Chloroplast-Transit-Peptid und ein EPSPS-Enzym, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 umfasst, umfasst.
Glyphosat-tolerante Pflanzenzelle, die ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Glyphosat-tolerante Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Reis, Hirse, Zuckerrohr, Gerste, Hafer, Roggen, Rasengräsern, Spargel, Soja, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps, Canola, Flachs, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Luzerne, Waldbäumen, Obstbäumen, einjährigen Zierpflanzen und Zierstauden besteht.
Glyphosat-tolerante Pflanze, die die Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9 umfasst.
Glyphosat-tolerante Pflanze gemäß Anspruch 11, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Reis, Hirse, Zuckerrohr, Gerste, Hafer, Roggen, Rasengräsern, Spargel, Soja, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps, Canola, Flachs, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Luzerne, Waldbäumen, Obstbäumen, einjährigen Zierpflanzen und Zierstauden besteht.
Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend: einen Promotor, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Produktion einer RNA-Sequenz zu bewirken, und der operabel mit einer Struktur-DNA-Sequenz verknüpft ist, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein EPSPS-Enzym codiert, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 umfasst, und die operabel mit einem 3'-untranslatierten Bereich verknüpft ist, der in Pflanzenzellen die Funkti on hat, die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken, wobei der Promotor homolog in Bezug auf die Struktur-DNA-Sequenz ist.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 13, wobei die Struktur-DNA-Sequenz ein Fusionspolypeptid codiert, das ein aminoterminales Chloroplast-Transit-Peptid und ein EPSPS-Enzym, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 7 umfasst, umfasst.
Glyphosat-tolerante transgene Pflanzenzelle, die ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 13 oder 14 umfasst.
Glyphosat-tolerante transgene Pflanzenzelle gemäß Anspruch 15, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Reis, Hirse, Zuckerrohr, Gerste, Hafer, Roggen, Rasengräsern, Spargel, Soja, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps, Canola, Flachs, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Luzerne, Waldbäumen, Obstbäumen, einjährigen Zierpflanzen und Zierstauden besteht.
Glyphosat-tolerante transgene Pflanze, die die Pflanzenzelle gemäß Anspruch 15 umfasst.
Glyphosat-tolerante transgene Pflanze gemäß Anspruch 17, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Reis, Hirse, Zuckerrohr, Gerste, Hafer, Roggen, Rasengräsern, Spargel, Soja, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps, Canola, Flachs, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Luzerne, Waldbäumen, Obstbäumen, einjährigen Zierpflanzen und Zierstauden besteht.
Samen einer Glyphosat-toleranten transgenen Pflanze gemäß Anspruch 12.
Samen einer Glyphosat-toleranten transgenen Pflanze gemäß Anspruch 18.