DE60109938T2

DE60109938T2 - Zusammenstellungen die aktive stilbenoidverbindungen enthalten zur senkung des triglyceridspiegels

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Publication number: DE60109938T2
Application number: DE60109938T
Authority: DE
Inventors: D. Wayne INMAN; Craig David HOPPE
Original assignee: Insmed Inc
Current assignee: Insmed Inc
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2001-08-15
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2021-08-16
Also published as: US6541522B2; DE60109938D1; WO2002013806A2; AU2001283355A1; EP1311258B1; ATE292460T1; WO2002013806A3; US20020055541A1; EP1311258A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Stilbenoiden, welche eine hypotriglyceridämische Aktivität in Säugern aufweisen. Speziell bezieht sie sich auf die Verwendung von solchen Stilbenoiden, insbesondere aus Cajanus cajan, in Nahrungsergänzungsmitteln zur Verabreichung an Säuger, die an erhöhten Serumtriglyceridspiegeln leiden, und zum Normalisieren von Serumtriglyceridspiegeln.
Zugehöriger Stand der Technik
Verwendungen von Cajanus SPP
Pflanzen von Cajanus spp. (Leguminosae), insbesondere C. cajan, das auch als Taubenerbse oder Straucherbse bezeichnet wird, sind krautartige Mitglieder der Leguminosenfamilie, welche verbreitet in Afrika, Asien und Süd- und Mittelamerika wachsen. Cajanus spp. sind in der traditionellen Medizin zum Behandeln von Magenschmerzen für Frauen, die für schwanger gehalten wurden, zum Behandeln von Wunden und Verbrennungen bzw. Verbrühungen, zum Behandeln von Zahnschmerzen, gegen Gonorrhö, zum Behandeln von schlechter Sehkraft und gegen Herzkrankheiten verwendet worden (Hedberg, H., et al., J Ethnopharmacol, 9 (2/3), 237–260 (1983).
Neben ihrer Verwendung durch traditionelle Heiler können diese Pflanzen auch in der normalen Nahrung als eine Nahrungspflanze enthalten sein. Cajanus spp. werden von Menschen in Indien, insbesondere solchen der wirtschaftlich schwächeren Schichten konsumiert. Zu diesem Zweck haben Studien berichtet, dass Ratten, die mit Straucherbsen, Urdbohnen und Pferdebohnen gefüttert wurden, eine lipidsenkende Wirkung zeigten. (Saraswathi Devi, K., et al., Atherosclerosis, 11, 479 (1970)).
Es wurde berichtet, dass Extrakte aus verschiedenen Leguminosenpflanzen eine hypotriglyceridämische Aktivität aufweisen. Jahromi beschrieb eine hypolipidämisch aktive Ethylacetatfraktion, die aus einem hypolipidämisch aktiven wässrigen Absud von Pterocarpus marsupium (Leguminosae) extrahiert wurde. Jahromi, M. A. F. et al., J. Nat. Prods. 56(7), 989–994 (1993). Untersuchungen haben auch über ein aktives hypertriglyceridämisches Agens aus der Straucherbse berichtet, das in einer extrahierten Proteinfraktion (Globulin) enthalten ist. Prema, L., et al., Atherosclerosis 18, 369–277 (1973). Prema, L., et al., Indian J. Biochem. Biophys., 10, 293–296 (1973).
Wenngleich Extrakte der Gattung Cajanus medizinisch verwendet worden sind, ist eine solche Verwendung nicht ohne potenzielle Nachteile. Erstens enthalten Pflanzenmaterialien neben einer oder mehreren Verbindungen mit einer "erwünschten" biologischen Aktivität oft auch eine große Zahl von in der Natur vorkommenden organischen Verbindungen, von denen eine oder mehrere eine physiologische oder pharmakologische Reaktion hervorrufen können, welche die Verwendung für die gewünschte Aktivität kontraindiziert. Zweitens kann, wenn in Form eines Pflanzenextrakts verabreicht wird, die tatsächliche Dosierung der unbekannten aktiven Verbindungen) nicht eingestellt werden, was zu einer unwirksamen Menge, d. h. einer zu niedrigen oder zu hohen Konzentration der verabreichten aktiven Verbindung führen kann.
Somit besteht ein Bedarf für eine isolierte oder eine gereinigte hypotriglyceridämisch aktive Verbindung, Zusammensetzungen, welche wirksame Mengen einer solchen Verbindung umfassen, und ihre Verwendung.
Isolierte Stilbenoide
Der Begriff Stilbenoid bezieht sich auf Stilbene, Bibenzyle (7,8-Dihydrostilbene) und Phenyldihydroisocumarine zusammen mit einer Reihe von stickstofffreien Phenathrenolen, von denen man annimmt, dass sie Produkte des gleichen Stoffwechselwegs sind, welcher zu Stilbenen führt. Gorham, J., The Stilbenoids in Progress in Phytochemistry, Band 6, Reinhold, et al., Hrsg., Pergamon Press, New York, 1980, Seiten 203–252. Stilbene (7,8-Dihydrostilbene) weisen im Allgemeinen zwei stereoisomere Formen, ein trans- oder ein cis-Gerüst auf:
Im Allgemeinen sind in der Natur vorkommende Stilbene und Bibenzyle in den 3,3',4,4',5 und 5'-Stellungen hydroxy- und/oder methoxysubstituiert. Zu einigen in der Natur vorkommenden Stilbenen und Bibenzylen gehören Pinosylvin (3,5-Dihydroxystilben), Piceatannol (3,3',4,5'-Tetrahydroxylstilben), Piceid (3,4',5-Trihydroxystilben-3-O-β-D-glucopyranosid) und Resveratrol (3,4',5-Trihydroxystilben). Mono-(3-Hydroxy-5-methoxystilben) und Dimethylether (3,5-Dimethoxystilben) von trans-Pinosylvin und ihre jeweiligen Dihydroderivate wurden angeblich aus dem Kernholz von Pinus armandi, P. morrisonicola und P. parviflorai isoliert (Fang, J–M, et al., Phytochemistry 27(5): 1395–1397 (1988)).
Stilbenoide können auch in den 2 und 4 (4 und 6)-Stellungen prenyliert oder homogeranyliert sein. 4-Isopentenylresveratrol (3,4',5-Trihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurde aus Arachis hypogea isoliert (Keen, N. T., of al., Phytochemistry 15, 1794 (1976)). Ein prenylierter Pinosylvindimethylether (3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurde aus Derris rariflora (Braz Filho, R., et al., Phytochemistry 14, 261 (1975a)) und D. floribunda (Braz Filho, R., et al., Phytochemistry 14, 1454 (1975b)) isoliert. Ein prenylierter Resveratroltrimethylether (3,4',5-Trimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurde angeblich aus D. floribunda isoliert (Braz Filho, R., et al., 1975b). Chlorophorin (4-Homogeranyl-2,3',4,5'-tetrahydroxystilben) wurde aus Chlorophora excelsa isoliert (Grundon, M. F., et al., Nature (Lond.) 163, 154 (1949)). Das Auftreten von mit Isoprenketten substituierten Stilbenen in Pflanzen wurde auch von King und Grundo (J. Chem. Soc. 1950, 3547 (1950)), Cooksey (Cooksey, C. J., et al., Phytochemistry 21(12), 2935 (1982)) und Monache (Lloydia 40(2): 201–208 (1977)) beschrieben.
Stilbenoid-2-carbonsäurederivate sind aus verschiedenen Pflanzen isoliert worden. Hydrangeasäure (3,4'-Dihydroxystilben-2-carbonsäure) wurde angeblich aus der gewöhnlichen Gartenhortensie (Hydrangea macrophylla) isoliert (Pryce, R. J., Phytochemistry 10, 2679 (1971)). Ein Glycosid, Gaylussacin, das angeblich aus Gaylussacia frondosa und G. vassata (Ericaceae) isoliert wurde, ergab ein 3,5-Dihydroxystilben-2-carbonsäurederivat (Gaylussacin-Aglycon) (Askari, A., et al., Lloydia 35,49 (1972)).
Aus Cajanus spp. isolierte Stilbenoide
Vier isoprenylierte Stilben-2-carbonsäure-phytoalexine (3-Hydroxy-5-methoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure, 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure, 3,5-Dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure und 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure) wurden angeblich aus den Blättern von mit Botrytis cinerea befallenem Cajanus cajan isoliert (Cooksey, CJ, et al., Phytochemistry 21(12): 2935–2938 (1982)).
Biologische Aktivität von Stilbenoiden
Es wurden verschiedene biologische Aktivitäten der Stilbenoide beschrieben. Zum Beispiel wurden cis-Piceid; trans-, cis-Resveratrol, Astringin und Astringinin aus Vitis vinifera im Hinblick auf antioxidative Aktivitäten getestet (A. Fauconneau, B., et al., Life Sci. 61(21): 2103 (1997)). Es wurde berichtet, dass 3,3',4,5'-Tetrahydroxystilben eine starke antimykotische Aktivität hat (Inamori, Y., et al., Chem. Phar. Bull. 33(7): 2904–09 (1985)). Es wurde auch berichtet, dass Resveratrol eine gegen die Plättchenaggregation gerichtete Aktivität (Chung, M–I, et al., Planta Med. 1992 58: 274–275; und Kimura, Y., et al., Biochim. Biophys. Acta 1995 175, 275–278); eine koronargefäßerweiternde Aktivität (Inamori, Y., et al., Chem. Pharm. Bull. 35, 887–89 (1987)), eine Antileukämieaktivität (Mannila, E., Phytochemistry, 1003, 33, 813–816), eine antimykotische Aktivität (Lanagcake, P., et al., Phytochemistry 1979, 18, 1025–1027; Hart, J. H., et al. Phytopathology 1979 69: 1138–1143) und eine Protein-Tyrosinkinase hemmende Aktivität (Orsini, F., et al., J. Nat. Prods. 60 1082–1087 (1997)) aufweist.
Die antitriglyceridämische Aktivität von Stilbenoiden wurde ebenfalls untersucht. Es wurde berichtet, dass aus den Wurzeln von Polygonum cuspidatium (auch als "Kojokon" und "Itadori-kon" bezeichnet) isoliertes Piceid (3,4',5-Trihydroxystilben-3-O-β-D-glucopyranosid) die Serumtriglycerid- und Leberlipidspiegel senkt (Arichi H., et al., Chem. Pharm. Bull. 30(5) 1766–1770 (1982)). Es wurde auch berichtet, dass aus Polygonum multiflorum isoliertes 2,3,5,4'-Tetrahydroxystilben-2-O-D-glucosid die Serum triglyceridspiegel verringert (Arichi, H., et al., 1982). Chem. Pharm. Bull., 30(5), 1766–1770, 1982 offenbart, dass oral verabreichtes Resveratrol die Ablagerung von Triglycerid und Cholesterin durch Verringern der Triglyceridsynthese in der Leber von Ratten hemmt, an die eine Ölmischung verfüttert wurde.
Den Erfindern sind keine prenylierten oder 2-Carbonsäure-Stilbenoide bekannt, von denen berichtet wurde, das sie eine antihypertriglyceridämische Aktivität aufweisen. Den Erfindern sind jedoch keine aus Cajanus spp. isolierten Stilbenoide bekannt, von denen berichtet wurde, dass sie eine antihypertriglyceridämische Aktivität aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Verwendung einer hypotriglyceridämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, mit der Formel:
worin
A eine Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation ist;
R₁ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy;
R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-11-Alkyl, C_2-11Alkenyl und C_2-11Alkinyl; und
R₅ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy;
wobei der Begriff "Alkyl" sich auf einen einwertigen von einem Alkan abgeleiteten Rest bezieht, welcher geradkettig oder verzweigt sein kann, einschließlich einer geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppe, welche einen Cycloalkylenteil enthält oder durch einen Cycloalkylenteil unterbrochen ist;
und eines Trägers zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zum Ergänzen der Nahrung eines Säugers, der an erhöhten Bluttriglyceridspiegeln leidet.
Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf die Verwendung einer hypotriglyceridämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, mit der Formel
worin
A eine Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation ist;
R₁ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy;
R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-11-Alkyl, C_2-11-Alkenyl und C_2-11-Alkinyl; und
R₅ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy;
wobei der Begriff "Alkyl" sich auf einen einwertigen von einem Alkan abgeleiteten Rest bezieht, welcher geradkettig oder verzweigt sein kann, einschließlich einer geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppe, welche einen Cycloalkylenteil enthält oder durch einen Cycloalkylenteil unterbrochen ist;
und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Senken der Serumtriglyceride bei einem Säuger, der dies benötigt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Liniendiagramm, das mittlere Serumglucosespiegel in mit Fett gefütterten und mit Streptozotocin (STZ) behandelten Ratten zeigt, denen GELUCIRE-Vehikel allein (2,5 ml/kg) und Verbindung A (250 mg/kg q. d.) verabreicht wurden. -O- bedeutet Vehikel; und
bedeutet Verbindung A. Blutproben wurden sechs Stunden nach der Verabreichung bzw. Gabe (Dosis) am Tag 2 und drei und sechs Stunden nach der Verabreichung an den Tagen 2 bis 4 entnommen. N = 8 in allen Fällen.
2 ist ein Liniendiagramm, das die mittleren Triglyceridspiegel (mg/dl) in mit Fett gefütterten und mit STZ behandelten Ratten zeigt, denen GELUCIRE^TM-Vehikel allein; und 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung A) verabreicht wurde. -O- bedeutet Vehikel; und
bedeutet Verbindung A, die in einer Menge von 250 mg/kg q. d. verabreicht wurde. Den Tieren wurden das Vehikel und die Verbindungen bei 24, 48, 72 und 96 h verabreicht und die Serumtriglyceridspiegel wurden bei 0, 30, 51, 54, 75 und 80 Stunden nach der oralen Verabreichung gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. (Varianzanalyse (ANOVA), einfaktoriell).
3 ist ein Liniendiagramm, das den mittleren Futterverbrauch (g) in mit Fett gefütterten und mit STZ behandelten Ratten zeigt, denen GELUCIRE^TM-Vehikel allein; und 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung A) verabreicht wurde. -O- bedeutet Vehikel; und
bedeutet Verbindung A, die in einer enge von mg/kg q. d. verabreicht wurde. Den Tieren wurden das Vehikel und die Verbindungen bei 24, 48, 72 und 96 h verabreicht und die Serumtriglyceridspiegel wurden bei 0, 30, 51, 54, 75 und 80 Stunden nach der oralen Verabreichung gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. (Varianzanalyse (ANOVA), einfaktoriell).
4 ist ein Liniendiagramm, das das mittlere Körpergewicht (g) in mit Fett gefütterten und mit STZ behandelten Ratten zeigt, denen GELUCIRE^TM-Vehikel allein; und 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung A) verabreicht wurden. -O- bedeutet Vehikel; und
bedeutet Verbindung A, die in einer Menge von 250 mg/kg q. d. verabreicht wurde. Den Tieren wurden das Vehikel und die Verbindungen bei 24, 48, 72 und 96 h verabreicht und die Serumtriglyceridspiegel wurden bei 0, 30, 51, 54, 75 und 80 Stunden nach der oralen Verabreichung gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. (Varianzanalyse (ANOVA), einfaktoriell).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
So wie er hier verwendet wird, wird der Begriff "unabhängig voneinander" oder die Äquivalente davon eingesetzt, um den Fall zu beschreiben, dass zwei oder mehr Gruppen gleich oder voneinander verschieden sein können und das Auftreten von einer Gruppe keine Auswirkung oder keinen Einfluss auf das Auftreten der anderen Gruppe hat.
Der Begriff "Alkyl" bezieht sich auf einen einwertigen von einem Alkan (Kohlenwasserstoff) abgeleiteten Rest, der 1 bis 11, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, sofern nichts anderes angegeben ist. Er kann geradkettig oder verzweigt sein. Zu bevorzugten geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen gehören Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, 3-Butyl und t-Butyl. Alkyl schließt auch eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ein, welche einen Cycloalkylenteil enthält oder durch einen Cycloalkylenteil unterbrochen ist.
Der Begriff "Cycloalkyl" bezieht sich auf cyclische einwertige Alkane. Zu bevorzugten Cycloalkylgruppen gehören Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Der Begriff "Alkenyl" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest, der 2 bis 11, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatome und wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Vorzugsweise ist eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung vorhanden und es können bis zu vier nicht-aromatische (nicht-mesomeriefähige) Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen vorhanden sein. Zu bevorzugten Alkenylgruppen gehören Ethenyl, Propenyl, Butenyl und Geranyl.
Der Begriff "Alkinyl" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest, der 2 bis 11, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatome und wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält. Es können bis zu drei Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen vorhanden sein. Zu bevorzugten Alkinylgruppen gehören Ethinyl, Propinyl und Butinyl.
Der Begriff "Alkoxy" bedeutet eine Alkylgruppe aus den angegebenen Kohlenstoffatomen, die durch eine Sauerstoffbindung gebunden ist.
Hypotriglyceridämisch aktive Stilbenoide
Die vorliegende Erfindung verwendet Zusammensetzungen, die eine hypotriglyceridämisch wirksame Menge einer isolierten Verbindung der Formel:
worin
A eine Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation ist;
R₁ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy;
R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-11-Alkyl, C_2-11-Alkenyl und C_2-11-Alkinyl; und
R₅ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy;
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon umfassen.
Das Folgende definiert Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlicher.
R₁ ist vorzugsweise H, OH, Methoxy oder Ethoxy;
R₂ ist vorzugsweise C_1-11-Alkyl oder C_2-11-Alkenyl. In einer besonderen Ausführungsform ist R₂ C_1-6-Alkyl oder C_2-6-Alkenyl. R₂ ist am meisten bevorzugt 3-Methyl-2-butenyl oder 3-Methylbutyl.
R₃ ist vorzugsweise H, OH, Methoxy oder Ethoxy.
R₄ ist vorzugsweise C_1-11-Alkyl oder C_2-11-Alkenyl. In einer besonderen Ausführungsform ist R₄ C_1-6-Alkyl oder C_2-6-Alkenyl. R₄ ist am meisten bevorzugt 3-Methyl-2-butenyl oder 3-Methylbutyl.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen verwendet, die eine hypotriglyceridämisch wirksame Menge einer isolierten Verbindung mit der Formel umfassen:
worin
R₂ und R₄ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-11-Alkyl oder C_2-11-Alkenyl und entweder R₂ oder R₄ H sind; und
R₃ C_1-6-Alkoxy ist.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(A) 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung A);
(B) 3-Hydroxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung B);
(C) 4-(3-Methyl-2-butenyl)-3,5-dimethoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung C);
(D) 6-(3-Methyl-2-butenyl)-3,5-dimethoxystilben-2-carbonsäure (Verbindung D);
(E) 3,4'-Dihydroxystilben-2-carbonsäure (Verbindung E);
(F) 3,5-Dihydroxystilben-2-carbonsäure (Verbindung F);
(G) 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxybibenzyl-2-carbonsäure (Verbindung H);
(H) 3,4'-Dihydroxybibenzyl-2-carbonsäure (Verbindung G); und
(I) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure (Verbindung I).

Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
Die folgenden Verbindungen veranschaulichen die Struktur und Nomenklatur der Verbindungen von Formel (I) und anderen hier beschriebenen Verbindungen.
Verbindung A
Verbindung A kann auch als Longistylin A-2-carbonsäure; 3-Hydroxy-4-isoprenyl-5-methoxystilben-2-carbonsäure; 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure; 2-Hydroxy-4-methoxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-6-(trans-styryl)benzoesäure bezeichnet werden.
Verbindung B
Verbindung B kann auch als 3-Hydroxy-6-isoprenyl-5-methoxystilben-2-carbonsäure oder 3-Hydroxy-5-methoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung C
Verbindung C kann auch als 3,5-Dimethoxy-4-isoprenylstilben-2-carbonsäure oder 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung D
Verbindung D kann auch als Longistylen C-2-carbonsäure; 3,5-Dimethoxy-6-isoprenylstilben-2-carbonsäure oder 3,5-Dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung E
Verbindung E kann auch als Hydrangeasäure oder 3,4'-Dihydroxystilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung F
Verbindung F kann auch als Gaylussacin-Aglycon; oder 3,5-Dihydroxystilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung G
Verbindung G kann auch als Lunularsäure; 3,4'-Dihydroxybibenzyl-2-carbonsäure; oder 3,4'-Dihydroxy-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung H
Verbindung H kann auch als 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure; 3,5-Dihydroxy-4-isoprenylbibenzyl-2-carbonsäure; 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure; oder 3,5-Dihydroxy-4-isoprenyl-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verbindung I
Verbindung I kann auch als 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-2-carbonsäure; 4-Isopentyl-3,5-dimethoxybibenzyl-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Verfahren zum Isolieren von Stilbenoiden
Die Verbindungen A–D können direkt aus Cajanus spp., vorzugsweise aus C. cajan isoliert oder chemisch synthetisiert und aus einem Reaktionsgemisch isoliert werden. Die Verbindungen E–I können isoliert oder durch dem Fachmann bekannte Verfahren und auch so, wie es in dieser Anmeldung beschrieben ist, halbsynthetisch hergestellt werden. Ganz gleich auf welche Weise können die isolierten Stilbenoide der Formel (I) in gereinigter Form, vorzugsweise in im Wesentlichen gereinigter Form, mittels Säulenchromatografie, Umkristallisierung oder andere dem Fachmann bekannte Mittel erhalten werden.
Isolieren von Stilbenoiden aus Cajanus SPP
Die Verbindungen A–D können aus Cajanus spp., vorzugsweise C. cajan unter Verwendung der nachstehend beschriebenen veranschaulichenden Verfahren oder anderer Standardextraktions- und Reinigungsmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden (Cooksey, C. J., et al., 1982).
Isolieren von Stilbenoiden aus anderen Spezies
Die Verbindung E wurde angeblich aus Hydrangea macrophylla isoliert (Gorham, J., Phytochemistry 16, 249 (1977)). Das Glycosid von Verbindung F, Gaylussacin, wurde angeblich aus den Blättern von Gaylussacia baccata und G. frondosa isoliert (Askari, A., Lloydia, 35(1), 49 (1972)). Die Verbindung G (Lunularsäure) wurde aus Hydrangea macrophylla isoliert (Valio, IFM, et al., Nature (London) 223, 1176 (1969), Gorham, J., Phytochemistry 16, 249 (1977) und Pryce, R. J., Phytochemistry 10, 2679 (1971)). Die Verbindung H wurde angeblich in Radula complanata identifiziert; und die Verbindung I wurde aus Verbindung H durch Methylierung mit (Me)₂SO₄ halbsynthetisch hergestellt (Asakawa, Y., et al., Phytochemistry 17, 2115 (1978)). Eine Methylierung von sauren Bibenzylen kann mit (Me)₂SO₄ erreicht werden. (Asakawa (1978)).
Isolierung und Reinigung von Stilbenoiden
Pflanzenmaterial aus Cajanus spp., vorzugsweise C. cajan (Leguminoseae) wird zunächst mit einem Lösungsmittel extrahiert, um einen rohen Extrakt zu erhalten, welcher die identifizierten Stilbenoide enthält. Mit "Pflanzenmaterial" ist ein beliebiger Teil der Cajanus-Pflanze wie etwa Rinde, Blätter, Blüten, Wurzeln und Stängel gemeint. Vorzugsweise werden die Blätter der Cajanus-Pflanze verwendet. Das Pflanzenmaterial kann gegebenenfalls vor der Extraktion zerkleinert, gemahlen, mazeriert oder anderweitig behandelt werden. Alternativ kann sich das Pflanzenmaterial bereits in einem pulverisierten, zerkleinerten, gemahlenen, mazerierten oder fein zerkleinerten Zustand befinden, wenn es hier verwendet wird. Zu geeigneten Extraktionslösungsmitteln gehören polare Lösungsmittel, unpolare Lösungsmittel oder Gemische davon. Zu brauchbaren polaren Lösungsmitteln gehören Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Aceton, Butanol, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidinon, Dimethylsulfoxid, Wasser und Gemische davon, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Zu brauchbaren unpolaren Lösungsmitteln gehören Pentan, Hexan, Heptan, höhere Alkan- und andere Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Petroleumether.
Vorzugsweise wird das Pflanzenmaterial mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert, um die Menge an Stilbenoiden zu maximieren, welche aus dem Pflanzenmaterial extrahiert werden kann. Mehr bevorzugt wird das Pflanzenmaterial mit einem Gemisch aus polarem Lösungsmittel und Wasser gewaschen, wobei das Verhältnis von Wasser zu polarem Lösungsmittel im Bereich von 1 : 99 bis 99 : 1 Volumen/Volumen (Vol./Vol.) liegt. Am meisten bevorzugt ist das polare Lösungsmittel ein organischer Alkohol wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Aceton, Butanol und dergleichen. Wenn der organische Alkohol Ethanol ist, beträgt das Verhältnis von Wasser zu organischem Alkohol vorzugsweise 5 : 95 bis 95 : 5 (Vol./Vol.), mehr bevorzugt 10 : 90 bis 30 : 70 (Vol./Vol.) und am meisten bevorzugt 20 : 80 (Vol./Vol.).
Das Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem Lösungsmittel kann bei einer Temperatur von ungefähr Raumtemperatur bis ungefähr der Rückflusstemperatur des gewählten Lösungsmittels oder Lösungsmittelsystems, vorzugsweise bei Raumtemperatur, während ungefähr 2 Stunden bis 72 Stunden, vorzugsweise während ungefähr 24 Stunden durchgeführt werden, um die Menge an Stilbenoiden zu maximieren, welche aus dem Pflanzenmaterial isoliert werden kann.
Das Pflanzenmaterial kann auch gerührt, eingeweicht oder anderweitig dem Lösungsmittel ausgesetzt werden, um das Extraktionsverfahren zu erleichtern. Zum Beispiel kann das Pflanzenmaterial mechanisch vermischt, beschallt oder anderweitig in dem Lösungsmittel durch dem Fachmann bekannte Verfahren gerührt werden.
Der resultierende Rohextrakt kann anschließend filtriert werden, um unerwünschte feste Verunreinigungen daraus zu entfernen und um ein Rohfiltrat zu erhalten, das die Stilbenoide enthält. Zu geeigneten Filterverfahren gehört das Leiten des Rohextrakts durch Diatomeenerde, z. B. CELITE^TM (Diatomeenerde, die von Fisher Scientific (Los Angeles, CA) verkauft wird), CELATOM^TM (Diatomeenerde, die von Great Western Chemical in Richmond, CA, verkauft wird); Silicagel; oder einen Glasfiltertrichter. Eine Zentrifugation von Lösungen oder verdünnten Lösungen des Rohextrakts kann ebenfalls eingesetzt werden, um unerwünschte feste Verunreinigungen daraus zu entfernen.
Das Rohfiltrat wird konzentriert, vorzugsweise im Vakuum, und der resultierende Rückstand wird dadurch weiter gereinigt, dass er zwischen zwei Verteilungslösungsmitteln verteilt wird, um die Ausbeute und insgesamt erhaltene Reinheit der isolierten Stilbenoide zu erhöhen. Es ist wichtig, dass die Verteilungslösungsmittel ineinander unvermischbar sind. Vorzugsweise ist eines der Verteilungslösungsmittel ein nicht-wässriges Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Diethylether, Ethylmethylacetat, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Acetat, Pentan, Hexan, Heptan, höhere Alkan(C < 7)lösungsmittel, Dichlormethan und andere Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Petrolether, von denen der Fachmann weiß, dass sie in Wasser unvermischbar sind oder im Stande sind, Stilbenoide aufzulösen. Das wässrige Lösungsmittel sollte vorzugsweise im Stande sein, in dem Pflanzenmaterial vorkommende Verunreinigungen aufzulösen.
Die organische Phase, welche die Stilbenoide enthält, wird abgetrennt, gegebenenfalls vereinigt und anschließend zur Trockne konzentriert, um ein Rohkonzentrat zu erhalten, welches an Stilbenoiden angereichert ist. Die zuvor beschriebenen Extraktions- und Filterschritte können wiederholt werden, um die Ausbeute und insgesamt erhaltene Reinheit der isolierten Stilbenoide zu erhöhen. Das Rohkonzentrat kann durch dem Fachmann bekannte Standardmethoden weiter gereinigt werden, um letztlich isolierte Stilbenoide zu erhalten. Zu beispielhaften Reinigungsmethoden gehören die Umkristallisation und die Chromatografie. Vorzugsweise wird das Rohkonzentrat unter Verwendung einer Flüssigchromatografie, z. B. Hochleistungsflüssigchromatografie, Vakuumblitzchromatografie und Adsorptionschromatografie gereinigt.
Es können verschiedene Harztypen verwendet werden, um die gewünschte chromatografische Wirkung zu erzielen. Zum Beispiel kann, um polare Verunreinigungen dar aus zu entfernen, das Rohkonzentrat durch ein Adsorptionsharz (HP-20, C-18 oder Silicagel) geleitet werden, um die Stilbenoide je nach Polarität selektiv zurückzuhalten oder durchzulassen. Die Größe, das Molekulargewicht oder die Celluloseeigenschaften des gewünschten Harzmaterials können verwendet werden, um die Stilbenoide durch selektive Verwendung von Molekularsieb- oder Cellulose-basierten Harzen zu trennen.
Eine geeignete Gradientenlösung wird verwendet, um die Stilbenoide aus dem Rohkonzentrat auf der mit dem gewünschten Harz gefüllten Säule zu waschen und zu trennen. Ein geeigneter Gradient kann eine anfängliche Waschung mit einem Lösungsmittel gefolgt von einem Elutionslösungsmittel einschließen. Geeignete Elutionslösungsmittel enthalten einen hohen Prozentsatz von Acetonitril (ACN), Methanol, Aceton, Dichlormethan, Ether/Hexan oder einem beliebigen anderen organischen Lösungsmittel oder von Gemischen davon, welche Stilbenoide von dem Harzmaterial in eine angereicherte Fraktion hinein ablösen können. Die angereicherte Fraktion besteht aus Stilbenoiden oder Gemischen davon. Das Elutionslösungsmittel kann bis zu 50% Wasser enthalten, um seine Polarität einzustellen oder zu optimieren. Die Art des Elutionslösungsmittels kann von der Art des verwendeten Harzes abhängen. Zum Beispiel kann für HP-20-Harz, das in Methanol äquilibriert ist, das Elutionslösungsmittel Dichlormethan sein; für C-18-Harz, das in 70% ACN/30% Wasser (Vol./Vol.) äquilibriert ist, ist ein Gradient mit zunehmender Acetonitrilkonzentration geeignet; oder für Silicagelharz, das in Hexan äquilibriert ist, kann das Elutionslösungsmittel ein Gradient mit zunehmender Konzentration von Ether in einer Ether/Hexan-Lösung sein.
Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC), Dünnschichtchromatografie (DSC) und magnetische Kernresonanz (NMR)-Analyse können verwendet werden, um festzustellen, welche der eluierenden Fraktionen eine angereicherte Fraktion ist und welche angereicherten Fraktionen die gewünschten Stilbenoide enthalten. Gegebenenfalls können verschiedene eluierende Fraktionen vereinigt und den vorstehend beschriebenen DSC- und NMR-Analysen unterzogen werden. Die angereicherten Fraktionen können gegebenenfalls erneut gereinigt werden, wobei entweder das gleiche oder ein anderes Elutionsmittelsystem verwendet wird.
Die resultierenden Fraktionen, welche die Stilbenoide enthalten, werden konzentriert, gegebenenfalls im Vakuum. Die die Stilbenoide enthaltenden Fraktionen aus den vor stehend beschriebenen Chromatografieverfahren können vereinigt und durch aufeinanderfolgende Wiederholungen des Vorstehenden oder durch Umkristallisation oder andere Arten von Chromatografie weiter gereinigt werden. Gegebenenfalls können aufeinanderfolgende Reinigungen durch Umkristallisation oder Chromatografie durchgeführt werden, um gereinigte Stilbenoide zu erhalten.
Unter Verwendung der vorstehenden Reinigungsmethoden können die isolierten Stilbenoide gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden. "Im Wesentlichen gereinigt" bedeutet, dass die Stilbenoide der Formel (I) einen Reinheitsgrad von wenigstens 95% aufweisen. "Gereinigt" bedeutet, dass die Stilbenoide der Formeln (I), (II) und (III) einen Reinheitsgrad von wenigstens 97% aufweisen.
Organische Synthese der Stilbenoide der Formel (I)
Es gibt zwei Hauptverfahren zum Synthetisieren von Stilbenoiden, wobei es sich bei dem frühesten Verfahren um Variationen der Perkin-Kondensation einer Phenylessigsäure mit einem Benzaldehyd zum Bilden einer Stilben-α-carbonsäure, gefolgt von einer Decarboxylierung handelt (Funk, C. et al., Chem. Ber., 38, 939 (1905); Buckles, R. E., et al., J. Am. Chem. Soc. 73, 4972 (1951); und Letcher, R. M., Phytochemistry 12, 2789 (1973)). Außerdem wurde die Wittig-Reaktion zwischen einem Benzyltriphenylphosphoniumchlorid oder einem Diethylbenzylphosphonat und einem Benzaldehyd verwendet, um eine höhere Ausbeute eines überwiegend trans-Stilbens zu erhalten (Gorham, J., Phytochemistry, 16, 249 (1977); Wheeler, O. H., et al., J. Org. Chem. 30, 1473 (1965)). Bibenzyle werden auch leicht aus Stilbenen durch katalytische Hydrierung mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Kohlenstoff hergestellt.
Die Verbindungen der Formel (I) können auch halbsynthetisch aus anderen isolierten Stilbenoiden hergestellt werden. 3-Hydroxy-5-methoxy-4-isoprenylstilben-2-carbonsäure (Verbindung A) und 3-Hydroxy-5-methoxy-6-isoprenylstilben-2-carbonsäure (Verbindung B) wurden angeblich aus Cajanus cajan isoliert (Cooksey, C. J., et al., (1982)). Eine Methylierung dieser Verbindungen mit Diazomethan ergab 3,5-Dimethoxy-6-isoprenylstilben-2-carbonsäure bzw. 3,5-Dimethoxy-4-isoprenylstilben-2-carbonsäure (Cooksey, C. J., et al., (1982)). Das Hydrolysieren des Glycosids Gaylussacin mit einer Emulsion ergab Verbindung F, das Gaylussacin-Aglycon (Askari, A., et al., (1972)). Die Verbin dung G, Lunularsäure, wurde durch die Reduktion von Hydrangenol erhalten (Asahina, Y., et al., Ber. dtsch. chem. Ges 63, 429 (1930)).
Stilben-2-carbonsäuren wurden ebenfalls synthetisiert. Lunularsäure wurde durch die Reduktion von Hydrangenol erhalten (Asahina, Y., et al., (1930)). Andere Wege zum Erhalten von Lunularsäure sind von Arai, et al., Phytochemistry 12, 2279 (1973); Arai, Y., et al., Tetrahedron Lett. Seite 1615 (1972) und von Huneck, S. et al., Phytochemistry 16, 1013 (1977) beschrieben worden. Lunularsäure kann auch durch die Perkin-Kondensation einer Phenylessigsäure mit einem Benzaldehyd zum Bilden einer Stilben-α-carbonsäure (Letcher, R. M., et al., Phytochemistry 12, 2789 (1973)) synthetisiert werden. Na(4-hydroxyphenyl)acetat und 3-Hydroxybenzaldehyd in Ac₂O, gefolgt von einer Hydrolyse mit NaOH-EtOH unter N₂ erzeugte ebenfalls Lunularsäure (Gorham, J. (1977)).
Lunularsäure kann auch in vivo durch einen Phenylpropanoid-Polymalonat-Stoffwechselweg synthetisiert werden (Pryce, R. J., Phytochemistry, 10, 2679 (1971)).
Sobald die Stilbenoide der Formel (I) synthetisiert worden sind, können sie unter Verwendung herkömmlicher Chromatografie, Umkristallisierung oder anderer Reinigungsmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden.
Derivate von Stilbenoiden
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen Ether- und Acetatderivate von Stilbenoiden, die zum Senken von Serumtriglyceridspiegeln und zum Behandeln von Hypertriglyceridämie brauchbar sind. Zum Beispiel können die Carbonsäuregruppen der Stilbenoid-2-carbonsäuren mit CH₂N₂ und Ether methyliert werden, um den Methylether davon herzustellen.
Eischer synthetisierte Lunularsäure und einige ihrer Derivate ausgehend von dem Methylether oder dem Acetat von Ethyl-6-methyl-salicylat durch Einführen der Bibenzylkomponente durch Metallierung, Alkylierung oder durch Bromierung, Wittig-Reaktion und Hydrierungssequenzen (Eischer, T. et al., Synthesis, 525–529 (1988)). Außerdem können die Hydroxylgruppen von diesen Stilbenoiden durch dem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. unter Verwendung von Acetylchlorid acetyliert werden (Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 101, (1981)).
Es soll darauf hingewiesen werden, dass beliebige Hydroxylgruppen, die nicht so methyliert oder acetyliert sind, an der Bildung der vorstehend beschriebenen pharmazeutisch annehmbaren Salze von Stilbenoiden beteiligt sein können.
Pharmazeutische Zusammensetzungen von Stilbenoiden der Formel (I)
Die Stilbenoide der Formeln, wie sie in dieser Anmeldung verwendet werden, können vermischt werden, z. B. mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für feste Zusammensetzungen wie Tabletten, Pellets oder Kapseln; Kapseln, die Flüssigkeiten enthalten; Suppositorien; Lösungen; Emulsionen; Suspensionen oder eine beliebige andere zur Verwendung geeignete Form. Zu geeigneten Trägern gehören z. B. steriles Wasser, sterile physiologische Salzlösung, Akaziengummi, Gelatine, Stärkekleister, Talk, Keratin, kolloidales Siliciumdioxid, Harnstoff und dergleichen. Außerdem können Hilfsmittel, Stabilisiermittel, Verdickungsmittel, Schmiermittel und Färbemittel verwendet werden.
Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können in Form von Tabletten, Trochisken, Pastillen, wässrigen oder öligen Suspensionen, Körnchen oder Pulvern, Emulsionen, Kapseln, Sirupen oder Elixieren vorliegen. Oral verabreichte Zusammensetzungen können ein oder mehrere Mittel, wie etwa Süßungsmittel wie Fructose, Aspartam oder Saccharin; Aromastoffe wie Pfefferminz, Wintergrünöl oder Kirsche, Färbemittel und Konservierungsmittel enthalten, um eine pharmazeutisch schmackhafte Zubereitung bereitzustellen. Außerdem können Zusammensetzungen in Tablettenform überzogen sein, um den Zerfall und die Absorption im Gastrointestinaltrakt zu verzögern, wodurch eine anhaltende Wirkung über einen längeren Zeitraum bereitgestellt wird. Selektiv permeable Membranen, welche eine osmotisch aktive treibende Verbindung umgeben, sind ebenfalls geeignete oral verabreichte Zusammensetzungen. In diesen letztgenannten Plattformen wird Flüssigkeit aus der Umgebung der Kapsel durch die treibende Verbindung aufgesaugt, welche quillt, wobei der Wirkstoff oder die Wirkstoffzusammensetzung durch eine Öffnung verdrängt wird. Diese Verabreichungsplattformen können ein Verabreichungsprofil von im Wesentlichen nullter Ordnung bereitstellen, im Gegensatz zu den zackenförmigen Profilen von Formulierungen mit sofortiger Freigabe. Ein Zeitverzögerungsmaterial wie Glycerinmonostearat oder Glycerinstearat kann ebenfalls verwendet werden.
Wässrige Suspensionen, welche die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln enthalten, können auch ein oder mehrere Konservierungsmittel, wie z. B. Ethyl- oder n-Propyl-p-hydroxy-benzoat, ein oder mehrere Färbemittel, Aromastoffe oder Süßungsmittel enthalten.
Nahrungsergänzungsmittel, die Stilbenoide enthalten
Die Stilbenoide der Formeln, wie sie in dieser Anmeldung verwendet werden, können in Form eines Nahrungsmittel- bzw. Futteradditivs, Nahrungsmittel- bzw. Futterergänzungsmittels, Nahrungsergänzungsmittels z. B. in fester, halbfester oder flüssiger Form verwendet werden, welche wenigstens eines der Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, einschließlich ihrer therapeutisch wirksamen Salze, als bioaktive Komponente enthält. Wenn es in Nahrungsmittel eingearbeitet ist, kann das aktive Stilbenoid als eine isolierte Verbindung verwendet werden oder in einer angereicherten Fraktion eines Pflanzenextrakts enthalten sein.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen können in Nahrungsmittel allein oder in Kombination mit einer anderen antidiabetischen, antihyperglykämischen (Blutglucose senkenden) oder antilipidämischen Verbindung, in Mischung mit einem Träger oder einem Excipiens, das sich für eine orale Verabreichung eignet, eingearbeitet sein.
Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können in Form von Nahrungsmitteln vorliegen, welche die Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen.
Es kann eine beliebige Nahrungsmittelverarbeitungsmethode verwendet werden, um ein Produkt zu erzielen, das die wirksame Menge der Stilbenoidverbindung der Formel (I) umfasst. Es gibt viel Information über das Fachgebiet und die Technologie der verschiedenen herkömmlichen Nahrungsmittelverarbeitungsmethoden und ihre praktische Durchführung sowohl in der Heimtierfutter- als auch der Nahrungsmittelindustrie und es wird entsprechend angenommen, dass die allgemeinen Prinzipien dieser Methoden dem Fachmann bekannt sind.
Bei der Zugabe eines Stilbenoids zu einem Trägermaterial ist das Verfahren zur Aufnahme der Stilbenoidverbindung nicht auf ein reines Backen oder Entwässern beschränkt, sondern kann auch Methoden wie eine Extrusionsverarbeitung, Koextrudieren und die Herstellung von Konserven einschließen. Außerdem kann das Verfahren, durch welches Granolariegel und Nahrungsmittelriegel hergestellt werden, zum Herstellen der vorliegenden Nahrungsmittel verwendet werden. So können bei der praktischen Durchführung der Erfindung verschiedene Arten von Nahrungsmittelprodukten zusätzlich zu Pulverinhaltsstoffen für Fertignahrungsmittel hergestellt werden. Zum Beispiel gehören zu Nahrungsmitteln, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung hergestellt werden, Heimtiertrockenfutter, das als Vollnahrung für Heimtiere dient, sowie Biskuits und Leckerbissen für Heimtiere. Außerdem können aus den vorliegenden Nahrungsmitteln Getreideflockengerichte, Snacks, Energieriegel, Suppen und Nahrungsriegel für Menschen gebildet werden. Ungeachtet des Verfahrens, durch welches die vorliegenden Nahrungsmittel oder die Komponenten darin hergestellt werden, ist es bevorzugt, dass die resultierenden Nahrungsmittel eine Stilbenoidkonzentration von wenigstens 0,1 Gramm pro Nahrungs- bzw. Diäteinheit bereitstellen.
Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wird als das Trägermaterial ein trockenes Material mit proteinartigem oder mehlartigem Charakter in Betracht gezogen. Zu Beispielen für geeignete Trägermaterialien gehören: ein getrocknetes Bäckereiprodukt, die Mehle von Weizen, Reis, Hafer, Mais und Soja; die Kleien von Weizen, Reis, Hafer und Mais, Weizenmittelmehl, Weizenvollkornmehl, Maisglutenmehl, Maisvollkornmehl, Sojabohnenmehl, Gerste, Sorghum, Fleisch- und Knochenmehle, Geflügelmehl, Fischmehl, Hundetrockenfutter und verschiedene Materialien, welche typisch für herkömmliche handelsübliche und Premium-Heimtierfutterprodukte sind.
Das bei der praktischen Durchführung der Erfindung hergestellte Nahrungsmittel kann jede beliebige Form annehmen, die von Menschen oder Heimtieren verzehrt werden kann, wozu eine vollständige und ausgewogene Heimtiernahrung; ein trockenes oder halbtrockenes Produkt, welches ein Additiv für Heimtiernahrung oder menschliche Nahrung ist; oder granola-artige Riegel, Nahrungsriegel oder andere Snacks für Menschen gehören. Speziell wird, wenn das Nahrungsmittel ein Stilbenoid der Formel (I) umfasst, in Betracht gezogen, dass es als ein Inhaltsstoff eingesetzt wird, der in ein anderes Nahrungsmittel eingearbeitet werden soll. Zu diesem Zweck kann das Stilbenoid in Form eines Pulvers oder feinen Mehls vorliegen, welches dann als ein Inhaltsstoff für andere Nahrungsmittel dienen kann. Zu weiteren Beispielen für Nahrungsmittel, die für den menschlichen Verbrauch in Betracht gezogen werden, welche als Inhaltsstoff Stilbenoide enthalten können, die gemäß der Erfindung verarbeitet sind, gehören Füllungen oder Puddings (ähnlich wie Gelatinen und JELLO-Produkte) sowie funktionale Nahrungsmittel in flüssiger Gelform und Dosensuppen.
Verwendung von hypotriglyceridämisch aktiven Stilbenoiden
Aufgrund der Aktivität der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Stilbenoide sind die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon vorteilhafterweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Nahrungsergänzungsmitteln brauchbar. Solche Zusammensetzungen und Nahrungsergänzungsmittel können zum Behandeln von Säugern verwendet werden, die an hohen Triglyceridspiegeln leiden, wie etwa Säuger mit Fettleibigkeit oder Diabetes.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel zum Senken der Serumfettsäuren bei Säugern mit Typ-I- oder Typ-II-Diabetes verwendet.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Verfahren, die ein Stilbenoid der Formel I verwenden, zur Verwendung bei der Behandlung von Fettleibigkeit bei Menschen oder Tieren bestimmt.
Wie es für die Behandlung von Typ-I- oder Typ-II-Diabetes oder Fettleibigkeit angemessen ist, kann eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, welche ein Stilbenoid der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon wie vorstehend beschrieben zusammen mit einem antidiabetischen, antihyperglykämischen oder Blutglucose senkenden Mittel enthält, wozu Insulin; ein Biguanid wie Metformin oder Buformin; ein Sulfonylharnstoff wie Acetohexamid, Chlorpropamid, Tolazamid, Tolbutamid, Glyburid, Glypizid oder Glyclazid; ein Thiazolidindion wie Troglitazon; ein α-Glucosidase-Inhibitor wie Acarbose oder Miglitol; ein β-Adrenoceptoragonist wie PL-316,243, Cholestyramin, Clofibrat, Colestipol, Fluvastatin, Gemfibrozil, Lovastatin, Niacin, Pravastatin, Probucol, hydrophiles Psyllium-Mucilloid, Simvastatin und Natriumdichloracetat gehören. Alternativ können die Zusammensetzungen, die ein hypoglykämisch aktives Stilbenoid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfassen, in Kombination mit, vor, gleichzeitig mit oder im Anschluss an die Verabreichung eines anderen antidiabetischen, antihyperglykämischen oder antilipidämischen Mittels wie vorstehend beschrieben verabreicht werden.
Die Verbindungen können auch zum Verhindern, Anhalten oder Verlangsamen des Fortschritts von atherosklerotischen kardiovaskulären Erkrankungen und damit zusammenhängenden Zuständen bzw. Leiden und Krankheitsereignissen bei Menschen oder Tieren verwendet werden. In dieser Ausführungsform kann man vorteilhafterweise ein Stilbenoid der Formel I mit wenigstens einer weiteren Verbindung verabreichen, welche Serumtriglycerid oder Cholesterin senkt. Solche Verbindungen sind im Fachgebiet bekannt und zu ihnen gehören (A) Fibrate; (B) HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren; und (C) Inhibitoren der Cholesterinabsorption; (D) Squalensynthese-Inhibitoren; (E) LDL-Katabolismus-Verstärker; und (F) Angiotensin-Konversionsenzym-Inhibitoren.
Fibratverbindungen sind Arzneimittel, welche eine Senkung der Blutcholesterinspiegel durch Hemmen der Synthese und Sekretion von Triglyceriden in der Leber und Aktivieren einer Lipoproteinlipase bewirken. Zu Beispielen für die Fibratverbindungen gehören Bezafibrat, Beclobrat, Binifibrat, Ciplofibrat, Clinofibrat, Clofibrat, Clofibrinsäure, Etofibrat, Fenofibrat, Gemfibrozil, Nicofibrat, Pirifibrat, Ronifibrat, Simfibrat und Theofibrat.
Statinverbindungen sind Arzneimittel, welche eine Senkung der Blutcholesterinspiegel durch Hemmen der Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA)-Reduktase bewirken. Zu Beispielen für die Statinverbindungen gehören Pravastatin und sein Natriumsalz, Simvastatin, Lovastatin, Atorvastatin und Fluvastatin.
Squalensynthese-Inhibitoren sind Arzneimittel, welche eine Senkung der Blutcholesterinspiegel durch Hemmen der Synthese von Squalen bewirken. Zu Beispielen für die Squalensynthese-Inhibitoren gehört das (S)-alpha-[Bis[2,2-dimethyl-1-oxopropoxy) methoxy]phosphinyl]-3-phenoxybenzolbutansulfonsäure-Monokaliumsalz (BMS-188494).
LDL-Katabolismus-Verstärker sind Arzneimittel, welche eine Senkung der Blutcholesterinspiegel durch Erhöhen der Anzahl von LDL (low-density lipoprotein)-Rezeptoren bewirken. Zu Beispielen für die LDL-Katabolismus-Verstärker gehört N-[2-[4-Bis(4-fluorphenyl)methyl-1-piperazinyl]ethyl]-7,7-diphenyl-2,4,6-heptatriensäureamid.
Angiotensin-Konversionsenzym-Inhibitoren sind Arzneimittel, welche durch Hemmen von Angiotensin-Konversionsenzymen zum Teil sowohl Blutglucosespiegel senken als auch den Blutdruck senken. Zu Beispielen für die Angiotensin-Konversionsenzym-Inhibitoren gehören Captopril, Enalapril, Alacepril, Delapril, Ramipril, Lisinopril, Imidapril, Benazepril, Ceronapril, Cilazapril, Enalaprilat, Fosinopril, Moveltopril, Perindopril, Quinapril, Spirapril, Temocapril und Trandolapril.
Wenn sie einem Säuger zur tierärztlichen Verwendung oder einem Menschen zur klinischen Verwendung verabreicht werden, werden die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln in isolierter Form verabreicht. "Isoliert" bedeutet, dass die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln von anderen Komponenten aus (a) einem natürlichen Ausgangsmaterial wie einer Pflanze oder Zellkultur oder (b) einem synthetischen organischen chemischen Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Vorzugsweise werden die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln durch herkömmliche Methoden im Wesentlichen gereinigt, vorzugsweise gereinigt.
Wenn sie einem Säuger zur tierärztlichen Verwendung oder einem Menschen zur klinischen Verwendung verabreicht werden, können die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln allein oder in Kombination mit einem beliebigen physiologisch annehmbaren Träger oder Excipiens verwendet werden, welcher bzw. welches für eine enterale oder parenterale Verabreichung geeignet ist. Wenn er für eine parenterale Verabreichung verwendet wird, muss der physiologisch annehmbare Träger steril und zur in vivo-Verwendung in einem Menschen oder zur Verwendung in einer tierärztlichen klinischen Situation geeignet sein.
Die in dieser Erfindung verwendeten Zusammensetzungen können durch eine Reihe von Verfahren verabreicht werden, unter anderem oral, intramuskulär, intravenös, subkutan, transdermal, rektal oder durch Inhalation. Wenngleich die bevorzugte Art und Weise der Verabreichung die orale Verabreichung ist, bleibt die genaue Art der Verabreichung der Entscheidung des praktischen Arztes überlassen. Sie sind besonders wirksam, wenn sie oral verabreicht werden.
Diese Erfindung umfasst die Verwendung eines Stilbenoids, vorzugsweise in isolierter oder gereinigter Form, das in einer Dosis von ungefähr 1 bis 1000 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von 2 bis 500 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, mehr bevorzugt 5 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, noch mehr bevorzugt 50 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht wird. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung die Verwendung eines Stilbenoids der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln in einer Dosis von 5 bis 350 mg/kg Körpergewicht/Tag der Verbindung, die in einer Menge verwendet werden soll, welche dazu führt, dass die Zusammensetzungen eine therapeutisch wirksame hypoglykämische, antihyperglykämische oder antidiabetische Aktivität aufweisen. Die Dosierung der vorliegenden Zusammensetzungen zur Behandlung oder Verhütung von Hypertriglyceridämie oder zum Verringern der Blutfettsäurespiegel hängt von dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung sowie dem Alter, dem Gewicht und dem physischen Zustand des Patienten ab. Im Allgemeinen liegt die Tagesdosierung im Bereich von 1 bis 1000 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von 2 bis 500 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, mehr bevorzugt 5 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, noch mehr bevorzugt 50 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Die Behandlung kann nach Bedarf wiederholt werden, was von der Dosierung und dem Bedarf abhängt, z. B. kann eine Dosierung von 62,5, 125 oder 250 mg/kg Körpergewicht/Tag des Patienten bzw. Tieres in aufgeteilten Dosen verabreicht werden, um Diabetes zu verhüten oder zu behandeln oder um Blutfettsäurespiegel zu senken. Die Behandlung kann z. B. auf das gewünschte Niveau verringert fortgesetzt werden, bis die Blutfettsäurenkonzentration nahezu der physiologischen entspricht, auf einem gewünschten Niveau stabilisiert wird oder auf einem gewünschten Niveau gehalten werden soll. Die angemessene Dosierung der Zusammensetzungen kann von dem medizinischen Fachmann leicht bestimmt werden.
Die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln können gegebenenfalls in einer wirksamen Menge als pharmazeutisch annehmbares Salz verabreicht werden. Aufgrund des Vorkommens von Carboxyl- und Phenolatkomponenten können pharmazeutisch annehmbare Carboxylat- oder Phenolatsalze von einem Fachmann allgemein erkannt werden, wobei z. B. Gegenionen wie Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Zink und Eisen verwendet werden.
Beispiele
Isolierung und Charakterisierung von Stilbenoiden durch Lösungsmittelextraktion
Verbindungen, Materialien und Methoden
Eine analytische Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC) wurde an einer Hitachi Model D-6500 Chromatography Data Station durchgeführt, die mit einer Pumpe L-6200A, einem automatischen Probengeber AS-2000, einem Diodenarraydetektor L-4500A und einem parallel geschalteten Lichtstreudetektor Sedex 55 und einer HPLC-Säule Primesphere C18 HC, 4 × 50 mm (5 μm) ausgestattet war. Alle Chromatografieläufe wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Lösungsmittel mit HPLC-Reinheit wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Magnetische Kernresonanz (NMR)-Spektren wurden an einem Varian Unity Plus 400 oder einem Varian Unity 400 Spektrometer aufgezeichnet. Die NMR-Spektren von Verbindungen wurden in deuteriertem Aceton aufgezeichnet. Ein- und zweidimensionale NMR-Experimente, darunter Distortionless Enhancement Polarization Transfer (DEPT), H-H Korrelationspektroskopie (COSY), Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (HMQC), Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC), long-range Heteronuclear Chemical Shift Correlation (HETCOR) ergaben Molekülstruktur-Information. MS-Spektren wurden an einem Kratos MS-50 im hochauflösenden Power Electron Impact Scanning Modus aufgezeichnet, 70 ev. Auflösung wurde auf 2000 eingestellt, die Abtastgeschwindigkeit auf 10 s/Zerfall, der Temperaturgradient von 50° bis 300°C stieg mit einer Geschwindigkeit von 50°/min an. IR-Spektren wurden an einen Perkin-Elmer 1600 Series FTIR aufgezeichnet. UV-Spektren wurden an einem Perkin-Elmer Lambda 2 UV/VIS-Spektrometer aufgezeichnet oder direkt von dem Hitachi Diodenarray-UV-Detektor an dem HPLC-System erhalten.
Isolierung von Stilbenverbindungen unter Verwendung einer Lösungsmittelextraktion
Zermahlenes Blattmaterial von Cajanus cajan (11 kg) wurde in 110 l Methanol 24 Stunden mit einem Überkopfmischer gerührt (Schema 1). Das Rühren fand mit Unterbrechungen statt (5 Minuten alle 30 Minuten während des Tages). Die Methanollösung wurde durch 1 kg CELITE^TM filtriert und im Vakuum eingedampft, wobei 1,39 kg grünes öliges Material erhalten wurde. Dieses Material wurde mit 20 l Aceton 4 Stunden verrieben. Das Acetongemisch wurde durch 1 kg CELITE^TM vakuumfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei 721 g Feststoffe erhalten wurden. Die Feststoffe (538 g) wurden in ein 4 l-Becherglas gegeben und mit 2 l Methanol 30 Minuten gerührt, wobei ein Magnetrührer verwendet wurde. Nach 30 Minuten wurde der Überstand dekantiert. Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt, zuerst mit 2 l und schließlich 1 l Methanol. Die Methanolextrakte wurden vereinigt, wobei 4 l Lösung erhalten wurden, zu der 1 l Wasser mit Mischen langsam zugegeben wurde. Die resultierende milchige Suspension wurde auf eine 18 × 92 cm Säule gepumpt, die HP 20 (Mitsubishi-Kasei) Sorbens enthielt, welches zuvor mit 40 l Aceton und dann mit 80 l von 4 : 1 Methanol/Wasser gewaschen worden war. Ein weiterer 1 l von 4 : 1 Methanol/Wasser wurde auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit 95 : 5 Methanol/Wasser eluiert. Es wurden vierzehn 10 l-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 7–10 wurden zusammengegeben und im Vakuum eingedampft, wobei 64 g eines öligen Feststoffs erhalten wurden. Dieses Material wurde in 6,5 l Methanol gelöst, zu dem 3,5 l Wasser zusammen mit 10 ml Essigsäure zugegeben wurden. Nach 30 Minuten wurde das Gemisch durch Whatman # 2 Filterpapier filtriert. Sowohl die Methanolfällungsfeststoffe als auch das Methanolfällungsfiltrat wurde für die weitere Verarbeitung aufbewahrt.
Schema 1
Die Methanolfällungsfeststoffe wurden in einem Vakuumofen über Nacht bei 40°C getrocknet. Dies ergab 10 g eines weißen amorphen Pulvers, welches zusammen mit 500 ml n-Hexan in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben wurde (Schema 2). Mit gutem Mischen wurde Aceton zugegeben, bis die Lösung klar wurde. Ein Gramm Entfärbungskohle wurde zu der gerührten Lösung zugegeben, welche dann durch ein Bett (2 g) aus CELITE^TM Diatomeenerde vakuumfiltriert wurde. Das Filtrat wurde über Nacht offen in einem Abzug stehen gelassen, was zu der Fällung und Erzeugung von Feststoffen führte. Der Überstand wurde dekantiert und 40 ml Hexan und 5 ml Aceton wurden zu den Feststoffen zurückgegeben, wodurch sich beim Stehen während 2 Stunden zwei Schichten bildeten. Die Schichten wurden getrennt und die obere Schicht wurde unbedeckt über Nacht stehen gelassen, was farblose kristalline Feststoffe ergab. Das kristalline Material wurde mit einer minimalen Menge an 10 : 1 Hexan/Aceton verrieben und in einem geschlossenen Behälter bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Der Überstand wurde dekantiert und die Kristalle in einem Vakuumofen getrocknet, wobei 6 g Material erhalten wurden, das anhand der NMR- und HPLC-Diodenarray-Daten als Verbindung A identifiziert wurde. Die Ausbeute aus der Pflanze betrug 0,07%.
Schema 2 Niederschlag aus Fällungsschritt (10 g)
Das Methanolfällungsfiltrat (10 l) wurde durch eine kleine Menge von C-18 (Bakerbond, 40 mm) geleitet und auf eine 100 × 5 cm C-18 Chromatografiesäule gepumpt, welche mit Methanol gewaschen und mit 65 : 35 : 0,1 Methanol/Wasser/Essigsäure äquilibriert worden war (Schema 3). Weitere 500 ml von 65 : 35 : 0,1 Methanol/Wasser/Essigsäure wurden durch die Säule gepumpt, um die Beladung zu vervollständigen. Die Säule wurde mit 80 : 20 : 0,1 Methanol/Wasser/Essigsäure eluiert. Es wurden 32 Fraktionen gesammelt, die jeweils 1 l enthielten. Die Fraktionen 12–18 wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei 18 g Feststoffe erhalten wurden. Die Feststoffe (11,1 g) wurden mit Rühren in 700 ml Hexan dispergiert. Zu der Dispersion wurde genügend Dichlormethan (200 ml) zugegeben, um eine klare Lösung zu erzeugen. Zu dieser Lösung wurde 1 g Entfärbungskohle zugegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde gerührt und anschließend durch ein Bett aus CELITE^TM (39 g) Diatomeenerde filtriert. Das CELITE^TM-Diatomeenerdebett wurde mit weiteren 100 ml von 7 : 2 Hexan/Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten Lösungen (1000 ml) wurden langsam (3 h) bis zu einem Volumen von 300 ml eingedampft, wobei ein Stickstoffstrom verwendet wurde. Die Feststoffe wurden filtriert, in einem Vakuumofen getrocknet und wie folgt umkristallisiert. Das getrocknete Material (8 g) wurde in 10 ml Dichlormethan gelöst, zu denen 70 ml Hexan mit Rühren zugegeben wurden. Die Lösung wurde unbedeckt stehen gelassen, bis sich Feststoffe bildeten. Der Behälter wurde dann bedeckt und über Nacht bei –10°C stehen gelassen. Die resultierende erste Ausbeute an Kristallen wurde filtriert und beiseite gestellt. Der Überstand wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms konzentriert und es wurde eine zweite Ausbeute an Kristallen gesammelt. Die ersten und zweiten Ausbeuten wurden zusammengegeben und über Nacht in einem Vakuumofen getrocknet, wobei 5,4 g SP-36302 als ein gebrochen weißer Feststoff erhalten wurden. Die Identifizierung erfolgte anhand von NMR- und HPLC-Diodenarray-Daten. Die Ausbeute aus dem Pflanzenmaterial betrug 0,1%.
Schema 3 Überstand aus Fällungsschritt
Strukturaufklärung der Stilbenoidverbindungen Longistylin C (Referenzverbindung)
Longistylin C wurde zuvor aus Lonchocarpus violaceus (Lloydia, 1977, 40, 201) und Cajanus cajan (Chung Ts'ao Yao, 1985, 18, 2) isoliert. Die Molekülformel von Longistylin C wurde auf der Grundlage eines Peaks in dem HREIMS bei m/z 294,1634 (M⁺, Δ 4,8 ppm von ber.) als C₂₀H₂₂O₂ bestimmt. Ein IR-Spektrum von Longistylin C wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3337, 2926, 1594, 1455, 1430, 1355 und 1316 auf. Die Struktur von Longistylin C wurde durch sorgfältige Interpretation der spektralen Daten aufgeklärt. Zuordnungen beruhten auf ein- und zweidimensionalen NMR-Experimenten, die Fachleuten auf dem Gebiet der Strukturaufklärung bekannt sind und zu denen ¹H-NMR, ¹³C-NMR, Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (HMQC) und Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) gehören. Werte für die chemischen Verschiebungen von SP-36302 in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. In dem HMBC-Spektrum beobachtete Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen sind ebenfalls aufgeführt.
NMR-Daten für Longistylin C In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz: δ ¹H-NMR @ 400 MHz: δ, Integral, Multiplizität, J
6.1.3.2 Longistylin A-2-carbonsäure (Verbindung A)
Die Verbindung A wurde zuvor aus Cajanus cajan berichtet (Cooksey, et al., Phytochemistry, 1982, 21, 2935). Auf der Grundlage des Vorhandenseins eines Peaks bei m/z 337,1473 (Δ 9,9 ppm von ber.) in dem HRFABMS, der [M – H]^– entspricht, wurde festgestellt, dass Verbindung A die Molekülformel C₂₁H₂₂O₄ hat. Das IR-Spektrum der Verbindung A wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3422, 2968, 1702, 1629, 1451, 1277, 1170 und 1117 auf. Die Struktur von Verbindung A wurde durch sorgfältige Untersuchung der spektralen Daten aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung A in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. In dem NMBC-Spektrum beobachtete Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen sind ebenfalls aufgeführt.
NMR-Daten für Verbindung A In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz: δ; ¹H-NMR @ 400 MHz: δ, Integral, Multiplizität, J
Verbindung I
Verbindung I wurde durch Hydrierung von Verbindung A hergestellt. Auf der Grundlage eines Peaks in dem HREIMS bei m/z 342,1834 (M⁺, Δ 0,89 ppm von ber.) wurde festgestellt, dass die Molekülformel von Verbindung I C₂₁H₂₆O₄ ist. Das IR-Spektrum von Verbindung I wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3398, 2951, 1609, 1457, 1271 und 1140 auf. Die Struktur von Verbindung I wurde durch sorgfältige Untersuchung der spektralen Daten aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung I in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind zusammen mit den Protonen-Kohlenstoff-Korrelationen in der nachstehenden Tabelle angegeben.
NMR-Daten für Verbindung I In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz: δ; ¹H-NMR @ 400 MHz: δ, Integral, Multiplizität, J
In vivo hypotriglyceridämische Aktivität des Stilbenoids der Formel (I)
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der Stilbenoide der Formel (I) beim Verringern von Serumtriglyceridspiegeln in mit Fett gefütterten und mit STZ behandelten männlichen Sprague-Dawley-Ratten, d. h. einem im Fachgebiet anerkannten Modell für Hypertriglyceridämie.
Eine repräsentative Auswahl von Stilbenoid-Analoga wurde in dem nachstehend beschriebenen in vivo-Rattenmodell getestet.
In vivo-Experimente 1–4, Allgemeines
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der Stilbenoide der Formel (I), z. B. Longistylin A-2-carbonsäure (Verbindung A) im Hinblick auf das Verringern von Serumtriglyceridspiegeln in mit Fett gefütterten und mit STZ behandelten männlichen Sprague-Dawley-Ratten, d. h. einem im Fachgebiet anerkannten Modell für Hypertriglyceridämie.
Materialien und Methoden
Männliche Sprague-Dawley-Ratten erhielten nach ihrer Ankunft von Charles River Laboratories, Hollister, CA, eine fettreiche (20 Gew.-%) Diät (TD 78463), die von Harlan Teklad, Madison, WI, erhalten wurde und vor der Verwendung bei 4°C aufbewahrt wurde. Die Verabreichung einer fettreichen Diät ist ein bekanntes Verfahren zum Herbeiführen einer Hypertriglyceridämie bei Ratten.
Die Verbindung A wurde durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten. GELUCIRE^TM 44/14-Vehikel wurde von Gattefossé Corp., Westwood, New Jersey, erhalten; Triglyceridstandard und Reagenz wurde von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erhalten.
GELUCIRE^TM-Vehikel wurde vor der Zugabe der passenden Menge von Verbindung A auf 48–50°C erwärmt. Das resultierende Gemisch wurde mit einem Vortex verwirbelt und anschließend bei 48–50°C beschallt, bis die Verbindung A vollständig aufgelöst war. Vor der Verabreichung wurden GELUCIRE^TM-Vehikel und Verbindung A/Vehikel in einem Wasserbad bei 48–50°C aufbewahrt, um eine Verfestigung zu verhindern.
Die Formulierungen der Verbindung A wurden täglich frisch hergestellt. Die passende Menge von Verbindung A in GELUCIRE^TM wurde mittels einer oralen Sonde in einem Volumen von 2,5 ml/kg Körpergewicht verabreicht. Die Tiere wurden jeden Tag um 8.00 Uhr vormittags fasten gelassen.
Blutproben aus Schwanzschnittblutungen (tail snips bleeds) wurden sechs Stunden nach der Dosis am Tag eins und drei (3) und sechs (6) Stunden nach der Verabreichung der Dosis an den Tagen 2 bis 4 in Serumtrennröhrchen der Marke M (M brand serum separator tubes) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) gesammelt und bei 12000 U/min 10 Minuten zentrifugiert. Das Serum wurde entnommen und die Triglyceridspiegel wurden unter Verwendung von enzymatischen kolorimetrischen Verfahren gemessen (M. W. McGowan, et al., Clin. Chem. 29, 538 (1983) und P. Trinder, Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969)), wobei Sigma Diagnostic Kits, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, verwendet wurden.
Die Triglyceridspiegel sind als der Mittelwert ±SEM angegeben. Die Daten wurden durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Post-hoc-Fisher-PLSD-Tests (post-hoc-Fisher protected least squares difference tests) analysiert. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert.
Nach dem Verabreichen der fettreichen Diät während wenigstens zwei Wochen an die Ratten wurden basale (vor der Behandlung erfolgende) Blutproben aus Schwanzschnittblutungen gesammelt und die Serumtriglycerid (TG)-Spiegel wurden gemessen. Ein Computer-Ausleseprogramm wurde verwendet, um die Tiere in Gruppen mit äquivalenten mittleren TG-Ausgangsspiegeln einzuteilen. Die anschließende Behandlung mit Vehikel allein oder Verbindung A in GELUCIRE^TM-Vehikel erfolgte einmal pro Tag (q. d.).
Die Blutproben wurden jeden Tag durch Schwanzschnitt sechs Stunden nach der täglichen Dosis gesammelt. An den Tagen 2 bis 4 wurde jeden Tag eine weitere Blutprobe drei Stunden nach der täglichen Dosis gesammelt. Das Serum wurde von jeder Blutprobe gesammelt und die Triglyceridspiegel wurden gemessen.
Ergebnisse
Die im Laufe der Behandlung mit GELUCIRE^TM-Vehikel oder Verbindung A (250 mg/kg Körpergewicht, q. d.) in GELUCIRE^TM-Vehikel beobachteten Serumtriglycerid (TG)-Spiegel sind in 2 gezeigt. Zu jedem der Zeitpunkte waren die TG-Spiegel für Tiere, denen Verbindung A verabreicht worden war, signifikant niedriger (p < 0,05) als die nach der Verabreichung von Vehikel allein erhaltenen Spiegel. Wenn sie zu den einzelnen Probenahmezeiten verglichen werden, zeigen die Daten an, dass die Behandlungsgruppen, die 250 mg/kg Körpergewicht, q. d., von Verbindung A erhielten, vom Tag 2 bis zum Ende der Behandlung mittlere TG-Spiegel aufwiesen, welche signifikant niedriger waren als die Spiegel der GELUCIRE^TM-Vehikel-Behandlungsgruppe.
Die täglichen mittleren Körpergewichte sind in 4 gezeigt. Die Zunahme des Körpergewichts der Ratten im Laufe der Behandlung war normal und bei den Behandlungsgruppen ähnlich und es scheint keinen biologisch signifikanten Unterschied des Körpergewichts zu geben. Der tägliche mittlere Futterverbrauch ist in 3 gezeigt. Die Futteraufnahme wurde durch die Behandlungen nicht beeinflusst.

Claims

Verwendung einer hypotriglyceridämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, mit der Formel:
worin A eine Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation ist; R₁ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy; R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-11-Alkyl, C_2-11-Alkenyl und C_2-11-Alkinyl; und R₅ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy; wobei der Begriff "Alkyl" sich auf einen einwertigen von einem Alkan abgeleiteten Rest bezieht, welcher geradkettig oder verzweigt sein kann, einschließlich einer geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppe, welche einen Cycloalkylenteil enthält oder durch einen Cycloalkylenteil unterbrochen ist; und eines Trägers zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zum Ergänzen der Nahrung eines Säugers, der an erhöhten Bluttriglyceridspiegeln leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger Typ-I-Diabetes hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger Typ-II-Diabetes hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger an Fettleibigkeit leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger eine atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die hypotriglyceridämisch wirksame Menge der Verbindung 1 bis 1000 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die hypotriglyceridämisch wirksame Menge der Verbindung 50 bis 350 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel für eine orale Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus Cajanus cajan isoliert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nahrungsergänzungsmittel in Form eines Nahrungsriegels, eines Getreideflockengerichts, eines Energieriegels, einer Suppe oder eines Tierfutters vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem getrockneten Bäckereiprodukt, Weizenmehl, Reismehl, Hafermehl, Maismehl, Sojamehl, Weizenkleie, Reiskleie, Haferkleie, Maiskleie, Weizenmittelmehl, Weizenvollkornmehl, Maisglutenmehl, Maisvollkornmehl, Sojaboh nenmehl, Gerste, Sorghum, Fleisch- und Knochenmehlen, Geflügelmehl, Fischmehl und Trockentierfutter.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (A) 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure; (B) 3-Hydroxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure; (C) 4-(3-Methyl-2-butenyl)-3,5-dimethoxystilben-2-carbonsäure; (D) 6-(3-Methyl-2-butenyl)-3,5-dimethoxystilben-2-carbonsäure; (E) 3,4'-Dihydroxystilben-2-carbonsäure; (F) 3,5-Dihydroxystilben-2-carbonsäure; (G) 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxybibenzyl-2-carbonsäure; (H) 3,4'-Dihydroxybibenzyl-2-carbonsäure; und (I) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure.
Verwendung einer hypotriglyceridämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, mit der Formel
worin A eine Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation ist; R₁ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy; R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-11-Alkyl, C_2-11-Alkenyl und C_2-11-Alkinyl; und R₅ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-6-Alkoxy; wobei der Begriff "Alkyl" sich auf einen einwertigen von einem Alkan abgeleiteten Rest bezieht, welcher geradkettig oder verzweigt sein kann, einschließlich einer geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppe, welche einen Cycloalkylenteil enthält oder durch einen Cycloalkylenteil unterbrochen ist; und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Senken der Serumtriglyceride bei einem Säuger, der dies benötigt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Säuger Typ-I-Diabetes hat.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Säuger Typ-II-Diabetes hat.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Säuger an Fettleibigkeit leidet.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Säuger eine atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Verbindung für die kombinierte Verabreichung mit wenigstens einer anderen blutglucosesenkenden Verbindung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Verbindung für die kombinierte Verabreichung mit wenigstens einer anderen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (A) Fibraten; (B) HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren; (C) Inhibitoren der Cholesterinabsorption; (D) Squalensynthese-Inhibitoren; (E) LDL-Katabolismus-Verstärkern; und (F) Angiotensin-Konversionsenzym-Inhibitoren bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die hypotriglyceridämisch wirksame Menge der Verbindung 1 bis 1000 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die hypotriglyceridämisch wirksame Menge der Verbindung 50 bis 350 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung für eine orale Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Verbindung aus Cajanus cajan isoliert wird.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das pharmazeutisch annehmbare Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Zink und Eisen.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (A) 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure; (B) 3-Hydroxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure; (C) 4-(3-Methyl-2-butenyl)-3,5-dimethoxystilben-2-carbonsäure; (D) 6-(3-Methyl-2-butenyl)-3,5-dimethoxystilben-2-carbonsäure; (E) 3,4'-Dihydroxystilben-2-carbonsäure; (F) 3,5-Dihydroxystilben-2-carbonsäure; (G) 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-methoxybibenzyl-2-carbonsäure; (H) 3,4'-Dihydroxybibenzyl-2-carbonsäure; und (I) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure.