DE60030412T2 - Verbesserte phytasen - Google Patents

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phytase
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Description

  • Phytasen sind Enzyme, die Phytat (myo-Inositolhexakisphosphat) zu myo-Inositol und anorganischem Phosphat hydrolisieren. Sie sind als wertvolle Futterzusätze bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Phytasen, d.h. Phytasen mit geänderten Eigenschaften, z. B. geänderten Aktivitätseigenschaften, wobei z. B. auf die Phytase(n) Bezug genommen wird, von der sie abgeleitet worden ist/sind, oder auf bekannte Phytasen. Geänderte Aktivitätseigenschaften bedeutet, geändert in mindestens einer Phytaseaktivitäts-bezogenen Hinsicht, wie (nicht-ausschließliche Liste): pH-Stabilität, Temperaturstabilität, pH-Profil, Temperaturprofil, spezifische Aktivität (insbesondere in Bezug auf pH und Temperatur), Substratspezifität, Substrat-Spaltmuster, Substratbindung, Positionsspezifität, die Geschwindigkeit und den Level der Freisetzung von Phosphat von Getreide, Reaktionsgeschwindigkeit, Geschwindigkeit der Degradierung von Phytat, erreichter Endlevel an freigesetztem Phosphat.
  • Beispiele von geänderten Aktivitätseigenschaften sind eine geänderte spezifische Aktivität (z. B. erhöht, z. B. erhöht bei einem pH von 3, 4, 5 oder 6); ein geändertes pH- oder Temperaturprofil; und 1 oder eine geänderte (z. B. erhöhte) Thermostabilität, z. B. eine erhöhte Schmelztemperatur, wie unter Verwendung von Differentialrasterkalorimetrie (Differential Scanning Calorimetry, DSC) gemessen.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung eines modifizierten Proteins, in welchem in einem ersten Schritt eine Consensussequenz von einer Anzahl von in hohem Grad homologen Sequenzen bestimmt wird, gemäß den nachfolgenden Schritten a), b) und c):
    • a) mindestens drei, bevorzugt mindestens 4 Aminosäuresequenzen werden anhand von einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Standardabgleichprogramm abgeglichen („aligned");
    • b) an jeder Position des Aminosäuresequenzabgleichs werden die Aminosäuren auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit hin bewertet und ein Consensusrest wird durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Standardprogramm ausgewählt, wobei die Mindestanforderungen für die Berechnung eines Consensusrests derart eingestellt werden, dass das Programm bereits in der Lage ist, einen Consensusrest zu bestimmen, wenn ein gegebener Rest in lediglich zwei der abgeglichenen Sequenzen vorkommt. Wenn dort jedoch eine Untergruppe von Sequenzen zwischen den verglichenen Aminosäuresequenzen vorhanden ist, die einen sehr viel höheren Ähnlichkeitsgrad miteinander zeigen als mit den verbleibenden Sequenzen des Abgleichs, kann die Untergruppe in der Berechnung lediglich mit ihrer Consensussequenz dargestellt werden, die auf die gleiche Weise bestimmt wird, wie in EP 897985 erläutert, oder es wird alternativ zu jeder Sequenz der Untergruppe ein Vote Weight („vote weight") von 1, dividiert durch die Anzahl an Sequenzen in der Untergruppe, festgesetzt;
    • c) in dem Fall, dass keine Consensusaminosäure an einer definierten Position von dem Programm identifiziert wird, wird eine beliebige der Aminosäuren, bevorzugt die an dieser Position am häufigsten vorkommende Aminosäure, ausgewählt.
  • In einem zweiten Aspekt wird eine homologe Sequenz mit der Consensussequenz verglichen und ein oder mehrere Nicht-Consensusreste in dieser homologen Sequenz werden durch die entsprechenden Consensusreste ersetzt.
  • Bevorzugt werden lediglich solche Aminosäurereste in der homologen Aminosäuresequenz ersetzt, wo ein Consensusrest durch das Programm unter moderat stringenten Bedingungen eindeutig definiert werden kann, während an allen Positionen des Abgleichs, wo keine bevorzugte Consensusaminosäure unter moderat stringenten Bedingungen bestimmt werden kann, die Aminosäuren des homologen Proteins unverändert bleiben.
  • In einem dritten Aspekt wird das aktive Zentrum des interessierenden Proteins bestimmt, welches alle Aminosäurereste, die in der Bildung des aktiven Zentrums involviert sind, umfasst, sowohl in der Consensussequenz als auch in der Sequenz eines homologen Proteins; nachfolgend werden einige oder alle der abweichenden Aminosäurereste des homologen Proteins in das Gerüst (Rückgrad) der Consensussequenz eingefügt.
  • In einer Ausführungsform dieses Verfahrens, das für den Vergleich der Aminosäuren an einer definierten Position Bezug auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit verwendet wird, ist das Programm „PRETTY".
  • Das aktive Zentrum des Proteins kann unter Verwenden einer Analyse der dreidimensionalen Struktur des Proteins bestimmt werden.
  • Ein Beispiel eines homologen Proteins ist eine Enzymfamilie, ein Beispiel einer definierten Proteinfamilie ist die Familie der Phytasen, z. B. mit Herkunft von Pilzen.
  • Die Aminosäuresequenz der Phytase kann beispielsweise durch die Einführung von mindestens einer Mutation oder Substitution, ausgewählt von
    E58A F54Y
    D69K I73V
    D197N K94A
    T214L R101A
    E222T N153K
    E267D V158I
    R291I A203G
    R329H S205G
    S364T V217A
    A379K A227V
    G404A V234L
    P238A
    Q277E
    A287H
    A292Q
    V366I
    A396S
    E415Q
    G437A
    R451E
    verändert werden.
  • Zum Interpretieren dieser Abkürzungen ist als ein Beispiel die Mutation E58A wie folgt zu interpretieren: Wenn 26 von der Zahl abgezogen wird, erhält man die Position oder die Nummer des Restes in der Consensus-Phytasesequenz oder einer anderen Phytasesequenz, abgeglichen wie in 1 gezeigt (entsprechend zu der Addition einer Signalsequenz mit 26 Aminosäuren zu den in 1 gezeigten Sequenzen). Zum Beispiel bedeutet die Zahl 58 in E58A die Position Nummer 32 (58 – 26 = 32). Und der Buchstabe vor der Zahl, d. h. E, stellt die in der Phytase zu modifizierenden Aminosäure dar, welche durch die Aminosäure nach der Zahl ersetzt wird, d. h. A.
  • Die oben erwähnten Ersetzungen von Aminosäuren, alleine und/oder in Kombination, weisen eine positive Wirkung auf die Proteinstabilität auf.
  • Die folgenden Untergruppen von Mutationen sind ebenfalls interessant (d. h. Phytasen, welche mindestens eine Mutation umfassen, ausgewählt aus einer der Gruppen aus):
    E58A, D69K, D197N, T214L, E222T, E267D, R2911, R329H, S364T, A379K, G404A; F54Y, I73V, K94A, R101A, N153K, V158I, A203G, S205G, V217A, A227V, V234L,
    P238A, Q277E, A287H, A292Q, V366I, A396S, E415Q, G437A, R451E;
    E58A, D69K, D197N, F54Y, I73V, K94A;
    T214L, E222T, E267D, R101A, N153K, V158I;
    R291I, R329H, S364T, A203G, S205G, V217A;
    A379K, G404A, A227V, V234L, P238A, Q277E;
    A287H, A292Q, V366I, A396S, E415Q, G437A, R451E;
    T214L, E222T, S364T, V158I, A203G, G404A, A227V, P238A, A396S, G437A, R451E.
  • Beispiele von Wirtszellen sind Pflanzenzellen, Tierzellen und mikrobielle Zellen, zum Beispiel prokaryotische oder eukaryotische Zellen, wie Bakterien-, Pilz- oder Hefezellen. Ein Beispiel eines Pilzwirtes ist ein Stamm der Gattung Aspergillus und Beispiele von Hefewirten sind Stämme von Saccharomyces und Stämme von Hansenula.
  • Die Erfindung offenbart ebenfalls ein modifiziertes Protein, das durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist oder erhalten wird.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Variante oder Mutante einer Phytase, wie (jedoch nicht hierauf beschränkt) Consensus-Phytase-1, wobei in der Aminosäuresequenz aus 2 mindestens eine der folgenden Ersetzungen bewirkt worden ist: Q50L, Q50T, Q50G, Q50T-Y51N, Q50L-Y51N oder Q50T-K91A.
  • In dem oben erwähnten dritten Aspekt wird eine Consensussequenz von homologen Sequenzen, wie oben beschrieben, bestimmt; in einem zweiten Schritt wird das aktive Zentrum des Proteins, welches alle Aminosäurereste umfasst, die in die Bildung des aktiven Zentrums involviert sind, in der Consensussequenz und in der Sequenz eines einzelnen homologen Proteins bestimmt. Das einzelne homologe Protein kann bevorzugte Eigenschaften aufweisen, wie eine hohe spezifische Aktivität oder eine unterschiedliche pH-Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität. In einem dritten Schritt werden einige oder alle Aminosäurereste, die in die Bildung des aktiven Zentrums des homologen Proteins involviert sind, in das Gerüst (Rückgrad) der Consensussequenz eingefügt. Das Ergebnis hiervon ist ein chimäres Protein, welches das von einem einzelnen Protein abgeleitete aktive Zentrum, und das Gerüst (Rückgrad) der Consensussequenz aufweist.
  • Das aktive Zentrum von einem Protein kann z. B. unter Verwenden jeder beliebigen Analyse der dreidimensionalen Struktur des Proteins bestimmt werden, z. B. durch Homologie-Modellierung („homology modelling") auf der Basis einer bekannten 3D-Struktur eines bekannten Proteins.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Consensusproteine bereit, die durch solche Verfahren erhältlich sind oder erhalten werden, insbesondere Proteine, die mindestens eine der in den 2 bis 6, 10 oder 21 gezeigten Aminosäuresequenzen umfassen oder Varianten oder Mutanten hiervon. Beispiele von solchen Varianten sind in den 7 bis 9 gezeigt.
  • Solche Varianten oder Mutanten können definiert und hergestellt werden auf der Basis der Lehre, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0897010 gegeben ist, z. B. Q50L, Q50T, Q50G, Q50L-Y51N oder Q50T-Y51N. Diese Mutationen sind wie oben oder alternativ unter Bezugnahme auf 2 definiert. Wenn auf die 2 Bezug genommen wird, ist keine Subtraktion des Signalpeptids mit 26 Aminosäuren erforderlich (z. B. in „Q50L" ist an Position 50 der Aminosäuresequenz aus 2 die Aminosäure Q durch die Aminosäure L ersetzt worden).
  • Eine Nahrungsmittel-, Futter- oder pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Phytasen der Erfindung umfasst, ist ein anderer Aspekt der Erfindung.
  • In diesem Zusammenhang bedeutet „mindestens 3, bevorzugt mindestens 4 Aminosäuresequenzen einer solchen definierten Proteinfamilie", dass drei, vier, fünf sechs bis zwölf zwanzig, fünfzig oder sogar mehr Sequenzen für den Abgleich und den Vergleich verwendet werden können, um die Aminosäuresequenz des Consensusproteins zu erzeugen. „Sequenzen einer definierten Proteinfamilie" bedeutet, dass solche Sequenzen in eine dreidimensionale Struktur gefaltet werden, in der bei die alpha-Helices, die beta-Faltblätter und beta-Drehungen an der gleichen Position vorliegen, so dass solche Strukturen, wie es von einem Fachmann bezeichnet wird, weitgehend überlagerbar („largely superimposable") sind. Weiterhin kennzeichnen diese Sequenzen Proteine, welche den gleichen Typ an biologischer Aktivität zeigen, z. B. einer definierten Enzymklasse, z. B. den Phytasen. Die dreidimensionale Struktur eines solchen Proteins ist ausreichend, um das Modellieren der Struktur der anderen homologen Proteine einer solchen Familie zu ermöglichen. Ein Beispiel, wie dies erfolgen kann, ist in Beispiel 1 gegeben. „Evolutionäre Ähnlichkeit" in dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Schema, welches Aminosäuren in Bezug auf ihre strukturelle Ähnlichkeit klassifizieren, was es erlaubt, dass eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt werden kann, mit einem minimalen Einfluss auf die Gesamtstruktur, wie dies beispielsweise durch im Stand der Technik bekannte Programme, wie „PRETTY", erfolgt. Der Satz „der Ähnlichkeitsgrad, der von einem solchen Programm bereitgestellt wird ... ist auf eine niedrige stringente Nummer eingestellt" bedeutet im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, dass Werte für die Parameter, welche den Ähnlichkeitsgrad in dem Programm bestimmen, das für das Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in einer Weise gewählt werden, die es dem Programm ermöglicht, eine Consensusaminosäure für ein Maximum an Positionen der gesamten Aminosäuresequenz zu definieren, z. B. kann im Fall des Programms „PRETTY" ein Wert von 2 oder 3 für die THRESHOLD und ein Wert von 2 für die PLURALITY gewählt werden. Weiterhin bedeutet „ein Vote Weight von einer geteilt durch die Anzahl solcher Sequenzen" in dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, dass die Sequenzen, welche eine Gruppe von Sequenzen mit einem höheren Ähnlichkeitsgrad als die anderen Sequenzen, die für die Bestimmung der Consensussequenz verwendet werden, definieren, lediglich mit einem Faktor, der gleich ist zu einer, geteilt durch die Anzahl von allen Sequenzen dieser Gruppe ist, zu einer solchen Bestimmung beitragen.
  • Wie zuvor erwähnt, sollte es das Programm nicht erlauben, die Consensusaminosäure auszuwählen, die häufigste Aminosäure wird ausgewählt; sollte das letztgenannte nicht möglich sein, wird der Fachmann eine Aminosäure aus all den Sequenzen, die für den Vergleich verwendet werden, auswählen, die im Stand der Technik für ihre Eigenschaft bekannt ist, die Thermostabilität in Proteinen zu verbessern, wie beispielsweise diskutiert von Janecek, S. (1993), Process Biochem. 28, 435–445; Fersht, A. R. & Serrano, L. (1993), Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75–83; Alber, T. (1989), Annu. Rev. Biochem. 58, 765–798; Matthews, B. W. (1987), Biochemistry 26, 6885–6888; oder Matthews, B. W. (1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17–21.
  • Die Stabilität eines Enzyms ist für zahlreiche industrielle Anwendungen relevant. Daher sind eine Vielzahl von Versuchen, mehr oder weniger erfolgreich, vorgenommen worden, um die Stabilität, bevorzugt die Thermostabilität von Enzymen, durch rationale und zufällige Ansätze zu verbessern.
  • Wir stellen hier einen alternativen Weg dar, um die Thermostabilität eines Proteins zu verbessern.
  • Die Erfindung offenbart ein Verfahren für die Herstellung eines Consensusproteins, welches ein Verfahren zum Berechnen eines Aminosäurerestes für nahezu alle Positionen eines so genannten Consensusproteins und zum Synthetisieren eines vollständigen Gens von dieser Sequenz, das in einem pro- oder eukaryotischen Expressionssystem exprimiert werden kann, umfasst.
  • DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können ausgehend von den genomischen oder cDNA-Sequenzen, welche die interessierenden Proteine, z. B. Phytasen, kodieren, konstruiert werden. Zum Beispiel können sie anhand von Verfahren der in vitro Mutagenese konstruiert werden [siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Eine weit verbreitete und verwendete Strategie für eine „ortsgerichtete Mutagenese", wie ursprünglich von Hurchinson und Edgell [J. Virol. 8, 181 (1971)] behandelt, involviert das Annealing (Annähern) eines synthetischen Oligonukleotids, welches die gewünschte Nukleotidsubstitution trägt, zu einer Target-Region (Zielregion) einer einzelsträngigen DNA-Sequenz, in welche die Mutation eingeführt werden soll (für einen Überblick siehe Smith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985), und für verbesserte Verfahren siehe Referenzen 2–6 in Stanssen et al., Nucl. Acids Res., 17, 4441–4454 (1989). Eine andere Möglichkeit zum Mutieren einer gegebenen DNA-Sequenz ist die Mutagenese durch Verwendung der Polymerasekettenreaktionen (PCR). DNA als Ausgangsmaterial kann von den jeweiligen Stämmen durch Verfahren isoliert werden, die im Stand der Technik bekannt sind und beispielsweise in Sambrook et al. (Molecular Cloning) beschrieben sind.
  • Für Informationen zu Stämmen, siehe z. B. EP 684313 oder jede beliebige nachfolgend angezeigte Hinterlegungsstelle. Aspergillus niger [ATCC 9142], Myceliophthora thermophila [ATCC 48102], Talaromyces thermophilus [ATCC 20186] und Aspergillus fumigatus [ATCC 34625] sind neu hinterlegt worden gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Cell Collection unter den folgenden Zugriffsnummern: ATCC 74337, ATCC 74340, ATCC 74338 bzw. ATCC 74339. Es versteht sich jedoch, dass DNA, welche ein Consensusprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, ebenfalls auf synthetische Weise hergestellt werden kann, wie beispielsweise beschrieben in EP 747483 oder EP 897985 oder in den Beispielen, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren.
  • Für Sequenzinformationen siehe z. B. EP 684313 oder Sequenzdatenbanken, zum Beispiel wie Genbank (Intelligenetics, Californien, USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) und Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA).
  • Das Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um die Thermostabilität der Enzymphytase zu verbessern.
  • Sobald vollständige DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, können sie in Vektoren eingeführt werden, anhand von im Stand der Technik bekannter Verfahren und wie in Sambrook et al. (s. o.) beschrieben, um das kodierte Polypeptid in einem geeigneten Wirtssystem zu überexprimieren. Ein Fachmann weiß jedoch, dass ebenfalls die DNA-Sequenz selbst verwendet werden kann, um das geeignete Wirtssystem der Erfindung zu transformieren, um eine Überexpression des kodierten Polypeptids zu erhalten. Geeignete Wirtssysteme sind zum Beispiel Pilze, wie Aspergilli, z. B. Aspergillus niger [ATCC 9142] oder Aspergillus ficuum [NRRL 3135] oder wie Trichoderma, z. B. Trichoderma reesei, oder Hefen, wie Saccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Pichia, wie Pichia pastoris, oder Hansenula polymorpha, z. B. H. polymorpha (DSM5215); oder Pflanzen, wie beispielsweise beschrieben von Pen et al., Bio/Technology 11, 811–814 (1994). Ein Fachmann weiß, dass solche Mikroorganismen von den Hinterlegungsstellen erhältlich sind, z. B. der American Type Culture Collection (ATCC), dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) oder der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) oder jeder beliebigen Hinterlegungsstelle, wie in der Zeitschrift „Industrial Property" [(1991) 1, S. 29–40] aufgelistet. Bakterien, die verwendet werden können, sind z. B. E. coli; Bacilli, wie z. B. Bacillus subtilis; oder Streptomyces, z. B. Streptomyces lividans (siehe z. B. Anné und Mallaert in FEMS Microbiol. Lett. 114, 121 (1993). Bevorzugte Stämme von E. coli, die verwendet werden können, sind Stämme von E. coli K12, z. B. M15 [beschrieben als DZ 291 von Villarejo et al. in J. Bacteriol. 120, 466–474 (1974)], HB 101 [ATCC Nr. 33694] oder E. coli SG13009 [Gottesman et al., J. Bacteriol. 148, 265–273 (1981)].
  • Vektoren, die für die Expression in Pilzen verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in EP 420358 oder von Cullen et al., [Bio/Technology 5, 369–376 (1987)], Ward [Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York (1991)], Upshall et al., [Bio/Technology 5, 1301–1304 (1987)], Gwynne et al., [Bio/Technology 5, 71–79, (1987)], oder Punt et al., [J. Biotechnol. 17, 19–34 (1991)]; und für Hefen von Sreekrishna et al., [J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988), Biochemistry 28, 4117–4125 (1989)], Hitzemann et al. [Nature 293, 717–722 (1981)] oder in EP 183070 , EP 183071 , EP 248227 oder EP 263311 beschrieben. Geeignete Vektoren, die für die Expression in E. coli verwendet werden können, sind beispielsweise von Sambrook et al. [s. o.] Fiers et al. [Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium, Soc. Franc. de Microbiol., Paris (Durand et al., Hrsg.), S. 680–697 (1988)], Bujard et al. [Meth. Enzymol. 155, 416–433 (1987)], oder Stüber et al. [Immunological Methods, Hrsg. Lefkovits und Pernis, Academic Press, Inc. Band IV, 121–152 (1990)] genannt. Vektoren, die für die Expression in Bacilli verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in EP 207459 , EP 405370 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984) oder Yansura und Henner, Meth. Enzymol. 185, 199–228 (1990) beschrieben. Vektoren, welche für die Expression in H. polymorpha verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in Gellissen et al., Biotechnology 9, 291–295 (1991) beschrieben.
  • Jeder dieser Vektoren trägt bereits regulatorische Elemente, z. B. Promotoren, oder die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können technisch so erzeugt werden, dass sie solche Elemente erhalten. Geeignete Promotorelemente, welche verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise für Trichoderma reesei der cgh1- [Haarki et al., Biotechnology 7, 596–600 (1989)] oder der pki1-Promotor [Schindler et al., Gene 130, 271–275 (1993)]; für Aspergillus oryzae der amy-Promotor [Christensen et al., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987), Christensen et al., Biotechnology 6, 1419–1422 (1988), Tada et al., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)]; und für Aspergillus niger der glaA- [Cullen et al., Bio/Technology 5, 369–376 (1987), Gwynne et al., Bio/Teehnology 5, 713–719 (1987), Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 83–106 (1991)], alcA- [Gwynne et al., Bio/Technology 5, 718–719 (1987)], suc1- [Boddy et al., Curr. Genet. 24, 60–66 (1993)], aphA- [MacRae et al., Gene 71, 339–348. (1988), MacRae et al., Gene 132, 193–198 (1993)], tpiA- [McKnight et al., Cell 46, 143–147 (1986), Upshall et al., Bio/Technology 5, 1301–1304 (1987)], gpdA- [Punt et al., Gene 69, 49–57 (1988), Punt et al., J. Biotechnol. 17, 19–37 (1991)] und der pkiA-Promotor [de Graaff et al., Curr. Genet. 22, 21–27 (1992)]. Geeignete Promotorelemente, die für die Expression in Hefe verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise der pho5-Promotor [Vogel et. al., Mol. Cell. Biol., 2050–2057 (1989); Rudolf und Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340–1344 (1987)] oder der gap-Promotor für eine Expression in Saccharomyces cerevisiae; der aox1-Promotor [Koutz et al., Yeast 5, 167–177 (1989); Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)] für Pichia pastoris; oder der FMD-Promoter [Hollenberg et al., EPA Nr. 0299108] oder der MOX-Promotor [Ledeboer et al., Nucl. Acids Res. 13, 3063–3082 (1985)] für H. polymorpha.
  • Demgemäß sind Vektoren, welche die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen, bevorzugt für die Expression der DNA-Sequenzen in Bakterien oder einem Pilz- oder einem Hefewirt, und solche transformierten Bakterien oder Pilz- oder Hefewirte ebenfalls ein Teil der Erfindung.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein System bereit, welches die hohe Expression von Proteinen ermöglicht, insbesondere von den Phytasen der Erfindung, wie rekombinante Stämme von Hansenula. Um dies zu erreichen, können die Codons der DNA-Sequenz eines solchen Proteins auf der Basis einer Tabelle für die Codonhäufigkeit des für die Expression verwendeten Organismus, z. B. Hefe wie in dem vorliegenden Fall (siehe z. B. in Beispiel 1) ausgewählt werden. Optional können die Codons für die Signalsequenz in einer Weise ausgesucht werden, wie sie für den spezifischen Fall in Beispiel 1 beschrieben ist; das bedeutet, dass eine Tabelle für die Codonhäufigkeit auf der Basis der Codons, die in den DNA-Sequenzen verwendet werden, welche die Aminosäuresequenzen der gegebenen Proteinfamilie kodieren, hergestellt wird. Dann werden die Codons für die Gestaltung der DNA-Sequenz der Signalsequenz aus einer Tabelle für die Codonhäufigkeit der für die Expression verwendeten Wirtszelle ausgewählt, wobei immer Codons von einer vergleichbaren Häufigkeit in beiden Tabellen verwendet werden.
  • Sobald solche DNA-Sequenzen in einer geeigneten Wirtszelle in einem geeigneten Medium exprimiert worden sind, kann das kodierte Protein isoliert werden, entweder aus dem Medium, in dem Fall, dass das Protein in das Medium sekretiert wird, oder aus dem Wirtsorganismus, in dem Fall, dass ein solches Protein intracellulär vorhanden ist, anhand von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Proteinaufreinigung oder, wie in dem Fall einer Phytase, beispielsweise in EP 420358 beschrieben. Demgemäß ist ein Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, in welchen, wie oben beschriebene, transformierte Bakterien oder Wirtszellen unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert werden und das Polypeptid hieraus gewonnen wird, und ein Polypeptid, wenn es durch ein solches Verfahren hergestellt wird; oder ein Polypeptid, welches durch eine DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung kodiert wird, ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Sobald sie erhalten wurden, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung hinsichtlich ihrer Eigenschaften, die sie für die Landwirtschaft wertvoll machen, charakterisiert werden anhand eines jeden beliebigen im Stand der Technik bekannten Assays.
  • Im Allgemeinen können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne auf ein spezifisches Anwendungsgebiet beschränkt zu sein, beispielsweise im Fall von Phytasen für die Umwandlung von Inositolpolyphosphaten, wie Phytat, zu Inositol und anorganischem Phosphat.
  • Weiterhin können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder Nahrungsmittel- oder Futtermischungen verwendet werden, wobei die Komponenten einer solchen Zusammensetzung mit mindestens einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung vermischt werden. Demgemäß sind Nahrungsmittel- oder Futtermischungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen, welche mindestens ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfassen, ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung. Ein Fachmann ist mit dem Verfahren ihrer Herstellung vertraut. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen oder Nahrungsmittel- oder Futtermischungen können weiterhin Additive oder Verbindungen, die im Allgemeinen für einen solchen Zweck verwendet werden und im Stand der Technik bekannt sind, umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Reduzierung der Level an Phytat in Dung von Tieren, in welchem ein Tier mit einer solchen Futterzusammensetzung in einer Menge gefüttert wird, die effektiv zum Umwandeln von Phytat, das in dem Futter enthalten ist, zu niedrigeren Inositolphosphaten und/oder Inositol und anorganischem Phosphat ist.
  • In dem vorliegenden Zusammenhang ist eine Phytase ein Enzym oder ein Polypeptid, das Phytaseaktivität aufweist. Eine Phytase kann beispielsweise eine myo-Inositolhexakisphosphatphosphorhydrolase, wie (myo-Inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8) und (myo-Inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase, EC 3.1.3.26) sein.
  • In einer Ausführungsform wird die Phytase aufgereinigt, d.h. mindestens 85%, bevorzugt mindestens 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% rein, wie anhand von SDS-PAGE bewertet. Die Phytase kann isoliert sein. Die Phytaseaktivität kann anhand von jedem beliebigen im Stand der Technik bekannten Phytase-Assay bestimmt werden, z. B. mit dem Assay, das hierin beschrieben wird (siehe Beispiel 9). Die Assay-Temperatur kann die optimale Temperatur für die aktuelle Phytase sein und der Assay-pH kann der optimale pH der aktuellen Phytase sein.
  • Die Assay-Temperatur kann beispielsweise ausgewählt werden innerhalb des Bereichs von 20 bis 90°C oder 30 bis 80°C oder 35 bis 75°C, zum Beispiel Temperaturen von 37°C, 50°C, 60°C oder 70°C.
  • Der Assay-pH kann beispielsweise ausgewählt werden innerhalb des Bereichs von pH 2 bis 9, oder 3 bis 8 oder 3 bis 6, zum Beispiel Assay-pH-Werte von 3, 4, 5, 6 oder 7 können ausgewählt werden.
  • Die Aminosäuresequenzhomologie (oder Polypeptid- oder Aminosäurehomologie) wird bestimmt als der Identitätsgrad zwischen zwei Sequenzen. Dies kann geeigneterweise anhand von im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket [Program Manual for the Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, USA], siehe ebenfalls Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (1970), J. Mol. Biol., 48, 443–453]. Bei Release 9.1 zum Vergleichen von Polypeptidsequenzen ist das Length Weight („length weight") auf 0 eingestellt und das Gap Weight („gap weight") ist auf 3,0 eingestellt.
  • Der Grad der Identität oder Homologie zwischen zwei DNA-(Nukleinsäure-)Sequenzen kann anhand von im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket [Program Manual for the Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, USA], siehe ebenfalls Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (1970), J. Mol. Biol., 48, 443–453]. Bei Release 9.1 wird GAP mit den folgenden Einstellungen für einen DNA-Sequenzvergleich verwendet: GAP Creation Penalty („GAP creation penalty") von 50 und GAP Extension Penalty („GAP extension penalty") von 3.
  • Geeignete experimentelle Bedingungen zum Bestimmen, ob eine gegebene DNA- oder RNA-Sequenz mit einer spezifischen Nukleotid- oder Oligonukleotidsonde hybridisiert, umfasst das Vorweichen des Filters, der die für die Hybridisierung zu überprüfenden DNA- oder RNA-Fragmente enthält, in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat; (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl, Cold Spring Harbor, New York) für 10 Min. und Prähybridisierung des Filters in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter beschallter Lachssperma-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von der Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer Zufalls-geprimten („random-primed") (Feinberg. A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), 32p-dCTP-markierten (spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) Sonde für 12 Stunden bei ungefähr 45°C.
  • Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS und bei mindestens 55°C (niedrige Stringenz), bei mindestens 60°C (mittlere Stringenz), bei mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz), bei mindestens 70°C (hohe Stringenz) oder bei mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
  • Moleküle, mit denen die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, können unter Verwendung eines Röntgenfilms detektiert werden.
  • Phytasen mit geänderter Thermostabilität oder thermostabile Phytasen sind ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Eine „thermostabile" Phytase ist eine Phytase, die einen Tm (Schmelztemperatur) – wie anhand eines aufgereinigten Phytaseproteins durch Differentialrasterkalorimetrie (DSC) gemessen – von mindestens 65°C aufweist. Für die DSC kann eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit verwendet werden, z. B. von 10°C/Min. In alternativen Ausführungsformen beträgt die Tm mindestens 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 oder 75°C. Oder die Tm ist gleich oder niedriger als 150°C oder gleich oder niedriger als 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115 oder 110°C. Demgemäß sind Beispiele für Intervalle der Tm: 65 bis 150°C, 66 bis 150°C, – (etc.) – 75 bis 150°C; 65 bis 145°C 66 bis 145°C, – (etc.) – 75 bis 145°C, 65 bis 140°C, – (etc.) – 75 bis 140°C; – (etc.) – 65 bis 110°C, 66 bis 110°C, – (etc.) – 75 bis 110°C.
  • Besondere Bereiche für die Tm sind die folgenden: zwischen 65 und 110°C; zwischen 70 und 110°C, zwischen 70 und 100°C; zwischen 75 und 95°C oder zwischen 80 und 90°C.
  • In den nachfolgenden Beispielen 9 und 10 wird die Messung der Tm anhand von DSC beschrieben und die Tm's einer Anzahl von Phytasen werden gezeigt.
  • Die optimalen Temperaturen sind ebenfalls angezeigt, da – als ein alternatives Mittel – eine thermostabile Phytase als eine Phytase definiert werden kann, die ein Temperaturoptimum von mindestens 60°C aufweist. Bevorzugt wird die optimale Temperatur gegenüber dem Substrat Phytat oder Phytinsäure bei pH 5,0 oder 5,5 bestimmt. Beispiel 9 beschreibt ein Beispiel eines Phytase-Assays, einschließlich einer Definition von Einheiten.
  • In alternativen Ausführungsformen beträgt die optimale Temperatur mindestens 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 oder 70°C. In einer besonderen Ausführungsform ist die optimale Temperatur gleich zu oder geringer als 140°C oder gleich zu oder geringer als 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105 oder 100°C. Demgemäß sind Beispiele von Intervallen der optimalen Temperatur: 60 bis 140°C, 61 bis 140°C, – (etc.) – 70 bis 140°C; 60 bis 135°C, 61 bis 135°C, – (etc.) – 70 bis 135°C, 60 bis 130°C, – (etc.) – 70 bis 130°C; – (etc.) – 60 bis 100°C, 61 bis 100°C, – (etc.) – 70 bis 100°C.
  • Bevor die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben wird, wird nachfolgend eine kurze Erläuterung der beigefügten Figuren gegeben.
  • 1:
  • Gestaltung der Consensussequenz der Phytase-1. Die Buchstaben stellen Aminosäurereste in dem Ein-Buchstaben-Code dar. Die folgenden Sequenzen wurden für den Abgleich verwendet: phyA von Aspergillus terreus 9A-1 [Mitchell, D. B., Vogel, K., Weimann, B. J., Pasamontes, L. & van Loon, A., P. G. M. (1997), The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila, Microbiology 143, 245–252); von Aminosäure (aa) 27; SEQ ID: NR: 1]; phyA von A. terreus cbs116.46 [ EP 897985 ]. A heat resistant phytase of Aspergillus fumigatus with superior performance in animal experiments. Phytase optimization and natural variability. In: The Biochemistry of phytate and phytases (Hrsg. Rasmussen, S. K.; Raboy, V.; Dalbøge, H. und Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers); von aa (Aminosäure) 27; SEQ ID NR: 2; phyA von Aspergillus niger var. awamori. (Piddington et al. (1993) Gene 133, 55–62; von aa 27; SEQ ID NR: 3); phyA von A. niger T213 ( EP 897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 4); phyA von A. niger Stamm NRRL3135 [van Hartingsveldt, W., van Zeijl, C. M. F., Harteveld, G. M., Gouka, R. J., Suykerbuyk, M. E. G., Luiten, R. G. M., van Paridon, P. A., Selten, G. C. M., Veenstra, A. E., van Gorcom, R. F. M., & van den Hondel, C. A. M. J. J. (1993) Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene 127, 87 – 94; von aa 27; SEQ ID NR: 5]; phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 13073 (Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Tessier, M. & van Loon, A. F. G. M. (1997) Cloning, purification and characterization of a heat stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus, Appl. Environ. Microbiol. 63, 1696–1700; von aa 25; SEQ ID NR: 6]; phyA von A. fumigatus ATCC 32722 ( EP 897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 7); phyA von A. fumigatus ATCC 58128 ( EP 897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 8); phyA von A. fumigatus ATCC 26906 ( EP 897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 9); phyA von A. fumigatus ATCC 32239 ( EP 897985 ); von aa 30; SEQ ID NR: 10; phyA von Emericella nidulans [Pasamontes, L., Haiker, M., Henriquez-Huecas, M., Mitchell, D. B. & van Loon, A. P. G. M. (1997a). Cloning of the phytases from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus. Biochim. Biophys. Acta 1353, 217–223; von aa 25; SEQ ID NR: 11]; phyA von Talaromyces thermophilus (Pasamontes et al., 1997a) ; von aa 24; SEQ ID NR: 12); und phyA von Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., 1997; von aa 19; SEQ: ID NR: 13). Der Abgleich wurde unter Verwendung des Programms PILEUP berechnet. Die Location der Gaps (Lücken) wurde von Hand verfeinert. Groß geschriebene Aminosäurereste in dem Abgleich an einer gegebenen Position gehören zu der Vereinigung von Aminosäuren, welche den Consensusrest bildet. In Fettdruck darunter wird die berechnete Consensussequenz, die Aminosäuresequenz der endgültig erstellten Consensus-Phytase (Fcp), gezeigt (SEQ ID NR: 14). Die Gaps (Lücken) in der berechneten Consensussequenz werden von Hand aufgefüllt, gemäß den in Beispiel 1 festgelegten Prinzipien.
  • 2:
  • Die DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 15) des Consensusgens der Phytase-1 (fcp) und der Primer, die für die Genkonstruktion verwendet wurden. Die berechnete Aminosäuresequenz (1, SEQ ID NR: 14) wurde in eine DNA-Sequenz umgewandelt unter Verwendung des Programms BACKTRANSLATE [Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, O. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucl. Acids Res. 12, 387–395], und der Tabelle für die Codonhäufigkeit von in hohem Maß exprimierten Hefegenen (GCG Programmpaket, 9.0). Das Signalpeptid der Phytase von A. terreus cbs 116.46 wurde mit dem N-Terminus fusioniert. Die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz ist die SEQ ID NR: 16. Die fett gedruckten Basen stellen die Sequenzen der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das Gen zu erzeugen, dar. Die Namen der jeweiligen Oligonukleotide sind alternierend oberhalb oder unterhalb der Sequenz notiert. Die unterstrichenen Basen stellen das Start- und Stoppcodon des Gens dar. Die kursiv geschriebenen Basen stellen die zwei eingeführten EcoRI-Stellen dar.
  • 3:
  • Abgleich und Consensussequenz von fünf Phytasen von Basidiomycete. Die Buchstaben stellen die Aminosäurereste im Ein-Buchstaben-Code dar. Die Aminosäuresequenzen der Phytasen von Paxillus involutus, phyA1 (von aa 21; SEQ ID NR: 17; und phyA2 (von aa 21, WO 98/28409; SEQ ID NR: 18); Trametes pubescens (von aa 24, WO 98/28409; SEQ ID NO: 19); Agrocybe pediades (von aa 19, WO 98/28409; SEQ ID NR: 20); und Peniophora lycii (von aa 21, WO 98128409; SEQ ID NR: 21), beginnend mit den in Klammern angegebenen Aminosäureresten, wurden für den Abgleich und die Berechnung der entsprechenden Consensussequenz, genannt in „Basidio" (Beispiel 2; SEQ ID NR: 22) verwendet. Der Abgleich wurde mit dem Programm PILEPUP durchgeführt. Die Lokation der Gaps wurden von Hand verfeinert. Die Consensussequenz wurde anhand des Programms PRETTY berechnet. Während ein Vote Weight von 0,5 für die zwei Phytasen von P. involutus bestimmt wurde, wurden alle anderen Gene mit einem Vote Weight von 1,0 für die Berechnung der Consensussequenz verwendet. An Positionen, an denen das Programm nicht in der Lage war, einen Consensusrest zu bestimmen, enthielt die Basidio-Sequenz einen Gedankenstrich. Groß geschriebene Aminosäurereste in dem Abgleich an einer gegebenen Position stellen die Vereinigung von Aminosäuren dar, die den Consensusrest festsetzt.
  • 4:
  • Gestaltung der Consensusaminosäuresequenz der Phytase-10. Durch Addieren der Sequenz der Phytase von Thermomyces lanuginosus [Berka, R. M., Rey, M. W., Brown, K. M., Byun, T. & Klotz, A. V. (1998) Molecular characterization and expression of a phytase gene from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4423–4427; SEQ ID NR: 23] und der Consensussequenz der Phytasen von fünf Basidiomyceten (SEQ ID NR: 22) zu dem Abgleich aus 1, wurde eine verbesserte Consensussequenz anhand des Programms PRETTY berechnet. Zusätzlich wurde die Aminosäuresequenz von A. niger T213 ausgelassen, und ein Vote Weight von 0,5 wurde für die verbleibenden zwei Phytasesequenzen von A. niger festgelegt. Für weitere Informationen siehe Beispiel 2.
  • 5:
  • DNA- und Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-10 (SEQ ID NR: 25 bzw. SEQ ID NR: 26).
  • Die Aminosäuresequenz ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die Sequenz der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das Gen zusammenzubauen, sind in Fettbuchstaben geschrieben. Die Namen der jeweiligen Oligonukleotide und der Aminosäuren, die sich in Bezug auf die Consensus-Phytase-1 unterscheiden, sind unterstrichen. Das Gen fcp10 wurde aus den folgenden Oligonukleotiden zusammengebaut: CP-1, CP-2, CP-3.10, CP-4.10, CP-5.10, CP-6, CP-7.10, CP-8.10, CP-9.10, CP-10.10, CP-11.10, CP-12.10, CP-13.10, CP-14.10, CP-15.10, CP-16.10, CP-17.10, CP-18.10, CP-19.10, CP-20.10, CP-21.10 und CP-22.10. Die neu synthetisierten Oligonukleotide sind weiterhin durch die Zahl 10 gekennzeichnet. Die Phytase enthält die folgenden 32 Austausche in Bezug auf die Consensus-Phytase-1: Y54F, E58A, D69K, D70G, A94K, N134Q, I158V, S187A, Q188N, D197N, S204A, T214L, D220E, L234V, A238P, D246H, T251N, Y259N, E267D, E277Q, A283D, R291I, A320V, R329H, S364T, I366V, A379K, S396A, G404A, Q415E, A437G, A463E. Die unterstrichenen Mutationen zeigen einen Stabilisierungseffekt gegenüber der Consensus-Phytase-1 an, wenn sie als Einzelmutationen in der Consensus-Phytase-1 getestet werden.
  • 6:
  • Abgleich für die Gestaltung der Consensus-Phytase-11 (SEQ ID NR: 27). Im Gegensatz zu der Gestaltung der Consensus-Phytase-10, wurden für die Gestaltung der Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-11 alle Phytase von Basidiomycete als unabhängige Sequenzen unter Verwenden eines festgelegten Vote Weigth von 0,2 für jede Sequenz von Basidiomycete verwendet. Zusätzlich wurde die Aminosäuresequenz von A. niger T213 wieder in diesem Abgleich verwendet.
  • 7:
  • DNA- und Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A (SEQ ID NR: 28 bzw. SEQ ID NR: 29). Die Aminosäuresequenz ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die ersetzten Aminosäurereste (in Bezug auf die Consensus-Phytase-1) sind unterstrichen. Das Stoppcodon des Gens ist durch einen Stern (*) markiert.
  • 8:
  • DNA- und Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A (SEQ ID NR: 30 bzw. SEQ ID NR: 31). Die Aminosäuresequenz ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die ersetzten Aminosäurereste (in Bezug auf die Consensus-Phytase-10) sind unterstrichen. Das Stoppcodon des Gens ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet.
  • 9:
  • DNA- und Aminosäuresequenz der alpha-Mutante Q51T der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 (SEQ ID NR: 32 bzw. SEQ ID NR: 33). Die Aminosäuresequenz ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die ersetzten Aminosäurereste (bezogen auf die Phytase von A. fumigatus ATCC 13073) sind unterstrichen. Das Stoppcodon des Gens ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet.
  • 10:
  • DNA- und Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-7 (SEQ ID NR: 34 bzw. SEQ ID NR: 35). Die Aminosäuren sind oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die Sequenz der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das Gen zusammenzubauen, sind in Fettbuchstaben geschrieben. Oligonukleotide und Aminosäuren, die ausgetauscht wurden (unter Bezug auf die Consensus-Phytase-1), sind unterstrichen, und die entsprechenden Triplets sind in Kleinbuchstaben geschrieben. Das Gen fcp7 wurde aus den folgenden Oligonukleotiden zusammengebaut: CP-1, CP-2, CP-3, CP-4.7, CP-5.7, CP-6, CP-7, CP-8.7, CP-9, CP-10.7, CP-11.7, CP-12.7, CP-13.7, CP-14.7, CP-15.7, CP-16, CP-17.7, CP-18.7, CP-19.7, CP-20, CP-21 und CP-22. Die neu synthetisierten Oligonukleotide sind zusätzlich durch die Zahl 7 gekennzeichnet. Die Consensus-Phytase-7 enthält die folgenden 24 Austausche im Vergleich mit der originalen Consensus-Phytase-1: S89D, S92G, A94K, D164S, P201S, G203A, G205S, H212P, G224A, D226T, E255T, D256E, V258T, P265S, Q292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I, A397S, S398A, G404A und A405S.
  • 11:
  • Differentialrasterkalorimetrie (DSC) von der Consensus-Phytase-1 und der Consensus-Phytase-10. Die Proteinproben wurden auf ungefähr 50 bis 60 mg/ml konzentriert und extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min. wurde bis zu 95°C angewendet. DSC von der Consensus-Phytase-10 (obere Kurve) ergab eine Schmelztemperatur von 85,4°C, welche 7,3°C höher ist als der Schmelzpunkt der Consensus-Phytase-1 (78,1°C, untere Kurve).
  • 12:
  • Differentialrasterkalorimetrie (DSC) von der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T und der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A. Die Proteinproben wurden auf ungefähr 50 bis 60 mg/ml konzentriert und extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min. wurde bis zu 95°C angewendet. DSC von der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T (obere Kurve) ergab eine Schmelztemperatur von 88,6°C, während die Schmelztemperatur der Consensus-Phytase-10-thermo-Q50T-K91A mit 89,3°C bestimmt wurde.
  • 13:
  • Vergleich des Temperaturoptimums zwischen der Consensus-Phytase-1, der Consensus-Phytase-10 und der Contensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T. Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Phytase-Standardassay aus Beispiel 9 für eine Reihe von Temperaturen zwischen 37 und 86°C durchgeführt. Der verdünnte Überstand von transformierten Stämmen von S. cerevisiae wurde für die Bestimmung verwendet. Die anderen Komponenten des Überstandes wiesen keinen Einfluss auf die Bestimmung des Temperaturoptimums auf: ∧, Connensus-Phytase-1; ♢, Consensus-Phytase-10;
    Figure 00240001
    , Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T.
  • 14:
  • ph-abhängiges Aktivitätsprofil und Substratspezifität der Consensus-Phytase-10 und ihrer Varianten thermo[3]-Q50T und thermo[3]-Q50T-K91A. Die Phytaseaktivität wurde unter Verwenden des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Die Kurve a) zeigt das pH-abhängige Aktivitätsprofil der Consensus- Phytase-10 (☐), Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T (·) und Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A (∧). Die Kurve b) zeigt die entsprechende Substratspezifität, die durch die Ersetzung von Phytat durch die angezeigten Verbindungen in dem Standardassay getestet wurde; offene Balken, Consensus-Phytase-10; graue Balken, Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T; dunkle Balken, Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A. Die Zahlen entsprechen den folgenden Substraten: 1, Phytat; 2, p-Nitrophenylphosphat; 3, Phenylphosphat; 4, Fructose-1,6-bisphosphat; 5, Fructose-6-phosphat; 6, Glucose-6-phosphat; 7, Ribose-5-phosphat; 8, DL-Glycerol-3-phosphat; 9, Glycerol-2-phosphat; 10, 3-Phosphoglycerat; 11, Phosphoenolpyruvat; 12, AMP; 13, ADP; 14, ATP.
  • 15:
  • ph-abhängiges Aktivitätsprofil und Substratspezifität der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T und der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A. Die Phytaseaktivität wurde unter Verwenden des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Die Kurve a) zeigt das pH-abhängige Aktivitätsprofil von der Q50T- (
    Figure 00250001
    ) und der Q50T-K91A-Variante (·). Die Kurve b) zeigt die entsprechenden Substratspezifitäten, die durch die Ersetzung von Phytat in dem Standardassay durch die angezeigten Verbindungen getestet wurde (offene Balken, Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T; ausgefüllte Balken Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A. Die Substrate sind in den Legenden der 14 aufgeführt.
  • 16:
  • Differentialrasterkalorimetrie (DSC) von der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T und der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A. Die Proteinproben wurden auf ungefähr 50 bis 60 mg/ml konzentriert und extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min. wurde bis zu 95°C angewendet. DSC von der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T (obere Kurve) zeigte eine Schmelztemperatur von 84,7°C, während der Schmelzpunkt der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A bei 85,7°C festgestellt wurde.
  • 17:
  • Vergleich des Temperaturoptimums zwischen der Consensus-Phytase-1, der Consensus-Phytase-1 thermo[3] und der Contensus-Phytase-1 thermo[8]. Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Phytase-Standardassay bei einer Reihe von Temperaturen zwischen 37 und 86°C durchgeführt. Protein, das aus dem Überstand von transformierten Stämmen von S. cerevisiae aufgereinigt wurde, wurde für die Bestimmung verwendet. O, Cosnensus-Phytase-1; ☐, Consensus-Phytase-1 thermo[3];
    Figure 00260001
    , Consensus-Phytase-1 thermo[8].
  • 18:
  • Vergleich des ph-abhängigen Aktivitätsprofils und der Substratspezifität zwischen der Consensus-Phytase-1, der Consensus-Phytase-7 und der Phytase von A. niger NRRL 3135. Die Phytaseaktivität wurde unter Verwenden des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Der Graph a) zeigt das pH-abhängige Aktivitätsprofil der Consensus-Phytase-1 (
    Figure 00260002
    ), der Phytase von A. niger NRRL 3135 (O) und der Consensus-Phytase-7 (
    Figure 00260003
    ). Der Graph b) zeigt die entsprechenden Substratspezifitäten, die durch die Ersetzung von Phytat in dem Standardassay durch die angezeigten Verbindungen getestet wurde (schwarze Balken, Phytase von A, niger NRRL 3135; offene Balken, Consensus-Phytase-1; gestrichelte Balken, Consensus-Phytase-7. Die Substrate sind in der Legende von 14 aufgelistet.
  • 19:
  • Differentialrasterkalorimetrie (DSC) von der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 und ihrer stabilisierten alpha-Mutante, welche die folgenden Aminosäurenaustausche enthält: F55Y, V100I, F114Y, A243L, S265P und N294D.
  • Die Proteinproben wurden auf circa 50 bis 60 mg/ml konzentriert und extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min. wurde bis zu 95°C angewendet. DSC von der Phytase von A. fumigatus 13073 (untere Kurve) zeigte eine Schmelztemperatur von 62,5°C, während der Schmelzpunkt der alpha-Mutante bei 67,0°C festgestellt wurde.
  • 20:
  • Vergleich der Temperaturoptima der Wildtyp-Phytase von A. fumigatus 13073, ihrer alpha-Mutante und einer weiter stabilisierten alpha-Mutante (E59A-S154N-R329H-S364T-G404A). Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Phytase-Standardassay bei einer Reihe von Temperaturen zwischen 37 und 75°C durchgeführt. Der verdünnte Überstand von transformierten Stämmen von S. cerevisiae wurde für die Bestimmung verwendet. Die anderen Komponenten in dem Überstand wiesen keinen Einfluss auf die Bestimmung des Temperaturoptimums auf. O, Phytase von A. fumigatus ATCC 13073;
    Figure 00270001
    , alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073; ☐, alpha-Mutant-(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)-Q27T von A. fumigatus ATCC 13073;
    Figure 00270002
    , alpha-Mutante-(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)-Q51T-K92A von A. fumigatus ATCC 13073. Q51T und K92A entsprechen den Substitutionen Q50T bzw. K91A der Consensus-Phytase-1.
  • 21:
  • Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-12 (consphy12; SEQ ID NR: 36), welche eine Anzahl von Resten aus der aktiven Seite enthält, die von der „Basidio"-Consensussequenz auf die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A transferiert wurden (unterstrichen).
  • 22:
  • DNA- und Aminosäuresequenz von der Consensus-Phytase-3-thermo[11]-Q50T. Die Aminosäuren sind unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben.
  • 23:
  • DNA- und Aminosäuresequenz von der Consensus-Phytase-3-thermo[11]-Q50T-K91A. Die Aminosäuren sind unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben.
  • 24:
  • DNA- und Aminosäuresequenz von der Consensus-Phytase-10-thermo[5]-Q50T. Die Aminosäuren sind unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben.
  • 25:
  • DNA- und Aminosäuresequenz von der Consensus-Phytase-10-thermo[4]-Q50T-K91A. Die Aminosäuren sind unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben.
  • Die hierin erwähnten Phytase-herstellenden Stämme von Mikroorganismen d.h. Paxillus involutus CBS 100231; Peniophora lycii CBS 686.96; Agrocybe pediades CBS 900.96; und Trametes pubescens CBS 100232; wurden von natürlichen Proben isoliert, die jeweils von Dänemark; Dänemark; Dänemark; und Schweden (die Uppsala-Sammlung) stammten. Die Proben wurden im November 1992; Oktober 1993; Juni 1995; bzw. November 1995 gesammelt.
  • Beispiel 1
  • Consensus-Phytase-1
  • Die Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-1 (fungale Consensus-Phytase, fcp) wurde gestaltet und berechnet, wie in den Beispielen 1 und 2 von EP 897985 beschrieben. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Herkunft und das Vote Weight der Aminosäuresequenzen der Phytasen, die für die Gestaltung der Consensus-Phytase-1 verwendet wurden. Die Sequenz der Consensus-Phytase-1 wurde weiterhin in eine DNA-Sequenz umgewandelt, wie in Beispiel 3 von EP 897985 beschrieben, und das Gen der Consensus-Phytase-1 wurde konstruiert und kloniert, wie in Beispiel 4 von EP 897985 beschrieben.
  • Tabelle 1
  • Herkunft und Vote Weight der Aminosäuresequenz der Phytasen
  • phyA von Aspergillus terreus 9A-1, aa 27, Vote Weight 0,5 (Mitchell et al., 1997) phyA von Aspergillus terreus cbs116.46, aa 27, Vote Weight 0,5 ( EP 897985 ) phyA von Aspergillus niger var. awamori, aa 27, Vote Weight 0,33 [Piddington, C. S., Houston, C. S., Paloheimo, M., Cantrell, M., Miettinen-Oinonen, A., Nevalainen, H. & Rambosek, J. (1993) The cloning and sequencing of the genes encording Phytase (phy) and ph 2.5-optimum acid phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori. Gene 133, 55–62].
    • – phyA von Aspergillus niger T213 ( EP 897985 ), aa 27, Vote Weight 0,33
    • – phyA von Aspergillus niger, Stamm NRRL3135, aa 27, Vote Weight 0,33 (van Hartingsveldt et al., 1993)
    • – phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, aa 26, Vote Weight 0,2 (Pasamontes et al., 1997)
    • – phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 32722, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 58128, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 89 7985 )
    • – phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 26906, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 32239, aa 30, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Emericella nidulans, aa 25, Vote Weight 1,0 (Pasamontes et al., 1997a)
    • – phyA von Talaromyces thermophilus ATCC 20186, aa 24, Vote Weight 1,0 (Pasamontes et al., 1997a)
    • – phyA von Myceliophthora thermophila, aa 19, Vote Weight 1,9 (Mitchell et al., 1997)
  • Beispiel 2
  • Gestaltung einer verbesserten Aminosäuresequenz einer Consensus-Phytase (Consensus-Phytase-10)
  • Die Abgleiche, die für die Gestaltung der Consensus-Phytase-10 verwendet wurden, wurden unter Verwenden des Programms PILEUP aus dem GCG-Sequenzanalysepaket, Release 9.0 (Devereux et al., 1984), mit den Standardparameter (Gap Creation Penalty 12, Gap Extension Penalty 4) berechnet. Die Lokalisation der Gaps wurde unter Verwenden eines Texteditors verfeinert.
  • Die folgenden Sequenzen wurden für den Abgleich der Phytasen von Basidiomycete verwendet, beginnend mit der Aminosäure (aa), die in Tabelle 2 angegeben ist:
  • Tabelle 2
  • Herkunft und Vote Weight von fünf Phytasen von Basidiomycete, die für die Berechnung der entsprechenden Consensusaminosäuresequenz (Basidio) verwendet wurden
    • – phyA1 von Paxillus involutus CBS Nr. 100231, aa 21, Vote Weight 0,5 (WO 98/28409)
    • – phyA2 von Paxillus involutus CBS Nr. 100231, aa 21, Vote Weight 0,5 (WO 98/28409)
    • – phyA von Trametes pubescens CBS Nr. 100232, aa 24, Vote Weight 1,0 (WO 98/28409)
    • – phyA von Agrocybe pediades CBS Nr. 900.96, aa 19, Vote Weight 1,0 (WO 98/28409)
    • – phyA von Peniophora lycii CBS Nr. 686.96, aa 21, Vote Weight 1,0 (WO 98/28409)
  • Der Abgleich ist in 3 gezeigt.
  • In Tabelle 3 sind die Gene aufgelistet, die für den endgültigen Abgleich verwendet wurden. Die erste Aminosäure (aa) der Sequenz, die in dem Abgleich verwendet wurde, ist hinter der Bezeichnung des Organismus angegeben.
  • Tabelle 3
  • Herkunft und Vote Weight der Phytasesequenzen, die für die Gestaltung Consensus-Phytase 10 verwendet wurden
    • – phyA von Aspergillus terreus 9A-1, aa 27, Vote Weight 0,5 (Mitchell et al., 1997)
    • – phyA von Aspergillus terreus cbs116.46, aa 27, Vote Weight 0,5 ( EP 897985 )
    • – phyA von Aspergillus niger var awamori, aa 27, Vote Weight 0,5 (Piddington et al., 1993)
    • – phyA von Aspergillus niger, Stamm NRRL3135, aa 27, Vote Weight 0,5 (van Hartingsveldt et al., 1993)
    • – phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, aa 26, Vote Weight 0,2 (Pasamontes et al., 1997)
    • – phyA von Aspergilluns fumigatus ATCC 32722, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Aspergilluns fumigatus ATCC 58128, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Aspergilluns fumigatus ATCC 26906, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Aspergilluns fumigatus ATCC 32239, aa 30, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
    • – phyA von Emericella nidulans, aa 25, Vote Weight 1,0 (Pasamontes et al., 1997a)
    • – phyA von Talaromyces thermophilus ATCC 20186, aa 24, Vote Weight 1,0 (Pasamontes et al., 1997a)
    • – phyA von Myceliophthora thermophila, aa 19, Vote Weight 1,9 (Mitchell et al., 1997)
    • – phyA von Thermomyces lanuginosus, aa 36, Vote Weight 1,0 (Berka et al., 1998)
    • – Consensussequenz von fünf Phytasen von Basidiomycetes, Vote Weight 1,0 (Basidio, 3)
  • Der entsprechende Abgleich ist in 4 gezeigt.
  • Berechnung der Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-10
  • Um den Abgleich zu verbessern, addierten wir die originale Consensussequenz von fünf Phytasen von vier verschiedenen Basidiomyceten (Basidio genannt; welche noch die undefinierten Sequenzpositionen enthielten; siehe 3), nahezu alle Phytasesequenzen, die für die Berechnung der originalen Consensussequenzen der Phytasen verwendet wurden, und eine neue Phytasesequenz von dem Ascomyceten Thermomyces lanuginosus zu einem größeren Abgleich.
  • Wir stellten die Plurality („plurality") auf 2,0 und Treshold („treshold") auf 3 ein. Die verwendeten Vote Weights sind in Tabelle 3 aufgelistet. Der Abgleich und die entsprechende Consensussequenz sind in 4 dargestellt. Die neue Consensussequenz der Phytase weist 32 verschiedene Aminosäuren auf im Vergleich zu der originalen Consensus-Phytase-1. Positionen, für welche das Programm PRETTY nicht in der Lage war, einen Consensusaminosäurerest zu berechnen, wurden gemäß den in Beispiel 1 angegebenen Regeln aufgefüllt. Keiner der von dem Programm vorgeschlagenen Reste wurde ersetzt.
  • Weiterhin schlossen wir in einer anderen Berechnung alle Phytasen von Basidiomycete als einzelne Aminosäuresequenzen ein, legten jedoch ein Vote Weight von 0,2 für die Berechnung fest. Der entsprechende Abgleich ist in 6 gezeigt. Die berechnete Consensusaminosäuresequenz (Consensus-Phytase-11) weist die folgenden Unterschiede zu der Sequenz der Consensus-Phytase-10 auf. Buchstabe X bedeutet, dass das Programm nicht in der Lage war, eine Consensusaminosäure zu berechnen; die Aminosäure in Klammern entspricht der Aminosäure, die endgültig in die Consensus-Phytase-10 eingeschlossen wurde.
  • D35X (erster Buchstabe für die Consensus-Phytase-10, letzter Buchstabe für die Consensus-Phytase-11), X(K)69K, X(E)100E, A101R, Q134N, X(K)153N, X(H)190H, X(A)204S, X(E)220D, E222T, V227A, X(R)271R, H287A, X(D)288D, X(K)379K, X(I)389I, E390X, X(E)415E, X(A)416A, X(R)446L, E463A. Die Nummerierung ist die, wie in 5 angegeben.
  • Wir überprüften ebenfalls Ersetzungen von einzelnen Aminosäuren, die von den verbesserten Consensussequenzen 10 und 11 vorgeschlagen wurden, auf ihren Einfluss auf die Stabilität der originalen Consensus-Phytase-1 hin. Der Ansatz ist in Beispiel 3 beschrieben.
  • Umwandlung der Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-10 in eine DNA-Sequenz
  • Die ersten 26 Aminosäurereste der Phytase von A. terreus cbs116.46 wurden als Signalpeptid verwendet und mit dem N-Terminus der Consensus-Phytase-10 fusioniert. Die verwendete Vorgehensweise ist weiter in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die resultierende Sequenz des Gens fcp10 ist in 5 gezeigt.
  • Konstruktion und Klonieren des Gens der Consensus-Phytase-10 (fcp10)
  • Die berechnete DNA-Sequenz von fcp10 wurde in Oligonukleotide von 85 Bp aufgeteilt, wobei abwechselnd die Sequenz des Sense- und des Antisense-Strangs verwendet wurde. Jedes Oligonukleotid überlappt mit 20 Bp mit dem vorangehenden und dem folgenden Oligonukleotid des gegenüberliegenden Stranges. Die Lokalisation aller Primer, die von Microsynth, Balgach (Schweiz) bezogen wurden und in einer PAGE-aufgereinigten Form erhalten wurden, ist in 5 angezeigt.
  • PCR-Reaktionen
  • In drei PCR-Reaktionen wurden die synthetisierten Oligonukleotide zu dem vollständigen Gen zusammengesetzt. Für die PCR wurde das „High Fidelity" Kit von Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) und der Thermocycler „The ProtokolTM" von AMS Biotechnology (Europa) Ltd. (Lugano, Schweiz) verwendet. Die folgenden Oligonukleotide wurden in einer Konzentration von 0,2 pMol/ml verwendet.
    Mix 1.10: CP-1, CP-2, CP-3.10, CP-4.10, CP-5.10, CP-6, CP-7.10, CP-8.10, CP-9.10, CP-10.10
    Mix 2.10: CP-9.10, CP-11.10, CP-12.10, CP-13.10, CP-14.10, CP-15.10, CP-16.10, CP-17.10, CP-18.10, CP-19.10, CP-20.10, CP-21.10, CP-22.10
  • Die neu synthetisierten Oligonukleotide sind mit der Nummer 10 markiert. Die Consensus-Phytase-10 enthält die folgenden 32 Austausche, welche in 5 unterstrichen sind, im Vergleich zu der originalen Consensus-Phytase-1: Y54F, E58A, D69K, D70G, A94K, N134Q, I158V, S187A, Q188N, D197N, S204A, T214L, D220E, L234V, A238P, D246H, T251N, Y259N, E267D, E277Q, A283D, R291I, A320V, R329H, S364T, I366V, A379K, S396A, G404A, Q415E, A437G, A463E.
  • Vier kurze PCR-Primer wurden für den Zusammenbau der Oligonukleotide verwendet:
    Figure 00340001
    PCR-Reaktion a: 10 μl Mix 1.10 (2,0 pmol von jedem Oligonukleotid)
    2 μl Nukleotide (10 mM von jedem Nukleotid)
    2 μl Primer CP-a (10 pmol/ml)
    2 μl Primer CP-c.10 (10 pmol/ml)
    10,0 μl PCR-Puffer
    0,75 μl Polymerase-Mischung (2,6 U)
    73,25 μl H2O
    PCR-Reaktion b: 10 μl Mix 2.10 (2,0 pmol von jedem Oligonukleotid)
    2 μl Nukleotide (10 mM von jedem Nukleotid)
    2 μl Primer CP-b (10 pmol/ml)
    2 μl Primer CP-e (10 pmol/ml)
    10,0 μl PCR-Puffer
    0,75 μl Polymerase-Mischung (2,6 U)
    73,25 μl H2O
    Reaktionsbedingungen für die PCR-Reaktionen a und b:
    Schritt 1 2 Min. – 45°C
    Schritt 2 30 Sek. – 72°C
    Schritt 3 30 Sek. – 94°C
    Schritt 4 30 Sek. – 52°C
    Schritt 5 1 Min. – 72°C
  • Schritte 3 bis 5 wurden 40 mal wiederholt.
  • Die PCR-Produkte (670 und 905 Bp) wurden durch Agarosegelelektrophorese (0,9% Agarose) aufgereinigt, gefolgt von einer Gelextraktion (QIAEX II Gelextraktionskit, Quiagen, Hilden, Deutschland). Die aufgereinigten DNA-Fragmente wurden für die PCR-Reaktion c verwendet.
    PCR-Reaktion c: 6 μl PCR-Produkt aus Reaktion a (≈ 50 ng)
    6 μl PCR-Produkt aus Reaktion b (≈ 50 ng)
    2 μl Primer CP-a (10 pmol/ml)
    2 μl Primer CP-e (10 pmol/ml)
    10,0 μl PCR-Puffer
    0,75 μl Polymerase-Mischung (2,6 U)
    73,25 μl H2O
    Reaktionsbedingungen für die PCR-Reaktion c:
    Schritt 1 2 Min. – 94°C
    Schritt 2 30 Sek. – 94°C
    Schritt 3 30 Sek. – 55°C
    Schritt 4 1 Min. – 72°C
  • Schritte 2 bis 4 wurden 31 mal wiederholt.
  • Die resultierenden PCR-Produkte (1,4 kB) wurden wie oben angegeben aufgereinigt, mit EcoRI verdaut und in einen EcoRI-verdauten und dephosphorylisierien pBsk(–)-Vektor (Stratagene La Jolla, CA, USA) ligiert. 1 μl der Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen von E. coli XL-1 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) zu transformieren. Alle Standardvorgehensweisen wurden ausgeführt, wie von Sambrook et al. (1987) beschrieben. Die DNA-Sequenz des konstruierten Gens (fcp10) wurden durch Sequenzieren, wie im Stand der Technik bekannt, überprüft.
  • Beispiel 3
  • Erhöhen der Thermostabilität der Consensus-Phytase-1 durch das Einführen von einzelnen Mutationen, nahegelegt durch die Aminosäuresequenzen der Consensus-Phytase-10 und der Consensus-Phytase-11
  • Um die Thermostabilität von homologen Genen zu erhöhen, ist es ebenfalls möglich, den Stabilitätseffekt von jedem abweichenden Aminosäurerest zwischen dem interessierenden Protein und der berechneten Consensussequenz zu überprüfen und alle stabilisierenden Mutationen in dem interessierenden Protein zu kombinieren. Wir verwendet die Consensus-Phytase-1 als interessierendes Protein und überprüften den Effekt von 34 Aminosäureresten auf die Proteinstabilität, die in Bezug auf die Consensus-Phytase-10 und/oder –11 durch einzelne ortsgerichtete Mutagenese abwichen.
  • Um Mutanten für die Expression in A. niger, S. cerevisiae oder H. polymorpha zu konstruieren, wurde das entsprechende Expressionsplasmid, welches das Gen der Consensus-Phytase-1 enthielt, als Template für ortsgerichtete Mutagenese verwendet (siehe Beispiele 6 bis 8). Mutationen wurden unter Verwenden des „quick exchangeTM site-directed mutagenesis kit" von Stratagene (La Jolla, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers und unter Verwenden der entsprechenden Primer eingeführt. Alle vorgenommenen Mutationen und die entsprechenden Primer sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Plasmide, welche die gewünschte Mutation beherbergten, wurden durch DNA-Sequenzanalyse, wie im Stand der Technik bekannt, identifiziert.
  • Tabelle 4
  • Primer, die für die ortsspezifische Mutagenese der Consensus-Phytase-1 verwendet wurden
  • Ausgetauschte Basen sind in fett hervorgehoben. Die Einführung einer Restriktionsstelle ist oberhalb der Sequenz markiert. Wenn eine Restriktionsstelle in Klammern geschrieben ist, wurde die angegebene Stelle durch Einführen der Mutation zerstört. Mutation Primer-Set
    Figure 00390001
    Figure 00400001
    Figure 00410001
    Figure 00420001
    und entsprechend für andere Mutationen.
  • Das Temperaturoptimum der aufgereinigten Phytasen, die in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurden (Beispiel 7), wurde, wie in Beispiel 9 angezeigt, bestimmt. Tabelle 5 zeigt den Effekt von jeder eingeführten Mutation auf die Stabilität der Consensus-Phytase-1.
  • Tabelle 5
  • Stabilitätseffekt der Ersetzungen von einzelnen Aminosäuren in der Consensus-Phytase-1
  • + oder – bedeutet ein positiver bzw. ein negativer Effekt auf die Proteinstabilität bis zu 1°C, ++ und –– bedeutet ein positiver bzw. ein negativer Effekt auf die Proteinstabilität zwischen 1 und 3°C; die Zahlen 10 oder 11 in Klammern zeigen die Consensus-Phytase-Sequenz an, durch welche der Austausch der Aminosäure nahegelegt wurde.
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Wir kombinierten acht positive Mutationen (E58A, D197N, E267D, R291I, R329H, S364T, A379K, G404A) in der Consensus-Phytase-1 thermo[8] unter Verwenden der oben in diesem Beispiel angegebenen Primer und Technik. Weiterhin wurden die Mutationen Q50T und/oder K91A eingeführt, welche hauptsächlich die katalytischen Eigenschaften einer Phytase beeinflussen (siehe Patentanmeldungen EP 897010 und EP 897985 , ebenso wie Beispiel 9). Die DNA- und Aminosäuresequenz der resultierenden Phytase (Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A) sind in 7 gezeigt. Auf diesem Weg wurde das Temperaturoptimum und der Schmelzpunkt für die Consensus-Phytase um 7°C erhöht (15, 16 und 17).
  • In einem weiteren Consensusprotein kombinierten wir elf positive Mutationen (E58A, D69K, D197N, T214L, E222T, E267D, R291I, R329H, S364T, A379K, G404A) in der Consensus-Phytase-1 thermo[11]. Weiterhin wurden die Mutationen Q50T und/oder K91A eingeführt. Auf diesem Weg wurde die Schmelztemperatur um weitere 3 bis 4°C erhöht im Vergleich zu der Consensus-Phytase-1 thermo[8].
  • Unter Verwenden der Resultate aus Tabelle 5 verbesserten wir die Thermostabilität der Consensus-Phytase-10 weiterhin durch die Rückmutationen K94A, V158I und A396S, deren Umkehrung (reverse) (A94K, I158V und S396A) einen starken negativen Einfluss auf die Stabilität der Consensus-Phytase-1 ergaben. Das resultierende Protein wurde Consensus-Phytase-10- thermo[3] genannt. SEQ ID NR: 26 plus die drei Mutationen K94A, V158I und A396S. Weiterhin führten wir die Mutationen Q50T und K91A ein, die hauptsächlich die katalytischen Eigenschaften einer Consensus-Phytase beeinflussen (siehe Patentanmeldungen EP 897010 und EP 897985 , ebenso wie Beispiel 9 und 14 und 15). Die resultierende DNA- und Aminosäuresequenz ist in 8 gezeigt. Die optimierte Phytase zeigte ein 4°C höheres Temperaturoptimum und einen 4°C höheren Schmelzpunkt als die Consensus-Phytase-10 (12 und 13). Weiterhin weist die Phytase ebenfalls eine stark erhöhte spezifische Aktivität mit Phytat als Substrat von 250 U/mg bei pH 5,5 auf (14).
  • In einem noch weiteren Consensusprotein wurden zwei zusätzliche Mutationen in die Consensus-Phytase-10 thermo[3] eingeführt (E222T, G437A), was die Consensus-Phytase-10 thermo[5] ergab. Weiterhin wurden die Mutationen Q50T und/oder K91A eingeführt. Auf diesem Weg wurde die Schmelztemperatur um weitere 1 bis 2°C erhöht im Vergleich zu der Consensus-Phytase-10 thermo[3].
  • Beispiel
  • Stabilisierung der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 durch die Ersetzung von Aminosäureresten durch die entsprechenden Consensus-Phytase-1- und/oder Consensus-Phytase-10-Reste
  • An sechs Aminosäuresequenzpositionen, an denen die Phytase von A. fumigatus 13073 die einzige oder nahezu die einzige Phytase in dem Abgleich von 1 ist, die nicht den entsprechenden Consensus-Phytase-Aminosäurerest enthält, wurde der Nicht-Consensusaminosäurerest durch den Consensusaminosäurerest ersetzt. Die folgenden Aminosäuren wurden in der Phytase von A. fumigatus 13073 ersetzt, welche zusätzlich die Substitution Q51(24)T (welche die katalytischen Eigenschaften beeinflusst und der Substitution Q50T in den Consensus-Phytasen entspricht) und die Signalsequenz der Phytase von A. terreus cbs116.46 enthält (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 0897010 und 9): F55(28)Y, V100(73)I, F114(87)Y, A243(220)L, S265(242)P, N294(282)D. Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Nummerierung aus 1.
  • In einer zweiten Runde, wenn vier der sieben stabilisierenden Aminosäureaustausche (E58A, R329H, S364T, G404A), die in der Consensus-Phytase-10 identifiziert wurden und als Einzelmutationen in der Consensus-Phytase-1 überprüft wurden (Tabelle 5), wurden zusätzlich in die alpha-Mutante von A. fumigatus eingeführt. Weiterhin wurde die Aminosäureersetzuung S154N eingeführt, von dem gezeigt wurde, dass er die Empfindlichkeit der Phytase gegenüber Proteasen reduziert.
  • Die Mutationen wurden wie in Beispiel 3 (siehe Tabelle 6) eingeführt und, wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben, exprimiert. Die resultierenden Phytasevarianten von A. fumigatus 13073 wurden alpha-Mutante (d. h. die Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 mit dem Substitutionen Q24T, F28Y, V73I, F87Y, A220L, S242P, N282D) und „optimierte" alpha-Mutante (d. h. die alpha-Mutante von A. fumigatus, welche die zusätzlichen Substitutionen E59A-S154N-R329H-S364T-G404A aufweist) genannt. K92A ist eine weitere bevorzugte Mutation.
  • Das Temperaturoptimum (60°C, 20) und die Schmelztemperatur (67,0°C, 19) der alpha-Mutanten-Phytase von A. fumigatus 13073 wurde um 5 bis 7°C im Vergleich zu den Werten Wildtyp-Phytase (Temperaturoptimum 55°C, Tm: 60°C) erhöht. Die fünf zusätzlichen Ersetzungen von Aminosäuren erhöhten das Temperaturoptimum weiterhin um 3°C (20).
  • Tabelle 6 Mutageneseprimer für die Stabilisierung der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 Mutation Primer
    Figure 00470001
  • Beispiel 5
  • Einführung der Aminosäurereste der aktiven Seite der Phytase von A. niger NRRL 3135 in die Consensus-Phytase-1
  • Wir verwendeten die Kristallstruktur der Phytase von Aspergillus niger NRRL 3135, um alle Aminosäurereste der aktiven Seite zu definieren (siehe Beispiel 1 und EP 897010 ). Unter Verwenden des Abgleichs aus 1 ersetzten wir die folgenden Reste der aktiven Seite und zusätzlich die nicht identischen benachbarten Reste der Consensus-Phytase-1 durch solche der Phytase von A. niger:
    S89D, S92G, A94K, D164S, P201S, G203A., G205S, H212P, G224A, D226T, E255T, D256E, V258T, P265S, Q292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I, A397S, S398A, G404A und A405S.
  • Die neue Proteinsequenz Consensus-Phytase-7 wurde in eine DNA-Sequenz rücktranslatiert (10), wie in Beispiel 1 beschrieben. Das entsprechende Gen (fcp7) wurde erzeugt, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwenden der folgenden Oligonukleotidmischungen:
    Mix 1.7: CP-1, CP-2, CP-3, CP-4.7, CP-5.7, CP-6, CP-7, CP-8.7, CP-9, CP-10.7
    Mix 2.7: CP-9, CP-10.7, CP-11.7, CP-12.7, CP-13.7, CP-14.7, CP-15.7, CP-16, CP-17.7, CP-18.7, CP-19.7, CP-20, CP-21, CP-22.
  • Die DNA-Sequenzen der Oligonukleotide sind in 10 angezeigt. Die neu synthetisierten Oligonukleotide sind zusätzlich durch die Zahl 7 markiert. Nach dem Zusammenbauen der Oligonukleotide unter Verwenden der gleichen PCP-Primer, wie in Beispiel 1 angegeben, wurde das Gen in einem Expressionsvektor kloniert, wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben.
  • Das pH-Profil des Enzyms, das nach der Expression in H. polymorpha und der Aufreinigung bestimmt wurde, war ähnlich zu dem der Phytase von A. niger (siehe 18).
  • Beispiel 6
  • Expression der Consensus-Phytasegene in Hansenula polymorpha
  • Die Phytase-Expressionsvektoren, die verwendet wurden, um H. polymorpha RB11 zu transformieren [Gellissen, G., Hollenberg, C. P., Janowicz, Z. A. (1994) Gene expression in methylotrophic yeasts, in Smith, A. (Hrsg.) S. 395–439], wurden durch Einführen des Eco RI-Fragments von pBsk-fcp oder Varianten hiervon in die Mehrfachklonierungsstelle („multiple cloning site") des Expressionsvektors pFPMT121 von H. polymorpha, welcher auf einem ura3-Selektionsmarker von S. cerevisiae, einem Formatdehydrogenase (FMD)-Promotorelement und einem Methanoloxidase (MO)-Terminatorelement von H. polymorpha basiert, konstruiert. Das 5'-Ende des Gens fcp wird mit dem FMD-Promotor fusioniert, das 3'-Ende mit dem MOX-Terminator (Gellissen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46–54, 1996; EP 299108 ). Die resultierenden Expressionsvektoren werden mit pFPMTfcp, pFPMTfcp10 und pFPMTfcp7 bezeichnet.
  • Die konstruierten Plasmide wurden in E. coli vermehrt. Plasmid-DNA wurde unter Standardverfahren aus dem Stand der Technik aufgereinigt. Die Expressionsplasmide wurden in den H. polymorpha Stamm RB11 transformiert, der defizient in der Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase (ura3) ist, unter Verwenden der Vorgehensweise zur Herstellung von kompetenten Zellen und zur Transformation von Hefe, wie beschrieben in Gellissen et al. (1996). Jede Transformationsmischung wurde auf YNB-Medium (0,14% w/v Difco YNB und 0,5% Amoniumsulfat), enthaltend 2% Glucose und 1,8% Agar, ausplatiert und bei 37°C inkubiert. Nach 4 bis 5 Tagen wurden einzelne Transformantenkolonien gepickt und in dem oben beschriebenen Flüssigmedium für zwei Tage bei 37°C wachsen gelassen. Nachfolgend wurde ein Aliquot dieser Kultur verwendet, um frische Fläschchen mit YNB-Medium, die 2% Glucose enthielten, zu inokulieren. Nach sieben weiteren Passagen in Selektivmedium ist der Expressionsvektor in das Hefegenom in multimerer Form integriert worden. Nachfolgend wurden mitotisch stabile Transformanten erhalten, durch zwei zusätzliche Kultivierungsschritte in 3 ml nicht-selektivem flüssigem Medium (YPD, 2% Glucose, 10 g/l Hefeextrakt und 20 g/l Pepton). Um genetisch homogene rekombinante Stämme zu erhalten, wurde ein Aliqout der letzten Stabilisierungskultur auf Selektivplatten platiert. Einzelne Kolonien wurden isoliert für die Analyse der Expression der Phytase in YNB, welches 2% Glycerol anstelle von Glucose enthielt, um den FMD-Promotor zu derepressieren. Die Aufreinigung der Consensus-Phytasen erfolgte wie in Beispiel 7 beschrieben.
  • Beispiel 17
  • Expression der Consensus-Phytasegene in Saccharomyces cerevisiae und Aufreinigung der Phytasen aus dem Kulturüberstand
  • Die Consensus-Phytasegene wurden aus dem entsprechenden Bluescript-Plasmid (pBsk-fcp, pBSK-fcp10, pBsk-fcp7) isoliert und in die Eco RI-Stellen der Expressionskassette des Expressionsvektors pYES2 von Saccharomyces cerevisiae ligiert (Invitrogen, San Diego, CA, USA) oder zwischen den verkürzten GAPFL (Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase)-Promotor und den pho5-Terminator subkloniert, wie von Janes et al., Curr. Genet. 18, 97–103, beschrieben. Die korrekte Orientierung des Gens wurde anhand von PCR überprüft. Die Transformation von Stämmen von S. cerevisiae, z. B. INVSc1 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) erfolgte gemäß Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–1933 (1978). Einzelne Kolonien, welche das Phytasegen unter der Kontrolle des GAPFL-Promotors beherbergten, wurden gepickt und in 5 ml Selektionsmedium [SD-uracil; Sherman, J. P., Finck, G. R. & Hicks, J. B. (1986) Laboratory course manual for methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor University], bei 30°C unter kräftigem Schütteln (250 upm) für einen Tag kultiviert. Die Vorkultur wurde dann zu 500 ml YPD-Medium (Sherman et al., 1986) hinzugefügt und unter den gleichen Bedingungen wachsen gelassen. Die Induktion des gal1-Promotors erfolgte gemäß den Instruktionen des Herstellers. Nach vier Tagen Inkubation wurde die Zellbrühe zentrifugiert (7000 upm, GS3-Rotor, 15 Min., 5°C), um die Zellen zu entfernen, und der Überstand wurde mittels Ultrafiltration konzentriert in Amicon 8400 Zellen (PM30-Membranen; Grace AG, Wallizeller, Schweiz) und ultrafreien-15 Zentrifugations-Filtervorrichtungen („ultrafree-15 centrifugal filter devices") (Biomax-30K, Millipore, Bedford, MA, USA). Das Konzentrat (10 ml) wurde über eine 40 ml Sephadex G25 Superfine-Säule (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) entsalzt, mit 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, das als Elutionspuffer diente. Die entsalzte Probe wurde auf 2 M (NH4)2SO4 gebracht und direkt auf eine 1 ml Butyl Sepharose 4 hydrophobe Interaktions-Chromatographiesäule mit geringem Durchfluss („Butyl Sepharose 4 Fast Flow hydrophobic interaction chromatography colum) (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) geladen, welche mit einem linearen Gradienten von 2 M bis 0 M (NH4)2SO4 in 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, eluiert wurde. Die Phytase wurde in den Durchschlag („breakthrough") eluiert, konzentriert und auf eine 120 ml Sephacryl S-300 Gelpermeations-Chromatographiesäule (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) geladen. Die Consensus-Phytasen –1, –7 und –10 wurden als homogener symmetrischer Peak eluiert und wurden mittels SDS-PAGE als ungefähr 95% rein gezeigt.
  • Beispiel 8
  • Expression der Consensus-Phytasegene in Aspergillus niger
  • Die Bluescript-Plasmide pBsk-fcp, pBsk-fcp10, pBsk-fcp7 wurden als Template für die Einführung einer Bsp HI-Stelle stromaufwärts des Startcodons der Gene und einer Eco RV-Stelle stromabwärts des Stoppcodons verwendet. Das ExpandTM High Fidelity PCR-Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde mit den folgenden Primern verwendet:
  • Primer Asp-1:
    Figure 00510001
  • Primer Asp-2, verwendet zum Klonieren von fcp und fcp7:
    Figure 00510002
  • Primer Asp-3, verwendet zum Klonieren von fcp10
    Figure 00510003
  • Die Reaktion wurde, wie von dem Anbieter beschrieben, durchgeführt. Die PCR-amplifizierten fcp-Gene wiesen eine neue Bsp HI-Stelle an dem Startcodon auf, die von dem Primer Asp-1 eingeführt wurde, was in einer Ersetzung des zweiten Aminosäurerests Glycin durch Serin resultierte. Nachfolgend wurde das DNA-Fragment mit Bsp HI und Eco RV verdaut und in die NcoI-Stelle, stromabwärts von dem Glucoamylasepromotor von Aspergillus niger (glaA), und die Eco RV-Stelle, stromabwärts von dem Tryptophan C-Terminator von Aspergillus nidulans (trpC), ligiert (Mullaney et al., 1985). Nach diesem Klonierungsschritt wurden die Gene sequenziert, um mögliche, durch die PCR eingeführte, Fehler zu detektieren. Die resultierenden Expressionsplasmide, welche grundsätzlich dem pGLAC-Vektor, wie beschrieben in Beispiel 9 aus EP 684313 , entsprechen, enthielten das Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylasegen (pyr4) von Neurospora crassa als einen Selektionsmarker. Transformation von Aspergillus niger und die Expression der Consensus-Phytasegene erfolgte, wie in EP 684313 beschrieben. Die Consensus-Phytasen wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, aufgereinigt.
  • Beispiel 9
  • Bestimmung der Phytaseaktivität und des pH und der Temperaturoptima
  • Dieses Beispiel betrifft u. a. die Bestimmung der Phytaseaktivität und des Temperaturoptimums. Zahlreiche Phytasen sind überprüft worden.
  • Die Phytase von Aspergillus niger NRRL 3135 wurde, wie in EP 420358 und von van Hartingsveldt et al., (Gene 127, 87–94, 1993) beschrieben, hergestellt.
  • Die Phytasen von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, Aspergillus terreus 9A-1, Aspergillus terreus cbs116.46, Emericella nidulans, Myceliophthora thermophila und Talaromyces thermophilus wurden, wie in EP 0897985 und den Referenzen darin, hergestellt.
  • Die verbleibenden überprüften Phytasen wurden, wie hierin beschrieben, hergestellt.
  • Die Consensus-Phytase-1 thermo[8] bezeichnet eine Variante der Consensus-Phytase-1, welche weiterhin die acht Mutationen umfasst, welche in der Legende von 5 unterstrichen sind. Die Consensus-Phytase-1 ist in 1 (SEQ ID NR: 14) ohne Signalpeptid und in 2 (SEQ ID NR: 16) mit dem Signalpeptid gezeigt.
  • Die Phytaseaktivität wurde grundsätzlich, wie von Mitchell et al. (1997) beschrieben, bestimmt. Die Aktivität wurde in einer Assay-Mischung, die 0,5% Phytinsäure (≈ 5 mM) in 200 mM Natriumacetat, pH 5,0, enthielt, gemessen. Nach 15 Min. Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion gestoppt, indem ein gleiches Volumen an 15% Trichloressigsäure zugefügt wurde. Das freigesetzte anorganische Phosphat wurde quantifiziert, indem 100 μl der Assay-Mischung mit 900 μl H2O und 1 ml 0,6 M H2SO4, 2% Ascorbinsäure und 0,5% Ammoniummolybdat gemischt wurde. Standardlösungen von Kaliumphosphat wurden als Referenz verwendet. Eine Einheit Enzymaktivität wurde definiert als die Menge an Enzym, die 1 μmol Phosphat pro Minute bei 37°C freisetzt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwenden des Enzym-Extinktionskoeffizienten bei 280 nm bestimmt, berechnet gemäß Pace et al. [Pace N. C., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Prot. Sci. 4, 2411–2423]: 1 Absorptionseinheit (1 OD) bei 280 nm entspricht 1,101 mg/ml der Consensus-Phytase-1, 1,068 mg/ml der Consensus-Phytase-7 und 1,039 mg/ml der Consensus-Phytase-10.
  • Für die Kurven des pH-Optimums wurden die aufgereinigten Enzyme in 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, aufgereinigt. Die Inkubationen wurden durch Mischen von Aliquots des verdünnten Proteins mit einem gleichen Volumen an 1% Phytinsäure (≈ 10 mM) in einer Reihe von verschiedenen Puffern gestartet: 0,4 M Glycin/HCl, pH 2,5; 0,4 M Acetat/NaOH, pH 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5; 0,4 M Imidazol/HCl, pH 6,0, 6,5; 0,4 M Tris/HCl, pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. Kontrollexperimente zeigten, dass der pH lediglich leicht durch den Mischungsschritt beeinflusst wurde. Die Inkubationen wurden für 15 Min. bei 37°C durchgeführt, wie oben beschrieben.
  • Für die Bestimmung der Substratspezifitäten der Phytasen wurde Phytinsäure in der Assay-Mischung durch 5 mM Konzentrationen der jeweiligen Phosphatverbindungen ersetzt. Darüber hinaus wurden die Aktivitätstest, wie oben beschrieben, durchgeführt.
  • Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurden Enzym (100 μl) und Substratlösung (100 μl) prä-inkubiert, für 5 Min. bei der gegebenen Temperatur. Die Reaktion wurde durch die Zugabe der Substratlösung zu dem Enzym gestartet. Nach 15 Min. Inkubation wurde die Reaktion mit Trichloressigsäure gestoppt und die Menge an freigesetztem Phosphat wurde bestimmt.
  • Das pH-Optimum der Consensus-Phytase-1 lag um pH 6,0 bis 6,5 (70 U/mg). Die Einführung der Mutation Q50T verschob das pH-Optimum auf pH 6,0 (130 U/mg). Die Einführung der Mutation K91A verschob das pH-Optimum weiterhin in den saueren pH-Bereich. Vergleichbare Wirkungen der Mutationen Q50T und K91A wurden ebenfalls für die Consensus-Phytase-10 und für weiter stabilisierte Consensus-Phytasevarianten beobachtet (14 und 15).
  • Die Consensus-Phytase-7, welche konstruiert wurde, um die katalytischen Eigenschaften der Phytase von A. niger NRRL 3135 auf die Consensus-Phytase-1 zu übertragen, wies ein pH-Profil auf, das sehr ähnlich zu dem der Phytase von A. niger in NRRL 3135 war (siehe 18). Die Substratspezifität ähnelte ebenfalls mehr der von der Phytase von A. niger NRRL 3135 als der der Consensus-Phytase-1.
  • Das Temperaturoptimum der Consensus-Phytase-1 (71°C) war 16 bis 26°C höher als die Temperaturoptima der Wildtyp-Phytasen (45 bis 55°C, Tabelle 7), die verwendet wurden, um die Consensussequenz zu berechnen. Die verbesserte Consensus-Phytase-10 zeigte einen weiteren Anstieg ihres Temperaturoptimums auf 80°C (13).
  • Das Temperaturoptimum der Consensus-Phytase-1 thermo[8] wurde in dem gleichen Bereich gefunden (78°C), wenn der Überstand eines überproduzierenden Stamms von S. cerevisiae verwendet wurde. Das höchste Temperaturoptimum, das mit 82°C erreicht wurde, wurde für die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A bestimmt.
  • Tabelle 7
  • Temperaturoptima und Tm-Werte der Consensus-Phytase und der Phytasen von A. fumigatus A. niger, E. nidulans und M. thermophila
  • Die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde, wie in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt. Die Tm-Werte wurden durch Differentialrasterkalorimetrie bestimmt, wie in Beispiel 10 beschrieben.
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Beispiel 10
  • Bestimmung der Schmelztemperatur durch Differentialrasterkalorimetrie (DSC)
  • Um die Temperatur zu bestimmen, bei der Phytasen entfaltet sind („unfolding temperature of the phytases"), wurde die Differentialrasterkalorimetrie (DSC) angewendet, wie von Brugger et al., 1997 [Brugger, R., Mascarello, F., Augem, S., van Loon, A. P. G. M. & Wyss, M. (1997).
  • Thermal denaturation of phytases and pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry. In The Biochemistry of phytate and phytase (Hrsg. Rasmussen, S. K.; Raboy, V.; Dalbøge, H. and Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande]. Lösungen von 50 bis 60 mg/ml homogenen Phytasen wurde für die Tests verwendet. Eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min. wurde bis zu 90 bis 95°C angewendet.
  • Die bestimmten Schmelzpunkte bestätigen die Ergebnisse, die für die Temperaturoptima erhalten wurden (Tabelle 7). Die stabilste Consensus-Phytase, die bislang gestaltet wurde, ist die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, welche eine Schmelztemperatur unter den gewählten Bedingungen von 89,3°C zeigt. Dies ist 26,0 bis 33,6°C höher als die Schmelztemperatur der verwendeten Wildtyp-Phytasen.
  • Beispiel 11
  • Transfer der aktiven Seite der Phytase von Basidiomycete in die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A
  • Wie vorangehend beschrieben (Beispiel 5), wurden Mutationen, die von der aktiven Seite der Phytase von Basidiomycete abgeleitet sind, in die Consensus-Phytase-10 eingeführt. Die folgenden fünf Konstrukte a) bis e) wurden hergestellt:
    • a) Das Konstrukt, welches Consensus-Phytase-12 genannt wird und eine ausgewählte Anzahl an Resten der aktiven Seite der Basidio-Consensussequenz umfasst. Seine Aminosäuresequenz ist in 21 gezeigt (die ersten 26 Aminosäuren von dem Signalpeptid; Positionen, die sich von der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A unterscheiden, sind unterstrichen);
    • b) ein Cluster von Mutationen (Cluster II) wurde in die Consensus-Phytase-1- und -10-Sequenzen transferiert, d.h.: S80Q, Y86F, S90G, K91A, S92A, K93T, A94R, Y95I;
    • c) auf eine ähnliche Weise wurde ein anderes Cluster an Mutationen (Cluster III) transferiert, d.h.: T129V, E133A, Q134N, M136S, V137S, N138Q, S139A;
    • d) auf eine ähnliche Weise wurde ein weiteres Cluster an Mutationen (Cluster IV) transferiert, d.h.: A168D, E171T, K172N, F173W;
    • e) und schließlich wurde ein weiteres Cluster an Mutationen (Cluster V) transferiert, d.h.: Q297G, S298D, G300D, Y305T.
  • Diese Konstrukte wurden, wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben, exprimiert.
  • Beispiel 12:
  • Phytase-Abgleich unter Verwendung von GAP
  • Die hierin beschriebenen Phytasen – d. h. die Aminosäuresequenzen ebenso wie die entsprechenden DNA-Sequenzen – wurden gegeneinander abgeglichen. Ebenfalls wurden einige andere Phytasen entsprechend abgeglichen, d.h. die folgenden:
    • – die Consensus-Phytase-1, beschrieben in EP 897985 ;
    • – die Phytase, die von Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 (A. niger NRRL 3135) abgeleitet worden sind, beschrieben in EP 420358 ;
    • – die Phytasen, die von Aspergillus fumigatus ATCC 13073 (A. fumigatus 13073); Aspergillus fumigatus ATCC 32239 (A. fumigatus 32239); Aspergillus terreus cbs116.46 (A. terreus cbs); Emericella nidulans (E. nidulans); und Talaromyces thermophilus (T. thermophilus) abgeleitet worden sind – alle beschrieben in EP 897010 ;
    • – die Phytasen, die von Myceliophthora thermophila (M. thermophila); und Aspergillus terreus 9-A1 (A. terreus 9-A1) abgeleitet worden sind – beide beschrieben in 684313;
    • – die Phytase, die von Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) abgeleitet worden ist, beschrieben in WO 9735017 (PCT/US97/04559);
    • – die Phytasen, die von Agrocybe pediades (A. pediades), Paxillus involutus 1 und 2 (P. involutus phyA1 und phyA2); und Trametes pubescens (T. pubescens) abgeleitet worden sind – alle beschrieben in WO 98128409; and
    • – die Phytase, die von Peniophora lycii (P. lycii) abgeleitet worden ist, beschrieben in WO 98/28408.
  • Für diese Abgleich wurde das Programm GAP verwendet, mit den oben beschriebenen Einstellungen.
  • Für die Polypeptidvergleiche wurden die Signalpeptide eingeschlossen, mit Ausnahme der Vergleiche mit der Consensus-Phytase-11.
  • Die Ergebnisse der Aminosäuresequenzenvergleiche sind in der nachfolgenden Tabelle 8 aufgezeigt. Die erste Zahl in jeder Zelle (in jedem Kästchen) ist die Aminosäureähnlichkeit, die zweite Zahl ist die Aminosäureidentität.
  • Für DNA-Sequenzvergleiche wurde die Signalsequenz immer eingeschlossen. Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle 9 gezeigt.
  • Diese Erfindung offenbart beispielsweise die folgenden Ausführungsformen (A) bis (J), die nachfolgend beschrieben sind.
  • In diesen Ausführungsformen wird ihre Aminosäuresequenz, wenn % Identität oder % Ähnlichkeit an dem Aminosäurelevel für eine andere Phytase bestimmt wird, mit der Referenzsequenz abgeglichen (z. B. in der Ausführungsform (A) der Aminosäuresequenz der Consensus-Phytase-10) unter Verwenden eines Abgleichprogramms („aligment program"), wie GAP, auf das oben Bezug genommen wird. Der Prozentsatz an Identität, ebenso wie der Prozentsatz an Ähnlichkeit, wird von dem Programm berechnet. Die Aminosäuresequenz der anderen Phytase kann oder kann nicht das Signalpeptid einschließen.
  • Wenn % Identität an dem DNA-Level für eine andere Phytase-kodierende DNA bestimmt wird, wird diese DNA-Sequenz mit der Referenzsequenz abgeglichen [z. B. in der Ausführungsform (A), den Nukleotiden 12 bis 1412 aus SEQ ID NR: 25 (die DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt)] unter Verwenden eines Abgleichprogramms wie GAP, auf das oben Bezug genommen wird. Der Prozentsatz an Identität wird von dem Programm berechnet. Die DNA-Sequenz, welche die andere Phytase kodiert, kann eine genomische DNA-Sequenz sein, welche Introns einschließt, oder es kann eine cDNA-Sequenz sein. Sie kann oder kann nicht den Signalpeptid-kodierenden Teil einschließen.
  • Wenn eine Hybridisierung bestimmt wird, ist die zu verwendende Sonde die spezifizierte DNA-Sequenz [z. B. in der Ausführungsform (A), die Nukleotide 12 bis 1412 aus SEQ ID NR: 25 (die DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt)].
  • Die DNA-Sequenz, welche die andere Phytase kodiert, kann eine genomische DNA-Probe sein, welche eine Phytase-kodierende DNA-Sequenz enthält; eine aufgereinigte genomische DNA-Sequenz (aufgereinigt in Bezug auf die Phytase-kodierende DNA-Sequenz); oder sie kann eine Phytase-kodierende cDNA-Sequenz sein, bevorzugt aufgereinigt oder amplifiziert, z. B. PCR-amplifiziert. Die Phytase-kodierende DNA, von welchem Typ auch immer, kann oder kann nicht den Signalpeptid-kodierenden Teil einschließen. Auf geeignete Hybridisierungsbedingungen wird oben Bezug genommen.
  • Der Begriff „DNA-Sequenz" schließt solche Fragmente oder Teile der hierin beispielhaft aufgeführten DNA-Sequenzen ein, solange sie in der Lage sind, ein aktives Enzym (z. B. eine Phytase) zu kodieren.
  • Der Begriff „Aminosäuresequenz" schließt solche Fragmente oder Teile von hierin beispielhaft aufgeführten Aminosäuresequenzen ein, solange sie enzymatisch aktiv sind (z. B. Phytaseaktivität entfalten).
  • (A) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-10 (CP10, Fcp10)
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 93,80%; oder mindestens 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 95,09%; oder mindestens 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-10 ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens 95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt, hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Consensus-Phytase-1 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige von CP10, CP10-thermo[3]-Q50T, K91A, CP1-thermo[8], CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 93,80%; oder mindestens 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-10 (Fcp 10), wie in 5 gezeigt, ist.
  • (B) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 93,37%; oder mindestens 93,5 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 94,66%; oder mindestens 95,0 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert und welche (i) mindestens 95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Consensus-Phytase-1 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige von CP10, CP10-thermo[3]-Q50T-K91A, CP1-thermo[8] oder CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 93,37%; oder mindestens 93,5 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, ist.
  • (C) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-1-thermo[8]
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 98,30%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K sind hinzuzufügen) ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 98,51%; oder mindestens 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K sind hinzuzufügen) ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 98,73%; oder mindestens 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K sind hinzuzufügen) ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens 98,73%; oder mindestens 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K sind hinzuzufügen) hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Consensus-Phytase-1 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige von CP1-thermo[8], CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 98,30%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K sind hinzuzufügen) ist.
  • (D) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 97,87%; oder mindestens 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1- thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 98,08%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 98,37%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens 98,37%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt, hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Consensus- Phytase-1 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige von, CP1-thermo[8], CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 97,87%; oder mindestens 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt, ist.
  • (E) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-11
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 90,71%; oder mindestens 91, 91,5, 92, 92,5 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 482 der Consensus-Phytase-11, wie in 6 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 92,07%; oder mindestens 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 482 der Consensus-Phytase-11, wie in 6 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 90,71%; oder mindestens 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 482 der Consensus-Phytase-11, wie in 6 gezeigt, ist.
  • (F) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die alpha-Mutante von A. fumigatus
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 97,17%; oder mindestens 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der alpha-Mutante von A. fumigatus (Phytase), wie in 9 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 97,82%; oder mindestens 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der alpha-Mutante von A. fumigatus (Phytase), wie in 9 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 96,13%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 1 bis 1401 der DNA-Sequenz der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 (Phytase), wie in 9 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 97,17%; oder mindestens 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 (Phytase), wie in 9 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens 96,13%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzhedingungen mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 (Phytase), wie in 9 gezeigt, hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Phytase der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige der Phytase von der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 oder der optimierten alpha-Mutante kodiert.
  • (G) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die optimierte alpha-Mutante von A. fumigatus
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 96,08%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Phytase der optimierten alpha-Mutante von A. fumigatus ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 96,74%; oder mindestens 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Phytase der optimierten alpha-Mutante von A. fumigatus ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 95,63%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 1 bis 1401 der DNA-Sequenz, welche die Phytase der optimierten alpha-Mutante von A. fumigatus kodiert, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 96,08%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Phytase der optimierten alpha-Mutante von A. fumigatus ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens 95,63%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz, welche die Phytase der optimierten alpha-Mutante von A. fumigatus kodiert, ist.
  • Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige der Phytase von der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 oder der optimierten alpha-Mutante kodiert.
  • (H) Phytasen und entsprechende DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-7
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 94,87%; oder mindestens 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 95,30%; oder mindestens 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens 96,38%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt, ist.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens 96,38%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt, hybridisiert.
  • Eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 94,87%; oder mindestens 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt, ist.
  • (I) Phytasen in Bezug auf die Basidio-Consensus-Phytase
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 76,23%; oder mindestens 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der kombinierten Sequenz aus (i) den Aminosäuren 1 bis 441 der Basidio-Consensus-Phytase, wie in 3 gezeigt, und (ii) den Aminosäuren 1 bis 26, wie in 5 gezeigt, ist (die Sequenz von (ii) ist dem N-Terminus der Sequenz aus (i) hinzuzufügen).
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 79,50%; oder mindestens 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 441 der Basidio-Consensus-Phytase, wie in 3 gezeigt, ist.
  • (J) Phytasen in Bezug auf die Consensus-Phytase-12
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-12, wie in 21 gezeigt, ist.
  • Eine Phytase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-12, wie in 21 gezeigt, ist.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (15)

  1. Phytase, welche (i) eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 93,80% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren –26 bis +441 von SEQ ID NR: 26 ist und/oder (ii) durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die mindestens 95,88% identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 von SEQ ID NR: 25 ist; wobei zum Berechnen der Identität das Programm GAP verwendet wird, wie in dem GCG-Programmpaket, Release 9.1, bereitgestellt, und mit den folgenden Einstellungen für DNA-Sequenzvergleiche: GAP Creation Penalty 50 und GAP Extension Penalty 3 und den folgenden Einstellungen für Aminosäurewequenzvergleiche: Length Weight 0 und Gap Weight 3,0.
  2. Phytase nach Anspruch 1, wobei (i) die Aminosäuresequenz mindestens 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 oder mindestens 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren –26 bis +441 von SEQ ID NR: 26 ist und/oder (ii) die kodierende DNA-Sequenz mindestens 96, 96,5, 97, 97,5 98, 98,5, 99 oder mindestens 99,5% identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 von SEQ ID NR: 25 ist.
  3. Phytase, welche die Aminosäuren +1 bis +441 von SEQ ID NR: 26 umfasst; welche durch die Nukleotide 12 bis 1412 oder 90 bis 1412 von SEQ ID NR: 25 kodiert wird; oder welche die Variante Q24L, Q24T, Q24G, Q24L-Y25N oder Q24T-Y25N von der Phytase der Aminosäuren +1 bis +441 von SEQ ID NR: 26 ist.
  4. Phytase nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 2, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus (i) den Sequenzen –26 bis +441, +1 bis +441 oder +1 bis +438 von SEQ ID NR: 26; oder einer Aminosäuresequenz, die kodiert wird durch (ii) die Nukleotide 12 bis 1412 oder 90 bis 1412 von SEQ ID NR: 25.
  5. Phytase nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 2, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus (i) Variante K68A+V132I+A370S von SEQ ID NR: 26, (ii) Varianten Q24T, K65A oder Q24T+K65A aus (i), (iii) den Sequenzen +1 bis 441 von einer beliebigen der Sequenzen aus (i) und (ii), (iv) den Sequenzen –26 bis +441 oder +1 bis +441 von SEQ ID NR: 31; oder einer Aminosäuresequenz, die kodiert wird durch (v) die Nukleotide 1 bis 1401 oder 79 bis 1401 von SEQ ID NR: 30.
  6. Phytase nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 2, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus (i) Variante T24Q+A65K von SEQ ID NR: 29, (ii) Varianten Q24T, K65A oder Q24T+K65A aus (i), (iii) den Sequenzen +1 bis +441 von einer beliebigen der Sequenzen aus (i) und (ii) oder (iv) den Sequenzen –26 bis +441 oder +1 bis +441 von SEQ ID NR: 29; oder einer Aminosäuresequenz, die kodiert wird durch (v) die Nukleotide 1 bis 1401 oder 79 bis 1401 von SEQ ID NR: 28.
  7. Phytase, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 27 umfasst oder die Variante Q24L, Q24T, Q24G, Q24L-Y25N oder Q4T-Y25N hiervon ist.
  8. Phytase nach Anspruch 7, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 27 umfasst.
  9. DNA-Sequenz, welche umfasst (i) eine DNA-Sequenz, welche die Phytase nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8 kodiert, (ii) eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, welche mindestens 95,88 identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 von SEQ ID NR: 25 ist und/oder (iii) eine DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, wobei die Phytase eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 93,80% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren –26 bis +441 von SEQ ID NR: 26 ist; wobei zum Berechnen der Identität das Programm GAP verwendet wird, wie in dem GCG-Programmpaket, Release 9.1, bereitgestellt, und mit den folgenden Einstellungen für DNA-Sequenzvergleiche: GAP Creation Penalty 50 und GAP Extension Penalty 3 und den folgenden Einstellungen für Aminosäuresequenzvergleiche: Length Weight 0 und Gap Weight 3,0.
  10. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, wobei (ii) die Phytase-kodierende DNA-Sequenz mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 oder mindestens 99,5% identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 von SEQ ID NR: 25 ist und/oder (iii) die Phytase-kodierende DNA-Sequenz eine Phytase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 oder mindestens 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren –26 bis +441 von SEQ ID NR: 26 ist.
  11. DNA-Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 10, welche eine DNA-Sequenz umfasst, welche eine Phytase kodiert, und wobei die Phytase-kodierende DNA-Sequenz umfasst (i) Nukleotide 12 bis 1412 oder 90 bis 1412 von SEQ ID NR: 25; (ii) Nukleotide 1 bis 1401 oder 79 bis 1401 von SEQ ID NR: 30; oder (iii) Nukleotide 1 bis 1401 oder 79 bis 1401 von SEQ ID NR: 28.
  12. Vektor, welcher die DNA-Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 11 umfasst.
  13. Mikrobielle Wirtszelle, welche die DNA-Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 11 oder den Vektor nach Anspruch 12 umfasst.
  14. Verfahren zum Herstellen einer Phytase, welches Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 13 unter Bedingungen, welche die Herstellung der Phytase erlauben, und das Gewinnen der Phytase aus der Kulturbrühe umfasst.
  15. Nahrungsmittel, Futtermittel oder pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Phytase nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
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