CN1294266C - 在转基因植物中表达耐热植酸酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用耐热性好的植酸酶编码基因来构建转基因植物的方法，植物中表达的植酸酶可经受饲料制粒高温。在植物中表达的植酸酶可直接用于单胃动物和鱼类的饲料中。

Description

在转基因植物中表达耐热植酸酶

技术领域

本发明涉及一种利用转基因植物来产生一种耐热性的植酸酶，这种植酸酶可耐受饲料加工的制粒高温，用于单胃动物和鱼类的饲料中。

背景技术

植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1～5％(Lolas M.Et al.Food Sci.42：1094-1097，1977)。它占植物中总磷的60～80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47：862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the FeedIndustry，Lyons T.P.ed.Alltech Technical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率仅在0～40％。

植酸磷不能被单胃动物有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费。一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。第二、形成高磷粪便而污染环境。饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土壤受到严重污染。第三、植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17：201-204，1978)。

植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌(Paver，V.K.J.，Bacteriol.151：1102-1108，1982)，假单孢杆菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.23：1207-1220，1970)，乳酸杆菌(Shirai K.，Letters Appl.Biol.Sci.19：366-369，1994)，大肠杆菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303：107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.17：24-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.32：1275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US PatentNo.5436156，1995)。。

植酸酶的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Ware J.H.et al.，USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition101：1289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.47：1842-1848，1968)。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷***量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

随着饲料工业的发展，植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热点。重点的研究方向之一就是解决在天然微生物中植酸酶的表达量太低，不能大量获得廉价的植酸酶产品，难以满足饲料工业发展的需求。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的。

在利用微生物做为生物反应器来高效表达生产植酸酶已取得了较大的突破。1993年在A.niger ALK02268中表达了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表达量比原菌株提高了几倍(Piddington C.S.，Gene.133：55-59，1993；)。同年，将来源于A.ficumm NRRL3135的phyA基因导回原菌株，使phyA基因的拷贝数增加到15个以上，从而使植酸酶的表达量提高到7600U/mL(Van Hartingsveldt W.et al.，Gene，127：87-94，1993：)。Moore E.等在A.oryzae中表达来源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和来源于A.niger 762的phyB基因，其结果也是使表达量分别提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.etal.J Ind Microbiol，14：396-420，1995)。以上的这些表达研究，从总体上看，其表达水平还较低，但却证实了利用基因工程手段来提高植酸酶的表达、生产量这一途径的有效性。1995年Van Gorcomd等(VanGorcom R.F.M.et al.，1995)将酸性植酸酶基因phyA重组到黑曲霉中，使植酸酶在重组菌株中的表达量达到了2.8×105U/mL，与天然植酸酶产生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生产成本。这是目前国外报道的植酸酶最高表达水平，也是国外目前植酸酶工业生产所采用的菌株。1997年姚斌等构建的基因工程酵母在小试水平上其酸性植酸酶的表达量达到5×105U/mL(相当于每毫升发酵液中表达5mg植酸酶蛋白)(姚斌等，中国发明专利97121731.9，2000)，中试水平上将表达量提高到1×106U/mL发酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger 963中的植酸酶表达量高3000倍，比国外正在用于商品化生产酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent 5436156，1995)高一倍以上。

另一条更为简便而有效的利用植酸酶的方法是直接利用基因工程技术来培育富含植酸酶的饲料专用作物，使其本身就包含足量而有效的植酸酶，植酸酶在动物的胃中释放出来而降解饲料中的植酸磷，这样比利用微生物发酵来生产植酸酶作为添加剂将更为经济、有效。国外近年来开始进行了这方面的尝试，1993年Jan Pen等(Bio/Technol，1993，11：811～814)将来源于黑曲霉的植酸酶基因转移到植物烟草中，在烟草种子中检测到了植酸酶活性，其表达量可达到种子中可溶性蛋白的1％，饲喂试验表明其饲喂效果与在饲料中直接添加等量的植酸酶相当。1995年Theo C.Verwoerd等(Plant Physiol，1995，109：1199～1205)也做了类似的工作，由于是利用非组织特异性启动子组成型表达植酸酶，所以在转基因烟草整个植株中检测到了植酸酶，其中在叶子中植酸酶的表达量最高，达到可溶性蛋白的14.4％。1999年和2002年Ullah等(BiochemBiophys Res Commun.1999，264：201～206；2002，290：1343～1348)分别在烟草和三叶草中表达了真菌来源的植酸酶，并对表达的植酸酶进行了酶学性质研究，表明植酸酶有正常的生物学活性。还有一些类似的工作，如1998年Koegel等(US patent 5824779，1998)在绿色植物中表达植酸酶，可从中得到包含植酸酶的植物浆汁；Ooijen等(US patent6022846，2000)和Sandra等(US patent 6248938，2001)均在三叶草中成功地表达了植酸酶。研究结果表明，植酸酶在植物中表达，似乎并不影响植物的形态、生长、及种子的萌发。这些研究结果证实了植酸酶转基因植物的可行性。

但以上工作中使用的植酸酶均是热稳定性较差的植酸酶，而要培育出种子中富含植酸酶的等饲料作物，首先必须采用性能优良、耐热性好的植酸酶基因，因为植物种子在加工成饲料的过程中有一个高温制粒过程，温度一般在75～93℃，持续时间为数分钟，种子中的植酸酶必须要能经受住此温度。植酸酶作为一种酶制剂形式的饲料添加剂可通过变通的方法回避耐高温问题，如包被酶颗粒或在饲料制粒加工后再添加进去，而存在于植物种子中的植酸酶却无法回避饲料制粒高温的问题，这也是目前培育富含植酸酶的转基因饲料作物的根本问题所在。

我们在前期工作中发明了一种耐高温、可同时适用于单胃动物和淡水鱼类饲料的广谱植酸酶及其编码基因(中国发明专利，申请号01142162.2)，利用此基因构建转基因植物可使转基因植物中表达的植酸酶耐饲料制粒高温，从而有望在生产实践中实际应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种采用耐热性好的植酸酶基因来构建转基因植物的方法，植物中表达的植酸酶可经受饲料制粒高温。

本发明提供了一种使植酸酶基因在转基因植物中高效表达的具体方法。用基因重组技术，将来源于各种微生物(如黑曲霉、烟曲霉、酵母等真菌，大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌等细菌)、植物(玉米、大豆、水稻等)的植酸酶基因，尤其是耐热性好的植酸酶编码基因如phyA3(中国发明专利，申请号01142162.2)，构建到植物表达载体上，采用在植物中有高活性的组成型或时空特异性启动子驱动植酸酶基因，通过转化整合到植物染色体上，构建高效表达植酸酶的转基因植物。转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法等，植物可以是烟草及农作物玉米、大豆、水稻等。

转植酸酶基因的植物表达的植酸酶可直接用于单胃动物和鱼类的饲料中。

附图说明

图1为植物表达载体的构建；

图2转基因烟草的PCR检测

1.阳性对照(质粒pYB-2)；2～8.分别为7株转基因烟草；3.阴性对照(未转化的烟草)；

图3转基因烟草植株的PCR-Southern分析

1.阳性对照(质粒pYB-2)；2.阴性对照(未转化的烟草)；3～10.分别为7株经PCR验证为阳性的转基因烟草；

图4转基因烟草的Western分析

1.阳性对照(值酸酶纯品)；2.阴性对照(未转化的烟草)；3～6.分别为4株经PCR-Southern验证为阳性的转基因烟草。

具体实施方案

实施例1

1.菌株与载体  大肠杆菌菌株E.coli DH5a、质粒pUC18等购自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His-Mut+)、质粒pPIC9由加拿大Alberta大学D.Luo博士惠赠。

2.酶与试剂盒  限制性内切酶、连接酶、Taq酶、Mung bean酶为Boehringer公司产品。T7DNA sequence kit购于Pharmacia公司。In vitromutagenesis systems Kit、随机引物标记Kit和PCR Kit均购于Promega公司。

3.生化试剂  DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。

4.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；农杆菌培养基YEB(5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母提取物、5g/L蔗糖、0.5g/L MgSO4·7H2O，pH7.2～7.5)；烟草转化培养基MS(1L中含有：6.2mg硼酸，22.3mg硫酸锰，8.6mg硫酸锌，0.25mg钼酸纳，0.025mg硫酸铜，0.025mg氯化钴，100mg肌醇，1mg烟酸，1mg盐酸吡哆素，10mg盐酸硫胺素，1.65g硝酸胺，1.9g硝酸钾，0.37g硫酸镁，0.17g磷酸二氢钾，0.04g Fe-330，0.4g氯化钙，0.83mg碘化钾)。

实施例2

本实验说明重组植物表达载体的构建(图1)。

克隆在质粒pYB2中的耐热植酸酶编码基因phyA3是一已切除信号肽编码序列的植酸酶成熟蛋白编码基因(中国发明专利，申请号：01142162.2)，将pYB2质粒用SphI酶切，抹平，再用XbaI酶切，电泳回收1.35kb片段，同时将植物载体pBI525用BamHI酶切，补平，再用XbaI酶切，回收产物与植酸酶片段相连，转化大肠杆菌，获得重组质粒pBI525phy。重组质粒经XbaI酶切鉴定大小约为5.2kb，再用植酸酶基因内部495bp处的BamHI酶切，结果得到0.9kb和4.3kb左右两条带，认为克隆正确。进一步将pBI525phy用EcoRI和HindIII双酶切，回收大小为2.25kb的片段，即为含有双35S启动子和Ω序列、植酸酶基因以及NOS终止子的表达盒，将此表达盒与同样双酶切的pBINPLUS质粒连接，转化大肠杆菌，得到重组双源载体pBINPLUSphy，重组双源载体经EcoRI和HindIII双酶切鉴定证实植酸酶基因表达盒被正确构建到双元载体pBINPLUS上。

实施例3

本实验说明烟草的遗传转化。

1)农杆菌活化：将含有pBINPLUSphy的农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml YEB(含Kan50mg/l)中，28℃培养过夜，取2ml菌液接种于50ml YEB(含Kan50mg/l)中，培养至OD值约为0.8，离心收集菌体，用等体积MS液体培养基重悬后，即成为侵染液。

2)叶盘法转化：将烟草栽培品种NC89种子，用自来水冲洗干净，置于70％乙醇1分钟，2％次氯酸钠中浸泡20分钟后，用大量无菌水冲洗干净，置于MS培养基上萌发，1个月后，生长至3cm高，叶片即可用于实验。将烟草无菌苗叶片切成0.5cm2大小的方块(叶盘)，在农杆菌侵染液中侵染5分钟，用镊子将叶盘夹到无菌滤纸上，吸去残留的菌液，然后置于铺有无菌滤纸的MS平板(含2mg/ml 6-BA，0.1mg/ml IAA)上，28℃黑暗下培养3天。同时将未经农杆菌侵染的叶盘放入同样的MS平板上作为阴性对照。3天后将转化处理的叶盘浸于MS液体培养基中3-5分钟后，放无菌滤纸上吸去残留液，转到MS平板(含2mg/ml 6-BA，0.1mg/ml IAA，500mg/ml CB，200mg/ml Kan)上，同时将对照叶盘也进行同样的处理，于光照培养箱中培养，条件为24℃光照16小时，两星期换一次培养基，直至分化出芽。

3)转化后根的再生：转化约6周后，将分化的抗性芽切下，转入生根培养基(MS+500mg/ml CB+100mg/ml Kan)上，10天后可见生根。

采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，用含有植酸酶基因的LBA4404工程菌株侵染烟草叶盘。经过7天左右，筛选培养基上经过农杆菌侵染的烟草叶盘伤口周围长出许多小的愈伤点，随着时间的推移，产生的芽点逐渐分化形成绿色的小芽。而未经农杆菌侵染过的烟草叶盘周围则未见任何愈伤的分化以及芽的形成，而是逐渐变黄、死亡。待绿色小芽长至约1cm高时，将其转移到含有卡那霉素的生根培养基上，7-15天可见根的产生，而超过15天未见生根的小芽则视为假阳性，弃之。经过先后几次转化，共获得卡那霉素抗性烟草植株250株，用于进一步的检测。

实施例4

本实验说明转基因烟草中植酸酶基因PCR产物的Southern分析方法。

为了证实在转基因烟草中植酸酶基因已整合到了烟草基因组中，我们通过PCR和Southen blotting的方法进行确证。

取0.1g左右的烟草叶片，用CTAB法提取其基因组DNA。用植酸酶基因两端序列作引物(P3：5’GCGAATTCATGTCCAAGTCCTGC 3’和P2：5’TCGAATTCTCAACTAAAGCACTC 3’)，以未转化烟草做阴性对照，以质粒pGEMTphy作阳性对照，PCR扩增植酸酶基因全长。结果在检测的144株植株中，有92株呈PCR阳性，扩增出1.35Kb的DNA片段，与植酸酶基因大小相符，而未转化植株没有此条带。图2示部分再生植株的PCR扩增结果。将92株PCR阳性植株分别命名为植株P1-P92。

为确证PCR扩增出的DNA条带为植酸酶基因，将其转到尼龙膜上，与32P标记的植酸酶基因进行了Southern杂交。结果可见明显清晰的杂交带。图3示部分转化植株的PCR-Southern杂交结果。

这些结果证实植酸酶基因已正确整合到转基因烟草的染色体上。

实施例5

本实验说明在转基因烟草中表达的植酸酶的Western检测方法。

为验证转化植株中植酸酶是否得到了表达，对其进行了Western-blot检测。称取基本在同一生长周期的PCR阳性植株与未转化植株叶片各100mg，分别加入500μl冰预冷的样品抽提缓冲液研磨，离心收集上清，即为叶片中的可溶性蛋白液。

为获得清晰的条带，保证较低的背景，做了多次预实验，最终决定将一抗稀释5000倍使用，转化植株叶片的蛋白液样品取5μl用于上样。同时以未转化烟草叶片蛋白为阴性对照，以纯化的植酸酶纯品为阳性对照，以中等大小蛋白为分子量标准。电泳、转膜、与抗体进行免疫反应以及ECL显色。

结果表明，部分转基因烟草在55kD左右处可见一明显、清晰的条带，大小与纯品植酸酶基本一致(图4)，而对于未转化植株则未见任何条带出现，由此表明在部分转化烟草中，植酸酶基因得到了表达。

总共对70株PCR阳性植株进行了Western检测，结果有41株可见特异性阳性条带，也就是在转化阳性植株中植酸酶的表达率约为58.6％。Western-blot检测呈阳性的41株转化植株为：P1，P2，P5，P6，P8，P11，P12，P13，P14，P15，P16，P20，P21，P23，P26，P28，P29，P30，P31，P33，P34，P36，P38，P40，P43，P45，P48，P49，P50，P51，P52，P54，P56，P57，P60，P61，P63，P64，P65，P68，P70。

实施例6

本实验说明转基因烟草中表达的植酸酶的ELISA分析。

将Western-blot阳性烟草植株蛋白提取液进行了ELISA检测。取50μl提取液，用TBS溶液稀释到100μl后加入96孔酶标板。每个样品设置了3个重复，用未转基因烟草做阴性对照，利用亲和纯化后的植酸酶抗体进行ELISA检测，通过酶标仪读取OD450值，同时作出植酸酶纯品的ELISA标准曲线用于定量。

在所检测植株中，P11和P34的OD450值较高，通过标准曲线计算出其表达量为每100mg新鲜叶片中分别有植酸酶3.75μg和3.20μg，分别占叶片总可溶性蛋白的0.38％和0.32％。

实施例7

本实验说明转基因烟草中表达的植酸酶的酶活性测定。

对通过ELISA检测植酸酶表达量相对较高的植株，用叶片蛋白提取液进行了酶活分析。以未转化植株为阴性对照。

酶活性测定方法为：0.2mL的酶稀释液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸钠，37℃保温30min，加入1mL 10％TCA终止酶活反应，然后加入2mL硫酸亚铁-钼酸铵显色液，700nm测定无机磷含量。对照为先在0.2mL的酶稀释液中加入1mL 10％TCA使酶灭活，再加入同体积的底物保温。一个酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1nmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。

测定结果(表1)表明，P11植株中的植酸酶活性为385U/100g鲜叶片，P34植株为330U/100g鲜叶片。

表1.转基因烟草中的植酸酶活性

植株号	未转化烟草	P2	P8	P11	P20	P23	P34	P38	P40	P43	P56	P63	P67
														酶活性(U/100g鲜叶片)	0	221	285	385	318	307	330	276	306	256	209	289	301

Claims (5)

1、耐热植酸酶编码基因phyA3的高效植物表达载体pBINPLUSphy。

2、权利要求1所述的表达载体pBINPLUSphy的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)将耐热植酸酶编码基因phyA3***植物载体pBI525中，得到重组质粒pBI525phy；

2)酶切上述重组质粒pBI525phy，得到包含双35S启动子、Q序列、phyA3基因、以及NOS终止子的表达盒；

3)将上述表达盒与质粒pBINPLUS连接，得到重组双源载体pBINPLUSphy。

3、一种在转基因植物中表达耐热植酸酶编码基因phyA3的方法，其特征在于，将权利要求1所述的表达载体pBINPLUSphy通过转化整合到植物染色体上，构建高效表达植酸酶的转基因植物。

4、权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的植物包括烟草、玉米、大豆、水稻。

5、权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法。

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