DE112009001459T5

DE112009001459T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben

Info

Publication number: DE112009001459T5
Application number: DE112009001459T
Authority: DE
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero; Yves Hatzfeld; Valerie Frankard; Christophe Reuzeau
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2011-09-29
Also published as: EP2297327A1; AR072284A1; MX2010012720A; BRPI0914777A2; CN102066569A; CN103834683A; US20110099669A1; US20140189910A1; WO2009153208A1; CA2724993A1; AU2009259433A1; EP2711424A2; EP2711424A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die eine GS1 (Glutamin-Synthase 1) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1 codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstums-Charakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PEAMT (Phosphoethanolamin-N-methyltransferase)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PEAMT codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte PEAMT-codierende Nukleinsäuresequenzen und Konstrukte, welche diesselben umfassen, bereit, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind. Noch weiter, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzensamenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte Samenertrag-bezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäuresequenz-Konstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten. Noch darüber hinaus, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die eine GS1 (Glutamin-Synthase 1) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1 codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstums-Charakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PEAMT (Phosphoethanolamin-N-methyltransferase)-Polypeptid codiert einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PEAMT codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte PEAMT-codierende Nukleinsäuresequenzen und Konstrukte, welche diesselben umfassen, bereit, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Noch weiter, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzensamenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte Samenrtrag-bezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäuresequenz-Konstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Noch darüber hinaus, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein LFY-like (LEAFY-like) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein LFY-like codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstums-Charakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantitiät und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten dar, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielen Wegen gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stengelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais (Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien, als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist jenes der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Plants 218: 1–14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Erhöhung und/oder Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
Eine Vorgehensweise zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
In Bezug auf GS1-Polypeptide ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene Wachstums-Charakteristika in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die eine GS1 (Glutamin-Synthase 1) codiert, in einer Pflanze moduliert.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die eine PEAMT (Phosphoethanolamin-N-methyltransferase) codiert, in einer Pflanze moduliert.
In Bezug auf FATB-Polypeptide ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene samenertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Gesamtzahl an Samen, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene Wachstumscharakteristika in Pflanzen durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, die ein LFY-like (LEAFY-like) in einer Pflanze codiert, verbessert werden können.
Hintergrund
Glutamin-Synthase (GS1)
Glutamin-Synthase katalysiert die Bildung von Glutamin aus Glutamat und NH₃, dies ist der letzte Schritt des Nitratassimilations-Weges. Auf Basis des Sequenzvergleichs werden Glutamin-Synthasen in zwei Familien-eingeteilt, die cytosolischen (GS1) und chloroplastidären (GS2) Isoformen. GS1-Glutamin-Synthasen bilden eine kleine Genfamilie, wobei GS2 als ein Einzelkopie-Gen vorzukommen scheint und sowohl GS1 als auch GS2 in Pflanzen und Algen vorkommen. Viele Berichte beschreiben, dass Glutaminsynthasen aus höheren Pflanzen eine direkte Auswirkung auf das Pflanzenwachstum unter Bedingungen von Stickstoffbeschränkung haben (Oliveira et al. Plant Physiol. 129, 1170–1180, 2002; Fuentes et al. J. Exp. Bot. 52, 1071–1081, 2001; Migge et al. Planta 210, 252–260, 2000; Martin et al. Plant Cell 18, 3252–3274). Allerdings sind bislang keine Daten über den Effekt von Glutaminsynthasen des Algen-Typs auf das Pflanzenwachstum verfügbar, insbesondere unter Bedingungen mit reduzierter Stickstoffverfügbarkeit.
Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT)
Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT), ebenfalls bezeichnet als S-Adenosyl-L-methionin:ethanolamin-phosphat-N-methyltransferase, ist an der Cholinbiosynthese in Pflanzen beteiligt. PEAMT fungiert in den Methylierungs-Schritten, die erforderlich sind, um Phosphoethanolamin in Phosphocholin umzuwandeln (Nuccio et al. 2000. J Biol Chem. 275(19): 14095–101). Folglich katalysiert ein PEAMT-Enzym eine oder mehrere der folgenden Reaktionen:

1) N-Dimethylethanolaminphosphat + S-Adenosyl-L-methionin <=> Phosphoryl-Cholin + S-Adenosyl-homocystein
2) N-Methylethanolaminphosphat + S-Adenosyl-L-methionin <=> N-Dimethylethanolamin phosphat + S-Adenosyl-homocystein
3) Phosphoryl-ethanolamin + S-Adenosyl-L-methionin <=> S-Adenosyl-homocystein + N-Methylethanolaminphosphat.

Die 'Enzyme Commission'-Nummer, welche durch die IUPAC-IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) an PEAMT zugewiesen wurde, ist EC2.1.1.103. Das PEAMT-Enzym gehört zu einer Klasse von Methyltransferasen (Mtasen), die von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) abhängig sind. Ein Methyl-Transfer von dem ubiquitären SAM auf Stickstoff-, Sauerstoff- oder Kohlenstoffatome wird häufig in diversen Organismen angewandt, was von Bakterien bis zu Pflanzen und Säugern reicht. Strukturanalysen zeigen, dass PEAMT-Proteine zu einer Klasse von Mtasen gehören, umfassend Methyltransferase-Domänen, welche die ”Rossman-like”-alpha-beta-Faltung ausbilden (Yang et al. 2004 J. Mol. Biol. 340, 695–706). Darüber hinaus umfassen Phosphatidylethanolamin-Transferasen typischerweise eine ubiE/COQ5-Methyltransferase-Domäne (Pfam-Referenznummer PF01209). Diese Domäne ist auch in einer Anzahl von Methyltransferasen vorhanden, die an der Ubichinon/Menachinon-, Biotin- und Sterol-Biosynthese beteiligt sind.
Phospholipide sind wichtige Strukturkomponenten von zellulären Membranen, und zusätzlich dazu spielen sie eine bedeutende Rolle im Metabolismus von essentiellen Verbindungen, wie Fettsäuren. Beim Menschen ist Cholin, ein B-Vitamin-ähnliches Molekül, ein natürlich produzierter essentieller Nährstoff und ist am Aufbau von Zellmembranen beteiligt und bewegt Fette und Nährstoffe zwischen Zellen.
Phosphocholin ist das hauptsächliche Phospholipid in fast jedem Pflanzengewebe. In nicht-photosynthetischem Gewebe, ist Phosphoethanolamin das zweithäufigste Phospholipid, wohingegen in grünem Gewebe die Spiegel an Phosphocholin ähnlich zu denjenigen von Phosphatidylglycerol sind (Dykes et al. 1976. Biochem J. 158(3): 575–581).
Bei Tabakpflanzen, welche ein Gen überexprimieren, das ein PEAMT-Enzym codiert, waren nach Berichten die Spiegel an Phosphocholin und freiem Cholin erhöht, ohne dass der Phosphatidylcholin-Gehalt oder das Wachstum beeinflußt waren (McNeil et al. 2001. PNAS. 2001, vol. 98, no. 17 10001–10005).
Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
Pflanzen enthalten eine beträchtliche Vielzahl an Membran- und Speicherlipiden, und in jedem Lipid wird eine Anzahl an verschiedenen Fettsäuren gefunden. Fettsäuren unterschieden sich durch ihre Kettenlänge und die Zahl an Doppelbindungen. Alle Pflanzenzellen synthetisieren de novo Fettsäuren aus Acetyl-CoA durch einen gemeinsamen Weg, der in Plastiden lokalisiert ist, anders als bei anderen Organismen. Fettsäuren werden entweder in dieser Organelle verwertet oder transportiert, um diverse zytoplasmatische Biosynthesewege und zelluläre Prozesse zu versorgen. Die Produktion von Fettsäuren für den Transport hängt von der Aktivität von Fettacyl-Acyl-Carrierprotein(ACP)-Thioesterasen (FATs; auch bezeichnet als Acyl-ACP TE) ab, welche freie Fettsäuren und ACP abgeben. Deren Aktivität stellt den letzten Schritt im plastidären Fettsäure-Biosyntheseweg dar. Die resultierenden freien Fettsäuren können in das Cytosol eintreten, wo sie an Coenzym A verestert und weiter zu Membranlipiden und/oder Speicher-Triacylglycerolen verstoffwechselt werden.
FATs spielt eine wesentliche Rolle bei der Bestimmung der Menge und Zusammensetzung von Fettsäuren, welche in den Speicherlipid-Pool eintreten. Zwei Klassen von FATs sind in Pflanzen beschrieben worden, basierend auf Aminosäuresequenzvergleichen und der Substratspezifität: die FATA-Klasse und die FATB-Klasse (Voelker et al. (1997) Plant Physiol 114: 669–677). Die Substratspezifität dieser Isoformen bestimmt die Kettenlänge und den Spiegel an gesättigten Fettsäuren in Pflanzen. Die höchste Akivität von FATA erfolgt mit Oleoyl-ACP, einem ungesättigten Acyl-ACP, bei sehr niedrigen Aktivitäten gegenüber anderen Acyl-ACPs. FATB hat die höchste Aktivität mit gesättigten Acyl-ACPs.
FATA und FATB sind nukleär-codierte, zu Plastiden zielgelenkte, globuläre Proteine, welche als Dimere funktional sind. Darüber hinaus umfassen FATB-Polypeptide einen helikalen Transmembran-Anker. FATB-Aktivität wird von mindestens zwei Genen in Arabidopsis (Bonaventure et al. (2003) Plant Cell 15: 1020–1033), und von mindestens vier Genen in Oryza sativa codiert.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen (Doermann et al. (2000) Plant Physiol 123: 637–643) und transgene Canola-Pflanzen (Jones et al. (1995) Plant Cell 7: 359–371), die ein Gen, codierend ein FATB, unter der Steuerung eines samenspezifischen Promotors exprimierten, zeigten eine modifizierte Samenöl-Zusammensetzung.
Die Internationale Patentanmeldung WO 2008/006171 beschreibt Verfahren zum genetischen Modifizieren von Reispflanzen, so dass daraus hergestellte(s) Reisöl, Reiskleie und Reis-Samen veränderte Spiegel an Oleic-Öl, Palmitinsäure und/oder Linolsäure aufweisen, durch Modulation der FAD2- und/oder FATB-Genexpression.
Leafy-like (LFY-like)
Leafy ist ein Transkriptionsfaktor, der für Blüteninduktion und Blütenentwicklung erforderlich ist, und an der Spezifikation der Blütenmeristem-Identität beteiligt ist: LFY-Expression ist reguliert und auf kleine Gruppen von Zellen beschränkt, die das Spross-Apikalmeristem flankieren, wo seine Expression bei hohem Spiegel den Bestimmungswechsel von einem Blatt-Primordium zu einem Blüten-Primordium markiert (Weigel et al., Cell 69, 843–859, 1992). Die Proteinsequenz ist hochkonserviert, und in vielen Pflanzenspezies wird das Protein durch ein Einzelgen codiert, in einigen wenigen Spezies sind auch Paraloge vorhanden. Bei Mais sind 2 Kopien des Gens vorhanden (zfl1 und zfl2). Doppelmutanten zeigen eine normale Entwicklung während des vegetativen Wachstums, aber die Blütenentwicklung ist gestört (Bomblies et al., Development 130, 2385–2395, 2003). Auch in Arabidopsis zeigen Funktionsverlust-Mutanten von LFY Defizienzen bei der Blütenentwicklung mit einer teilweisen Transformation von Blüten zu Blütenstandtrieben (Weigel et al., 1992). Es wird ebenfalls berichtet, dass Leafy eine Rolle bei der zeitlichen Regulierung des Blühens spielt.
Zusammenfassung
Glutamin-Synthase (GS1)
Es ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid vom Algen-Typ codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT)
Es ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PEAMT-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PEAMT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
Es ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, welche ein FATB-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein FATB-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Gesamtzahl an Samen, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex.
Leafy-like (LFY-like)
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein LFY-like-Poylpeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassten einen erhöhten Samenertrag und wurden ohne Änderung der Blühzeit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhalten.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleinsäuresequenzmolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
Homolog(e)
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman und Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; lle
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte, etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um ihren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuresequenzen liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuresequenzen an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuresequenzen an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäuresequenz-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäuresequenz-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuresequenzmoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Strigenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuresequenzen hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuresequenzmoleküle zu identifizieren.
Die T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter der T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäuresequenz-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5 (log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58 (%G/C^b) + 11,8 (%G/C^b)² – 820/L^c
3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2 (I_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (I_n) ^aoder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M. ^bnur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%. ^cL = Länge des Duplex in Basenpaaren. ^dOligo, Oligonukleotid; I_n = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).

Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nichtspezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäuresequenz-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäuresequenz. Wenn Nukleinsäuresequenzen von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5–1,0% SDS, 100 µg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
Splice-Variante
Der Begriff ”Splice-Variante” wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelische Variante
Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäuresequenz-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäuresequenz gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende -10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuresequenz-Moleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuresequenzmolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten, Nukleinsäuresequenz mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Funktions fähig verbunden
Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Alfalfa H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant., Mol. Biol.; 14, 1990: 433–443
kleine Rubisco-Untereinheit	US 4 962 028
OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Super-Promotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe, etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
RCc3	Plant Mol. Biol., Jan. 1995; 27(2): 237–48
Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Tabak, Auxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
Tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
B. napus G1-3b-Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
LRX1	Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
The LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1 Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
Weizen, α-, β-, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D-Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblume-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein	WO 2004/070039
PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele von endosperm-spezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
Gerste Itr1-Promoter	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gerste DOF	Mena et al, (1998) Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
Sorghum Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.

Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

Gen	Expression	Literatur-Bezugsstelle
Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Reis, beta-Expansin EXBP9	spross-spezifisch	WO 2004/070039
Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbse RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

Genquelle	Expressionsmuster	Literatur-Bezugsstelle
Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Modulierung
Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachtsum der Pflanzen führt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäuresequenz/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder) eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäuresequenz, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten, Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäuresequenz oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuresequenzen, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des Inverted Repeat wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäuresequenz als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäuresequenz transkribierte RNA wird bezüglich einer Ziel-Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäuresequenz-Konstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz-Moleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf” einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 , und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäuresequenz, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuresequenzen, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welcher sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäuresequenz besteht.
Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäuresequenz-Konstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzmoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuresequenzen erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuresequenzen in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäuresequenz verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäuresequenz-Konstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Transgenisch/Transgen/Rekombinant
Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
(b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
(c) a) und b),

US 5 565 350

WO 00/15815

Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenzen nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuresequenzen homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuresequenzen stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einbringung oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutezutage eine durchaus routinemäßige Technik. in vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et a). (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et a)., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in plante. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Plants 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuresequenzen oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist Ober einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäuresequenz in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
Früh-Wuchskraft
”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-` Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhen/Verbessern/Steigern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
Samenertrag
Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann aufgrund einer modifierten Architektur auftreten.
Grünheits-Index
Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäuresequenz von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäuresequenz von Interesse umfasst.
Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp.; Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp.; Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp.; Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatam, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PEAMT-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PEAMT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein FATB-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von samenertragsbezogenen. Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein LFY-like-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein LFY-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
In Bezug auf GS1-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein GS1-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines solchen GS1-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”GS1-Nukleinsäuresequenz” oder ”GS1-Gen”.
Ein ”GS1-Polypeptid”, wie hierin für den Zweck der vorliegenden Erfindung definiert, bezieht sich auf eine beliebige Glutamin-Synthase 1 (GS1), welche sich zusammen mit GS1-Proteinen von Algen-Ursprung (unter Bildung eines Astes für den Algen-Typ) in einem phylogenetischen Baum einordnen lässt, wie etwa demjenigen, der in 3 abgebildet ist. Vorzugsweise ist das GS1 von Algen-Ursprung. Glutaminsynthase (Enzym-Katalognummer EC 6.3.1.2) katalysiert die folgende Reaktion: ATP + L-Glutamat + NH₃ ⇄ L-Glutamin + ADP + Phosphat
Vorzugsweise umfasst das GS1-Protein die Gln-synt_C Domäne (Pfam-Eintrag PF00120) und eine Gin-synt_N Domäne (Pfam-Eintrag PF03951). Ferner umfasst das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche GS1-Protein vorzugsweise mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt alle drei der folgenden konservierten Sequenzen, in welchen maximal 4, vorzugsweise 3 oder weniger, weiter bevorzugt 2 oder weniger, am stärksten bevorzugt 1 oder keine Fehlpaarungen vorhanden sind:
Motiv 1 (SEQ ID NR: 3): GY(Y/L/F)(E/T)DRRP(A/S/P)(A/S)(N/D)(V/L/A/M)D(P/A)Y
Vorzugsweise ist Motiv 1 GY(Y/L/F)(E/T)DRRP(A/P)(A/S)(N/D)(V/L/A)D(P/A)Y
Motiv 2 (SEQ ID NR: 4): DP(I/F)RG(A/E/D/S/G/L/V)(P/N/D)(H/N)(V/I)(L/I)V(L/I/M)(C/T/A)
Vorzugsweise ist Motiv 2 DP(I/F)RG(A/E/G)(P/N/D)(H/N)(V/I)LV(L/M)(C/A)
Motiv 3 (SEQ ID NR: 5): G(A/L/M/G/C)H(T/S/I/V/F)(N/K)(F/Y/V)S(T/S/N)
Vorzugsweise ist Motiv 3 G(A/M/G/C)H(T/I/V/F)(N/K)(F/Y)S(T/N)
Alternativ besitzt das Homolog eines GS1-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3a und 3b abgebildet ist, verwendet wird, eher bei dem Ast des Algen-Typs (der Gruppe von Algen-GS1-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst), als bei der Pflanzen-Chloroplasten- oder Pflanzen-Cytosol-Glutaminsynthase-Gruppe einordnen.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein (oder Polypeptid)” so, dass ein PEAMT-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines solchen PEAMT-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”PEAMT-Nukleinsäuresequenz” oder ”PEAMT-Gen”.
Ein ”PEAMT-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das Phosphoethanolamin-N-methyltransferase-Aktivität aufweist.
Werkzeuge und Techniken zur Messung von Phosphoethanolamin-N-methyltransferase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel kann die In-vivo-Aktivität von PEAMT-Polynukleotid und des davon codierten Polypeptids durch Komplementation in Schizosaccharommyces pombe analysiert werden (Nuccio et al; 2000). PEAMT-Aktivität kann auch in vitro bestimmt werden, wie beschrieben von (Nuccio et al; 2000).
Ein PEAMT-Polypeptid umfasst zwei IPR013216, Methyltransferase-Typ 11-Domänen (Interpro-Zugangsnummer: IPR013216; Pfam-Zugangsnummer: PF08241) und gegebenenfalls eine ubiE/COQ5-Methyltransferase-Domäne (Ubie_methyltran; Pfam-Zugangsnummer: PF01209).
Eine Methyltransferase-Typ 11-Domäne und ein Verfahren zum Identifizieren der Gegenwart einer solchen Domäne in einem Polypeptid sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Beispiele für Proteine, die zwei Methyltransferase-Typ 11-Domänen umfassen, sind in der Tabelle A2 dargestellt. Die Methyltransferase-Typ 11-Domänen, wie vorhanden in SEQ ID NR: 58, sind in SEQ ID NR: 86 und 87 angegeben. Der Beispiel-Abschnitt lehrt Verfahren zum Identifizieren des Vorhandenseins von Methyltransferase-Typ 11 und ubiE/COQ5-Methyltransferase in dem PEAMT-Polypeptid, das durch SEQ ID NR: 58 repräsentiert wird.
SEQ ID NR: 58 umfasst zwei Methyltransferase-Typ 11-Domänen, repräsentiert durch SEQ ID NR: 86 (PPYEGKSVLELGAGIGRFTGELAQKAGEVIALDIIESAIQKNESVNGHYKNIKFMCADVTSPDLKIKDGSIDLIFSNWLLMYLSDKEVELMAERMIGWVKPGGYIFFRES) und SEQ ID NR: 87 (DLKPGQKVLDVGCGIGGGDFYMAENFDVHVVGIDLSVNMISFALERAIGLKCSVEFEVADCTTKTYPDNSFDVIYSRDTILHIQDKPALFRTFFKWLKPGGKVLITDY). Darüber hinaus umfasst SEQ ID NR: 58 eine ubiE/COQ5-Methyltransferase-Domäne, die repräsentiert wird durch SEQ ID NR: 88 (ERVFGEGYVSTGGFETTKEFVAKMDLKPGQKVLDVGCGIGGGDFYMAENFDVHVVGIDLSVNMISFALERAIGLKCSVEFEVADCTTKTYPDNSFDVIYSRDTILHIQDKPALFRTFFKWLKPGGKVLITDYCRSAETPSPETAEYIKQRGYDLHDVQAYGQMLKDAGFDDVIAEDRTDQ).
Ein in den Verfahren der Erfindung nützliches ”PEAMT-Polypeptid” kann ferner eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen:

1. Motiv 4: IFFRESCFHQSGD (SEQ ID NR: 89);
2. Motiv 5: EYIKQR (SEQ ID NR: 90);
3. Motiv 6: WGLFIA (SEQ ID NR: 91);

Die Motive 4 bis 6 sind in der C-terminalen Hälfte des PEAMT-Polypeptids lokalisiert, repräsentiert durch SEQ ID NR: 58 an den Aminosäurepositionen 138–150, 383–388 bzw. 467–472.
Vorzugsweise umfasst das in den Verfahren der Erfindung nützliche PEAMT-Protein ein Motiv, das mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% Sequenzidentität zu einem beliebigen der Motive 1 bis 3 aufweist.
Weiter bevorzugt umfasst das in den Verfahren der Erfindung nützliche PEAMT-Protein eine konservierte Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NR: 86 bis 88 oder zu einer beliebigen der Aminosäuredomänen, die in Tabelle C2 des Beispiel-Abschnitts dargestellt sind.
Ein ”PEAMT oder ein Homolog davon”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 58.
Alternativ, umfasst das Homolog eines PEAMT-Proteins eine konservierte Aminosäure-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu den Aminosäuremotiven, die in Tabelle C2 dargestellt sind.
Die Sequenzidentität wird unter Anwendung eines Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, oder BLAST ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 6 abgebildet ist, verwendet wird, bevorzugt eher bei der Gruppe I von PEAMT-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 58 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Weiterhin, sieht die Erfindung auch eine bislang unbekannte Nukleinsäuresequenz, welche ein FATB-Polypeptid codiert, und ein FATB-Polypeptid vor.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, umfassend:

(i) eine Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 130 repräsentiert;
(ii) das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 130 repräsentiert;
(iii) eine Nukleinsäuresequenz, codierend FATB-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 131 repräsentiert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend:

(i) eine Polypeptidsequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 131;
(ii) eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 131 repräsentiert;
(iii) Derivate von einer beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Polypeptidsequenzen.

Ein bevorzugtes Verfahren für das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, welche ein FATB-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
In Bezug auf FATB-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein FATB-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines solchen FATB-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Polypeptid codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”FATB-Nukleinsäuresequenz” oder ”FATB-Gen”.
Ein ”FATB-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend (i) ein plastidäres Transitpeptid; (ii) mindestens eine Transmembranhelix; (iii) und eine Acyl-ACP-Thioesterase-Famile-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002864;
Alternativ oder zusätzlich, bezieht sich ein ”FATB-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf eine beliebige Polypeptidsequenz, aufweisend (i) ein plastidäres Transitpeptid; (ii) in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Transmembranhelix, wie durch SEQ ID NR: 141 repräsentiert; und aufweisend, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Acyl-ACP-Thioesterase-Famile-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 140 repräsentiert.
Alternativ oder zusätzlich, bezieht sich ein ”FATB-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem FATB-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, oder auf eine beliebige der in Tabelle A3 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen.
Alternativ oder zusätzlich, bezieht sich ein ”FATB-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf eine beliebige Polypeptidsequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums von FATs (FATA und FATB zusammen) verwendet wird, wie demjenigen, der in 10 abgebildet ist, eher bei dem Ast von FATB-Polypeptiden, der die Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, umfasst (gezeigt durch einen Pfeil in 10), als bei dem Ast der FATA-Polypeptide einordnen lässt.
Alternativ oder zusätzlich, ist ein ”FATB-Polypeptid” ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität, die im Hydrolysieren von Acyl-ACP-Thioester-Bindungen, präferentiell von gesättigten Acyl-ACPs (mit Kettenlängen, welche zwischen 8 und 18 Kohlenstoffatomen variieren), unter Freisetzung freier Fettsäuren und Acyl-Carrier-Protein (ACP) besteht.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein so, dass ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines solchen LFY-like-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz; welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”LFY-like-Nukleinsäuresequenz” oder ”LFY-like-Gen”.
Ein ”LFY-like-Polypeptid” wie hierin definiert, bezieht sich auf einen beliebigen Transkriptionsfaktor, umfassend eine FLO_LFY-Domäne (InterPro-Zugangsnummer IPR002910; Pfam-Zugangsnummer PF01698). Die FLO_LFY-Domäne repräsentiert den Hauptteil der Proteinsequenz (siehe 14) und ist hochkonserviert (15).
Vorzugsweise, weist das LFY-like-Protein in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 146, auf, vorausgesetzt dass das homologe Protein das konservierte FLO_LFY-Motiv, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive (wie die FLO_LFY-Domäne) betrachtet werden.
Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, bei der Gruppe von LFY-like-Polypeptiden einordnen.
Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53-61, AAAI Press; Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the protzeomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
In Bezug auf FATB-Polypeptide ist eine Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 93 nachstehend im Beispiel 4 hierin präsentiert. Zum Beispiel umfasst ein FATB-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 93, eine Acyl-ACP-Thioesterase-Familie-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002864. Ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A3 hierin ist in der 13 gezeigt. Derartige Alignments sind brauchbar zum Identifizieren der am stärksten bzw. der meisten konservierten Domänen oder Motive zwischen den FATB-Polypeptiden, wie der TMpred vorhergesagten Transmembranhelix (siehe Beispiel 5 hierin), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 141 (enthalten in SEQ ID NR: 93).
Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
In Bezug auf FATB-Polypeptide, beschriebt Beispiel 3 hierin in Tabelle B3 die prozentuale Identität zwischen dem FATB-Polypeptide, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 93, und den in der Tabelle A2 aufgelisteten FATB-Polypeptiden, welche so gering wie 53% Aminosäuresequenz-Identität sein kann.
Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Die Kenntnis der Lokalisierung eines Proteins hilft dabei, seine Funktion aufzuklären. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisation bis zum Tagging von Proteinen unter Einsatz von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Derartige Verfahren sind exakt, wenngleich arbeitsintensiv im Vergleich zu computergestützten Verfahren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht worden. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Swiss institute for Bioinformatics (Schweizer Institut für Bioinformatik) bereitgestellt werden, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere verfügbar. Die Identifizierung der subzellulären Lokalisierung des Polypeptids der Erfindung ist in Beispiel 5 gezeigt. Insbesondere wird SEQ ID NR: 2 der vorliegenden Erfindung dem plastidären (Chloroplasten-)Kompartiment von Pflanzenzellen zugeordnet. Zusätzlich zu einem Transitpeptid, umfassen FATB-Polypeptide ferner eine vorhergesagte Transmembranhelix (siehe Beispiel 5 hierin) zur Verankerung an eine Chloroplastenmembran.
Verfahren zur Ziellenkung zu Plastiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen den Gebrauch von Transitpeptiden ein. Die nachstehende Tabelle 3 zeigt Beispiele von Transitpeptiden, welche zum Ziellenken von beliebigem FATB-Polypeptid zu einer Plastide verwendet werden können, wobei das FATB-Polypeptid, in seiner natürlichen Form, normal nicht zu einer Plastide gelenkt wird, oder wobei das FATB-Polypeptid in seiner natürlichen Form dank eines anderen Transitpeptids (zum Beispiel seinem natürlichen Transitpeptid) zu einer Plastide gelenkt wird. Das Einklonieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein Transitpeptid codiert, stromaufwärts und im-Leseraster einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert (zum Beispiel ein FATB-Polypeptid, dem sein eigenes Transitpeptid fehlt), involviert molekulare Standardtechniken, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind.
Tabelle 3: Beispiele von Transitpeptid-Sequenzen, die beim Targeting von Polypeptiden zu Plastiden nützlich sind
Das FATB-Polypeptid wird in den Chloroplast zielgelenkt und ist darin aktiv, d. h. das FATB-Polypeptid ist zum Hydrolysieren von Acyl-ACP-Thioester-Bindungen, präferentiell von gesättigten Acyl-ACPs (mit Kettenlängen, die zwischen 8 und 18 Kohlenstoffatomen schwanken), unter Freisetzung von freien Fettsäuren und Acyl-Carrier-Protein (ACP) in der Lage. Assays zum Testen dieser Aktivitäten sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Weitere Einzelheiten sind im Beispiel 6 angegeben.
Ferner besitzen GS1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise Glutaminsynthase-Aktivität. Werkzeuge und Techniken zur Messung von Glutaminsynthase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Martin et al. Anal. Biochem. 125, 24–29, 1982 und Beispiel 6).
Darüber hinaus ergeben PEAMT-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Beispiel-Abschnitt dargelegt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem oder mehren von erhöhter/erhöhtem Grün-Biomasse, Frühwuchskraft, Gesamtsamengewicht, Zahl an Blüten je Rispe, Samenfüllrate, Tausendkerngewicht und Ernteindex.
Weiterhin besitzen LFY-like-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise DNA-Bindungs-Aktivität. Werkzeuge und Techniken zur Messung von DNA-Bindungs-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Ein Beispiel einer Charakterisierung von DNA-Bindungs-Eigenschaften eines Proteins wird von Xue (Plant J. 41, 638–649, 2005) angegeben.
Ferner ergeben LFY-like-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 7 und 8 dargelegt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag.
In Bezug auf GS1-Polypeptide, wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der von SEQ ID NR: 1 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen GS1-codierenden Nukleinsäuresequenz oder eines beliebigen GS1-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, welche GS1-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A1 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 2 repräsentierten GS1-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Chlamydomonas-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide, wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der von SEQ ID NR: 57 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 58 codiert. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen PEAMT codierenden Nukleinsäuresequenz oder eines beliebigen PEAMT-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, welche PEAMT-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 58 repräsentierten PEAMT-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 57 oder SEQ ID NR: 58 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt
In Bezug auf FATB-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der von SEQ ID NR: 92 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die FATB-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 93 codiert. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen, für ein FATB-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, welche FATB-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A3 des Beispiels 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 93 repräsentierten FATB-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A3 des Beispiels 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 92 oder SEQ ID NR: 93 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide, wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 145 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 146 codiert. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen LFY-like codierenden Nukleinsäuresequenz oder eines beliebigen LFY-like-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, welche LFY-like-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A4 des Beispiels 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 146 repräsentierten LFY-like-Polypeptids; wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A4 des Beispiels 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 145 oder SEQ ID NR: 146 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt
Hoch-eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Ferner stellt die Erfindung auch bisher unbekannte GS1-codierende Nukleinsäuresequenzen und GS1-Polypeptide bereit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das ausgewählt ist aus:

(i) einer Aminosäuresequenz, die von SEQ ID NR: 53 oder SEQ ID NR: 54 repräsentiert wird;
(ii) einer Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 53 oder SEQ ID NR: 54,
(iii) Derivaten von beliebigen der in (i) oder (ii) oben stehend angegebenen Aminosäuresequenzen.

Die Erfindungen sieht auch Nukleinsäuresequenzen vor, codierend die unbekannten GS1-Polypeptide, wie oben beschrieben, sowie Nukleinsäuresequenzen, die daran, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, hybridisieren.
Auch Nukleinsäuresequenzvarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, welche Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert beschaffen sind. Außerdem sind Nukleinsäuresequenzen in den Verfahren der Erfindung nützlich, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität, wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
Ferner zählen zu den, bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäuresequenzvarianten Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide, oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, Nukleinsäuresequenzen, die an Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, die GS1-Polypeptide, oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, Splice-Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide, oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide, oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide, oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide, oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängen-Nukleinsäuresequenzen sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäuresequenz hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
In Bezug auf GS1-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein GS1-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3a und 3b abgebildet ist, verwendet wird, eher bei dem Ast des Algen-Typs (der Gruppe von Algen-GS1-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst), als bei der Pflanzen-Chloroplasten- oder Pflanzen-Cytosol-Glutaminsynthase-Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein PEAMT-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 57. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 6 abgebildet ist, bevorzugt eher bei der Gruppe I von PEAMT-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 58 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf FATB-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein FATB-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem FATB-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird, oder zu beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A hierin angegeben sind. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 92.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 145. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, verwendet wird, bei der Gruppe von LFY-like-Polypeptiden einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stingenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid, oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, oder mit einem Abschnitt, wie hierin definiert, in der Lage ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert.
In Bezug auf GS1-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein GS1-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
In Bezug auf GS1-Polypeptide codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3a und 3b abgebildet ist, eher bei dem Ast des Algen-Typs (der Gruppe von Algen-GS1-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst), als bei der Pflanzen-Chloroplasten- oder Pflanzen-Cytosol-Glutaminsynthase-Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein PEAMT-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 57, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 6 abgebildet ist, eher bei der Gruppe I von PEAMT-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 58 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf FATB-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein FATB-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an ein Komplement davon, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, oder an ein Komplement davon, in der Lage ist.
In Bezug auf FATB-Polypeptide ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise in der Lage zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem FATB-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird, oder zu beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben sind. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie von SEQ ID NR: 92 repräsentiert, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 145, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, bei der Gruppe von LFY-like-Polypeptiden einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein GS1-Polypeptid, oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
In Bezug auf GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder A2 oder A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einer Splice-Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 oder A2 oder A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
In Bezug auf FATB-Polypeptide wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einer Splice-Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, welche im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweisen wie die Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird, und beliebige der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 abgebildet sind.
In Bezug auf GS1-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3a und 3b abgebildet ist, eher beidem Ast des Algen-Typs (der Gruppe von Algen-GS1-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst), als bei der Pflanzen-Chloroplasten- oder Pflanzen-Cytosol-Glutaminsynthase-Gruppe einordnen.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 57, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 58 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 6 abgebildet ist, eher bei der Gruppe I von PEAMT-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 58 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf FATB-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 92, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 93 codiert. Vorzugsweise ist die Splice-Variante eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem FATB-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird, oder zu beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben sind.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 145, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 146 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, bei der Gruppe von LFY-like-Polypeptiden einordnen.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid, oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
In Bezug auf GS1-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das GS1-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3a und 3b abgebildet ist, eher bei dem Ast des Algen-Typs (der Gruppe von Algen-GS1-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst), als bei der Pflanzen-Chloroplasten- oder Pflanzen-Cytosol-Glutaminsynthase-Gruppe einordnen.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das PEAMT-Polypeptid von SEQ ID NR: 58 und beliebige der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 57 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 58 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 6 abgebildet ist, eher bei der Gruppe I von PEAMT-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 58 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf FATB-Polypeptide weisen die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das FATB-Polypeptid von SEQ ID NR: 93 und beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 92 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 93 codiert. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem FATB-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird, oder zu beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben sind.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das LFY-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 146 und beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 145 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 146 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, bei der Gruppe von LFY-like-Polypeptiden einordnen.
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide, wie oben definiert, codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäuresequenz durch Gen-Shuffling erhalten wird.
In Bezug auf GS1-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3a und 3b abgebildet ist, vorzugsweise eher bei dem Ast des Algen-Typs (der Gruppe von Algen-GS1-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst), als bei der Pflanzen-Chloroplasten- oder Pflanzen-Cytosol-Glutaminsynthase-Gruppe einordnen.
In ”Bezug auf PEAMT-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 6 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe I von PEAMT-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 58 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf FATB-Polypeptide codiert die durch Genshuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem FATB-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird, oder zu beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 hierin angegeben sind.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, vorzugsweise bei der Gruppe von LFY-like-Polypeptiden einordnen Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenz-Varianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
GS1-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die GS1-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus der Abteilung Chlorophyta, weiter bevorzugt aus der Klasse Chlorophyceae, stärker bevorzugt aus der Familie Chlamydomonadaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Chlamydomonas reinhardtii.
PEAMT-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die PEAMT-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
In vorteilhafter Weise stellt die vorliegende Erfindung bisher unbekannte PEAMT-Nukleinsäuresequenz(en) und -Polypeptidsequenzen zur Verfügung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes PEAMT-Nukleinsäuresequenz-Molekül bereitgestellt, das mindestens 98% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 57 umfasst.
Darüber hinaus wird ein isoliertes Polypeptid, das mindestens 99% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 58 aufweist, bereitgestellt.
FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die, ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Es versteht sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unterhalb des Erdbodens einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100, ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhten Ertrag und/oder erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen. Jedoch wurde in Bezug auf LFY-like-Polypeptide keine frühere Induktion der Blütezeit beobachtet.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Geschwindigkeit der Keimung, Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer maximalen Größe zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung, ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren und/oder Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid, oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen tritt ungeachtet dessen auf, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
Erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften treten ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden, auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen erlauben. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen bei optimalen Wachstumsbedingungen (kultiviert unter Nicht-Stress-Bedingungen) ergeben typischerweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
In Bezug auf GS1-Polypeptide, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre angebaut werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PEAMT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In Bezug auf FATB-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre angebaut werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In Bezug auf GS1-Polypeptide gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei, unter Bedingungen von Stickstoffmangel angebauten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In Bezug auf GS1-Polypeptide gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche unter Bedingungen von Salzstress kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Salzstress kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um ein oder mehrere beliebige von, unter anderem NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ handeln.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PEAMT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
In Bezug auf FATB-Polypeptide führt die Ausführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dazu, dass unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogene Pflanzen erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Da diverse umweltbedingte Stressformen ähnliche Wege aktivieren, sollte die beispielhafte Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung mit Dürrestress nicht als ein Beschränkung auf Dürrestress angesehen werden, sondern vielmehr als Abbild zum Aufzeigen der Beteiligung von FATB-Polypeptiden, wie oben definiert, an der Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen, im Allgemeinen abiotischen Stressformen, wachsen gelassen werden.
Es versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Dürre oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂, verursacht wird.
In Bezug auf FATB-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften, unter abiotischen Stressbedingungen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen wachsen gelassen werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein FATB-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des stärken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche, hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zeilen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuresequenzen und Cholorphyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen von großem Interesse.
In Bezug auf FATB-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, wachsen gelassen werden, welche erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem, Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein LFY-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile oder Zellen davon umfassen ein Nukleinsäuresequenz-Transgen, das ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid, oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie oben definiert, codiert.
Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide, wie hierin definiert, codierenden Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen vor. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:

(a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid, oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie oben definiert;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, welche ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid, oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, die auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
In Bezug auf FATB, ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Ein Beispiel eines pflanzlichen konstitutiven Promotors ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein Reis-GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert wird.
In Bezug auf GS1 kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein Promotor, der zum Antreiben der Expression in Schößlingen bzw. Sprosstrieben, und insbesondere in grünem Geweben, fähig ist, ist in den Verfahren besonders nützlich. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin für die verschiedenen Promotortypen.
In Bezug auf PEAMT kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
In Bezug auf FATB kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu erhöhen. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich, vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert ist. Der pflanzliche konstitutive Promotor treibt die Expression einer codierenden Sequenz bei einer Höhe an, die in allen Fällen unter derjenigen ist, die unter der Steuerung eines viralen 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Ebenfalls in Bezug auf FATB sind organspezifische Promotoren, zum Beispiel für bevorzugte Expression in Blättern, Stengeln, Knollen, Meristemen, nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Entwicklungs-regulierte Promotoren sind ebenfalls nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
In Bezug auf LFY-like kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin. Ebenfalls nützlich in den Verfahren der Erfindung ist ein Spross-spezifischer (oder Grüngewebe-spezifischer) Promotor.
In Bezug auf GS1-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die GS1-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer GS1-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter Steuerung durch einen Spross-spezifischen Promotor begrenzt ist.
Der spross-spezifische Promotor treibt die Expression vorzugsweise in Grüngewebe an, weiter bevorzugt ist der spross-spezifische Promotor aus einer Pflanze isoliert, wie etwa ein Protochlorophyllid-Reduktase (pPCR)-Promotor, stärker bevorzugt stammt der Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor repräsentiert durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 6 ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie von SEQ ID NR: 6 repräsentiert. Für weitere Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
In Bezug auf GS1-Polypeptide können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, umfassend einen Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, der im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 6 ist, und die Nukleinsäure, welche das GS1-Polypeptid codiert.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die PEAMT-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 57, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer PEAMT-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem Pflanzen-abgeleiteten Promotor, wie einem GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 85 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 85 repräsentiert. Siehe den hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
In Bezug auf PEAMT-Polypeptide können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, umfassend einen GOS2-Promotor, der im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 85 ist, und die Nukleinsäure, welche das PEAMT-Polypeptid codiert.
In Bezug auf FATB-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine das FATB-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 92, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer FATB-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Erhöher einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Increaser- bzw. Erhöher-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Erhöher, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die LFY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 145, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer LFY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor oder unter der Steuerung durch einen Spross-spezifischen Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, wie ein GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 149 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 149 repräsentiert. Siehe Tabelle 2a im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide ist, gemäß eines anderen bevorzugten Merkmals der Erfindung, die Nukleinsäure, welche ein LFY-like-Polypeptid codiert, funktionsfähig gebunden an einen spross-spezifischen (oder Grüngewebe-spezifischen) Promotor. Der spross-spezifische Promotor ist vorzugsweise ein Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, stärker bevorzugt stammt der Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor aus Reis, weiter bevorzugt wird der Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor repräsentiert durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 150 ist, am stärksten bevorzugt ist der Promotor beschaffen, wie von SEQ ID NR: 150 repräsentiert. Beispiele anderer spross-spezifischer Promotoren, welche ebenfalls zur Ausführung der Verfahren der verwendet werden können, sind in der Tabelle 2b im oben stehenden Abschnitt ”Definitionen” gezeigt.
In Bezug auf LFY-like-Polypeptide können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die den GOS2-Promotor oder den Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor umfasst, der funktionsfähig an die Nukleinsäure gebunden ist, welche das LFY-like-Polypeptid codiert.
Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Enhancer einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markengen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure, codierend ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, umfasst.
Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer ein GS1-Polypeptid codierenden oder ein PEAMT-Polypeptid codierenden oder ein LFY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines GS1-Polypeptids oder eines PEAMT-Polypeptids oder eines LFY-like-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, codierend ein FATB-Polypeptid, wie hierin oben definiert, umfasst.
Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, von einer ein FATB-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines FATB-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung, wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
Nach einer Transformation, werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlichexprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und, nach einer anfänglichen Wachstumsperiode, einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, welche ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Weiterhin schließt die Erfindung auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, die ein FATB-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, welche funktionsfähig an einen konstituiven Promotor gebunden ist. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuresequenzen oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei die erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäuresequenz umfassen, welche ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Ferner erstreckt sich die Erfindung ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz umfassen, die ein FATB-Polypeptid (wie hierin oben definiert) codiert, welche funktionsfähig an einen konstituiven Promotor gebunden ist, wie etwa, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid, oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid, oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die FATB-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Anwendung dieser FATB-Polypeptide in der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
In Bezug auf GS1-Polypeptide, können die hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, oder die GS1-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein Gen gekoppelt sein kann, das ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codiert. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die GS1-Polypeptide selbst, oder die PEAMT-Polypeptide selbst, oder die LFY-like-Polypeptide, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
In Bezug auf FATB-Polypeptide, können hierin beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die FATB-Polypeptide codieren, oder die FATB-Polypeptide selbst, Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein FATB-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen, oder die FATB-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Allelische Varianten einer ein GS1-Polypeptid oder ein PEAMT-Polypeptid, oder ein FATB-Polypeptid oder ein LFY-like-Polypeptid codierenden Gen/Nukleinsäuresequenz können ebenfalls Anwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, und welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Nukleinsäuresequenzen, die GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige, Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide, oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide, oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den ein GS1-codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen.
Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der GS1-Polypeptide oder PEAMT-Polypeptide, oder FATB-Polypeptide oder LFY-like-Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenz in der genetischen Karte zu berechnen; welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäuresequenz-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenz-Sonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäuresequenz-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerten derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen oder gesteigerten samenertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber weiteren abiotischen und biotischen Stressformen, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Merkmals-Gesichtspunkte

1. Ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein cytoplasmatisches Glutaminsynthase (GS1)-Polypeptid vom Algen-Typ, wobei das Algen-Typ-GS1-Polypeptid eine Gln-synt_C-Domäne (Pfam-Eintrag PF00120) und eine Gln-synt_N-Domäne (Pfam-Eintrag PF03951) umfasst.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das GS1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (a) Motiv 1, SEQ ID NR: 3; (b) Motiv 2, SEQ ID NR: 4; (c) Motiv 3, SEQ ID NR: 5; wobei in diesen Motiven maximal 2 Fehlpaarungen erlaubt sind.
3. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Algen-Typ-GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß beliebigen der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
5. Verfahren gemäß beliebigen der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß beliebigen der Punkte 1 bis 5, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen mit Nährstoffmangel erhalten werden.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem spross-spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor aus Reis, verbunden ist.
9. Verfahren gemäß beliebigen der Punkte 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer Alge, weiter bevorzugt aus der Klasse Chlorophyceae, weiter bevorzugt aus der Familie Chlamydomonadaceae, am stärksten bevorzugt aus Chlamydomonas reinhardtii ist.
10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß beliebigen der Punkte 1 bis 9 erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, umfasst.
11. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei eine der Steuerungssequenzen ein spross-spezifischer Promotor, vorzugsweise ein Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, am stärksten bevorzugt ein Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor aus Reis, ist.
13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 11 oder 12 transformiert ist.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fordern.
16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18 abgeleitet sind.
20. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Spross-Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
21. Isoliertes Polypeptid, gewählt aus: (i) einer Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 53 oder 54; (ii) einer Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 53 oder 54, (iii) Derivaten von beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
22. Eine isolierte Nukleinsäure, codierend ein Polypeptid, wie definiert in Punkt 22, oder eine Nukleinsäure, die daran hybridisiert.
23. Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon, umfassend eine Proteindomäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der in Tabelle C2 dargestellten Proteindomänen.
24. Verfahren gemäß Punkt 23, wobei die Nukleinsäure ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, welches in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamt sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 58 aufweist.
25. Verfahren gemäß Punkt 23 oder 24, wobei die Nukleinsäure, die ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, ein Abschnitt der Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 57 ist, oder ein Abschnitt einer Nukleinsäure ist, codierend ein Ortholog oder Paralog der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 58, wobei der Abschnitt eine Länge von mindestens 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810 aufeinanderfolgenden Nukleotiden besitzt, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide von SEQ ID NR: 57 stammen oder von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 58.
26. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 23 bis 25, wobei die Nukleinsäure, die ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, zum Hybridisieren an die Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, in der Lage ist, oder zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NR: 58 codiert.
27. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 23 bis 26, wobei die Nukleinsäure, die ein PEAMT-Polypeptid oder am Homolog davon codiert, ein Ortholog oder Paralog der von SEQ ID NR: 58 repräsentierten Sequenz codiert.
28. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 23 bis 27, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
29. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 23 bis 28, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, umfassend erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
30. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 23 bis 29, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, umfassend erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, unter Dürrestress-Bedingungen erhalten werden.
31. Verfahren gemäß Punkt 28, 29 oder 30, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
32. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 23 bis 31, wobei die Nukleinsäure, die ein PEAMT-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
33. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert.
34. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend mindestens 98% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 57.
35. Isoliertes Polypeptid, umfassend mindestens 99% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 58.
36. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, codierend ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 23 bis 27 und Punkte 34 und 35; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
37. Konstrukt gemäß Punkt 36, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
38. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 36 oder 37 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit geänderten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
39. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 36 oder 37 transformiert ist.
40. Verfahren für die Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon, wie in einem beliebigen der Punkte 23 bis 27 und Punkte 34 und 35 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
41. Transgene Pflanze mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultieren, die ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, wie es in einem beliebigen der Punkte 23 bis 27 und Punkte 34 und 35 definiert ist.
42. Transgene Pflanze gemäß Punkt 33, 39 oder 41, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
43. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 42 abgeleitet sind.
44. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein PEAMT-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, bei der Änderung von ertragsbezogenen Eigenschaften von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
45. Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Fettacyl-Acyl-Carrierprotein(ACP)-Thioesterase B (FATB)-Polypeptid, wobei das FATB-Polypeptid (i) ein plastidäres Transitpeptid; (ii) mindestens eine Transmembranhelix; (iii) und eine Acyl-ACP-Thioesterase-Familie-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002864 umfasst, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfasst.
46. Verfahren gemäß Punkt 45, wobei das FATB-Polypeptid aufweist (i) ein plastidäres Transitpeptid; (ii) in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Transmembranhelix, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 141; und in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Acyl-ACP-Thioesterase-Familie-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 140 repräsentiert, aufweist.
47. Verfahren gemäß Punkt 45 oder 46, wobei das FATB-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem FATB-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 93 oder zu beliebigen der in Tabelle A3 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
48. Verfahren gemäß beliebigen von Punkt 45 bis 47, wobei das FATB-Polypeptid eine beliebige Polypeptidsequenz ist, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums von FATs verwendet wird, wie demjenigen, der in 10 abgebildet ist, eher bei dem Ast von FATB-Polypeptiden, der die Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, umfasst, als bei dem Ast der FATA-Polypeptide einordnen lässt.
49. Verfahren gemäß einem beliebigen von Punkt 45 bis 48, wobei das FATB-Polypeptid ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ist, die im Hydrolysieren von Acyl-ACP-Thioester-Bindungen, präferentiell von gesättigten Acyl-ACPs (mit Kettenlängen, welche zwischen 8 und 18 Kohlenstoffatomen variieren), unter Freisetzung freier Fettsäuren und Acyl-Carrier-Protein (ACP) besteht.
50. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 45 bis 49, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, repräsentiert wird durch eine beliebige der in Tabelle A3 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn, oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A3 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID NRn, oder an ein Komplement davon, in der Lage ist.
51. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert.
52. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere beliebige aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
53. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
54. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Gesamtzahl an Samen, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex.
55. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist.
56. Verfahren gemäß Punkt 55, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor, bevorzugt ein Reis-GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert wird, ist.
57. Verfahren einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae ist, und die Nukleinsäuresequenz am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
58. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die bzw. der Pflanze, Teil oder Zelle davon ein isoliertes, ein FATB-Polypeptid codierendes Nukleinsäure-Transgen, das funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, umfasst.
59. Isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend: (i) eine Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 130 repräsentiert; (ii) das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 130 repräsentiert; (iii) eine Nukleinsäuresequenz, codierend FATB-Polypeptid mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 131.
60. Ein isoliertes Polypeptid, umfassend (i) eine Polypeptidsequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 131; (ii) eine Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 131; (iii) Derivate von einer beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Polypeptidsequenzen.
61. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein FATB-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 45 bis 51; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
62. Konstrukt gemäß Punkt 61, wobei die Steuerungssequenz ein konstitutiver Promotor ist.
63. Verfahren gemäß Punkt 60, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein Reis-GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert wird, ist.
64. Verwendung eines Konstrukts gemäß einem beliebigen der Punkte 61 bis 63 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten samenertragsbezogene Eigenschaften eines oder mehrere sind von: erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Gesamtzahl an Samen, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex.
65. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß einem beliebigen der Punkte 61 bis 63 transformiert ist.
66. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 45 bis 51 definiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
67. Transgene Pflanze mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz resultieren, die in funktionsfähiger Verknüpfung an einen konstitutiven Promotor ein FATB-Polypeptid codiert, wie es in einem beliebigen der Punkte 45 bis 51 definiert ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
68. Transgene Pflanze gemäß Punkt 58, 65 oder 67, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
69. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 68, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
70. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 68 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 69 abgeleitet sind.
71. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, wie es in einem beliebigen der Punkte 45 bis 51 definiert ist, bei der Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere von erhöhtem erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Gesamtzahl an Samen, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex umfassen.
72. Ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, wobei das LFY-like-Polypeptid eine FLO_LFY-Domäne umfasst.
73. Verfahren gemäß Punkt 72, wobei das LFY-like-Polypeptid mindestens 50% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 146 aufweist.
74. Verfahren gemäß Punkt 72 oder 73, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, bewirkt wird.
75. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 72 bis 74, wobei die Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A4 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
76. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 72 bis 75, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A4 angegebenen Proteine codiert.
77. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 72 bis 76, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
78. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 72 bis 77, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
79. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 74 bis 78, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
80. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 72 bis 79, wobei die Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
81. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, umfasst.
82. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 72 oder 73 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
83. Konstrukt gemäß Punkt 82, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
84. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 82 oder 83 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
85. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 82 oder 83 transformiert ist.
86. Verfahren für die Produktion einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, wie in Punkt 72 oder 73 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
87. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, wie in Punkt 72 oder 73 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
88. Transgene Pflanze gemäß Punkt 81, 85 oder 87, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
89. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 88, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
90. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 88 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 89 abgeleitet sind.
91. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein LFY-like-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
1 die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 2 repräsentiert, wobei die Gln-synt_N-Domäne (PF03951) fett unterstichen dargestellt ist, die Gln-synt_C-Domäne (PF00120) kursiv unterstichen dargestellt ist, und die konservierten Motive 1 bis 3 durch die gestrichelte Linie gezeigt sind.
2 gibt ein multiples Alignment von Algen-GS1-Proteinsequenzen wider.
3 zeigt phylogenetische Bäume von GS1-Proteinen. Tafel a gibt einen Überblick über GS1 (cytosolisch) und GS2 (chloroplastidär) Proteine in einem Zirkular-Phylogramm. Tafel b zeigt die Sequenzen, die der Algen-Gruppe zugeordnet werden, mit einigen wenigen Sequenzen der cytosolischen und cytoplasmatischen Außengruppen. Die Zahlen in dem Baum von Tafel b entsprechen den folgenden SEQ ID NRs: (1) SEQ ID NR: 21, (2) SEQ ID NR: 26, (3) SEQ ID NR: 27, (4) SEQ ID NR: 10, (5) SEQ ID NR: 11, (6) SEQ ID NR: 15, (7) SEQ ID NR: 24, (8) SEQ ID NR: 25, (9) SEQ ID NR: 12, (10) SEQ ID NR: 2, (11) SEQ ID NR: 16, (12) SEQ ID NR: 13, (13) SEQ ID NR: 28, (14) SEQ ID NR: 14, (15) SEQ ID NR: 9, (16) SEQ ID NR: 17, (17) SEQ ID NR: 19, (18) SEQ ID NR: 22, (19) SEQ ID NR: 30, (20) SEQ ID NR: 18, (21) SEQ ID NR: 20, (22) SEQ ID NR: 23, (23) SEQ ID NR: 29.
4 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer GS1-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-Protochlorophyllid-Reduktase-Promotors (pPCR).
5 repräsentiert ein Mehrfach-Alignment der Aminosäuresequenzen der PEAMT-Polypeptide von Tabelle A2.
6 repräsentiert einen phylogenetischen Baum der Aminosäuresequenzen der PEAMT-Polypeptide von Tabelle A2.
7 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, der Arath_PEAMT_1 codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
8 repräsentiert schematisch den allgemeinen Weg für die Synthese verschiedener Fettsäuren (Triacylglycerol; TAGs, synthetisiert über den Kennedy-Weg) und Schritte, die normalerweise bei der Herstellung von Samen-Speicherlipiden beteiligt sind. Die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen FATB-Polypeptide sind mit einem Pfeil angezeigt. Gemäß Marillia et al. (2000) Developments in Plant Genetics and Breeding. Band 5, 2000, Seiten 182–188.
9 repräsentiert eine Skizze eines FATB-Polypeptids, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, welches die folgenden Merkmale umfasst: (i) ein plastidäres Transitpeptid; (ii) mindestens eine Transmembranhelix; (iii) und eine Acyl-ACP-Thioesterase-Famile-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002864.
10 zeigt einen phylogenetischen Baum von FATs-Polypeptiden aus verschiedenen Quellen-Organismen, gemäß Mayer et al. (2007) BMC Plant Biology 2007. FATA-Polypeptidee und FATBA-Polypeptide gehören sehr deutlich verschiedenen Ästen an. Der FATB-Ast von Polypeptiden, die nützlich bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung sind, ist mit einem Kreis gekennzeichnet, der Pfeil zeigt auf das Arabidopsis thaliana-FATB-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird.
11 repräsentiert die graphische Ausgabe des Algorithmus TMpred für SEQ ID NR: 93. Aus der Algorithmus-Vorhersage unter Verwendung von SEQ ID NR: 93 wird eine Transmembranhelix zwischen dem Transitpeptid (lokalisiert am N-Terminus des Polypeptids) und der Acyl-ACP-Thioesterase-Famile-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002864 (lokalisiert am C-Terminus des Polypeptids) vorhergesagt.
12 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa-Pflanzen, einer Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid codiert, unter der Steuerung eines konstitutiven Promotors aus Reis.
13 zeigt ein AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation)-Mehrfach-Sequenzalignment der FATB-Polypeptide von Tabelle A3. Das N-terminale plastidäre Transitpeptid, wie vorhergesagt durch TargetP, ist in SEQ ID NR: 93 (Arath_FATB) eingekastet, und die vorhergesagte Transmembranhelix (typisch nur für FATB-Polypeptide), wie vorhergesagt durch TMpred, ist quer über, zur Ausführung der Verfahren der Erfindung nützliche, FATB-Polypeptide eingekastet. Das konservierte IPR002864 der Acyl-ACP-Thioesterase-Famile ist durch X unter der Consensus-Sequenz markiert. Die drei hoch-konservierten katalytischen Reste sind quer über das Alignment eingekastet.
14 repräsentiert die LFY-like-Proteinsequenz von SEQ ID NR: 146, wobei die FLO_LFY-Domäne in Fettdruck gezeigt ist.
15 repräsentiert ein ClustalW 2.0.3-Mehrfach-Alignment von verschiedenen LFY-like-Proteinen. Die Asterisken zeigen absolut konservierte Aminosäuren, die Doppelpunkte zeigen hoch-konservierte Aminosäurereste und die Punkte zeigen konservierte Aminosäuren.
16 zeigt einen phylogenetischen Baum, erzeugt aus dem Alignment von 15 mit dem 'Neighbour Joining'-Algorithmus und 1000 Bootstrap-Repetitionen. Die Bootstrap-Werte sind gezeigt.
17 represents repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer LFY-like codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die in der Erfindung anwendbar sind
1.1 Glutamin-Synthase (GS1)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen können die Vorgabeparameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden.

Die Tabelle A1 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A1: Beispiele von Algen-Typ-GS1-Polypeptiden:

Pflanzen-Quelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Chlamydomonas reinhardtii 133971	1	2
Aureococcus anophagefferens_20700	31	9
Chlamydomonas reinhardtii_129468	32	10
Chlamydomonas reinhardtii_136895	33	11
Chlamydomonas reinhardtii_147468	34	12
Helicosporidum sp. DQ323125	35	13
Thalassiosira pseudonana_26051	36	14
Volvox carterii 103492	37	15
Volvox carterii 77041	38	16
Hordeum vulgare_TA45411_4513	43	21
Physcomitrella patens_122526	46	24
Physcomitrella patens_146278	47	25
Pinus taeda TA26121_3352	48	26
Pinus taeda TA8958_3352	49	27
Phaedactylum tricornutum_51092	50	28
Hordeum vulgare_7728	53	55
Hordeum vulgare_7958	54	56

In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um solche verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. Vorzugsweise ist das Algen-Typ-GS1-Polypeptide von Algen-Herkunft (wie die Proteine, die durch SEQ ID NR: 2 und SEQ ID NR: 9 bis 16 exemplifiziert werden).
1.2. Phosphoethanolamin N-methyltransferase (PEAMT)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen wurden die Vorgabeparameter angepasst, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel wurde der E-Wert erhöht, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden.
Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden.

Die Tabelle A2 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen und davon codierten Polypeptiden an, welche mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A2: Beispiele von PEAMT-Polypeptiden:

Name	Pflanzen-Quelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Arath_PEAMT_1	Arabidopsis thaliana	57	58
AT1G48600_1	Arabidopsis thaliana	59	60
AT1G73600_1	Arabidopsisthaliana	61	62
AT3gG18000	Arabidopsis thaliana	63	64
Os01g50030	Oryza sativa	65	66
Os05g47540_1	Oryza sativa	67	68
Os05g47540_2	Oryza sativa	69	70
Os05g47540_3	Oryza sativa	71	72
PtPEAMT1	Populus trichocarpa	73	74
PtPEAMT2	Populus trichocarpa	75	76
ZmPEAMTa	Zea Mays	77	78
ZmPEAMTb	Zea Mays	79	80
ZmPEAMTc	Zea Mays	81	82

1.3. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402).
Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäuresequenz- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden.
Zum Beispiel wurde das von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen können die Vorgabeparameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden.

Die Tabelle A3 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A3: Beispiele von FATB-Polypeptidsequenzen und den codierenden Nukleinsäuresequenzen:

Name	Quell-Organismus	Öffentl. Datenbank Zugangsnummer	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
Arath_FATB	Arabidopsis thaliana	NM_100724.2	92	93
Aqufo_FATB	Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens	TA8354_338618	94	95
Arahy_FATB	Arachis hypogaea	EF117305.1	96	97
Braju_FATB	Brassica juncea	DQ856315.1	98	99
Brasy_FATB	Brachypodium sylvaticum	EF059989	100	101
Citsi FATB	Citrus sinensis	TA12334_2711	102	103
Elagu_FATB	Elaeis guineensis	AF147879	104	105
Garma_FATB	Garcinia mangostana	U92878	106	107
Glyma_FATB	Glycine max	BE211486.1 CX703472.1	108	109
Goshi_FATB	Gossypium hirsutum	AF034266	110	111
Helan FATB	Helianthus annuus	AF036565	112	113
Irite_FATB	Iris tectorum	AF213480	114	115
Jatcu_FATB	Jatropha curcas	EU106891.1	116	117
Maldo_FATB	Madus domestica	TA26272_3750	118	119
Orysa_FATB	Oryza sativa	NM_001063311	120	121
Picgl_FATB	Picea glauca	TA16055_3330	122	123
Popto_FATB	Populus tomentosa	DQ321500.1	124	125
Ricco_FATB	Ricinus communis	EU000562.1	126	127
Soltu_FATB	Solanum tuberosum	TA28470_4113	128	129
Tager_FATB	Tagetes erecta	Proprietary	130	131
Vitvi_FATB	Vitis vinifera	GSVIVT00016807001 (Genoscope)	132	133
Zeama_FATB	Zea mays	EE033552.2, BQ577487.1, AW066432.1	134	135
Zeama_FATB II	Zea mays	DV029251.1, CF010081.1	136	137
Poptr_FATB	Populus trichocarpa	Poptr_FATB	138	139

In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um derartige verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”.
1.4. Leafy-like (LFY-like)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen können die Vorgabeparameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. ”Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden

Die Tabelle A4 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A4: Beispiele von LFY-like-Polypeptiden:

Pflanzen-Quelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Arabidopsisthaliana	145	146
Arabidopsis thaliana	176	151
Brassica juncea	177	152
Ionopsidium acaule	178	153
Leavenworthia crassa	179	154
Selenia aurea	180	155
Arabidopsis lyrata	181	156
Streptanthus glandulosus	182	157
Cochlearia officinalis	183	158
Brassica oleracea var. botrytis	184	159
Idahoa scapigera	185	160
Capsella bursa-pastoris	186	161
Barbarea vulgaris	187	162
Petunia hybrida	188	163
Antirhinum majus	189	164
Nicotiana tabacum	190	165
Nicotiana tabacum	191	166
Triticum aestivum	192	167
Triticum aestivum	193	168
Lolium temulentum	194	169
Oryza sativa	195	170
Zea mays	196	171
Zea mays	197	172
Ophrys tenthredinifera	198	173
Lycopersicon esculentum	199	174
Carica papaya	200	175

In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um derartige verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren
Beispiel 2: Alignment von in der Erfindung nützlichen Sequenzen
2.1 Glutamin-Synthase (GS1)
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des ClustalW 2-Algorithmus für progressives Alignment (Larkin et al., Bioinformatics 23, 2947–2948, 2007) durchgeführt. Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) von 0,2, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Gonnet (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments kann eine geringfügige Editierung von Hand vorgenommen werden. Die Sequenzkonservierung zwischen GS1-Polypeptiden liegt im Wesentlichen überall in der vollständigen Sequenz vor und entspricht der Tatsache, dass die Gln-synt_C-Domäne und die Gln-synt_N-Domäne großteils die komplete Proteinsequenz überspannen. Die GS1-Polypeptide sind in der 2 aligniert.
Ein phylogenetischer Baum von GS1-Polypeptiden (3) wurde aus dem Alignment mit Hilfe einer großen Anzahl an pflanzlichen Glutaminsynthase-Proteinsequenzen erstellt (Tafel a). Aus diesem Baum lässt sich deutlich ersehen, dass die Algen-Glutaminsynthase-Proteine eine eigene Gruppe bilden (den Ast des Algen-Typs), in Vergleich zu anderen Glutaminsynthase-Proteinen von pflanzlichem Ursprung. Die Tafel b zeigt den gleichen Algen-Typ-Ast von Glutaminsynthase-Proteinen, jedoch mit einem begrenzten Satz von Proteinen außerhalb dieser Gruppe.
Die in Tafel a gezeigten Proteine wurden unter Verwendung von MUSCLE (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792–97) aligniert. Ein Neighbour-Joining-Baum wurde mit Hilfe von QuickTree (Howe et al. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546–7) berechnet. Belege der Haupt-Zweige werden für 100 Bootstrap-Repetitionen angezeigt. Ein zirkulares Phylogramm wurde unter Verwendung von Dendroscope (Huson et al. (2007), BMC Bioinformatics 8(1): 460) gezeichnet. Der Baum zeigt deutlich, dass die Algen-GS1-Proteine eine eigene Gruppe bilden. Die in Tafel b gezeigten Sequenzen wurden mit Hilfe von ClustalW 2 aligniert (Protein-Wichtungsmatrix: Gonnet-Serie, Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2), und ein Baum wurde mit Hilfe des 'Neighbour Joining'-Algorithmus mit 1000 Bootstrap-Repetitionen errechnet. Zum Zeichnen des Zirkular-Phylogramms wurde 'Dendroscope' verwendet.
2.2. Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT)
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) durchgeführt. Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Die Sequenzkonservierung zwischen PEAMT-Polypeptiden liegt im Wesentlichen in der C-terminalen Hälfte der Polypeptide vor, wobei die N-terminale Domäne üblicherweise hinsichtlich Sequenzlänge und Zusammensetzung variabler ist. Die PEAMT-Polypeptide sind in der 5 aligniert. Aminosäurereste an Positionen, die mit * oder : markiert sind, sind in PEAMT-Proteinen hochkonserviert.
Ein phylogenetischer Baum von PEAMT-Polypeptiden (6) wurde mit Hilfe eines 'Neighbour Joining'-Clusterungs-Algorithmus erstellt, wie er im Clustal W-Programm bereitgestellt wird.
2.3. Fettacyl-Acyl-Carrjer-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
Ein Mehrfach-Sequenzalignment aller FATB-Polypeptidsequenzen in Tabelle A wurde durchgeführt unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation). Die Ergebnisse des Alignments sind in 10 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt. Das N-terminale plastidäre Transitpeptid, wie vorhergesagt durch TargetP (Beispiel 5 hierin) ist in SEQ ID NR: 93 (Arath_FATB) eingekastet worden, und die vorhergesagte Transmembranhelix (typisch nur für FATB-Polypeptide), wie vorhergesagt durch TMpred (Beispiel 5 hierin), ist quer über, zur Ausführung der Verfahren der Erfindung nützliche, FATB-Polypeptide, eingekastet worden. Das konservierte IPR002864 der Acyl-ACP-Thioesterase-Famile ist durch X unter der Consensus-Sequenz markiert. Die drei hochkonservierten katalytischen Reste sind quer über das Alignment eingekastet.
2.4. Leafy-like (LFY-like)
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe von ClustalW 2.0.3 (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500) mit Standardeinstellung (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2) durchgeführt. Die Sequenzkonservierung zwischen LFY-like-Polypeptiden liegt im Wesentlichen über die volle Länge der Polypeptide vor, wobei der N-Terminus und der C-Terminus üblicherweise hinsichtlich Sequenzlänge und Zusammensetzung variabler sind. Die LFY-like-Polypeptide sind in der 15 aligniert.
Ein phylogenetischer Baum von LFY-like-Polypeptiden (16) wurde mit Hilfe eines 'Neighbour Joining'-Clusterungs-Algorithmus, wie er in ClustalW 2.0.3 bereitgestellt wird, mit 1000 Bootstrap-Repetitionen erstellt
Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen in der Erfindung brauchbaren Polypeptidsequenzen
3.1 Glutaminsynthase (GS1)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).

Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, Algen-GS1-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 23% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 2 (C.reinhardtii_133971), sein. Es sollte angemerkt werden, dass die Algen-Typ-GS1-Polypeptide aus höheren Pflanzen (wie SEQ ID NR: 21, 24, 25, 26, 27 und 28) mindestens 41% Sequenzidentität haben, wenn sie mit MatGAT analysiert werden, wie oben beschrieben. Tabelle B1: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der GS1-Polypeptidsequenzen.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
1. C.reinhardtii_129468		43,7	95,3	20,5	86,6	43,9	45,6	41,7	40,0
2. C.reinhardtii_133971	62,3		42,1	23,0	43,7	92,1	52,1	68,3	48,5
3. C.reinhardtii_136895	95,8	61,3		20,1	86,3	42,9	46,2	42,2	39,8
4. C.reinhardtii_147468	31,5	36,6	31,2		21,0	23,0	20,7	26,1	22,1
5. V.carterii_103492	92,4	63,9	91,3	33,6		43,4	46,3	42,3	41,5
6. V.carterii_77041	62,3	95,3	61,3	37,1	63,9		52,2	70,4	49,0
7. A.anophagefferens_20700	57,4	64,9	58,4	30,8	59,9	65,4		49,6	52,3
8. Helicosporidum_DQ323125	60,1	79,8	59,6	37,1	60,1	81,1	62,7		46,3
9. T.pseudonana_26051	56,0	60,1	55,0	34,8	57,2	61,1	63,5	59,9

3.2. Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe von Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist unterhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist oberhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, PEAMT-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 60.2% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 58, sein.
3.3. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe von Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B3 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg (mit Ausnahme der partiellen Polypeptidsequenzen) gezeigt.
Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, Volllängen-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 53% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 93, sein.
3.4. Leafy-like (LFY-like)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe von Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B4 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben.
Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, LFY-like-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 50% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 146, sein. Tabelle B4: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der LFY-like-Polypeptidsequenzen.
Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, enthalten in Polypeptidsequenzen, die in der Erfindung nützlich sind
4.1. Glutamin-Synthase (GS1)
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle C1 dargestellt. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert ist.

Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	Aminosäure-Koordinaten auf SEQ ID NR 2
InterPro	IPR008146	Glutamin-Synthetase, katalytische Region
PRODOM	PD001057	Gln_synt_C	153–370
PFAM	PF00120	Gln-synt_C	132–381
PROSITE	PS00181	GLNA_ATP	264–280
InterPro	IPR008147	Glutamin-Synthetase, beta-Grasp
PFAM	PF03951	Gln-synt_N	36–116
PROSITE	PS00180	GLNA_1	74–91
InterPro	IPR014746	NGlutamin-Synthetase/Guanido-Kinase, katalytische Region
GENE3D	G3DSA:3.30.590.10	ohne Beschreibung	135–376
PANTHER	PTHR20852	GLUTAMIN-SYNTHETASE	42–381
PANTHER	PTHR20852:SF14	GLUTAMIN-SYNTHETASE (GLUTAMAT–AMMONIAKLIGASE) (GS)	42–381

4.2. Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT)
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche viele übliche Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 58 repräsentiert, sind in der Tabelle C2 dargestellt. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 58 repräsentiert wird.

Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	SEQ ID NR:	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 58
Interpro	IPR013216	Methyltransferase type 11	86	34–143
Interpro	IPR013216	Methyltransferase type 11	87	263–370
Interpro	IPR001601	Generische Methyltransferase		104–144
Interpro	IPR001601	Generische Methyltransferase		333–371
Interpro	IPR004033	UbiE/COQ5 Methyltransferase	88	239–418

4.3. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, Panther, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Tabelle C3: Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird.

InterPro-Zugangsnummer und -name	Integrierte Datenbank, Name	Integrierte Datenbank, Zugangsnummer	Integrierte Datenbank, Zugangs-Name
IPR002864 Acyl-ACP Thioesterase-Familie	Pfam	PF01643	Acyl-ACP_TE
Keine IPR integriert	G3DSA: 3.10.129.10	CATH	G3DSA:3.10.129.10
Keine IPR integriert	SSF54637	Superfamily	SSF54637 Thioesterase/Thiolester-Dehydrase-Isomerase

4.4. Leafy-like (LFY-like)
Die ”Integrated ”Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche viele gewöhnliche Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten. InterPro wird am 'European Bioinformatics institute' in Großbritannien bereitgehalten.
Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 146 repräsentiert, sind in der Tabelle C4 dargestellt. Tabelle C4: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 146 repräsentiert wird.

Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 146

InterPro IPR002910 Floricaula/leafy Protein

HMMPfam PF01698 FLO_LFY T[1–395] 0.0
Beispiel 5: Topologie-Vorhersage der Polypeptidsequenzen, die in der Erfindung nützlich sind
5.1. Glutamin-Synthase (GS1)
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Orts-Zuordnung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
SEQ ID NR: 2 wurde mit TargetP 1.1 analysiert. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentierten Polypeptidsequenz kann es sich um das Cytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird (vorhergesagte Lokalisierung: Andere: Wahrscheinlichkeit 0,737, Zuverlässigkeitsklasse 3). Vorhersagen aus anderen Algorithmen ergaben ähnliche Ergebnisse:

Psort:: Peroxisom 0,503; Cytoplasma 0,450
PA-SUB:: Cytoplasma, Sicherheit 100%
PTS1:: nicht zu Peroxisom gelenkt

Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark
• PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).

5.2. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP) Thioesterase B (FATB)
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
Ergebnisse der TargetP v1.1-Vorhersage:
Anzahl an Suchsequenzen: 1
Einschließlich Spaltungsstellen-Vorhersagen.
Verwendung des PLANT Netzwerks.

Name Länge cTP mTP SP andere Ort RC TP-Länge

Sequenz 412 0,957 0,010 0,089 0,144 C 1 49
Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 93 ist der Chloroplast, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids liegt bei 49 Aminosäuren ausgehend vom N-terminus (nicht so zuverlässig wie die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung an sich; kann hinsichtlich Länge um wenige Aminosäuren abweichen).
Es können viele Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark

Eine Transmembran-Domäne bezeichnet üblicherweise eine einzelne Transmembran-alpha-Helix eines Transmembranproteins. Sie wird als ”Domäne” bezeichnet, weil eine alpha-Helix in der Membran unabhängig vom Rest des Proteins gefaltet werden kann. Noch allgemeiner ist eine Transmembrandomäne jedwede dreidimensionale Proteinstruktur, welche in der Membran thermodynamisch stabil ist. Dies kann eine einzelne alpha-Helix, ein stabiler Komplex von mehreren Transmembran-alpha-Helizes, eine Transmembran-beta-Tonne, eine beta-Helix von Gramicidin A, oder eine beliebige andere Struktur sein.
Das Programm TMpred trifft eine Vorhersage über Membran-durchspannende Regionen und ihre Orientierung. Der Algorithmus basiert auf der statistischen Analyse durch TMbase, einer Datenbank von natürlich vorkommenden Transmembranproteinen. Die Vorhersage wird unter Verwendung einer Kombination von mehreren Wichtungs-Matrizes zur Bewertung-erstellt (K. Hofmann & W. Stoffel (1993) TMbase – A database of membrane spanning Proteins segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 166). TMpred ist Teil der European Molecular Biology-Netzwerkdienste (EMBnet.ch), und wird am Server des ”Swiss Institute of Bioinformatics” gehalten. TMpred-Ausgabe (siehe Figur 11 für graphische Ausgabe):

# von AA bis AA Länge Gesamtwert

Stark bevorzugtes Modell 1 84 107 24 1214

Alternatives Modell 1 89 113 25 1018
5.3. Leafy-like (LFY-like)
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 146, werden in Tabelle D präsentiert. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der wie durch SEQ ID NR: 146 repräsentierten Polypeptidsequenz kann es sich um das Mitochondrion handeln, obwohl die Zuverlässigkeit der Vorhersage gering ist. Tabelle D: TargetP 1.1-Analyse von Atleafy, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 146, wobei Len die Länge des Proteins ist, cTP: Wahrscheinlichkeit für ein Chloroplasten-Transitpeptid, mTP: Wahrscheinlichkeit für ein mitochondriales Transitpeptid, SP: Wahrscheinlichkeit für ein Signalpeptid des sekretorischen Wegs, other: Wahrscheinlichkeit für ein sonstiges subzelluläres Targeting, Loc: vorhergesagte Lokalisierung, RC: Zuverlässigkeitsklasse, TPlen: vorhergesagte Transitpeptid-Länge:

Name Len cTP mTP SP other Loc RC TPlen

Atleafy 424 0,181 0,432 0,015 0,404 M 5 61
Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation, Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark

Beispiel 6: Assay bezüglich den in der Erfindung nützlichen Polypeptidsequenzen
6.1. Glutaminsynthase (GS1)
Assay für Glutaminsynthase, wie über den Handel von Sigma-Aldrich erhältlich (modifiziert nach Kingdon, H. S., Hubbard, J. S., und Stadtman, E. R. (1968) Biochemistry 7, 2136–2142):
Prinzip:
ADP, erzeugt durch GS1 nach Synthese von Glutamin, wird mit Phosphor(enol)pyruvat und Pyruvatkinase verwendet, um Pyruvat und ATP zu erzeugen. Pyruvat wird durch L-Lactat-Dehydrogenase in L-Lactat umgewandelt, bei Oxidation von β-NADH zu β–NAD. Die Oxidation von NADH lässt sich spektrophotometrisch bei 340 nm bei 37°C mit einem Lichtweg von 1 cm in einem Puffer mit pH 7.1 verfolgen.
Reagentien:

A. 100 mM Imidazol-HCl-Puffer, pH 7,1 bei 37°C (Herstellen von 200 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von Imidazol, Sigma Prod. Nr. I-0250. Einstellen auf pH 7,1 bei 37°C mit 1 M HCl.)
B. 3 M Natriumglutamat-Lösung (Glu) (Herstellen von 10 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von L-Glutaminsäure, Mononatrium-Salz, Sigma Prod. Nr. G-1626.)
C. 250 mM Adenosin-5'-triphosphat-Lösung (ATP) (Herstellen von 5 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von Adenosin-5'-triphosphat, Dinatrium-Salz, Sigma Prod. Nr. A-5394. FRISCH ZUBEREITEN.)
D. 33 mM Phospho(enol)pyruvat-Lösung (PEP) (Herstellen von 10 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von Phospho(enol)pyruvat, Trinatrium-Salz, Hydrat, Sigma Prod. Nr. P-7002. FRISCH ZUBEREITEN.)
E. 900 mM Magnesiumchlorid-Lösung (MgCl₂) (Herstellen von 10 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von Magnesiumchlorid, Hexahydrat, Sigma Prod. Nr. M-0250.)
F. 1 M Kaliumchlorid-Lösung (KCl) (Herstellen von 5 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von Kaliumchlorid, Sigma Prod. Nr. P-4504.)
G. 1,2 M Ammoniumchlorid-Lösung (NH4Cl) (Herstellen von 5 ml in entionisiertem Wasser unter Verwenden von Ammoniumchlorid, Sigma Prod. Nr. A-4514.)
H. 12,8 mM β-Nicotinamid-Adenindinucleotid-Lösung, Reduzierte Form (β-NADH) (Den Inhalt einer 10 mg-Flasche β-Nicotinamid-Adenindinucleotid, Reduzierte Form, Dinatrium Salt, Sigma Stock Nr. 340-110, in geeigneten Volumen Reagens A lösen. FRISCH ZUBEREITEN.)
I. PK/LDH-Enzymlösung (PK/LDH) (PK/LDH Enzym-Lösung in 50% Glycerol, Sigma Prod. Nr. P-0294, verwenden; enthält ungefähr 700 Units/ml Pyruvatkinase und 1000 Units/ml Lactatdehydrogenase. L-Lactatdehydrogenase Unit-Definition: Eine Unit reduziert pro Minute 1,0 µMol Pyruvat zu L-Lactat bei pH 7,5 und 37°C. Pyruvatkinase Unit-Definition: Eine Unit wandelt pro Minute 1,0 µmol Phospho(enol)pyruvat zu Pyruvat bei pH 7,6 bei 37°C um.)
J. Glutamin-Synthetase-Enzymlösung (Unmittelbar vor Gebrauch eine Lösung mit 4–8 Units/ml Glutaminsynthetase in kaltem entionisiertem Wasser bereiten).

Vorgehensweise: Herstellen eines Reaktions-Cocktails durch Pipettieren (in Milliliter) der folgenden Reagentien in einen geeigneten Behälter:

Entionisiertes Wasser 20,60

Reagens A (Puffer) 17,20

Reagens B (Glu) 1,80

Reagens C (ATP) 1,80

Reagens E (MgCl₂) 3,55

Reagens F (KCl) 0,90

Reagens G (NH₄Cl) 1,80

Mischen durch Rühren und Einstellen auf pH 7,1 bei 37°C mit 0,1 N HCl oder 0,1 N NaOH, falls notwendig. Pipettieren (in Millilitern) der folgenden Reagentien in geeignete Küvetten:

Test Leerprobe

Reaktions-Cocktail 2,70 2,70

Reagens D (PEP) 0,10 0,10

Reagens H (β-NADH) 0,06 0,06

Mischen durch Umdrehen, und Äquilibrieren auf 37°C. Überwachen der A₃₄₀ nm bis konstant, unter Verwendung eines geeignet thermostatisierten Spektrophotometers. Danach zugeben:

Reagens I (PK/LDH) 0,04 0,04

Mischen durch Umdrehen, und Äquilibrieren auf 37°C. Überwachen der A₃₄₀ nm bis konstant, unter Verwendung eines geeignet thermostatisierten Spektrophotometers. Danach zugeben:

Entionisiertes Wasser - 0,10

Reagens J (Enzym-Lösung) 0,10 -

Unverzüglich Mischen durch Umdrehen, und Aufzeichnen der Verringerung der A₃₄₀ nm für etwa 10 Minuten. Man erhält ΔA₃₄₀ nm/min mit Hilfe der maximalen linearen Geschwindigkeit, für Test als auch Leerprobe. Berechnungen:

3: = Assay-Gesamtvolumen (in Milliliter)
15: = Umrechnungs-Faktor zu 15 Minuten (Unit-Definition)
6,22: = Millimolar Extinktionskoeffizient von β-NADH bei 340 nm
0,1: = Volumen (in Milliliter) verwendetes Enzym

Unit-Definition:
Eine Unit setzt, bei pH 7,1, in 15 Minuten 1,0 µmol L-Glutamat zu L-Glutamin bei 37°C um.
Assay-Endkonzentrationen:
In einem 3,00 ml Reaktionsmix sind die Endkonzentrationen 34,1 mM Imidazol, 102 mM Natriumglutamat, 8,5 mM Adenosine-5'-triphosphat, 1,1 mM Phosphoenolpyruvat, 60 mM Magnesiumchlorid, 18,9 mM Kaliumchlorid, 45 mM Ammoniumchlorid, 0,25 mM β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, 28 Units Pyruvatkinase, 40 Units L-Lactatdehydrogenase und 0,4–0,8 Units Glutaminsynthetase.
6.2. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP)-Thioesterase B (FATB)
In der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützliche Polypeptide zeigen typischerweise enzymatische Thioesterase-Aktivität. Es gibt viele Assays zur Messung derartiger Aktivität, zum Beispiel, kann das FATB-Polypeptid in einem E. coli-Stamm exprimiert werden, der defizient bezüglich der Aufnehme freier Fettsäure aus dem Medium ist. Wenn ein FATB-Polypeptid in diesem System funktioniert, sammelt sich das freie Fettsäureprodukt der Thioesterase-Reaktion daher im Medium an. Durch Messen der freien Fettsäuren im Medium kann die enzymatische Aktivität des Polypeptids identifiziert werden (Mayer & Shanklin (2005) J Biol Chem 280: 3621). Thioesterase-Assays bezüglich enzymatischer Aktivität von FATB-Polypeptid können auch wie in Voelker et. al. (1992; Science 257: 72–74) beschrieben durchgeführt werden.
Der Fachmann kennt allgemein solche experimentellen Vorgehen zum Messen von enzymatischer Aktivität von FATB-Polypeptid, einschließlich der Aktivität eines FATB-Polypeptids, wie es durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert wird.
Beispiel 7 Klonieren der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird
7.1. Glutamin-Synthase (GS1)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte Chlamydomonas reinhardtii-cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 µl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm08458 (SEQ ID NR: 7; Sense, Startcodon in Fettdruck): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctt aaacaatggccgcgggatctgtt-3' und prm08459 (SEQ ID NR: 8, Rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgctgctcctgcgcttacagaa-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pGS1, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Eintritts- bzw. Entry-Klon, welcher SEQ ID NR: 1 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen pflanzlichen selektierbaren Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor-Promotor (pPCR, SEQ ID NR: 6) für spross-spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pPCR::GS1 (3) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
7.2. Phosphoethanolamin-N-methyltransferase (PEAMT)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 µl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren der Primer: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaa tggagcattctagtgatttg-3' (SEQ ID NR: 83; Sense) und der Primer 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcagagtt ttgggataaaaaca-3' (SEQ ID NR: 84; rückwärts, komplementär), welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pArath_PEAMT_1, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Eintritts-Klon, der die SEQ ID NR: 57 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 85) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::Arath_PEAMT_1 (7) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
7.3. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP)-Thioesterase B (FATB)
Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) sowie Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Die Arebidopsis thaliana-Nukleinsäuresequenz, die eine FATB-Polypeptidsequenz wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 93 codiert, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine cDNA-Bank verwendet wurde, die unter Verwendung von RNA aus Arabidopsis-Pflanzen bei verschiedenen Entwicklungsstadien konstruiert worden war. Die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, wurden für die PCR-Amplifikation verwendet: prm08145: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggtggccacctctgc-3' (SEQ ID NR: 142, Sense) und prm08146: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttttcttacggtgcagttcc-3' (SEQ ID NR: 143, rückwärts, komplementär). Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (attB-Stellen beinhaltend) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt: Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon” hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, erworben.
Der Eintritts-Klon, der die SEQ ID NR: 92 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 144) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::FATB (12) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
7.4. Leafy-like (LFY-like)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 µl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm4841 (SEQ ID NR: 147; Sense, Startcodon fettgedruckt): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggc ttaaacaatggatcctgaaggtttcac-3' und prm4842 (SEQ ID NR: 148; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaccaaactagaaacgcaagt-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pLFY-like, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Eintritts-Klon, der die SEQ ID NR: 145 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 5) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. In einer alternativen Ausführungsform wurde ein trieb- bzw. spross-spezifischer Promotor verwendet (PCR, Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, SEQ ID NR: 150).
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::LFY-like (16) oder pPCR::LFY-like gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 8: Pflanzentransformation
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Celli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Transformation von Mais
Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Weizen
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexico) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet, werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt.
T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Sojabohne
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A & M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Ansäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jung-Setzlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Raps/Canola
Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Ansäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Alfalfa
Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, Wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie, et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 µm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle
Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwolle-Samen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 µg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 µg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 µg/ml MgCl₂, sowie mit 50 bis 100 µg/ml Cefotaxim und 400–500 µg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
Beispiel 9: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
9.1 Auswertungsansatz
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren und dass die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung erfüllt wurden.
Vier Ereignisse wurden, unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens, wie für die T2-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Dürre-Screen
Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens nähern. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden werden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte geht, werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann wieder zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff (N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Salzstress-Screen
Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden Samen-bezogene Parameter gemessen.
9.2 Statistische Analyse: F-Test
Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
9.3 Gemessene Parameter
Messung von Biomassen-bezogenen Parametern
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Messungen von Samen-bezogenen Parametern
Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Der Ernteindex (HI) ist in der Vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
10.1 Glutamin-Synthase (GS1)
Die Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff (N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.

Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche GS1-Nukleinsäure unter Bedingungen mit Nährstoffmangel exprimieren, sind nachstehend in der Tabelle E1 präsentiert. Eine Erhöhung vonmehr als 5% wurde für Gesamt-Samenertrag, Anzahl gefüllter Samen, Füllrate, Gesamtzahl an Samen und Ernteindex beobachtet. Diese Erhöhungen wurden in einem anschließenden Experiment bestätigt. Tabelle E1:

	1. Experiment		Bestätigungsexperiment
Parameter	% Zuwachs	p-Wert	% Zuwachs	p-Wert
Gesamt-Samenertrag	17	0,011	18	0,000
Zahl gefüllter Samen	16	0,014	18	0,000
Füllrate	7	0,043	10	0,308
Gesamtzahl an Samen	26	0,117	15	0,000
Ernteindex	12	0,019	14	0,021

Darüber hinaus wurde eine Erhöhung für Biomass (2 positive Linien von 4, Gesamtzuwachs 13%) und für Frühwuchskraft (3 positive Linien von 4, Gesamtzuwachs 28%) gefunden.
10.2. Phosphoethanolamin-N-Methyltransferase (PEAMT)
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Arath_PEAMT_1 Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind nachstehend aufgeführt. Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für Gesamt-Samenertrag, Samen-Füllrate, Anzahl an Blüten pro Rispe und Ernteindex beobachtet (Tabelle E2). Tabelle E2. Ergebnisse der phänotypischen Auswertung unter Nicht-Stress-Bedingungen.

Parameter Kontrollpflanze % Erhöhung in transgener Pflanze geg.

Gesamt-Samenertrag 12

Blüten pro Rispe 5,1

Samen-Füllrate 12

Ernte-Index 3,4
Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fiel, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt.
Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine PEAMT-Nukleinsäure unter Dürre-Stress-Bedingungen exprimieren, sind hierin nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung wurde für Gesamt-Samengewicht, Anzahl gefüllter Samen, Füllrate, Ernteindex und Tausendkerngewicht beobachtet (Tabelle E3). Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für die oberirdische Fläche (AreaMax; grüne Biomasse) Emergenzwuchskraft (Frühwuchskraft), und von 2,5% für das Tausendkerngewicht, beobachtet. Tabelle E3. Ergebnisse der phänotypischen Auswertung unter Dürre-Screening.

Parameter % Erhöhung in transgener Pflanze geg. Kontrollpflanze

oberirdische Fläche 5,4

Emergenzwuchskraft 15

Tausendkerngewicht 3
10.3. Fettacyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP)-Thioesterase B (FATB)
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T1- und T2-Generation-Reispflanzen, welche eine Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, codiert, unter der Steuerung eines konstitutiven GOS2-Promotors exprimieren und unter normalen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen wurden, sind nachstehend angegeben.

Es bestand eine signifikante Erhöhung bei der Frühwuchskraft, bei der oberirdischen Biomasse, beim Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, bei der Gesamtzahl an Samen, bei der Anzahl gefüllter Samen, bei der Samenfüllrate und beim Ernteindex der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle E4 gezeigt ist. Tabelle E4: Ergebnisse der Auswertung von transgenen T1- und T2-Generation-Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, die ein FATB-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 93 repräsentiert, codiert, unter der Steuerung eines GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren.

Eigenschaft	gesamter mittlerer % Zuwachs in 6 Ereignissen in der T1-Generation	gesamter mittlerer % Zuwachs in 4 Ereignissen in der T2-Generation
Gesamt-Samenertrag pro Pflanze	17%	9%
Gesamtzahl an Samen	1%	8%
Gesamtzahl gefüllter Samen	17%	10%
Samenfüllrate	14%	2%
Ernteindex	17%	6%

10.4. Leafy-like (LFY-like)
Transgene Reispflanzen, die eine LFY-like-Nukleinsäure unter Nichtstress-Bedingungen exprimierten, zeigten einen erhöhten Samenertrag. Die Pflanzen, welche Atleafy unter der Steuerung des konstitutiven Promotors oder des spross-spezifischen Promotors exprimierten, ergaben eine Erhöhung in einem oder mehreren der folgenden Parameter: Füllrate, Ernteindex, Tausendkerngewicht, Blüten pro Rispe.

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Claims

Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein cytoplasmatisches Glutaminsynthase (GS1)-Polypeptid vom Algen-Typ, wobei das Algen-Typ-GS1-Polypeptid eine Gln-synt_C-Domäne (Pfam-Eintrag PF00120) und eine Gln-synt_N-Domäne (Pfam-Eintrag PF03951) umfasst
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das GS1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1, SEQ ID Nr: 3; (ii) Motiv 2, SEQ ID NR: 4; (iii) Motiv 3, SEQ ID NR: 5, wobei in diesen Motiven maximal 2 Fehlpaarungen erlaubt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein Algen-Typ-GS1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren gemäß beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
Verfahren gemäß beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
Verfahren gemäß beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen mit Nährstoffmangel erhalten werden.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem spross-spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Verfahren gemäß beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer Alge, weiter bevorzugt aus der Klasse Chlorophyceae, weiter bevorzugt aus der Familie Chlamydomonadaceae, am stärksten bevorzugt aus Chlamydomonas reinhardtii ist.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, umfasst.
Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
Konstrukt gemäß Anspruch 11, wobei eine der Steuerungssequenzen ein sprossspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor, am stärksten bevorzugt ein Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 11 oder 12 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 18 abgeleitet sind.
Verwendung einer Nukleinsäure, die ein GS1-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Spross-Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Isoliertes Polypeptid, gewählt aus: (i) einer Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 53 oder 54; (ii) einer Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID NR: 53 oder 54 repräsentiert wird, (iii) Derivaten von beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
Eine isolierte Nukleinsäure, codierend ein Polypeptid, wie definiert in Anspruch 22, oder eine Nukleinsäure, die daran hybridisiert.