-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen gemäß der Formel
von Anspruch 1, wie Harnstoffe, welche einen Komplex mit Epoxidhydrolase
bildet, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Bluthochdruck.
-
Diese
Erfindung wurde mit Unterstützung
der US-Regierung unter Grant ES02710, erhalten vom Nationalen Gesundheitsinstitut,
gemacht. Die Regierung hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
-
Diese
Anmeldung ist eine Teilfortführung
der ebenfalls anhängigen
Anmeldung mit der fortlaufenden Nummer 08/909,523, eingereicht am
12. August 1997, Hammock et al., von gemeinsamem Aufgabengebiet, die
auf der vorläufigen
Anmeldung mit der fortlaufenden Nummer 60/023,397, eingereicht am
13. August 1996, jetzt fallengelassen, beruht.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Epoxidhydrolasen
(EH, E.C. 3.3.2.3) sind Enzyme, welche die Hydrolyse von Epoxiden,
einschließlich Arenoxiden,
zu deren entsprechenden Diolen durch Anlagern von Wasser katalysieren.
EHs spielen eine wichtige Rolle im Metabolismus einer Vielzahl von
Verbindungen, einschließlich
Hormonen, Fettsäurederivaten, Chemotherapeutika,
Karzinogenen, Umweltschadstoffen, Mykotoxinen und anderen schädlichen
fremden Verbindungen.
-
Mehrere
Mitglieder dieser ubiquitären
Enzymunterfamilie wurden aufgrund der Substratspezifität und der
subzellulären
Lokalisierung beschrieben. Solche Säuger-EHs umfassen Cholesterinepoxidhydrolase,
Leukotrien A4-Hydrolase, Hepoxilinhydrolase,
mikrosomale Epoxidhydrolase (mEH) und lösliche Epoxidhydrolase (sEH).
Die letzten zwei Enzyme wurden ausführlich untersucht und es wurde
gefunden, dass diese eine breite und komplementäre Substratselektivität aufweisen.
Es ist bekannt, dass die mikrosomalen und löslichen Formen mutagene, toxische
und karzinogene xenobiotische Epoxide entgiften, bei der physiologischen
Homöostase
beteiligt sind, und beide Mitglieder der α/β-Hydrolase-Faltungsfamilie sind.
-
Das
US-Patent 5,445,956 , erteilt
am 29. August 1995, Erfinder Hammock et al., offenbart rekombinante
lösliche
Epoxidhydrolase aus Mensch und Maus. Das Maus-Enzym stellt ein Nagetieruntersuchungsmodell im
Hinblick auf die therapeutische Entwicklung von Inhibitoren für lösliche humane
Epoxidhydrolysen bereit.
-
Die
Suche nach guten sEH-Inhibitoren wurde während etwa der letzten zwanzig
Jahre aktiv betrieben, wie durch Hammock et al., Comprehensive Toxicology,
(Guengerich, F. P., Herausgeber), Pergamon, Oxford, Band 3, Kapitel
18, Seiten 283–305
(1997) im Rahmen eines Reviews dargestellt. Zahllose Reagenzien,
welche selektiv Thiole, Imidazole und Carboxyle modifizieren, inhibieren
sEH irreversibel. Mullin und Hammock, Arch. Biochem. Biophys., 216,
Seiten 423–429
(1982) offenbart, dass Chalkonoxide wirksame Inhibitoren von sEH
sind, und Dietze et al., Corp. Biochem. Physiolo., 1048, Nr. 2,
Seiten 309–314
(1993) offenbart, dass trans-3-Phenylglycidole wirksame chirale
Inhibitoren von sEH sind.
-
Die
ebenfalls anhängige
US-Anmeldung mit der fortlaufenden Nummer 08/909,523, eingereicht
am 12, August 1997, Hammock et al., schlägt die Behandlung von Lungenerkrankungen
mit Epoxidhydrolase-Inhibitoren, wie Chalkonoxiden, vor und beschreibt
Assays für
Epoxidhydrolase-Inhibitoren. Unter den beschriebenen Epoxidhydrolase-Inhibitoren
sind alternative Enzymsubstrate, wie das Epoxid von Methyloleat
und andere Fettsäuren
und Ester oder Methylepoxyoctadecenoat und Phenylglycidiole, sowie
Chalkonoxide.
-
Es
wurde beschrieben, dass EH-Enzyme in einer großen Vielzahl von Spezien, einschließlich Bakterien,
Hefe, Pilzen, Pflanzen, Nematoden, Insekten, Vögeln, Fischen und Säugetieren,
vorkommen. Sie scheinen tatsächlich
in den meisten, wenn nicht allen, Organismen vorzukommen und dienen
verschiedenen Zwecken. Epoxid hydrolasen aus Pflanzen sind ebenfalls
bekannt. Es wurden beispielsweise Fettsäureepoxidhydrolasen aus Apfelhaut,
Sojabohnensämlingen
und Reispflanzen beschrieben. Die cDNAs, welche Epoxidhydrolase
aus Kartoffel, Kresse und Tabak codieren, wurden isoliert und kloniert.
Stapleton et al., Plant J., 6, Seiten 251–258 (1994); Kiyosue et al.,
Plant J., 6, Seiten 259–269
(1994); Guo et al., Plant J., 15, Seiten 647–656 (1998). Diese Epoxidhydrolasen
aus Pflanzen weisen eine hohe Homologie mit löslicher Säuger-Epoxidhydrolase auf, sind
jedoch am N-Terminus 30% kürzer.
-
Die
Epoxidhydrolasen in Insekten und anderen Arthropoden wirken im Metabolismus
von endogenen chemischen Mediatoren, wie dem Juvenilhormon, und
beim Abbau von Pflanzenallelochemikalien mit, welche die Pflanze
gegen Insekten schützt.
Diese Enzyme in Pflanzen katalysieren die Hydratation von Epoxystearinsäure zu den
entsprechenden α,β-Diolen,
die wichtige Zwischenprodukte in der Biosynthese von Cutin sind und
eine gewisse antimykotische Wirkung aufweisen.
-
Epoxide
und Diole sind synthetische Schlüsselzwischenprodukte
bei der Herstellung von organischen Massen- als auch Spezialchemikalien.
Biosynthetische Mechanismen zur Umwandlung von Epoxiden in Diole unter
sanften, regio- und stereospezifischen Bedingungen sind folglich
sehr wichtig. Die Fähigkeit
durch die Verwendung eines selektiven Inhibitors zu testen, ob ein
biosynthetischer Weg ein Epoxid einschließt, kann wichtig sein bei der
Suche nach neuen biosynthetischen Enzymen, und die Verwendung von
hochaffinen Bindungsagenzien bei der schnellen Affinitätsreinigung
von Epoxidhydrolasen hat sich als sehr wichtig beim Untersuchen
von löslichen
Säuger-Epoxidhydrolasen
erwiesen.
-
Die
gegenwärtig
bekannten hochaffinen Bindungsagenzien für die Affinitätsreinigung
von löslichen Säuger-Epoxidhydrolasen
umfassen Thiole, wie Benzylthiol, Alkyl- oder Terpenoidthiole, die
mit Epoxy-aktiviertem SEPHAROSE-Trennmedium (SEPHAROSE ist von Pharmacia
erhältlich)
umgesetzt wurden. Diese Affinitätschromatographiesäulen binden
eine Vielzahl von Proteinen, wobei viele derselben ein lipophiles
aktives Zentrum aufweisen. Die lösliche
Epoxidhydrolase kann allgemein wie durch Prestwich, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, Seiten 1663–1667
(1985) und Wixtrom et al., Analyt. Biochem., 169, Seiten 71–80 (1988)
beschrieben, selektiv mit Chalkonoxiden von diesen Säulen eluiert
werden. Zur Zeit gibt es jedoch keine Affinitätsreinigungssysteme für andere
Epoxidhydrolasen, welche für
eine erste Isolierung und Klonierung dieser Enzyme sowie für die Isolierung
von Epoxidhydrolasen für
industrielle Zwecke verwendet werden könnten. Neue hochaffine Bindungsagenzien
für verschiedene
Epoxidhydrolasen, insbesondere für
lösliche
Säuger-Epoxidhydrolasen,
bleiben eine wertvolle Zielsetzung. Auch Eluierungsmittel, die kompetitive
statt irreversible Inhibitoren sind, können nützlich sein.
-
FR-A-1403699 beschreibt
asymmetrische 1,3-Dincloarylharnstoffe und deren Verwendung bei
der Verringerung des Wachstums von Unkräutern.
US-A-3347658 beschreibt Herbizidzusammensetzungen
und Verfahren unter Einsatz von Dicycloarylharnstoffen. Beaune,
PH et al., Journal of Chromatography, 426 (1998): 169–176, beschreibt
ein Verfahren zur Reinigung einer mikrosomalen Epoxidhydrolase aus
menschlicher Leber.
EP-A-4011903 beschreibt
die Verwendung von Vanilloiden für
die Behandlung von Atemwegserkrankungen oder -krankheiten.
EP-A-446699 beschreibt Verbindungen,
die geeignet sind als Inhibitoren der Biosynthese von Nitritoxid.
Usha, R. et al., Protein Expression and Purification, 15 (1999):
48–56,
beschreibt die Reinigung eines multi-katalytischen Proteasekomplexes
aus sich entwickelnden Goabohnensamen durch indirekte Immunaffinitätschromatographie.
Riley, R.J. et al., Br. J. Clin. Pharmac. (1989), 28:482–487, beschreibt
die strukturellen Voraussetzungen für die Bioaktivierung von Antikrampfgiften
durch cytotoxische Metaboliten in vitro.
WO 98/06261 beschreibt Verfahren
zum Behandeln von Lungenerkrankungen, vermittelt durch polyungesättigte Lipidmetabolite,
und Assays für
Epoxidhydrolase-Inhibitoren.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Ein
Verfahren wird beschrieben, jedoch nicht beansprucht, das nützlich ist
zum Reinigen, Isoliern oder Inhibieren der Ziel-Epoxidhydrolase
durch Komplexbildung mit einer Verbindung in freier Form oder einer
immobilisierten Verbindung, so dass die Aktivität der komplexierten Epoxidhydrolase
gegenüber
einer enzymatisch aktiven, nicht-komplexierten Epoxidhydrolase modifiziert
ist. Bei der Ausführung
dieser Erfindung zur Bildung von Komplexen mit Epoxidhydrolasen
geeignete Verbindungen umfassen Epoxidhydrolase-Übergangszustandsmimetika. Harnstoffe,
Amide und Carbamate können
beispielsweise den Enzymübergangszustand oder
andere transiente Intermediate entlang der Reaktionskoordinate nachahmen,
falls diese Verbindungen stabil mit dem aktiven Zentrum des Enzyms
wechselwirken.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Klasse von Verbindungen
mit dieser Komplexbildungsfähigkeit,
welche die in Formel 1 gezeigte Struktur aufweisen, FORMEL
1
wobei X und Y jeweils unabhängig voneinander Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel sind, und X außerdem Kohlenstoff sein kann,
und mindestens einer von R
1-R
4 Wasserstoff
ist, R
2 Wasserstoff ist, wenn X Stickstoff ist,
aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist, R
4 Wasser ist, wenn Y Stickstoff ist, aber nicht
vorhanden ist, wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R
1 und
R
3 jeweils unabhängig voneinander substituiertes
oder nicht substituiertes Alkyl, Haloalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl
oder ein Heterozyklus sind, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung
von Bluthochdruck in einem Säuger.
-
Falls
die modifizierte Aktivität
der komplexierten Epoxidhydrolase eine Enzym-Inhibierung ist, weisen besonders bevorzugte
Ausführungsformen
von Verbindungen einen IC50 (Inhibierungsvermögen oder,
per Definition, die Konzentration des Inhibitors, welche die Enzymaktivität um 50%
verringert) von weniger als 500 μM
auf. Wir haben beispielsweise entdeckt, dass die fünf Verbindungen,
die in der Tabelle 1 aufgelistet sind, einen IC50 für die lösliche Maus-Epoxidhydrolase
von weniger als 0,1 µM
und weniger als 0,8 µM
für die
lösliche humane
Epoxidhydrolase aufweisen.
-
-
In
der Tabelle 1 ist die Verbindung 187 ein Amid und zeigt, dass der
Pharmacophor allgemeiner sein kann als Harnstoffe oder Carbamate.
-
Die
Enzyme, die für
diese Erfindung von Interesse sind, sind üblicherweise in der Lage, Enantiomere zu
unterscheiden. Folglich ist es bei der Wahl eines Inhibitors zur
Verwendung in einer Anwendung gemäß der Erfindung bevorzugt,
verschiedene optische Isomere des Inhibitors mit dem ausgewählten Enzym
mittels Routine-Assays zu screenen, um ein besseres optisches Isomer
für die
bestimmte Anwendung auszuwählen,
falls zweckdienlich. Die vorliegend beschriebenen Pharmacophore
können
verwendet werden, um dem aktiven Zentrum eine reaktive Funktionalität zuzuführen. Diese
könnte
Alkylierungsmittel, wie Halogene oder Epoxide oder Michael-Akzeptoren,
die mit Thiolen und Aminen reagieren, umfassen. Diese reaktiven
Funktionalitäten können auch
verwendet werden, um dem aktiven Zentrum des Enzyms Fluoreszenz-
oder Affinitätsmarkierungen
zum Enzymnachweis zuzuführen.
-
Die
Inhibierung von löslicher
Epoxidhydrolase kann therapeutisch wirksam sein, um eine Entzündungserkrankung
zu behandeln, wie das Atemnotsyndrom der Erwachsenen. Dies ist darauf
zurückzuführen, dass
geeignete Epoxidhydrolase-Inhibitoren eine Entzündungsantwort in einem Patienten über eine
Inhibierung der Bildung einer oder mehreren polyungesättigten
Lipidmetaboliten, wie die Inhibierung der Bildung von Dihydroxyoxyeicosadienoaten,
oder DiHOxyEDEs in der Arachidonsäurereihe von Oxylipinen, verzögert oder verhindert.
Arachidonsäureepoxide
(EETs) und in einigen Fällen
die entsprechenden Diole (DHETs) sind allgemein bekannt, auch biologisch
aktiv zu sein. Man glaubt, dass diese am Verlauf und Schwere von
Fieber beteiligt sind (Kozak, 1998); die Erzeugung von Prostaglandin
E2 in vaskulärem
glattem Muskel inhibieren (Fang, 1998), die Bradykinin-induzierte
Vasodilation des Herzens vermitteln (Fulton, 1998), die Vasodilation
induzieren (Oltman, 1998; Imaoka, 1998), und andere physiologische
Wirkungen haben. Die lösliche
Epoxidhydrolase scheint einen von einer Entzündung abstammenden Mediator
biologisch zu aktivieren, was die Notwendigkeit hinsichtlich wirksamer
und ortsspezifischer Inhibitoren von Epoxidhydrolase, wie die hier
beschriebenen, nahe legt. Der Inhibitor von Epoxidhydrola se kann
auch therapeutisch verwendet werden, um Fieber, entzündliche
Erkrankungen und Bluthochdruck zu behandeln. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren
wirken folglich durch Verringerung der Umwandlung der Lipidepoxide
in die entsprechenden Diole, wie die Umwandlung von EEP's in DHET's.
-
Die
Bildung eines Epoxidhydrolase-Komplexes ist nützlich bei der Reinigung oder
Isolierung der Ziel-Epoxidhydrolase. Die Verbindung der Formel 1
kann beispielsweise so derivatisiert werden, dass diese an einen
wasserunlöslichen
Träger
immobilisiert ist. Wenn man den Träger mit enzymatisch aktiver
Epoxidhydrolase kontaktiert, beispielsweise bei der Eluierung einer
wässrigen
Lösung
mit Epoxidhydrolase durch den Träger,
führt die
Komplexbildung dann zu einer selektiven Abtrennung der Epoxidhydrolase.
-
Inhibitoren,
wie bestimmte Analoga und aktive Derivate der Verbindung der Formel
1, können
auch verwendet werden, um Epoxidhydrolasen von diesen und anderen
Trägern
zu eluieren. Wie zuvor angemerkt, umfassen nützliche Verbindungen, die einen
Komplex mit Epoxidhydrolasen eingehen, Epoxidhydrolaseübergangszustand-Dicyclohexylmimetika,
wie Harnstoffe und Carbamate, welche den Enzymübergangszustand nachahmen können, falls
diese stabil mit dem aktiven Zentrum des Enzyms wechselwirken. Wir
haben gefunden, dass Analoga der Verbindung der Formel 1, die auch
als selektive Inhibitoren von löslicher
Epoxidhydrolase fungieren können,
Verbindungen mit der Struktur der Formel 2 umfassen (wobei X, Y,
R1, R2, R3 und R4 wie für Formel
1 beschrieben sein können),
wobei Z jedoch Sauerstoff oder Schwefel ist, und W Kohlenstoff, Phosphor
oder Schwefel ist. Eine Darstellung mehrerer solcher beispielhaften
Inhibitorverbindungen der Struktur der Formel 2 sind in der Tabelle
2 gezeigt. Die Verbindung 12 kann zu dem entsprechenden Carbodiimid (Verbindung
1) und anschließend
zu dem entsprechenden Harnstoff (Verbindung 2) umgewandelt werden.
-
Die
Verbindungen der Formel 2 sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung,
außer
diejenigen Verbindungen der Formel 2, die durch die Formel 1 erfasst
sind. FORMEL
2
TABELLE
2
-
Ein
Thioharnstoff kann chemisch und biochemisch in ein Carbodiimid umgewandelt
werden und das Carbodiimid kann sich zu Harnstoff hydrolysieren.
Wenn die N- und N'-Substituenten
Cyclohexyl sind, dann ist die Verbindung Dicyclohexylcarbodiimid
(Verbindung 1).
-
Wir
glauben, dass die hierin beschriebenen Inhibitoren die ersten biologisch
stabilen Inhibitoren für
alle Epoxidhydrolasen sind. Die Inhibitoren können auf Epoxidhydrola sen in
Säugern,
Pflanzen, Insekten und wahrscheinlich auf alle Organismus mit einer
Epoxidhydrolase angewendet werden.
-
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
Die 1A und 1B stellen
graphisch die Wirkung der Zeit auf die Inhibierung von löslicher Maus-EH
bzw. löslicher
humaner EH durch die Verbindungen 1 und 2 dar; und
-
die 2 stellt
graphisch die Wirkung der Verbindung 2 auf die lösliche Kartoffel-EH (22,5 nM)
und lösliche
Kresse-EH (35 nM) dar.
-
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
-
Die
vorliegenden Verbindungen sind Inhibitoren von Epoxidhydrolase,
vorzugsweise selektive Inhibitoren. Dies bedeutet, dass ein Inhibitor
eine größere inhibitorische
Wirkung auf ein EH-Enzym als auf andere EH-Enzyme aufweist, und
hat eine höhere
Selektivität
für EH
als für
Nicht-EH-Enzyme.
-
Bei
der Ausführung
dieser Erfindung ist es besonders bevorzugt, lösliche EH selektiv zu inhibieren. Das
Beispiel 5 zeigt den Assay, der zur Bestimmung der selektiven Inhibierung
von löslicher
EH für
eine Anzahl von Verbindungen, die gemäß dieser Erfindung nützlich sind,
verwendet wurden, wobei deren Inhibitordaten in der Tabelle 4 gezeigt
sind. Die Selektivität
ist in der Tabelle 3 dargestellt, wobei der verwendete Inhibitor
die Verbindung 2 war. TABELLE 3
Enzyme | %
Inhibierung durch 100 µM
von 2 |
cytosolische
EH | 99,3 ± 0,8 |
Peroxisom-EH | 99,6 ± 0,6 |
mikrosomale
EH | 0,5 ± 0,8 |
cytosolische
GST | 0,8 ± 1,1 |
mikrosomales
P-450 | 1,7 ± 2,3 |
mikrosomale
Carboxylesterase | 3,5 ± 4,7 |
Pepsin | 0,1 ± 0,1 |
-
Wie
durch die Daten der Tabelle 3 gezeigt, inhibierte die Verbindung
2 bei einer Konzentration von 100 µM die cytosolische und die
Peroxisom-EH-Aktivität
vollständig,
während
keine signifikante Inhibierung für
die anderen getesteten Enzymaktivitäten beobachtet wurde. Diese
Ergebnisse zeigen die selektive Inhibierung von löslicher
EH, die im Cytosol vorliegt, und Peroxisom-Enzymen, durch gemäß der Erfindung
nützlichen
Verbindungen. Eine Schlussfolgerung aus diesen Daten besteht darin,
dass die Verbindung 2 ein wirksamer Inhibitor der cytosolischen
und peroxisomalen EH, jedoch nicht der anderen getesteten Enzyme
ist. Der für
die Verbindung 2 für
Maus-sEH berechnete Ki betrug 22 ± 3 nM.
-
Geeignete Inhibierung
-
Ein
Verfahren wird beschrieben, das geeignet ist zum Reinigen, Isolieren
oder Inhibieren der Ziel-Epoxidhydrolase durch Komplexbildung mit
einer Verbindung in freier Form oder einer immobilisierten Verbindung,
so dass die Aktivität
der so komplexierten Epoxidhydrolase gegenüber enzymatisch aktiver, nicht-komplexierter
Epoxidhydrolase modifiziert ist.
-
Verbindungen
mit dieser Komplexbildungsfähigkeit
zur Verwendung gemäß der Er
findung weisen die in der Formel 1 gezeigte Struktur auf. FORMEL
1
wobei X und Y jeweils unabhängig voneinander Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel sind, und X außerdem Kohlenstoff sein kann,
mindestens einer von R
1-R
4 Wasserstoff
ist, R
2 Wasserstoff ist, wenn X Stickstoff
ist, aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist,
R
4 Wasserstoff ist, wenn Y Stickstoff ist,
aber nicht vorhanden ist, wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R
1 und R
3 jeweils
unabhängig
voneinander H, C
1-20 substituiertes oder
nicht substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl oder ein Heterozyklus
sind.
-
Zusätzlich zu
den Verbindungen der Formel 1, welche aufgrund des Inhibitors, der
einen Enzym-Substrat-Übergangszustand
oder ein Reaktionsintermediat nachahmt, mit dem Enzym in reversibler
Weise wechselwirkt, sind andere Verbindungen irreversible Inhibitoren
des Enzyms. Die aktiven Strukturen, wie diejenigen der Tabellen
oder der Formel 1, können
den Inhibitor zu dem Enzym leiten, wo eine reaktive Funktionalität im aktiven
Zentrum des Enzyms eine kovalente Bindung mit dem Inhibitor ausbilden
kann. Eine Gruppe von Molekülen,
die so Wechselwirken könnten,
hätten
eine Abgangsgruppe, wie ein Halogen oder ein Tosylat, die durch
ein Lysin oder ein Histidin gemäß SN2 angegriffen werden könnte. Alternativ könnte die
reaktive Funktionalität
ein Epoxid oder ein Michael-Akzeptor sein, wie ein α/β-ungesättigter
Ester, ein Aldehyd, ein Keton, ein Ester oder ein Nitril.
-
Wie
in 1 gezeigt, erhöht sich die Inhibierung der
Maus-sEH durch die Verbindung 1 mit der Zeit, während die Inhibierung durch
die Verbindung 2 über
die Zeit stabil ist. Diese Beobachtung könnte durch die Tatsache erklärt werden,
dass das Carbodiimid 1 in einer Wasserlösung langsam zu dem Harnstoff
2 hydrolysiert wird. Diese Ergebnisse stützten die Hypothese, dass die
Harnstoffe, Carbamate, Amide und verwandte Verbindungen, die in
dieser Erfindung diskutiert werden, direkt wirken. Diese Ergebnisse
zeigen auch die Möglichkeit
auf, Carbodiimide als Vorläuferformen
der in der Erfindung nützlichen
Harnstoff-Verbindungen zu verwenden. Thioharnstoffe andererseits
wurden kommerziell als Vorläuferformen
von Carbodiimiden verwendet.
-
Dicyclohexylthiolharnstoff
kann zu Dicyclohexylcarbodiimid oxidiert werden, das, mit Enzym
oder einer wässrigen
Säurelösung (physiologische
Salzlösung),
einen aktiven Dicyclohexylharnstoff bilden wird. Alternativ können die
sauren Protonen der Carbamate oder Harnstoffe durch eine Vielzahl
von Substituenten ersetzt werden, welche nach Oxidation, Hydrolyse
oder Angriff durch ein Nukleophil, wie Glutathion, die entsprechende
Stammstruktur ergeben wird. Diese Materialien sind als Prodrugs
oder Protoxine bekannt (Gilman et al., 1985, The Pharmacological
Basis of Therapeutics, 7. Auflage, MacMillan Publishing Company,
New York, Seite 16). Ester sind beispielsweise verbreitete Prodrugs,
welche freigesetzt werden, um enzymatisch die entsprechenden Alkohole
und Säuren
zu ergeben (Yoshigae et al., Chirality, 9, Seiten 661–666, 1997).
Die Prodrugs können
für eine
höhere
Spezifität
chiral sein. Diese Derivate wurden umfassend in der Medizin- und
Agrochemie verwendet, um die pharmakologischen Eigenschaften der
Verbindungen zu verändern,
wie beispielsweise zum Erhöhen
der Wasserlöslichkeit,
zum Verbessern der Formulierungschemie, zum Verändern des Gewebe-Targetings,
zum Verändern
des Verteilungsvolumens und zum Verändern des Penetrationsvermögens. Sie wurden
auch verwendet, um toxikologische Profile zu verändern.
-
Es
gibt viele mögliche
Prodrugs, wobei jedoch der Ersatz eines oder beider der zwei aktiven
Wasserstoffe in den hier beschriebenen Harnstoffen oder des einzigen
aktiven Wasserstoffs, das in Carbamaten vorkommt, ist jedoch besonders
günstig.
Solche Derivate wurden ausführlich
durch Fukuto und Mitarbeiter beschrieben. Diese Derivate wurden
ausführlich
beschrieben und werden allgemein in der Agro- und Medizinchemie
verwendet, um die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen
zu verändern
(Black et al., "Selective
Toxicity of N-Sulfenylated Derivatives of Insecticidal Methylcarbamate
Esters", Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 21(5), Seiten 747–751, 1973;
Fahmy et al., "Selective
Toxicity of N,N'-thiodicarbamates", Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 26(3), Seiten 550–556, 1978; Jojima et al., "Sugar, Glyceryl,
and (Pyridylalkoxy)Sulfinyl Derivatives of Methylcarbamates Insecticides", Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 31(3), Seiten 613–620, 1983; und Fahmy et al., "N-Sulfinylated Derivative
of Methylcarbamate Esters", Journal
of Agricultural and Food Chemistry", 29(3), Seiten 567–572, Mai-Juni 1981).
-
Ohne
an eine Theorie gebunden zu sein, glauben wir, das geeignete erfindungsgemäße Inhibitoren den
Enzymübergangszustand
nachahmen, so dass eine stabile Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum
des Enzyms besteht. Die Inhibitoren scheinen Wasserstoffbindungen
mit der nukleophilen Carbonsäure
und einem polarisierenden Tyrosin des aktiven Zentrums zu bilden.
-
Falls
die modifizierte Aktivität
der komplexierten Epoxidhydrolase eine Enzyminhibierung ist, weisen besonders
bevorzugte Ausführungsformen
von Verbindungen einen IC50 (Inhibierungsvermögen oder,
per Definition, die Konzentration des Inhibitors, welche die Enzymaktivität um 50%
verringert) von weniger als 500 µM auf.
-
Isolation oder Reinigung von
Epoxidhydrolasen durch Affinitätstrennung
-
Affinitätsreinigungssysteme
sind für
Enzyme beschrieben, die ein Oxyanion-Loch und eine nukleophile Säure im aktiven
Zentrum aufweisen, insbesondere im Falle, dass das Enzym eine Epoxidhydrolase
ist. Wir glauben, dass es wahrscheinlich ist, dass die Inhibitoren,
für die
hierin gezeigt wurden, dass sie lösliche EH inhibieren, auch
ein breites Spektrum an Enzymen der α/β-Hydrolase-Faltungsfamilie,
die eine nukleophile Säure
im aktiven Zentrum aufweisen, inhibieren werden. Ein Reinigungsverfahren
für eine
Epoxidhydrolase wird demzufolge beschrieben durch Immobilisieren
einer Verbindung mit der Struktur der Formel 2 an einen wasserunlöslichen
Träger. FORMEL
2
wobei Z Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ist,
W Kohlenstoff, Phosphor oder Schwefel ist, X und Y jeweils unabhängig voneinander
Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, und X außerdem Kohlenstoff
sein kann, R
1-R
4 Wasserstoff
ist, R
2 Wasserstoff ist, wenn X Stickstoff
ist, aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist,
R
4 Wasserstoff ist, wenn Y Stickstoff ist,
aber nicht vorhanden ist, wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R
1 und R
3 jeweils
unabhängig
voneinander H, C
1-20 substituiertes oder
nicht substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl oder ein Heterozyklus
sind.
-
Geeignete
wasserunlösliche
Träger,
an welche die Verbindung der Formel 2 geeigneterweise immobilisiert
sind, umfassen Epoxy-aktivierte SEPHAROSE, Aminopropyl- oder -hexyl-SEPHAROSE
oder Carboxyl-SEPHAROSE. Eine Vielzahl von festen Trägermatrices,
einschließlich
Glaskügelchen,
Polyvinylkügelchen oder
Agarose, kann verwendet werden.
-
Die
so immobilisierten Verbindungen stellen ein geeignetes Packungsmaterial
für Affinitätstrennungen dar,
wobei die immobilisierten Verbindungen einen Komplex mit Epoxidhydrolase
bilden können,
wenn eine wässrige
Lösung
durch eine mit dem Trennpackungsmaterial gepackte Säule eluiert
wird, oder in einem Batchverfahren.
-
Die
Immobilisierung der Verbindung erfolgt typischerweise durch Derivatisieren
von einem von R1 oder R3 mittels
gut bekannter Verfahren. Pharmacia Fine Chemicals verkauft beispielsweise
Aminopropyl- oder andere aminoterminale Affinitätsmaterialien (üblicherweise
unter der Handelsbezeichnung "SEPHAROSE") und BioRad Laboratories
verkauft Agarosegele und -kügelchen
für verschiedene
Erfordernisse der Affinitätschromatographie
(üblicherweise
unter der Handelsbezeichnung "AFFI-GEL"). Diese Materialien
können
beispielsweise mit Isocyanaten behandelt werden, um stabile immobilisierte
Harnstoffderivate gemäß der Erfindung
zu erhalten, welche mit Epoxidhydrolasen einen Komplex bilden. Alternativ
können
die Verbindung der Formel 1 verwendet werden, um Epoxidhydrolasen
von gebräuchlicheren
Affinitätssäulen zu
eluieren, wie in dem Fall, in dem ein Thiol (z. B. Benzylthiol)
mit Epoxyaktivierter "SEPHAROSE" (entweder Gel oder
Kügelchen),
hergestellt durch Umsetzen von Butanglycoldiglycidylether, umgesetzt
wird. Die Epoxidhydrolasen in einer wässrigen Lösung können dann selektiv mit den
derivatisierten Harnstoffen der Formel 1 oder den derivatisierten Verbindungen
der Formel 2 gemäß der vorliegenden
Erfindung eluiert werden.
-
Inhibierung von Epoxidhydrolase zur Behandlung
einer Entzündungserkrankung
-
(nicht Teil der Erfindung)
-
Die
Entzündungsantwort
ist eine der wichtigsten physiologischen Mechanismen für die Aufrechterhaltung
der menschlichen Gesundheit. Entzündungsstörungen oder eine nicht adäquate Entzündungsantwort kann
jedoch zu Gewebeschäden,
Morbidität
oder Mortalität
führen.
-
Atemnotsyndrom
der Erwachsenen (ARDS) ist eine Lungenerkrankung, welche eine Sterblichkeitsrate von
50% hat und auf Lungenläsionen
zurückzuführen ist,
welche durch eine Vielzahl von Zuständen verursacht sind, die in
Trauma-Patienten und in Opfern starker Verbrennungen gefunden werden.
Ingram, R. H. Jr., "Adult Respiratory
Distress Syndrome",
Harrisons's Principals
of Internal Medicine",
13, Seite 1240, 1995. Mit der eventuellen Ausnahme von Glucocorticoiden
gab es keine Therapeutika, von denen bekannt war, dass sie wirksam
sind bei der Prävention
oder Linderung von Gewebeschäden,
wie eine mit einer akuten Entzündung assoziierte
mikrovaskuläre
Schädigung,
welche während
der frühen
Entwicklung von ARDS auftritt.
-
ARDS,
das teilweise durch die Entstehung eines alveolären Ödems definiert ist, stellt
eine klinische Manifestation einer Lungenerkrankung dar, die sowohl
aus einer direkten als auch einer indirekten Lungenschädigung resultiert.
Während
in früheren
Studien eine scheinbar zusammenhangslose Vielzahl von verursachenden
Agenzien ausführlich
beschrieben wurden, sind die initialen Vorgänge, welche der Pathophysiologie von
ARDS zugrunde liegen, nicht gut verstanden. ARDS wurde ursprünglich als
Einzelorganversagen angesehen, wird nun jedoch als Komponente des
Multisystem-Organversagungssyndroms (MOFS) betrachtet. Die pharmakologische
Intervention oder Prävention
der Entzündungsantwort
wird gegenwärtig
als vielversprechenderes Verfahren zum Kontrollieren des Krankheitsverlaufs
als Atemunterstützungstechniken
angesehen, siehe beispielsweise Demling, Annu. Rev. Med., 46, Seiten
193–203,
1995.
-
Eine
andere Erkrankung (oder Gruppe von Erkrankungen), die mit einer
akuten Entzündung
einhergeht, ist das systemische Entzündungsantwortsyndrom, oder
SIRS, wobei dies die Bezeichnung ist, die kürzlich von einer Gruppe von
Forschern eingeführt
wurde, um verwandte Zustände
zu beschreiben, die beispielsweise aus einer Sepsis, einer Pankreatitis,
multiplen Traumata, wie einer Hirnschädigung, und einer Gewebeschädigung,
wie einem Muskelriss, einer Hirnoperation, einem hämorrhagischer
Schock und einer immunvermittelten Organschädigung resultieren. Bone, JAMA,
268:24, Seiten 3452–3455,
1992.
-
Die
Lunge mit ihrer ausgedehnten Oberfläche, die direkt der Umgebung
ausgesetzt ist, ist besonders anfällig für eine oxidative Schädigung und
Entzündungsprodukte.
Da der gesamte Herzausstoß durch
die Lungenarterie fließt,
können
die Lungen auch durch Agenzien im Blut geschädigt werden. Die zelluläre Heterogenität von Säugetierlungen
verkompliziert die direkte Untersuchung dieser Lungenzellen, die
am anfälligsten
für eine
Schädigung
sind. Des Weiteren macht es die komplexe Lungenanatomie schwierig,
genau zu unterscheiden, wo biologische Agenzien im Lungengewebe
metabolisiert werden. Das Zielgewebe und die Abfolge von Ereignissen,
welche einem alveolären Ödem zugrunde
liegen, sind nicht abschließend
festge stellt; deshalb bleiben die wechselseitigen Beziehungen und
die jeweiligen Beiträge
von endothelialen versus epithelialen versus inflammatorischen Kompartimenten
bei der Verbesserung einer Schädigung
der Luft-Blut-Schranke fraglich.
-
Die
ARDS-Beschwerden werden bei einer Vielzahl von Patienten mit schweren
Verbrennungen oder Sepsis beobachtet. Sepsis ist andererseits eines
der SIRS-Symptome.
In ARDS gibt es eine akute Entzündungsreaktion
mit einer hohen Anzahl an Neutrophilen, welche in das Interstitium
und die Alveolen wandern. Falls dies fortschreitet, ergibt sich
eine verstärkte
Entzündung,
verstärkt Ödeme, eine
verstärkte
Zellproliferation und das Endergebnis ist eine beeinträchtigte
Fähigkeit,
Sauerstoff zu entziehen. ARDS ist folglich eine verbreitete Komplikation
in einer Vielzahl von Erkrankungen und Traumata. Die einzige Behandlung
ist unterstützend.
Es treten geschätzte
150000 Fälle
pro Jahr auf und die Mortalität
liegt im Bereich von 10% bis 90%.
-
Die
genaue Ursache von ARDS ist nicht bekannt. Es wurde jedoch die Hypothese
aufgestellt, dass die Überaktivierung
von Neutrophilen zur Freisetzung von Linolsäure in hohen Konzentrationen über eine
Phospholipase A2-Aktivität führt. Linolsäure wiederum wird enzymatisch
durch Cytochrom P-450-Epoxygenase von Neutrophilen und/oder einem
Burst von aktivem Sauerstoff zu 9,10-Epoxy-12-octadecenoat umgewandelt. Dieses
Lipidepoxid, oder Leukotoxin, wird in hohen Konzentrationen in verbrannter
Haut und im Serum und der Bronchial-Lavage von Verbrennungspatienten
gefunden. Des Weiteren führt
es bei der Injektion in Ratten, Mäuse, Hunde und andere Säugetiere
zu ARDS. Der Wirkmechanismus ist nicht bekannt. Das Leukotoxindiol, das
durch die Wirkung von löslicher
Epoxidhydrolase erzeugt wird, scheint jedoch ein spezifischer Induktor
der Permabilitätstransition
der Mitochondrieninnenmembran (MPT) zu sein. Diese Induktion durch
Leukotoxindiol, die diagnostische Freisetzung von Cytochrom c, die
Kernkondensation, die DNA-Leiterbildung und die CPP32-Aktivierung,
welche zum Zelltod führen,
wurden alle durch Cyclosporin A inhibiert, was diagnostisch ist für den MPT-induzierten
Zelltod. Die Wirkungen auf mitochondrialem und zellulärem Niveau
stehen im Einklang mit diesem Wirkmecha nismus, was nahe legt, dass
die hierin beschriebenen Inhibitoren mit Verbindungen, die MPT blockieren,
therapeutisch verwendet werden könnten.
-
In
der Erfindung nützliche
therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die
Inhibitoren enthalten, können
durch irgendeines der verschiedenen, gut bekannten Verfahren hergestellt
werden. Üblicherweise
wird der Inhibitor so formuliert, dass dieser für die orale oder parenterale
Verabreichung geeignet ist und ist üblicherweise in einem physiologisch
tolerierbaren Träger
oder Verdünnungsmittel
gelöst oder
dispergiert. Ein Inhibitor kann beispielsweise in einer flüssigen Zusammensetzung,
wie einer sterilen Suspension oder einer Lösung gelöst oder dispergiert werden,
oder als eine isotonische Zubereitung,. Besonders gut geeignet sind
injizierbare Medien, die mit gepufferten oder nicht gepufferten
isotonischen und sterilen Salz- oder Glucoselösungen formuliert sind. Für die in
vitro-Verwendung kann die Inhibierung der Aktivität der Ziel-Epoxidhydrolase,
wie gut bekannt, anhand der Abnahme des Enzündungsgrads verfolgt werden.
Die Menge des verabreichten therapeutischen Inhibitors kann eine
einzelne Verabreichung oder ein Teil der Gesamtmenge sein. Ferner
sind mehrere Verabreichungen über
eine Zeitspanne von mehreren Tagen, Wochen oder Monaten denkbar.
-
Der
Wirkstoff kann auch in Zusammensetzung, wie Tabletten oder Pillen,
die vorzugsweise eine Einheitsdosis enthalten, verwendet werden,
und können
mit herkömmlichen
Tablettierungsbestandteilen vermischt sein. Die tatsächlichen
Dosierungen des Epoxidhydrolase-Inhibitors können variiert werden, um die
gewünschte
therapeutische Antwort für
eine bestimmte Zusammensetzung und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren
zu erhalten. Die verabreichte tägliche
Gesamtdosis kann von 0,001 bis 100 mg pro kg Körpergewicht sein. Bei der Ausführung der
Erfindung sollte allerdings ein Wirkstoff, wie Clofibrat, der dafür bekannt
ist, die lösliche
Epoxidhydrolase und Cytochrom P-450 zu induzieren, und ein Wirkstoff,
wie Acetaminophen, der zu einer Verarmung an Glutathion führt, vermieden
werden. Der Grund hierfür
besteht darin, dass wir experimentelle Daten haben, welche darauf
hinweisen, dass, wenn die Glutathionkonzentrationen vermindert sind,
Leukotoxin toxischer wird. Im Gegensatz dazu sollten parallele Therapien
gefördert
werden, die entwickelt wurden, um alternative Wege des Leukotoxin-Metabolismus
zu verstärken,
wie die Verabreichung von N-Acetylcystein und Glutathion und deren
Ethylester.
-
Das
Beispiel 1 veranschaulicht eine in vivo Anwendung der Inhibitor-Ausführungsform
2, um den durch Leukotoxine/Isoleukotoxine induzierten Tod eines
Tieres blockieren oder das Leben von Mäusen zu verlängern.
-
REFERENZBEISPIEL 1
-
Männliche
Swiss-Webster-Mäuse
(25–28
g) wurden von Simonsen, Gilroy, Kalifornien, gekauft. Die Tiere
hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Die Mäuse (drei in jeder Gruppe)
wurden i. p. mit in Maisöl suspendiertem
Dicyclohexylharnstoff (Verbindung 2) (400 mg/kg, 7 ml/kg) oder mit
Maisöl
als Positivkontrollen vorbehandelt. Nach 30 Minuten der Vorbehandlung
wurden die Mäuse über die
Schwanzvene intravenös
mit einer 1:1-Mischung von Leukotoxin/Isoleukotoxinmethylester in
Ethanol (700 mg/kg, 1,0 ml/kg) behandelt.
-
Die
Mäuse starben
nach Aussetzen gegenüber
Leukotoxin/Isoleukotoxin an respiratorischer Insuffizienz. Die tödlichen
Reaktionen erfolgten nacheinander durch beschleunigtes Atmen, Öffnen des
Mundes zur Unterstützung
der Atmung, und dem Austreten von Körperflüssigkeit aus der Nase. Die
Vorbehandlung mit N,N'-Dicyclohexylharnstoff
2 blockierte jedoch entweder den durch Leukotoxin/Isoleukotoxin
induzierten Tod der Tiere oder verlängerte das Leben der Mäuse.
-
Andere Anwendungen für die Inhibierung
von Epoxidhydrolase
-
Eine
Inhibierung von Epoxidhydrolase kann für Forschungszwecke nützlich sein,
beispielsweise um die mikrosomale Epoxidhydrolase im Ames-Assay
und anderen Toxizitätassays
zu inhibieren, bei denen man die Sensitivität des Assays für Epoxid enthaltende
Mutagene und Karzinogene erhöhen
kann und die Hypothese, dass das Epoxid bei der Toxinwirkung beteiligt
ist, überprüfen kann.
-
Die
Tabelle 4 zeigt eine Vielzahl von Inhibitoren zusammen mit Inhibierungsdaten. TABELLE
4
-
Die
Daten der Tabelle 4 zeigen, dass lösliche EH selektiv inhibiert
werden kann, und die Verbindungen 19 und 101 zeigen, dass auch mikrosomale
EH inhibiert werden kann. Wir glauben, dass diese Verbindungen ein
breites Spektrum von Enzymen der α/β-Hydrolase-Faltungsfamilie,
die eine nukleophile Säure
im aktiven Zentrum aufweisen, inhibieren werden. Diese Verbindungen
sollten es der Computerchemie ermöglichen, weitere aktive Materialien
vorherzusagen.
-
Ferner
stellt Verbindung 2 einen sehr wirksamen Inhibitor (bevorzugte Ausführungsform)
der EHs dar. Die Verbindungen 19, 101, 204 und 238 stellen wirksame
selektive Inhibitoren der mikrosomalen EH dar. Die Verbindung 225
zeigt, dass chirale Verbindungen verwendet werden können, um
die Wirksamkeit und Selektivität
zu erhöhen.
-
Wie
zuvor erwähnt,
können
auch Metabolite oder Abbauprodukte der Inhibitoren der Formel 1
oder Formel 2 Inhibitorkomplexe mit EH bilden und nützlich bei
der Ausführung
der Erfindung sein. So ist beispielsweise die Verbindung 32 der
Tabelle 4 ein bekannter Metabolit des Herbizids Diuron, und die
Verbindung 32 inhibiert lösliche
Epoxidhydrolase aus Mensch und Maus. Die Verbindung 303 (ein Abbauprodukt
der Verbindung 28) ist ein besserer Inhibitor der mikrosomalen Ratten-Epoxidhydrolase.
-
Die
therapeutischen Anwendungen der Inhibierung von Epoxidhydrolyse
gemäß der Erfindung
können auch
in Verbindung mit einer Krebstherapie nützlich sein. Dies ist darauf
zurückzuführen, dass
die Epoxidhydrolase-Expression in malignen Tumoren ein möglicher
Mechanismus ist, der für
die Antikrebsmittel-Resistenz vorgeschlagen wurde. Murray et al., "The Expression of
Cytochrome P-450, Epoxide Hydrolase, and Glutathione S-Transferase
in Hepatocellular Carcinoma",
Cancer, 71, Seiten 36–43,
1993; Theyer et al., "Role
of the MDR-1-Encoded Multiple Drug Resistance Phenotype in Prostate
Cancer Cell Line",
J. of Urology, 150, Seiten 1544–1547,
1993; Murray et al., "The
Immunohistochemical Localization of Drug-Metabolizing Enzymes in Prostate
Cancer", J. of Pathology,
177, Seiten 147–152,
1995.
-
Tabelle
5 zeigt beispielsweise die mEH-Aktivität für cis-Stilbenoxid (Wixtrom
und Hammock, 1985, Biochemical Pharmacology and Toxicology, Band
1: Methodological Aspect of Drug Metabolizing Enzymes (Zakin und
Versey, Hrgb.), John Wiley & Sons,
Inc., New York, Seiten 1–93)
mit verschiedenen Krebszelllinien, welche mikrosomale EH exprimieren.
Es ist gut bekannt, dass dieses Enzym im Leber-Metabolismus des
Wirkstoffs mitwirkt. Die Inhibierung dieses Enzyms durch Verbindungen
der Formeln 1 oder 2 sollte deshalb den Metabolismus von Epoxid
enthaltenden Krebsmitteln verringern und folglich deren Wirksamkeit
erhöhen. Tabelle 5
Zelllinie | mEH-Aktivität (nMol.min–1.mg–1) |
Prostatakrebszellen | |
PC-3 | 0,67 |
DU
145 | 1,80 |
LNCaP | 1,37 |
Lungenkrebszellen | |
CaLu-1 | 1,53 |
A-549 | 0,66 |
Kopf-
und Halskrebszellen | |
SQ-20B | 0,37 |
Eierstockkrebszellen | |
ES-2 | 0,10 |
SK-OV3 | 1,11 |
-
Wie
aus den Daten der Tabelle 5 ersichtlich, ist die mikrosomale EH-Aktivität in mehreren
Krebslinien signifikant exprimiert und könnte im Metabolismus von Krebsmedikamenten,
wie Cyclohexendiepoxid, in malignen Tumoren mitwirken. Eine Vielzahl
von antineoplastischen Wirkstoffen wurden entwickelt, deren Wirkung auf
den alkylierenden Eigenschaften von Epoxiden und Diepoxiden beruht.
Die Inhibitoren von Epoxidhydrolase könnten diese Verbindungen stabilisieren
und deren antineoplastische Aktivität verstärken.
-
Die
Herstellung von beispielhaften Inhibitoren und eines Assays, der
zur Bestimmung der Inhibierung nützlich
ist, wird nun näher
durch die Beispiele 2–5
beschrieben.
-
BEISPIEL 2
-
Synthese von 1-Octyl-3-penylharnstoff
-
Zu
0,262 g (3,00 mmol) Pentylamin in 20 ml Hexan werden 0,53 ml (0,47
g, 3,0 mmol) Octylisocyanat unter Rühren gegeben, um letztendlich
einen weißen
kristallinen Feststoff zu erzeugen. Nach Stehenlassen über Nacht
wird die Mischung gekühlt,
das feste Produkt gesammelt und mit kaltem Hexan gewaschen. Durch Trocknen
an der Luft werden 0,705 g (2,91 mmol, 97%) 1-Octyl-3-pentylharnstoff
als sehr feine weiße
Nadeln, Schmp. 65,0–65,5°C, erhalten.
Dieses Material zeigt ein 13C-NMR-Spektrum und ein
Massenspektrum, das mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt. 13C-NMR (CDCl3): δ 159,0 (C=O),
40,47 und 40,45 (C-1 und C-1'), 31,8
(C-6 und C-3'),
30,4 (C-2), 30,1 (C-2'),
29,3 (C-4), 29,2 (C-5), 27,0 (C-3), 22,5 (C-7), 22,4 (C-4'), 13,9 (C-8 und
C-5'); wichtige
Infrarotbanden (KBr-Scheiben) sind vorhanden bei 3334 (s, N-H),
1617 (vs, C=O) und 1579 (vs, Amid II) cm–1.
-
BEISPIEL 3
-
Synthese von 1-Cyclohexyl-3-cyclooctylharnstoff
-
Cyclooctylamin,
0,382 g (3,00 mmol), 0,40 ml (0,39 g, 3,1 mmol) Cyclohexylisocyanat
in 20 ml Hexan, nach Stehenlassen für einen Tag, liefert 0,664
g (88%) 1-Cyclohexyl-3-cyclooctylharnstoff
als weiße
Nadeln, Schmp. 194,0–194,5°C. Ein Infrarotspektrum
[3344 (s, NH), 3334 (s, NH), 1624 (vs, C=O), 1564 (vs. Amid II) cm–1]
und ein Massenspektrum [FAB-MS m/z berechnet für C15H28N2O: 252, beobachtet:
253
(M + H+)] bestätigen die Identität dieses
Materials.
-
BEISPIEL 4
-
Cyclohexylcarbamothionsäure-5-cyclohexylester
-
Zu
einer Lösung
von 0,61 ml (0,58 g, 5,0 mmol) Cyclohexylthiol in 25 ml Hexan wurde
langsam eine Lösung
von 0,626 g (5,00 mmol) Cyclohexylisocyanat in 5 ml Hexan zugegeben.
Die Zugabe eines Tropfens 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en initiiert die
Bildung eines weißen
kristallinen Produkts. Nach mehreren Tagen bei Umgebungstemperatur
wird die Mischung gekühlt,
der Cyclohexylcarbamothionsäure-S-cyclohexylester
gesammelt, mit eiskaltem Hexan gewaschen und getrocknet, wodurch
1,15 g (4,76 mmol, 95%) eines Produkts erhalten wurde, das bei 117,0–118,0°C schmilzt.
Ein bestätigendes 13C-NMR-Spektrum (CDCl3)
wird für dieses
Material beobachtet: δ 165,9
(C=O), 50,3 (C-1), 43,4 (C-1'),
33,8 (C-2', 6'), 33,1 (C-2, 6),
26,0 (C-3', 5'), 25,5 (C-4'), 25,4 (C-4), 24,7
(C-3, 5). Unterstützende
Infrarotbanden (KBr) werden bei 3343 (s, N-H), 1649 (vs, C=O) und
1206 (m, C-N) cm–1 beobachtet.
-
REFERENZBEISPIEL 5
-
Assay zur Bestimmung der Inhibibierung
von löslicher
EH
-
Rekombinante
Maus-sEH (MsEH) und humane sEH (HsEH) wurden in einem Baculovirus-Expressionssystem,
wie zuvor beschrieben, erzeugt. Grant et al., 3. Biol. Chem., 268,
Seiten 17628–17633
(1993); Beetham et al., Arch. Biochem. Biophys., 305, Seiten 197–201 (1993).
Die exprimierten Proteine wurden aus dem Zelllysat durch Affinitätschromatographie
gereinigt. Wixtrom et al., Anal. Biochem., 169, Seiten 71–80 (1988). Die
Proteinkonzentration wurde durch den Pierce BCA-Assay unter Verwendung
von Rinderserumalbumin als Kalibrierungsstandard quantifiziert.
Die Präparationen
waren wenigstens 97% rein, beurteilt durch SDS-PAGE und Scanning-Densitometrie. Sie
enthielten keine nachweisbare Esterase- oder Glutathiontransferase-Aktivität, welche
den Assay stören
kann. Der Assay wurde mit ähnlichen
Ergebnissen auch in rohen Zelllysaten oder Gewebehomogenaten evaluiert.
-
Der
IC50 für
jeden Inhibitor wurde mittels des spektrophotometrischen Assays
von Dietze et al. (Dietze et al., "Spectrophotometric Substrates for Cytosolic
Epoxide Hydrolase",
Anal. Biochem., 216, Seiten 176–187, 1994)
bestimmt unter Verwendung von klonierten Epoxidhydrolase-Genen,
die im Baculovirus-System unter Verwendung von racemischem 4-Nitrophenyl-trans-2,3-epoxy-3-phenylpropylcarbonat
(NEP2C) als Substrat exprimiert wurden. In einer 96-Well-Styrol-Mikroplatte
wurden 20 µl
der Enzympräparation
und 2 µl
der Inhibitorlösung
in DMF ([I]ENDE: 0,05 bis 500 µM) zu 180 µl Natriumphosphat
(0,1 M, pH 7,4), enthaltend 0,1 mg/ml BSA, gegeben. Die Mischung
wurde für
5 Minuten bei 30°C
inkubiert. Eine Substratkonzentration von 40 µM wurde dann erhalten, indem
4 µl einer
2 mM Lösung
zugegeben wurde. Die Aktivität
wurde bestimmt durch Messen des Auftretens des 4-Nitrophenolats
bei 405 nm bei 30°C
für 1 Minute
(Spectramax 200; Molecular Device Inc., USA). Die Assays wurden
vierfach durchgeführt.
Per Definition ist der IC50 die Konzentration
des Inhibitors, welche die Enzymaktivität um 50% verringert. Die IC50 wurden mittel Regression von wenigstens
fünf Datenpunkten
mit einem Minimum von zwei Punkten im linearen Bereich der Kurve
auf jede Seite des IC50 bestimmt. Die Kurve
wurde aus wenigstens vier separaten Läufen generiert, um die Standardabweichung
zu erhalten. In wenigstens einem Lauf wurden Verbindungen mit vergleichbarer
Wirksamkeit einbezogen, um die Rangfolge sicherzustellen. Eine weitere
Rangfolge unter sehr guten Verbindungen wurde bestimmt mit dem 3H-trans-Stilbenoxid-Assay, der in Wixtrom
und Hammock (unten) beschrieben ist, oder einem verwandten Assay,
der auf Borhan et al., "Improved
Radiolabeled Substrates for Soluble Epoxide Hydrolase", Anal. Biochem., 231,
Seiten 188–200,
1995, beruht. Ein ähnlicher
auf 3H-cis-Stilbenoxid beruhender Verteilungsassay
ist in Wixtrom und Hammock, "Membrane-Bound and Soluble-Fraction
Epoxide Hydrolases: Methodological Aspects", Biochemical Pharmacology and Toxicology,
Band 1, (Zakim und Vessey, Hrgb.), John Wiley & Sons, Inc., New York, Seiten 1–93, 1985,
beschrieben.
-
REFERENZBEISPIEL 6
-
Wirkung auf andere Enzyme
-
Mikrosomale
Säuger-EH
wurde untersucht unter Verwendung von 3H-cis-Stilbenoxid,
mikrosomale Insekten-EH wurde untersucht mit 3H-Juvenilhormon
III und 3H-trans-Diphenylpropenoxid, cytosolische und
peroxisomale Säuger-
und Pflanzen-EHs wurden untersucht unter Verwendung von 3H-trans-Diphenylpropenoxid, P-450 wurde
untersucht unter Verwendung von 3H-Testosteron,
der Carboxylesterase-Assay verwendete para-Nitrophenylacetat und
der Glutathion-S-Transferase-Assay verwendete Chlordinitrobenzol.
Pepsin wurde unter Verwendung von Hämoglobin als Substrat untersucht.