DD300886A5 - Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase - Google Patents

Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase Download PDF

Info

Publication number
DD300886A5
DD300886A5 DD344227A DD34422790A DD300886A5 DD 300886 A5 DD300886 A5 DD 300886A5 DD 344227 A DD344227 A DD 344227A DD 34422790 A DD34422790 A DD 34422790A DD 300886 A5 DD300886 A5 DD 300886A5
Authority
DD
German Democratic Republic
Prior art keywords
phytase
protein
sequence
peptide
expression
Prior art date
Application number
DD344227A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Gist Brocades Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37728159&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DD300886(A5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority to SK4663-90A priority Critical patent/SK466390A3/sk
Priority to CZ19904663A priority patent/CZ289014B6/cs
Application filed by Gist Brocades Nv filed Critical Gist Brocades Nv
Priority to DD344227A priority patent/DD300886A5/de
Priority to IL9580390A priority patent/IL95803A/en
Priority to DK90202565T priority patent/DK0420358T3/da
Priority to KR1019910700528A priority patent/KR0159782B1/ko
Priority to PT95447A priority patent/PT95447B/pt
Priority to AU65011/90A priority patent/AU636673B2/en
Priority to CA002042054A priority patent/CA2042054C/en
Priority to CA002341081A priority patent/CA2341081C/en
Priority to EP96202943A priority patent/EP0779037A1/de
Priority to SU4895487A priority patent/RU2113468C1/ru
Priority to PCT/NL1990/000140 priority patent/WO1991005053A1/en
Priority to NZ235478A priority patent/NZ235478A/xx
Priority to CN90108977A priority patent/CN1053013C/zh
Priority to JP02513672A priority patent/JP3105920B2/ja
Priority to AT90202565T priority patent/ATE180014T1/de
Priority to DE69033103T priority patent/DE69033103T2/de
Priority to HU907465A priority patent/HU215179B/hu
Priority to EP90202565A priority patent/EP0420358B1/de
Priority to DE0420358T priority patent/DE420358T1/de
Priority to ES90202565T priority patent/ES2072834T3/es
Priority to NO912011A priority patent/NO303988B1/no
Priority to FI912530A priority patent/FI104380B/fi
Priority to BG94500A priority patent/BG60108B2/bg
Publication of DD300886A5 publication Critical patent/DD300886A5/de
Priority to LVP-93-1302A priority patent/LV10310B/en
Priority to GR990401907T priority patent/GR3030819T3/el
Priority to FI992420A priority patent/FI108299B/fi
Priority to US11/036,272 priority patent/US20060063243A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

Eine für Phytase codierende Nucleotidsequenz wurde isoliert und cloniert. Die codierende Sequenz wurde in ein Expressionskonstrukt inseriert, das wiederum in einen Vektor inseriert wurde, der in der Lage ist, einen mikrobiellen Expressionswirt zu transformieren. Die transformierten mikrobiellen Wirte können zur ökonomischen Produktion von Phytase im großtechnischen Umfange verwendet werden. Die erfindungsgemäß produzierte Phytase kann in einer Vielzahl von Prozessen eingesetzt werden, die die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat erfordern.

Description

Hierzu 32 Seiten Zeichnungen
Clonlerung und Expression von mikrobieller Phytase
Die Erfindung betrifft die mikrobialle Erzeugung von Phytase.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Phosphor ist ein wesentliches Element für das Wachstum aller Organismen. Bei der Tierproduktion muß das Futter mit anorganischem Phosphor ergänzt werden, um bei monogastrischen Tieren (zum Beispiel Schweinen, Geflügel und Fischen) gute Wachstumsleistungen zu erzielen.
Im Gegensatz dazu ist es nicht erforderlich, anorganische Phosphate zu don Futtermitteln von Wiederkäuern zuzusetzen.
Mikroorganismen, die in dem Pansen vorhanden sind, erzeugen Enzyme, die die Umwandlung von Phytat (Myo-Inositolhexakisphophat) zu Inositol und anorganischen Phosphat katalysieren.
Phytat tritt als eine Speicherphosphorquelle in praktisch allen Futtermittelstoffen auf, die von Pflanzen herrühren (für einen Überblick siehe Phytic add, chemistry and applications (Phytinsäure, Chemie und Anwendungen], D. Graf [Hrsg.], Pilatus Press, Minneapolis, MN, USA [1986]).
Phytat ist in 1 bis 3% aller Nüsse, Getreidearten, Hülsenfrüchte, Ölsamen, Sporen und Pollen enthalten. Komplexe Salze der Phytinsäure werden als Phytin bezeichnet. Phytinsäure wird als ein der Ernährung abträglicher Faktor angesehen, da sie solche Mineralien wie Calcium, Zink, Magnesium, Eisen chelatlsiert und auch mit Proteinen reagieren kann, wodurch die biologische Verfügbarkeit von Protein und ernährungswissenschaftlich wichtigen Mineralien vermindert wird.
Phytatphosphor passiert den gastrointestinalen Trakt von monogastrischen Tieren und wird im Dung ausgeschieden. Obgleich eine gewisse Hydrolyse von Phytat im Dickdarm auftritt, hat der so freigesetzte anorganische Phosphor keinen Ernährungswert, da anorganischer Phosphor nur im Dünndarm absorbiert wird. Infolgedessen wird eine signifikante Menge des ernährungswissenschiiftlich wichtigen Phosphors trotz Anwesenheit in monogastrischen Tieren nicht verwertet. Die Ausscheidung von Phyiatphosphor in den Dickdarm hat weitere Konsequenzen. Die intensive Tierproduktion hat während der vergangenen Jahrzohnte sehr stark zugenommen und verursacht in verschiedenen Teilen der Welt Umweltprobleme. Dieses beruht teilweise auf der Tatsache, daß die Akkumulierung von aus dem Dung herrührenden Phosphat Eutrophierung des Oberflächenwassers verursacht.
Die durch Mikroorganismen produzierten Enzyme, die die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganischen Phosphor katalysieren, sind allgemein als Phytasen bekannt.
Phytase erzeugende Mikroorganismen umfassen Bakterien wie Bacillus subtliis (V.K. Paver und V. J. Jagannathan [1982] J.
Bacteriol. 151,1102-1108) und Pseudonomas (D. J.Cosgrove (1970) Austral. J. Biol. Sei. 23,1207-1220); Hefen wie Saccharomyces cerevisla (N. R. Nayini und P. Markakis [1984] Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17,24-26) und Pilze wie Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda und S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 32,1275-1282). Verschiedene andere Aspergillus-Spezies sind dafür bekannt, daß sie Phytase erzeugen, von denen die von Aspergillus ficuum erzeugte Phytase nachweislich einen der höchsten spezifischen Aktivitätsgrade wie auch eine bessere Wärmebeständigkeit als durch andere Mikroorganismen erzeugte Phytasen aufweist (unveröffentlichte Beobachtungen).
Das Konzept, mikrobielle Phytase zu den Futtermitteln von monogastrischen Tieren zuzugeben, ist bereits beschrieben worden (Ware, J. H., Bluff, L., und Shieh, T. R., [1967] US-Patent Nr. 3.297.548; Nelson, T. S., Shie, T. R., Wodzinski, R. H., und Ware, J. H., [1971 ] J. Nutrition 101,1289-1294). Bis heute ist jedoch dieses Anwendungskonzept aufgr.md der hohen Kosten für die Erzeugung der mikrowellen Enzyme (Y.W. Han [1989] Animal Feed Sei. & Technol. 24,345-350) kommerziell nicht durchführbar.
Aus wirtschaftlichen Gründen werden Futtermittel für monogastrische Tiere weiterhin mit anorganischem Phosphor angereichert.
Für mikrobielle Phytasen gibt es in der Industrie auch andere Einsatzgebiete. Beispielhaft für ein derartiges Einsatzgebiet ist ein großtechnisches Verfahren für die Erzeugung von Stärke aus Getreide wie Mais und Weizen. Abfallprodukte umfassen zum Beispiel Maisglutenfuttermittel aus einem Naßmahlverfahren, die als Tierfuttermittel verkauft werden. Während des Einweichprozesses kann Phytase zugesetzt werden. Bedingungen wie eine Temperatur von etwa 50°C und ein pH-Wert von 5,5 sind für pilzartigo Phytasen ideal (siehe zum Beispiel die Europäische Patentanmeldung 0321004 an Aiko Ltd.) Tierfuttermittel, die aus den Abfallprodukten dieses Verfahrens herrühren, werden anstelle von Phytat Phosphat enthalten.
Es hat sich ebenfalls herausgestellt, daß Phytasen bei der Sojabohnenverarbeitung verwendet werden können (siehe Flnase™Enzymes By Aiko, eine Produktinformationsbroschüre, die von Aiko Ltd., Rajamäki, Finnland veröffentlicht wurde).
Sojabohnenmehl enthält große Mengen des ernährungsmäßig ungünstig wirkenden Phytats, das diese Proteinquelle für die Anwendung in Babynahrung und Futtermitteln für Fische, Kälber und andere Nichtwiederkäuer als ungeeignet erscheinen läßt.
Die enzymatische Qualitätsverbesserung der wertvollen Proteinquelle steigert den Ernährungs- und Handelswert dieses Stoffes.
Andere Forscher interessierten sich mehr für eine bessere Charakterisierung der verschiedenen Phytasen und für verbesserte Verfahren für die Produktion und die Verwendung dieser Phytasen. Ullah veröffentlichte ein Verfahren zur Reinigung von Phytase aus dein Wildtyp Aspergillus ficuum, außerdem ermittelte er mehrere biochemische Parameter des durch dieses Reinigungsverfahren gewonnenen Produktes (Ullah, A., [1988a] Preparative Biochem. 18,443-458). Von Ullah gewonnene relevante Daten werden in Tabelle 1, siehe unten, dargestellt.
Die Aminosäuresequenz des N-Terminus von A.flcuum-Phytaseprotein wurde von Ullah zweimal offenbart: Ullah, A. (1987) Enzyme and Engineering Conference IX (Enzym und -technik-Konferenz), 4.-8.Oktober, 1987, Santa Barbara, Kalifornien (Posterrepräsentation); und Ullah, A., (1988b) Prep. Biochem. 18., 459-471. Die vcr. Ullah erhaltenen Aminosäuresequenzdaten werden in Figur 1A, Sequenz E, unten, wiedergegeben.
Mehrere interessante Beobachtungen können bei diesen Offenlegungen von Ullah angestellt werden. Vor allen Dingen besteht das bei Ullah (1988a und 1988 b) beschriebene „gereinigte" Präparat aus zwei Proteinbanden auf SDS-PAGE. Wir stellten jedoch fest, daß die von A.ficuum gereinigte Phytase einen Kontaminanten enthält und daß eine der auf SDS-PAGE gefundenen Banden, die von Ullah als Phytase identifiziert wurde, von diesem Kontaminanten stammt.
Dieser Unterschied ist ebenfalls aus den Aminosäuresequenzierwerten, die von Ullah veröffentlicht wurden (1987,1988b) offensichtlich (vergleiche Figur 1A, Sequenzen A und B mit Sequenz C).
Wir haben tatsächlich ermittelt, daß eine der von Ullah beschriebenen Aminosäuresequenzen von inneren Phytase-Peptiden (siehe Figur 1B, Sequenz E) tatsächlich zu dem kontan inierenden lOOKDa-Protein gehört (Figur 1 C), das über das von Ullah beschriebene Verfahren gewonnen wurde und als eine der beiden Banden auf SDS-PAGE angesehen wird (Ullah, 1988 a und 1988b). Ullah hat die Anwesenheit eines derartigen kontaminierenden Proteins nicht erkannt und identifizierte es statt dessen als eine weitere Form der Phytase.
Die Anwesenheit einer solchen Kontamination erhöhte wiederum die Schwierigkeit beim Selektieren und Isolieren der tatsächlich für Phytaseaktivität codierenden Nuclotidsequenz. Darüber hinaus senkt die Anwesenheit von Kontamination den spezifischen Aktivitätswert des geprüften Proteins. Bei weiterem Betrachten der von Uliah veröffentlichten Sequenz sollte festgehalten werden, daß der Aminosäurerest bei Position 12 von Ullah als Glycin offenbart wurde. Unter Verwendung von Protein- und DNA-Sequenzierungstechniken fanden wir durchweg, daß dieser Rest nicht ein Glycin ist, sondern in Wirklichkeit ein Cystein (siehe Figur 6 und 8).
Schließlich r ifenbart Ullah, daß Phytase nach Deglycosylierung ein 85kDa-Protein mit einer relativen Molekülmasse von 61,7kDa Ullah, 1988b) ist. Diese Zahl, die viel niedriger ist als die des früher geschilderten 76kDa-Proteins (Ullah, A. und Gibson,
D. [1988) Prep. Biochem. 17(1], 63-91), basiert auf der relativen Menge der durch die Hydrolyse freigesetzten Kohlenhydrate, und die scheinbare relative Molekülmasse des nativen Proteins auf SDS-PAGE. Wir stellten jedoch fest, daß die glycosylierte Phytase
eine einzige scheinbare relative Molekülmasse von 85 kDa hat, während das doglycolysierte Protein eine scheinbare relative Molekülmasse im Bereich von 48 bis 56,5kDa hat, was vom Grad der Deglycolysierung abhängt.
Mullaney et al. (Filamentous Fungi Conference [Fadenpilz-Konferenz], April, Pacific Gi ove, Kalifornien [Posterrepräsentation]) offenbart ebenfalls die Charakterisierung von Phytase von A. ficuum. Dieser Bericht enthält jedoch auch die Angabe über zwei Proteinbanden auf SDS-PAGE, eine davon auf 85 kDa und die andere auf 10OkDa, die beim „gereinigten" Proteinpräparat anwesend waren. Diese Proteinbanden werden von den Autoren beide als Formen von Phytase identifiziert. Es wird eine Methode für die Transformation von mikrowellen Wirten angekündigt, über die jedoch nichts berichtet wurde. Das Cionieren und Isolieren der für Phytase codierenden DNA Sequenz wurde nicht beschrieben.
Es wird davon ausgegangen, daß ein wirtschaftliches Verfahren für die Phytaseproduktion von signifikantem Vorteil unter anderem für die Tierfutterindustrie ist. Ein Verfahren für die Erzeugung einer wirtschaftlicheren Phytase würde darin bestehen, rekombinante DNA-Techniken zu verwenden, um die Expressionsniveaus der Enzyme in verschiedenen Mikroorganismen, die dafür bekannt sind, daß sie hohe Anteile von exprimierten Peptiden oder Proteinen produzieren, zu erhöhen. Bis heute wurde jedoch noch nichts über die Isolierung und Cloiiierung der DNA-Sequenz, die für die Phytaseaktivität codiert, veröffentlicht.
Zusammenfassung der Erfindung Die Erifndung stellt eine gereinigte und isolierte, für Phytase codierende DNA- Sequenz zur Verfugung. Die Isolierung und Clonierung dieser für Phytase codierenden DNA-Sequenz wurde über die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsonden,
die speziell für diese Erfindung entwickelt wurden, erzielt. Bevorzugte DNA-Sequenzen, die für diese Phytasen codieren, erhältman aus pilzartigen Quellen, besonders aus fädigen Pilzen der Gattung Aspergillus.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen Vektor zur Verfügung zu stellen, der ein Expressionskonstrukt enthält,
das wiederum mindestens eine Kopie von mindestens einer, vorzugsweise für Phytase codierenden homologen DNA-Sequenz,enthält, die ope ibel an einen geeigneten Regulationsbereich gebunden ist, der in der Lage ist, die hohe Expression der Peptideoder Proteine mit Phytaseaktivität in einem geeigneten Expressionswirt zu lenken.
Das erfindungsgemäß zur Verfügung gestellte Expressionskonstrukt kann in einen Vektor, vorzugsweise ein Plasmid, inseriert
werden, das in der Lage ist, eine mikrobielle Wirtszelle zu transformieren und in das Genom zu integrieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Transformanten, vorzugsweise eines mikrowellen Wirtes
der durch einen wie im vorstehenden Absatz beschriebenen Vektor transformiert wurde. Die erfindungsgemäß transformierten
Wirte sind fädige Pilze der Gattungen Aspergillus, Trichoderma, Mucor und Penicillium, Hefen der Gattungen Kluy veromyces
und Soccharomyces oder Bakterien der Gattung Bacillus. Besonders bevorzugte Expressionswirte sind fädige Pilze der Gattung
Aspergillus. Die transformierten Wirte sind in der Lage, große Mengen rekombinierter Phytase in einem wirtschaftlichen,
großtechnischen Umfange zu erzeugen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist auf rekombinante Peptide und Proteine mit Phytaseaktivität in glycolysierter oder
nichtglycolysierter Form gerichtet; auf eine Methode zur Erzeugung dieser nichtglycosylierten Peptide und Proteine; auf Peptideund Proteine mit Phytaseaktivität, die frei von Verunreinigungen sind; und auf monoclonale Antikörper, die mit diesenrekombinantön oder gereinigten Proteinen reaktionsfähig sind.
Ein Vergleich der biochemischen Parameter der gereinigten Wildtyp A. ficuum-Phytase von Ullah mit der weiter gereinigten Wildtyp A. flcuum-Phytarie, die erfindungsgemäß gewonnen wurde, ist in Tabelle 1, unten, aufgeführt. Besonders beachtenswert
sind die Werte der spezifischen Aktivität, die zeigen, daß das gereinigte Protein, das wir gewonnen haben, zweimal sovielspezifische Aktivität aufweist wie das von Ullah veröffentlichte.
Die Erfindung stellt weitere für Proteine codierende und Phytaseaktivität aufweisende Nucleotidsaquenzen wie auch Aminosäuresequenzen dieser Proteine zur Verfügung. Die bereitgestellten Sequenzen können dafür eingesetzt werden, Oligonucleotidsonden zu konstruieren, die wiederum bei Hybridisierungsscreeninguntersuchungen für die Identifizierung von Phytasegenen aus anderen Spezies, besonders mikrowellen Spezies verwendet werden können, die anschließend isoliert und
geclont werden können.
Die erfindungsgemäß zur Verfugung gestellten Sequenzen können auch als Startmaterialien für die Konstruktion von Phytasen
der „zweiten Generation" eingesetzt werden.
„Zweite Generation"-Phytasen sind Phytasen, die durch Mutagenesetechniken (zum Beispiel ortsspezifische Mutagenese)verändert wurden und jetzt Eigenschaften aufweisen, die sich von denen der Wilrityp-Phytasen oder rekombinanten Phytasenwie auch jener, die erfindungsgemäß erzeugt werden, unterscheiden. Zum Beispiel kann die Temperatur oder das pH-Optimum,die spezifische Aktivität oder Substrataffinität verändert werden, so daß sie für die Anwendung in einen definierten Verfahrenbesser geeignet sind.
Im Kontext der Erfindung umfaßt der Terminus Phytase eine Enzymfamilie, die Reaktionen katalysiert, die der Entfernung von
anorganischem Phosphor aus verschiedenen Myoinositolphosphaten dienen.
Die Phytaseaktivität kann über eine Anzahl von Assays ermittelt werden, deren Auswahl im Hinblick auf die Erfindung nicht
kritisch ist. Zum Zwecke der Veranschaulichung kann die Phytaseaktivität durch Messen der Enzymmenge, die anorganischen
Phosphor aus 1,5mM Natriumphytat mit einer Geschwindigkeit von 1 pmol/min bei 37°C und einem pH-Wert von 5,50 freisetzt,
ermittelt werden.
Es sollte festgehalten werden, daß der Terminus „Phytase" im Text dieser Beschreibung durchweg mit der Absicht verwendet
wird, alle Peptide und Proteine mit Phytaseaktivität darin einzuschließen. Diese Absicht wird in Figur 1 Averanschaulicht, die die
Sequenzen A und B (Sequenzen, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit gewonnen wurden) mit Sequenz C (von Ullah
veröffentlicht, 1988b) vergleicht. Die Figur zeigt, daß erfindungsgemäß Proteine gewonnen werden können, denen die erstenvier Aminosäuren fehlen (dem Protein von Sequenz A fehlen die ersten sieben Aminosäuren) des maturen A. ficuum·
Phytaseproteins. Diese Proteine behalten jedoch die Phytaseaktivität. Die vollständige Aminosäuresequenz des Phytaseproteins,
so wie sie von der entsprechenden Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, wird in Figur 8 gezeigt.
Die erfindungsgemäß erzeugte Phytase kann bei einer Vielzahl von Verfahren, die die Umwandlung von Phytat in Inositol und
anorganisches Phosphat erfordern, angewandt werden.
Die Erzeugung erfindungsgemäßer Phytasen verringert zum Beispiel die Produktionskosten von mikrowellen Phytasen, so daß
ihre wirtschaftliche Anwendung im Tierfutter möglich wird, was schließlich zu einem In-vlvo-Preis/Leistungsverhältnis führt,das mit anorganischem Phosphat wettbewerbsfähig ist. Ein weiterer v/orteil liegt darin, daß der Phosphorgehalt von Dungbeträchtlich vermindert wird.
Es wird davon ausgegangen, daß die Verwendung von Phytasen, die zu einem Preis zur. Verfügung stehen, der mit
anorganischem Phosphat konkurrenzfähig ist, den Freihoitsgrad der Mischfutterindustrie erhöht, ein Futtermittel hoher Qualitätzu erzeugen.
Wenn zum Beispiel das Futtermittel mit Phytase ergänzt wird, können die Zugabe von anorganischem Phosphat ausgelassen
und der Gehalt von verschiedenen Stoffen, die Phytat enthalten, vergrößert werden.
Zusätzlich zur Verwendung in Tierfuttermitteln und bei der Sojabohnenverarbeitung kann, wie bereits obenerwähnt, die
erfindungsgemäß gewonnene Phytase auch in diversen großtechnischen Anwendungsgebieten eingesetzt werden wie:
- flüssige Futtermittel für Schweine und Geflügel. Es hat sich als allgemeine Praxis herausgestellt, Futtermittel mehrere Stunden vor der Fütterung einzuweichen. Während dieser Zeit ist das Enzym in der Lage, Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat umzuwandeln,
- ein industrielles Verfahren für die Produktion von Inositol oder Inositolphosphaten,
- andere industrielle Verfahren unter Verwendung von Substraten, die Phytat enthalten, wie die Stärkeindustrie, und bei den Gärungsindustrien z.B. die Brauereiindustrie. Die Chelatbildung von Metallionen durch Phytat kann bewirken, daß diese Mineralien für die Erzeugung von Mikroorganismen nicht zur Verfügung stehen. Enzymatische Hydrolyse von Phytat verhindert diese Probleme.
Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden, genaueren Beschreibung ersichtlich. Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1.A,
Für gereinigte Phytase ermittelte N-terminale Aminosäuresequenzen. Die mit A und B markierten Aminosäuresequenzen
werden erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt; sie entstehen aus Phytaseunterformen mit isoelektrischen Punkten von 5,2beziehungsweise 5,4. Sequenz C wird bei Ullah angeführt (1987,1988b, siehe oben). Der bei Position 12 von Sequenz A und Blokalisierte Aminosäurerest konnte durch die vorliegende Erfindung nicht als Glycinrest bestätigt werden.
( + bedeutet: keine eindeutige Identifizierung,
+ 4- bedeutet: kein Rest nachgewiesen)
B. N-terminale Aminosäuresequenzen von CNBr-geschnittenen inneren Phytasefragmenten. Die mit A und B markierten Aminosäuresequenzen (scheinbare relative Molekülmasse ungefähr 2,5kDa- beziehungsweise 36kDa-Peptide) werden erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt. Die Sequenzen C bis E werden von Ullah (1988b, siehe oben) angeführt.
C. N-terminale Aminosäuresequenz eines lOOkDa-Proteins, dessen Anwesenheit erfindungsgemäß in rohen Phytaseproben festgestellt wurde.
Figur 2.A.
Oligonucleotidsonden, die auf der Grundlage der Werte von Figur 1A, den Peptiden A bis E, konstruiert wurden. B. Oligonucleotidsonden, die auf der Grundlage der Werte von Figur 1B, den Peptiden A und B, konstruiert wurden.
Figur 3.
Oligonucleotidsonden, die für die Isolierung des für saure Phosphatase codierenden Gens verwendet werden.
Figur 4.
Restriktionskarte von Bacteriophage Lambda AF201, der den Phytaselocus von A. ficuum enthält. Die Pfeile zeigen die Stellung des Phytasegens und die Richtung der Transkription an. Clon # zeigt die mit bezeichneten Restriktionsenzymen von Phage AF201 in pAN 8-1 (für pAF 28-1) und in pUC19 (für alle anderen Subclone) abgeleiteten Subclone.
Figur 5.
Physikalische Karte von pAF 1-1. Das in pUC19 inserierte 1Okb BamHI-Fragment enthält das gesamte, für saure Phosphatase aus A. ficuum codierende Gen.
Figur β.
Kompilation der Nucleotidsequenzen der Plasmide pAF 2-3, pAF 2-6, und pAF 2-7, die den chromosomalen Phytasegen-Locu; umfassen. Der Phytase codierende Bereich wird von Nucleotidposition 210 bis Position 1713 lokalisiert; in dem chromosomalen Gen ist von Nucleotidposition 254 bis Position 355 ein Intron vorhanden. Relevante Merkmale wie Restriktionsstellen, Phytasestart und Stoppcondone und die Intror.stellung werden angegeben.
Figur 7.
Eine detaillierte Karte des sequenzierten Phytasechromosomenortes; die Pfeile geben die Lage der beiden Exone des Phytase codierenden Bereiches an.
Figur 8.
Nucleotidsequenz des translatierten Bereichs des Phytase-cDNA-Fragments und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Phytaseproteins; der Start des maturen Phytaseproteins wird als Position +1 ungegeben. Der Aminoterminus des inneren 36kDa-Proteinfragments liegt bei der Aminosäureposition 241, wohingegen das 2,5kDa-Proteinfragment bei Aminosäureposition 390 startet.
Figur 9.
Physikalische Karte der Phytaseexpressionskassette pAF 2-2S. Pfeile geben die Richtung der Transkription der Gone an.
Figur 10.
lEF-PAGE-Nachweis der Überexpression von Phytase in einem A. flcuum NRRL 3135-Transformanten. Gleiche Volumen des Kulturüberstandes von A. f icuum (Spur 1) und des Transformanten pAF 2-2S (Spur 2), die unter identischen Bedingungen vermehrt wurden, wurden auf einem Phast-System-Pharmacia-IEF-PAGE-Gol im pH-Bereich von 4,6 bis 6 analysiert. Zum Beispiel wurde ein? Probe von A. flcuum-Phytase, die bis zur Homogenität gereinigt wurde, entweder separat (Spur 4) oder mit einem Kulturüberstand vermischt (Spur 3) eingefügt. Die Gele wurden entweder mit einem Phosphatasefarbstoff, wie in Text (A) beschrieben, oder einem allgemeinen Proteinfarbstotf (Coomassie Brillantblau, B) gefärbt. Die Phytasebanden werden mit einem Sternchen gekennzeichnet.
Figur 11.
IEF-PAGE-Nachweis für die Überexpression von Phytase in A. nlyer CBS 513.88-Transformanten. Gleiche Volumen der Kulturüberstände des A. nlger-Elternstamms (Spur 1) odor der Transformanten pAF 2-2S # 8 (Spur 2), pFYT3 # 205 (Spur 3) und # 282 (Spur 4) wurden durch IEF-PAGE wie in der Legende von Figur 10 beschrieben analysiert. Die Gele wurden entweder durch einen allgemeinen Phosphataseaktivitätsfarbstoff (A) odor durch einen allgemeinen Proteinfarbstoff (B) gefärbt. Phytasebanden worden mit einem Sternchen gekennzeichnet.
Figur 12.
Physikalische Karte von pAB 6-1. Das 14,5 kb Hlndlll DNA-Insert in pUC19 enthält den gesamten Glucoseamylase (AG)-Locus von
A. nlger.
Figur 13.
Eine schematische Darstellung der Generation von AG-Promotor/Phytasegenfusionen durch die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Sequenzen aller verwendeten Oligonucleotidstarter werden im Text angegeben.
Figur 14.
Physikalische Karte der Phytaseexpressionskassette pAF 2-2SH.
Figur 15.
Physikalische Karten der intermediären Konstrukte pXXFYTI, pXXFYT2 und der Phytaseexpressionskassetten pXXFYT3, worin XXdie Leader-Sequenz (L) bezeichnet. In p18FYT# beziehungsweise ρ24FYT# sind die 18aa- und die 24aa-AG-Leader-Sequenz inseriert, wohingegen in pFYT# der Phytase-Leader verwendet wird.
Figur 16.
Physikalische Karte von Plasmid pFYT3 amdS.
Figur 17.
Physikalische Karte von Plasmid pFYT3INT.
Figur 18.
Physikalische Karte des Phytase/AG-Substitutionsvektors pREPFYT3.
Figur 19.
Autoradiographische Aufnahmen von chromosomaler DNA, die mit Pvull (A) und BamHI (B) digeriert und mit der,"p-markierten A. ficuum-Phytase-cDNA als Sonde der mikrobiellen Spezies S. cerevlslae (Spur 2) hybridisiert wurde; B. subtills (Spur 3); K. lactis (Spur 4); P. crysogenum (Spur 5); P. aeruglnosa (Spur 6); S. lividans (Spur 7); A. niger 1 \ig (Spur 8); A. nlger 5pg (Spur 9); Leerwert (Spur 10); C. thermocellum (Spur 11). Spur 1: Marker-DNA.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Clonierung der Gene, die für durch Mikroorganismen erzeugte ausgewählte Proteine codieren, kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Eine Methode beruht auf der Reinigung des in Frage kommenden Proteins, anschließenden Ermittlungen seiner N-terminalen Aminosäuresequenz und Screening einer genomischen DNA-Bank des Mikroorganismus unter Verwendung einer DNA-Oligonucleotidsonde, die auf der N-terminalen Aminosäuresequenz basiert. Beispiele der erfolgreichen Anwendung dieses Verfahrens stellen die Clonierung de- Isoper.icillin N-synthetasegens aus Cephalosporin acremonlum (S. M. Samson et. al. [1985] Nature 318,191-194) und die Isolierung des Gens dar, das für die TAKA-Amyiase für Aspergillus oryzae (Boel et. al. [1986] EP-A-0238023) codiert.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde der Versuch unternommen, das für Phytase cocierende Asperglllus Iltuum-Gen zu isolieren. Das Protein wurde ausgiebig gereinigt, und es wurden mehrere biochemische Parameter ermittelt. Die erhaltenen Daten wurden mit den von Ullah (1988a) veröffentlichten verglichen. Beide Datenreihen werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.
-7- 300 886 Biochemische Parameter von gereinigter Wildtyp A. tlcuum-Phytase
Parameter Erfindungsgemäß Ullah
Spezifische Aktivität» 100U/mg Protein 50U/mg Protein
Reinheit: SDS-PAGE 85kDa 85/10OkDa
: IEF-PAGE 3cder4Banden Nicht ermittelt
Km (Affinitätskonstante) 250μΜ 40 μΜ
Spezifitätfür:
lnositol-1-P nicht aktiv nicht aktiv
lnositol-2-P Km = 3,3mM 5% Aktivität
pH Optimum 2,5 und 5,5 2,5 und 5,5
Temperaturoptimum ("C) 50 58
MW(kDa)»· 85 85 und 100
MWfnichtglycosyliert)·· 56,5 61,7
Isoelektrischer Punkt·»· 5,0 bis 5,4
* Die PhytasedktivitS; wurde von Ullah eher bei 58'C als boi 370C gemessen. Eine Einheit der Phytaseaktivität wird als die En:ymmenge definiert, die anorganischen Phosphor aus 1,5mM Natriumphytat mit einer Geschwindigkeit von 1 μηηοΙ/min bei 37 0C und einem pH-Wert von 5,50 freisetzt. Damit die Fermentationcargebnisse und die spezifischen Aktivitäten verglichen werden konnten, wurden die von Ullah offenbarten AktivitSten hinsichtlich der Temperaturunterschiede korrigiert. Die Korrektur basiert auf dem Unterschied In der PhytaseaktivitBt, die bei 370C und bei 58°C flamessen wurde, wie aus Tabelle III von Ullah (1988b) ersichtlich ist.
** Scheinbare relative MolekQlmasse wie anhand von SDS-PAQE ermittelt.
··· Wie ermittelt anhand von IEF-PAGE.
Zur Isolierung des für Phytase codierenden Gens wurde ein erster Satz Oligonucleotidsonden entsprechend der zuvor beschriebenen Methode (Figur 2 A) konstruiert. Die Gestaltung dieser Sonden basierte auf den Aminosäuresequenzdaten. Als Kontrolle für die gesamte Prozedur wurden ähnliche Schritte unternommen, um das für saure Phosphatase codierende Gen zu isolieren, wobei die von Ullah und Cummins ([19781 Prep. Biochem. 17,397-422) veröffentlichten Daten verwendet wurden. Für saure Phosphatase wurde das entsprechende Gen ohne Schwierigkeiten isoliert. Für Phytase schien sich jedoch die Situation schwierig zu gestalten. Trotz vieler Versuche, bei denen von der N-terminalen Aminosäuresequenz abgeleitete Proben verwendet wurden, konnten keine genomischen DNA-Fragmente oder Clone aus der genomischen DNA-Bank isoliert werden, die positiv identifiziert werden konnten, daß sie das für Phytase codierende Gen enthalten.
Zur Überwindung dieses Problems wurde die gereinigte Phytase CNBr-gelenkter Spaltung unterzogen, und die resultierenden Fragmente wurden isoliert. Die N-terminalen Aminosäuresequenzon dieser Fragmente wurden ermittelt (Figur 1 B), und es
wurden neue Oligonucleotidsonden konstruieM, die auf den neuen Daten (Figur 2B) beruhen. Überraschenderweise identifizierten die neuen Oligonucleotidsonden spezifische DNA-Fragmente und erwiesen sich als geeignet, unzweideutig Clone aus einer genomischen DNA-Bank zu identifizieren. Zwischen den neuen Clonen oder den daraus isolierten DNA-Fragmenten und dem ersten Satz von Oligonucleotidsonden oder den unter Verwendung des ersten Sondensatzes isolierten Clonen wurde keine Kreuzhybridisierung beobachtet.
Es wird davon ausgegangen, daß dieser zweite Sondensatz ebenfalls zur Identifizierung der Codierungssequenzen von verwandten Phytasen verwendet werden kann.
Die neu isolierten Clone wurden als Sonden bei Northern-Blot-Hybridisierungen verwendet. Eine diskrete mRNA konnte nur nachgewiesen werden, wenn die mRNA aus Phytase erzeugendem Myzel isoliert wurde.
Wenn die RNA aus richtphytaseerzeugendem Myzel versuchsweise eingesetzt wurde, konnte kein Hybridisierungssignal festgestellt werden. Die mRNA hatte eine Größe von etwa 1800b, die theoretisch ein Protein mit einer maximalen relativen Molekülmasse von etwa 6OkDa ergab.
Dieser Wert stimmt mit der relativen Molekülmasse überein, die für das nichtglycolysierte Protein ermittelt wurde, und der relativen Molekülmasse des von der DNA-Sequenz abgeleiteten Proteins.
Darüber hinaus konnte eine Zunahme der Phytaseaktivität demonstriert werden, wenn eine Einfügung in eine Pilzstelle durch Transformation erfolgte. Dieses führt zu dem Schluß, daß die für Phytase codierende Nucleotidsequenz tatsächlich isoliert wurde. Die für das gereinigte Phytaseenzym und für die daraus erhaltenen CNBr-Fragmente ermittelten Aminosäuresequenzen stimmen mit der Aminosäuresequenz überein, die aus der Sequenz abgeleitet wurde, die für das clonierte Gen ermittelt wurde.
Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz werden in den Figuren 6 und 8 angegeben, und sie veranschaulichen ebenfalls die für Phytase codierende clonierte Sequenz.
Die Isolierung der für Phytase codierenden Nucleotidsequenz ermöglicht die wirtschaftlichere Produktion von Phytase in industriellem Umfange und zwar über die Anwendung moderner rekombinanter DNA-Techniken wie Genamplifikation, Austausch von regulierenden Elementen wie zum Beispiel Promotoren, Sekretionssignale oder Kombinationen davon.
Dementsprechend umfaßt die Erfindung ebenfalls einen transformierten Expressionswirt, der zur effizienten Expression von großen Peptid- oder Proteinmengen mit Phytaseaktivität und, falls gewünscht, zur effizienten Expression von sauren Phosphatasen fähig ist. Expressionswirte von Interesse sind fädige Pilze, die aus den Gattungen Aspergillus, Trichoderma, Mucor und Penlclllium ausgewählt wurden, Hefen, die aus den Gattungen Kluyveromyces und Saccharomyces, und Bakterien, die aus der Gattung Bacillus ausgewählt wurden. Es v/ird vorzugsweise ein Expressionswirt ausgewählt, der zur effizienten Sekretion der endogenen Proteine in der Lage ist.
Von besonderem Interesse sind industrielle Stämme von Asperlllus, speziell niger, ficuum, awamori oder oryzae. Alternativ können Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevislae, Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis verwendet werden.
Das Expressionskonstrukt umfaßt die gewünschten für das zu exprimierende Enzymprodukt codierenden Nucleotidsequenzen, die gewöhnlich eine Signalsequenz besitzen, die in dem Wirt funktionsfähig ist und die für die Sekretion des Produktpeptids oder -proteins Sorge trägt.
Erfindungsgemäß können verschiedene Signalsequonzen verwendet werden. Es kann eine Signalsequonz verwendet werden, die homolog zur clonierten Nucleotidsequenz ist, die exprimiert werden soll. Alternativ kann eine Signalsequenz verwendet werden, die homolog oder im wesentlichen homolog zu der Signalsequenz eines Gens am Ziellocus des Wirtes ist, um die homologe Rekombination zu erleichtern. Darüber hinaus können auch Signalsequenzen verwendet werden, die entwickelt wurden, um eine bessere Sekretion aus dem seloktierten Expressionswirt zur Verfügung zu stellen. Siehe zum Beispiel von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133,17-21; und Perlman und Halverson (1983) J. Mol. Biol. 167,391-409. Die für die Signalsequenz codierende DNA-Sequenz kann direkt durch die Sequenz, die für das Processing-Signal (Spaltungs-Erkennungsstelle) codiert, mit der Sequenz verbunden werden, die für das gewünschte Protein codiert, oder durch eine kurze Brücke, die gewöhnlich weniger als zehn Condone umfaßt.
Im Geltungsdbereich der Erfindung bevorzugt verwendete Sekretionssignalsequenzen sind Signalsequenzen, die zu der zu exprimierenden clonierten Nucleotidsequenz homolog sind, die 18 Aminosäureglucoamylase (AG)-Signalsequenz und die 24 Aminosäureglucoamylase (AG)-Signalsequenz, wobei die letzteren beiden entweder homolog oder heterolog zur Nucleotidsequenz sind, die exprimiert werden soll.
Das Expressionsprodukt oder die Nucleotidsequenz von Interesse kann DNA sein, die homolog oder Keterolog zum Expressionswirt ist.
,Homologe" DNA wird hierin als DNA definiert, die aus der gleichen Gattung herrührt. Zum Beispiel wird Asperglllus mit DNA aus Aspergillus transformiert. Auf diese Weise ist es möglich, bereits die vorhandenen Eigenschaften der Pilzgattung zu verbessern, ohne neue Eigenschaften einzuführe' e in der Gattung vorher nicht vorhanden sind.
„Heterologe" DNA wird hierin als DNA definiert, die aus mehr als einer Gattung herrührt, d. h„ wie aus dem in dem vorstehenden Abschnitt erwähnten Beispiel gefolgert werden kann, rührt die DNA aus einer anderen Gattung her als Aspergillus, die dann in Asperglllus exprimiort wird.
Die für Phytaseaktivität codierenden Nucleotidsequenzen-werden vorzugsweise aus einer Pilzquelle gewonnen. Bevorzugter sind Phytase codierende Nucleotidsequenzen, die man aus der Gattung Asp; rglllus gewinnt. Die bevorzugtesten Sequenzen erhält man aus den Spezies Aspergillus flcuum oder Aspergillus niger.
Der Bereich 5' zum offenen Leseraster in der Nucleotidsequenz von Interesse umfaßt den Transkriptionsinitiierungs-Regulationsbereich (oder Promotor). Jeder Bereich, der in dem Wirt eine Funktion hat, kann verwendet werden, einschließlich des Promotors, der zu der Phytase codierenden Nucleotidsequenz, die exprimiert werden soll, homolog ist. Der verwendete Bereich wird jedoch größtenteils mit dem Bereich des Ziellocus homolog sein. Dieses hat die Wirkung, daß das Expressionsprodukt des Ziellocus mit dem Expressionsprodukt von Interesse substituiert wird. In dem Umfange, wie der Grad der Expression und Sekretion des Ziellocus codierten Proteins für eine effiziente Produktion sorgt, wird dieser TransKriptionsinitierungs-Regulationsbereich normalerweise als zufriedenstellend angesehen werden. In manchen Fällen kann jedoch der Wunsch nach einem höneren Transkriptionsniveau als dem Ziellocus-Gen bestehen, oder men mag wünschen, induzierbare Expression, die ein besonderes induzierendes Agens verwendet, zu haben. In diesen Fällen wird ein Transkriptionsinitiierungs-Regulationsbereich verwendet, der sich von dem Bereich in dem Ziellocus-Gen unterscheidet. Eine große Anzahl von Transkriptionsinitiierungs-Regulationsbereichen sind bekannt, die in fädigen Pilzen funktionsfähig sind. Diese Bereiche beinhalten solche von Genen, die für Glycoamylase (AG), Pilzamylase, saure Phophatase, GAPDH, TrpC, AmdS, AIcA, AIdA, Histon H2A, Pyr4, PvrG, Isopenicillin-N-synthetase, PGK, saure Protease, Acyltransferase und dergleichen codieren. Der Ziellocus wird vorzugsweise für ein höher exprimiertes Proteingen codieren, d. h. ein Gen, dessen Expressionsprodukt zu einer Konzentration von mindestens etwa 0,1 g/l am Ende des Fermentationsverfahrens exprimiert. Die Dauer dieses Prozesses kann unter anderem bei dem gewünschten Proteinprodukt variieren. Als ein Beispiel für ein derartiges Gen ist das für Glucoamylse (AG) codierende Gen sehr anschaulich. Andere Gene von Interesse umfassen pilzartige a-Amylase, saure Phosphatase, Protease, saure Protease, Lipase, Phytase und Celiobiohydrolase. Besonders bevorzugte Zielloci sind das Glucoamylasegen von A. nlger, das Pilzamylasegen von A. oryiue, die Cellobiohydrolasegene von T. reesel, das saure Proteasegen von Mucor mlehei, das Lactasegen von Kluyveromyces lactls oder das Invertasegen von Saccharomyces cerevisiae. DerTranskriptionsterminations-Regulationsbereich kann aus dem Gen von Interesse, dem Zieilocus oder irgendeiner anderen günstigen Sequenz herrühren. Dort, wo das Konstrukt weitere Sequenzen stromabwärts (in Richtung der Transkription) aus dem Gen von Interesse einschließt, sollte der Transkriptionsterminations-Regulationsbereich, falls homolog mit dem Ziellocus, wesentlich kleiner als der homologe flankierende Bereich sein.
Gewöhnlich wird ein Selektionsmarker verwendet, der Teil des Expressionskonstrukts oder separat vom Expressionskonstrukt sein kann, so daß er an einer Stelle integriert werden kann, die sich vom Gen von Interesse unterscheidet. Da die erfindungsgemäßen rekombinanten Moleküle vorzugsweise zu einem Wirtsstamm transformiert werden, der für die industrielle Produktion verwendet werden kann, sind Selektionsmarker zur Überwachung der Transformation vorzugsweise dominante Selektionsmarker, d. h., es müssen keine Mutationen in den Wirtsstamm eingeführt werden, um die Verwendung dieser Selektionsmarker zu ermöglichen. Beispiele für diese sind Marker, die die Transformanten in die Lage versetzen, auf definierten Nährstoffquellen (z. B. das A. nldulans amdS-Gen befähigt A. niger-Transformanten auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen) zu wachsen, oder Marker, die Widerstandsfähigkeit gegen Antibiotika verleihen (z.B. verleiht das ble-Gen Widerstandsfähigkeit gegen Phleomycin, oder das hpH-Gen verleiht Widerstandsfähigkeit gegen Hygromycin B). Das Selektionsgen wird seine eigenen Translatationsinitiierungs- und -terminations-Regulationsbereiche aufweisen, um die unabhängige Expression des Marker zu ermöglichen. Wie zuvor beschrieben, sind eine große Anzahl von Transkriptionsinitiierungs-Regulationsbereichen bekannt und können in Verbindung mit dem Markergen verwendet werden. Don, wo antibiotische Widerstandsfähigkeit erforderlich ist, wird die Konzentration des Antibiotikums für die Selektion in Abhängigkeit von dem verwendeten Antibiotikum variieren, im allgemeinen liegt sie im Bereich von etwa 30 bis 300pg/ml des Antibiotikums.
Die verschiedenen Sequenzen können in ÜberainstimmungTnit den bekannten Techniken wie Restriktion, Verbinden komplementärer Restriktionsstellen und Ligieren, stumpfes Enden durch Füllen der überstehenden Enden und Ligation stumpfer Enden, Ba131-Resektion, Starterreparatur, In-vitro-Mutagenese oder dergleichen verbunden werden. Wenn angebracht, können Polylinker und Adapter verwendet werden und durch die bekannten Techniken eingeführt oder entfernt werden, um die Montage des Expressionskonstrukts zu erleichtern. Während jeder Sythesestufe des Konstrukts kann das Fragment cloniert, analysiert
durch das Restriktionsenzym, sequenziert oder hybridisiert werden etc. Für das Cionieren stehen eine große Anzahl von Vektoren zur Verfügung, und eine spezielle Auswahl ist für diese Ertindung nicht kritisch, Normalerweise wird das Cionieren in E. coil eintreten.
Die flankierenden Bereiche können mindestens einen Teil des offenen Leserasters des Ziollocus, besonders der Signalsoquenz, der Regulationsbereiche 5' und 3' des Ziellocus-Gens umfassen oder können sich über die Regulationsbereiche hinaus ausdehnen. Normalerweise wird ein flankierender Bereich mindestens 100bp, gewöhnlich mindestens 200bp betragen und kann 500 bp oder darüber betragen. Die flankierenden Bereiche werden selektiert, um das Zielgen zu zerreißen und seine Expression zu verhindern.
Dieses kann durch Inserieren der Expressionskassette (die eine exprimierende Nucleotidsequenz umfaßt und gegebenenfalls zusätzliche Elemente wie eine Signalsequenz, eine Transkriptionsinitiierungs-Regulationsbereich- und/oder eine Transkriptionsterminations-Regulationsbereichssequenz) im offenen Leseraster p< <imal 5'-Bc-reich, durch Substituieren des ganzen oder eines Teils des Zielgens mit dem Expressionskonstrukt erreicht werde , oder men läßt das Expressionskonstrukt zwischen dem Tronskriptionsinitiierungs-Regulationsbereich am Ziellocus und dei . offenen Leseraster vermitteln. Wie bereits erwähnt, sollte dort, wo der Terminationsregulationsbereich homolog ist mit der Ragion am Ziellocus, der 3'-Flankenbereich wesentlich größer als ein im Konstrukt vorhandener Terminationsregulationsbereich sein.
Die Erfindung stellt ebenfalls das Startormaterial für die Konstruktion von „zweite Generation"-Fhytason zur Verfügung, d. h.
Phytaseenzyme mit Eigenschaften, die sich von denen der darin isolierten Enzyme unterscheiden. Zweite-Generation-Phytase kann eine veränderte Temperatur oder pH-Optimum, eine veränderte spezifische Aktivität oder Affinität für seine Substrate oder irgendeine andere veränderte Qualität aufweisen, die das Enzym für die Anwendung in einem definierten Verfahren geeigneter werden läßt.
E. coil ist dor beste Wirt für eino derartige Mutagenese (z. B. ortsspezifische Mutagenese). Da E, coil der Spleißmechanismus für die Entfernung von Intronen fehlt, die in dem Phytasegen<vorhanden sein könnten, ist ein cDNA-Clon von Phytase die wünschenswerte, in E. coil zu exprimierende Sequenz. Diese cDNA-Sequenz kann dun . im Fachgebiet bekannte Verfahren leicht mutiert werden. Anschließend kann das mutierte Gen in die gewünschte Expression&ivonstrukte eingefügt werden.
Das Konstrukt kann in den Wirt als dem Clonierungsvektor entweder linear oder ringförmig transformiert werden, oder es kann, wenn gewünscht, aus dem Clonierungsvektor entfernt werden. Der Cloniarungsvektor ist vorzugsweise ein Plasmid. Das Plasmid wird üblicherweise in etwa 1 kbp des Gens von Interesse linearisiert. Das Expressionskonstrukt für die Produktion der erfindungsgemäßen Phytasen wird in das Genom des selektierten Expressionswirtes integriert.
Für die Transformation \/on fadenförmigen Pilzen existieren eine Vielzahl von Techniken. Diese Techniken schließen Protoplastenfusion oder -transformation, Elektroporation und Schießen von Mikroprojektion in die Zeilen ein. Die Protoplastentransformtition erwies sich als erfolgreich und kann vorzugsweise angewendet werden.
Das Myzel des Pilzstammes von Interesse wird zuerst durch enzymatisches Digerieren der Zellwandung in Gegenwart eines osmotischen Stabilisierungsmittels wie KCL oder Sorbit umgewandelt. Die DNA-Aufnahme durch die Protoplasten wird durch die Zugabe von CaCI2 und einer konzentrierten Lösung von Polyethylenglycol gefördert, wobei die letztere Substanz die Aggregation der Protoplasten bewirkt, so daß durch diesen Prozeß die transformierende DNA in die Aggregate eingefügt und durch den Protoplasten aufgenommen wird.
Anschließend läßt man die Protoplasten auf einen festen Medium regenerieren, das ein osmotisches Stabilisierungsmittel und, wenn zweckmäßig, ein Selektionsmittel enthält, für dao die Resistenz durch die transformierende DNA codiert wird.
werden. Durch die Verwendung von Antikörpern, wo das Expressionsprodukt heterolog zum Wirt ist, kann man das Vorhandensein von Expression des Gens von Interosse nachweisen. Alternativ kann man Southern- oder Northern-Blots benutzen, um die Anwesenheit des integrierten Gens oder seines Transkriptionsproduktes nachzuweisen.
Die Amplifikation der Nucleotidsequenz oder des Expressionskonstrukts von Interesse kann über Standardtechniken wie das Einfügen vun multiplen Konstruktkopien in den transformierenden Vektor oder die die Verwendung des amdS-Gens als selektiven Marker erreicht werden (z.B. Weinans et al. [1985) Current Genetics, 9,361-368).
Die zu amplifizierends DNA-Sequenz kann DNA umfassen, die entweder homolog oder heterolog zum Expressionswirt ist wie bereits vorstehend erörtert wurde.
Die Zellen können dann in einem geeigneten Medium vermehrt werden. Es können niedrige Konzentrationen eines Preoteaseinhibitors wie Phenymethylsulfonylfluorid, 0.2-Makroglobuline, Pepstatin oder dergleichen verwendet werden.
Gewöhnlich liegt die Konzentration im Bereich von etwa 1 pg/ml bis 1 mg/ml. Das Preoteasegen(e) kann inaktiviert sein, um Degradation des gewünschten Proteins zu vermeiden oder zu reduzieren.
Die Transformanten können entweder in Batch- oder kontinuierlichen Fermentationsreaktoren vermehrt werden, wo das Nährmedium isoliert und das gewünschte Produkt extrahiert wird.
Für die Reinigung des Produktes können, wenn erforderlich, verschiedene Verfahren angewandt werden, wie Chromatographie (z.B. Hochdruckflüssigkeitschromatographie), Solvent-Solventextraktion, Elektrophorese, Kombination davon oder dergleichen.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine Stromabwärts-Processingmethode zur Verfügung, bei der die Fermentationsbrühe (wahlweise gereinigt) filtriert wird, der sich eine zweite keimfreihe Filtration anschließt, und anschließend die filtrierte Lösung eingeengt wird. Das so erhaltene flüssige Konzentrat kann wie folgt verwendet v/erden:
a) Phytase und andere Proteine können aus dem flüssigen Konzentrat durch Zugabe von Aceton zum endgültigen Volumen von 60% (V/V) unter ständigem Rühren ausgefällt werden. Das Präzipitat kann in einem Vakuum bei 35°C getrocknet werden. Nach dem Mahlen des trocknen Pulvers kann das Entzymprodukt als solches für Applikationsexperimente verwendet werden. Die rückgewonnenen Ausbeuten betrugen etwa 90%.
b) Das flüssige Konzentrat kann unter Anwendung herkömmlicher SprühtrocMiungsmethoden sprühgetrocknet werden. Die rückgewonnenen Ausbeuten variierten zwischen 80 bis 99%.
c) Das flüssige Konzentrat kann mit Trägermaterialien wie Weizenkleie gemischt werden. Das so erhaltene Gemisch kann in einem Sprühturm oder in einem Wirbelbett getrocknet werden.
d) Das flüssige Konzentrat kann z. B. durch die Zugabe von Sorbit osmotisch stabilisiert werden. Es kann ein Konservierungsmittel wie Benzoesäure zugegeben werden, um mikrobielle Kontamination zu verhindern.
Alle vier Formulierungen können an Vormischungshersteller, die Mischfutterindustrien, andere Zwischenhändler und Bauern verkauft werden.
Die hierin dargestellten Beispiele sind nicht als den Geltungsbereich der Erfindung in irgendeiner Weise einschränkend anzusehen. Fachleuten auf dem Gebiet wird einleuchten, daß das erfindungsgemäße Phytasegen bei neterologen Hybridisierungsexperimenten, die auf dio Isolierung des für Phytase codierenden Gens aus andoren Mikroorganismen gerichtet sind, verwendet werden kann.
Beispiel 1
Fermentation von A. flcuum NRRL 3135
Den Aspergillus ficuum-Stamm NRRL 3135 erhielt man vom Northern Region Laboratory, USDA, 1815 North University Street, Peorid, Illinois, USA. Die Pilzsporenpräparate wurden mit folgenden Standardtechniken durchgeführt.
Sporen und anschließend Zellen wurden über eine Reihe von Batch-Fermentationen in Erlenmeyer-Kolben auf einen lO-l-Fermentor übertragen. Nach der Vermehrung in der Batch-Kultur wurde der Inhalt dieses Fermentors als Inokulum für eine abschließende 500-Liter-Batch-Fermentation verwendet.
Die verwendeten Medien enthalten: 91 g/l Maisstärke (BDH Chemicals Ltd.); 38g/l Glucose · H2O;0,6g/l MgSO4 7H2O;0,6g/l KCI; 0,2 g/l FeSO4 · 7 H2O und 12g/l KNO3. Der pH wurde durch automatische Titration mit entweder 4 N NaOH oder 4 N H2SO4 bei 4,6 ± 0,3 aufrechtzuerhalten.
Die Zellen vermehrten sich bei 280C bei einer automatisch gesteuerten Gelöstsauerstoffkonzentration von 25% Luftsättigung.
Die Phytaseproduktion erreichte ein maximales Niveau von 5-10U/ml nach 10 Fermentationstagen.
Beispiel
Reinigung und Charakterisierung von A.ficuum-Phytase ·
Λ. Phytaseaktlvltatsassay
ΙΟΟμΙ Brühefiltrat (wenn erforderlich verdünnt) oder Überstehendes oder 100μΙ entmineralisiertes Wasser als Bezugssubstanz wurden zu einem Inkubationsgemisch mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben:
- 0,25M Natriumacetatpuffer pH 5,5 oder
- Glycin-HCI-PufferpH2,5
- 1 mM Phytinsäure, Natriumsalz
- Entmineralisiertes Wasser bis zu 900μΙ.
Das resultierende Gemisch wird 30 Minuten bei 370C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml 10%iger TCA (Trichloressigsäure) beendet. Nach Beendigung der Reaktion wurden 2ml Reagens (3,66g FeSO4 7H2O in 50ml AmmoniummolybdatlÖ3ung [2,5g (NHF4)eMo7O24 4H2O und 8ml H2SO4, verdünnt auf 250ml mit entmineralisiertem Wasser)) zugegeben
Die Intensität der blauen Farbe wird spektrophotometrisch bei 750 nm gemessen. Die Messungen geben einen Hinweis auf die Menge des freigesetzten Phosphats in bezug auf eine Eichkurve von Phosphat im Bereich von 0-1 mMol/l.
Phosphatasef&rbung
Bestandteile mit Phosphataseaktivität wurden durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer allgemeinen Phosphatasefärbung nachgewiesen. Das Gel wurdr mit einer Lösung von a-Naphthylphosphat und Fast Garnet GBC-SaIz (Sigma, 0,1 bzw. 0,2% M/V) in 0,6M Natriumacetatpuffer pH 5,5 inkubiert. Die Reaktion, deren Ergebnis ein schwarzes Präzipitat war, wurde entweder mit Methanol !Essigsäure (30:10%, V/V) beendet oder, wenn das Phytaseaktivität aufweisende Protein weiter erforderlich sein sollte, durch Spülen mit destilliertem Wasser.
B. Reinigung von A. flcuum-Phytase
Phytase wurde aus der Kulturbrüho von A. ficuum NRRL 3135 bis zur Homogenität gereinigt. Die Brühe wurde zuerst durch Filtration keimfrei gemacht. Das resultierende Kulturfiltrat wurde anschließend in einer Filtron-Ultrafiltrationsapparatur mit 30kD-Trannfiltern weiter eingeengt. Der pH-Wert und die lonenstärke der Probe wurden für die Reinigungsprozedur durch Waschen der Probe mit 1OmM Natriumacetatpuffer, pH4,5, eingestellt. Die endgültige Konzentration betrug bei diesem Ultrafiltrationsverfahren ungefähr das 20fache.
Die Probe wurde anschließend auf einen Kationenaustauscher (S-Sepharose Fast-Flow in einer HR16/10 20-ml-Säule, beide von Pharmacia erhältlich) in einem modernen Water-Preparative-650-Proteinreinigungssystem aufgebracht. Die gebundenen Proteine wurden mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1M in Natriumacetatpuffer eluiert. Die Phytase eluierte bei ungefähr 25OmM NaCI. Die Phytaseaktivität enthaltenden Fraktionen wurden durch Ultrafiltration gepoolt, konzentriert und entsalzt. Die sich ergebende Lösung wurde auf einen Anionenaustausch^ (A-Sepharose Fast-Flow in einer HR16/10 20-ml-Säule, Pharmacia) aufgebracht, und die Proteine wurden wiederum durch einen Natriumchloridgradienten von 0 bis 1M in wie zuvor beschriebenen Acetatpuffer eluiert. Die Phytase wurde aus dieser Säule bei ungefähr 20OmM NaCI eluiert.
Das Ergebnis dieser Reinigungsstufen ist ein teilweise gereinigtes Phytasepräparat mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 40-50U/mg Protein, das eine 25fache Reinigung aufweist.
Die Analyse der Reinheit der teilweise gereinigten Phytase ergab den Hinweis auf die Anwesenheit einer Hauptverunreinigung mit einer relativen Molekülmasse von ungefähr 10OkDa (Figur 1B, Sequenz E). Isoelektiische Fokussierung ergab die Anwesenheit einer Anzahl von Phosphataseaktivität enthaltenden Enzymen, einschließlich 3 bis 4 Phytaseunterformen (die isoelektrischen Punkie variierten von 5,0 bis 5,4) (Figur 1A, Sequenzen A und B).
Um ein homogenes Phytasepräparat zu erhalten, wurde eine weitere zweifache Reinigung durch eine anschließende Trennung der Bestandteile der teilweise gereinigten Phytase durch isoelektrische Fokussierung in einem LKB Multiphor-System auf Ampholine PAG-Platten (pH-Bereich 4 bis 6,5) erreicht. Die Proteine mit Phosphataseaktivität (einschließlich Phytase) wurden durch das herkömmliche Phosphatasefärbungsverfahren wie zuvor beschrieben nachgewiesen. Die Banden von Interesse wurden anschließend von dem Gel abgeschnitten, und das aktive Protein wurde durch eine 16stündige Inkubation der Gelscheiben in 10mM Natriumacetatpuffer 5,5 eluiert. Die Proteinfraktionen wurden in dem spezifischen Phytaseaktivitätsassay wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert, um auf diese Weise die Phytasefraktionen aus anderen sauren Phosphatasen abzutrennen. Der endgültige Reinigungsfaktor für Phytase betrug ungefähr das 60fache (spezifische Aktivität des finalen
Präparats 100U/mg Protein). Bei dienern abschließenden Reinigungsschritt war es gleichfalls möglich, unterschiedliche Unterformen von Phytase zu isolieren (Figur 1A, Sequenz A und B). Ee wurden mondclonale, gegen A. f icuum gerichtete Antikörper hergestellt, die ein effektives Reinigungsverfahren zur Verfügung stellen. Der Antikörper wurde an Cyanogenbromidaktivierte Sepharose 4 B (5 mg/ml Gel) gekoppelt, und diose Matrixwurde in einer Immunoaffinitrttssäule verwendet. Die Matrix zeigte, daß sie ungefähr 1 mg Phytase pro ml binden konnte. Die Phytase konnte aus der Affinitätssäule mit einem Puffer (10OmM Glycin-HCI, 50OmM NaCI), pH 2,5, eluiert werden, ohne daß
irgendein Aktivitätsvorlust entstand. Dieses Verfahren kann zur Isolierung homogener Phytase aus einem rohen Kulturfiltrat ineiner einzigen Stufe mit einer 80%igen Rückgewinnung und einer 60fachen Reinigung vorwendet werden.
C. Deglycolyslerung von Phytase A.flcuum-Phytase (70μο Protein) wurde mit 2,5UN-Glycanase (Genenzym) in 0,2M Natriumphosphatpuffer, pH8,6, und 1OmM
1,10-Phenanthrolin in einem Gesamtvolumen von 30μΙ inkubuiert.
Nach 16 Stunden bei 37°C wurde der Umfang der Declycosylierung durch Elektrophorese (Phast System, Pharmacia) geprüft. Die scheinbare relative Molekülmasse der Phytase, to wurde festgestellt, verringerte sich von 85kDa auf ungefähr 56,5küa. Die
periodische saure Schiff-IPASl-Zuckerfärbung, die die native Phytase als ein Glycoprotein identifizierte, konnte keine an das
Protein angehefteten Restkohlenhydrate nachweisen. Die vollständige Entfernung von Kohlenhydrat wurdu woiiui tlui ch die sensitive Loctin-Blotting-Methode erhärtet. Native und
declycosylierte Phytaso (beide 1,5pg) wurden auf einem Standard-SDS-PAGE-Gel separiert und eloktrophoretisch auf einer
PVDF-Membran (Immcbilon, Millipore) in 25 mM TRIS-Glycinpuffer, pH 8,3,20% (V/V) Methanol über einen Zeitraum von
16 Stunden bei 30V transferiert.
Die Membran wurde anschließend mit 1 % (M/V) Rinderserumalbumin in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung inkubiert und mit Concavanalin-A-Peroxidase (Sigma, 10μς/ηη in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung) inkubiert. Die Peroxidase wurde dann mit'4-Chloro-i-naphthol (Sigma) gefärbt. Diese sensitive Methode konnte ebenfalls kein restliches an die deglycolysierte Phytase angeheftetes Kohlenhydrat nachweisen. Nach der Deglycolysierung verlor die Phytase vollständig ihre Aktivität, möglicherweise auf Grund der Aggregation des Enzyms Beispiel 3 Ermittlung der Aminosäuresequenz von Phytase und die Konstruktion von Ollgnnuclootldsonden A. Ermittlung der N-terminalen Aminosäuresequenz Phytase wurde elektrophoretisch von SDS-PAGE oder IEF-PAGE auf eine PVDF-Blotting-Membran (Immobilon, Millipore)
transferiert. Das Elektroblotting wurde in 1OmM CAPS ß-Cyclohexylaminpropansulfonsäurel-Puffer, pH 11,0, mit 10% (V/V)
Methanol über einen Zeitraum von 16 Stunden bei 30V und 40C durchgeführt. Das Protein wurde mit Coomassie-Brillantblau-Färbung lokalisiert. Die Banden von Interesse wurden ausgeschnitten, weiter in Methanol entfärbt und Gasphasensequenzierung unterzogen. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung mehrerer individueller Präparate mehrmals durchgeführt. Die erhaltene Ergebnisse werden in Figur 1A (Sequenzen A bis D) dargestellt. Die Aminosäuresequenz wurde auch für ein in den rohen Präparaten vorhandenes lOOkDa-Protein ermittelt. Die für dieses Protein gewonnenen Daten werden in Figur 1C dargestellt. Diese Sequenz weist eine beträchtliche Homologie mit der sauren Phosphatase auf, die aus Asperegillus niger (MacRae et al. [1988] Gene 71,339-348) isoliert wurde.
B. Ermittlung der inneren Aminosäuresequenzen Proteinfragmentierung durch Cyanogenbromid
Bis zur Homogenität gereinigte Phytase wurde in 10OmM NaHCO3 durch Ultrafiltration (Microconcentrator Centricon 30, Amicon) transferiert. Das Protein wurde anschließend lyophilisiert, in 70% Trifluoressigsäure (V/V) gelöst, und 6 Stunden mit einem 300fachen molaren Überschuß von CNBr inkubiert. Die Raktion wurde durch Verdünnen des Gemischs mit Wasser beendet. Die resultierenden Fragmente wurden wieder lyophilisiert. Die Probe wurde anschließend in SDS-PAGE-Probenpuffer, der DTT (Dithiothreitol) enthielt, aufgelöst, und das Ausmaß der Fragmentierung wurde durch PAGE ermittelt. Analytische PAGE wurde auf einer Phast-System-Apparatur von Pharmacia auf 20%igen SDS-Pag j-Gelen durchgeführt. Die Gele wurden vorseparariert, um ein kontinuierliches Puffersystem zur Verbesserung der Trennung der kleinen Peptide (nach Anleitung) zu schaffen. Die Peptide wurden unter Verwendung einer im Fachgebiet bekannten Silberfärbungstechnik nachgewiesen, da Coomassie-Brillantblau die kleinsten Peptide nicht nachweisen konnte. Das Ergebnis des Verfahrens war eine vollständige Degradation von Phytase in Peptide mit relativen Molekülmassen von <2,5kDa, 57kDa und 8OkDa.
Die Peptide wurden für die Gasphasensequenzierung durch SDS-Tricine-PAGE wie von Schagger & Jagow (1987) beschrieben in Anal. Biochem. 166,368-379 isoliert, anschließend wurden sie wie zuvor beschrieben Elektroblotting unterzogen. Der N-Terminus des 57 kDa-Fragments ist identisch mit dem N-Terminus von Phytase wie von Ullah (1988b, siehe oben) ermittelt wurde, mit Ausnahme der ersten vier Aminosäuren, die nicht vorhanden waren (Figur 1A, Sequenz D). Die N-terminalen Sequenzen der 2,5kDa- und 36kDa-Peptide werden in Figur 1 B als Sequenz A und B dargestellt.
C. Oligonucleotidsonden
Es wurden Oligonucleotidsonden konstruiert, die auf den in Figur 1A und 1B dargestellten Aminosäuresequenzen basieren, und unter Verwendung eines Applied-Biosystems-ABI-380B-DNA-Synthesizers hergestellt. Diese Oligonucleotide werden in Figur 2 A und 2 B aufgeführt.
Beispiel 4
Hybridisierung von genomischen Blots und genomisches DNA-Banken mit einem ersten Satz von Ollgonuclectldsonden Die genomische DNA von A.f icuum wurde durch Mahlen des Myzels !/> flüssigem Stickstoff unter Verwendung von Standardverfahren (z. B. Yelton et al. (19841 Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 1470-1474) isoliert. Eine genomische DN Α-Bank wurde in dem Bacteriophagevektor Lambda EMBL 3 unter Verwendung einer teilweisen Sau 3 Α-Verdauung der A. ficuum NRRL 3135 chromosoma'en DNA entsprechend den Standardtechniken (z. B. Maniatis et al. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual [Molekulares Cionieren, ein Laborhandbuch], Cold Spring Harbor Laboratory, New York) konstruiert. Die so erhaltene genomisr.he DNA-Bank enthielt 60- bis 70mal das A.ficuum-Genom. Die Bank wurde hinsichtlich des Auftretens von Plaques ohne Inserts durch Hybridisierung mit dem Lambda-EMBL 3-Stuffer-Fragment überprüft. Es wurde beobachtet, daß unter 1 % der Plaques die Lambda EMBL 3-Sonden hybridisierten. Die Insertgröße betrug 13 bis 17kb.
Damit die für das Screenen der genomischen DNA-Bank geeigneten Bedingungen und Sonden identifiziert werden konnten, wurde die genomische DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, auf Agarosegeln separiert und auf Genescreen plus unter Verwendung der Anleitung des Herstellers geblottert. Die Blots wurden mit allen Ollgonucleotldsonden hybridisiert, Die Hybridltsung wurde unter Anwendung von Bedingungen variierender Strenge (θχ SSC, 40'C bis 60°C für die Hybridisierung; bis zu 0,2x SSC, 650C für das Waschen) durchgeführt. Die Sonden 1068 und 1024 (Figur 2 A) wurden für das Screenen der genomischen DNA-Bank selektiert, obgleich keine üblichen DNA-Fragmente identifiziert werden konnten, die speziell mit beiden Sonden hybridisierten.
Die saure Phosphatasesonde 1025 (Figur 3) ergab ein spezifisches und diskretes Hybridisierungssignal, und daher wurde diese Sonde für das Screenen der genomischen DMA-Bank für das saure Phosphatasegen ausgewählt.
Unter Verwendung der drei Sonden konnten die hybridisierenden Plaques in der genomischen DNA-Bank identifiziert werden. Das Sonde 1025 (saure Phosphatase) entsprechende Hybridisierungssignal war kräftig und reproduzierbar. Hybridisiorungssignale verschiedener Intensität wurden bei Verwendung der Sonden 1024 und 1068 (Phytase) beobachtet. Zwischen den beiden Serien wurde keine Kreuzhybridlsierung festgestellt. Alle drei Plaqueserien wurden erneut gescreent und die DNA wurde aus acht einzelnen, positiven Plaques (Manlatis et al., siehe oben) isoliert. In jeder Serie konnten Clone identifiziert werden, die identische Hybridislerungsfragmente enthielten, was darauf hinweist, daß die Inserts der Clone verwandt sind und wahrscheinlich die gleiche genomischo DNA-Region überlappen. Es konnte wiederum keine Kreuzhybridisierung unter Verwendung der beiden phytasespezifischen Serien (Sonde 1024 und 1068) demonstriert werden, was darauf hinweist, daß, obgleich die beiden verwendeten Sondon zur Isolierung der beiden Clonserien aus der N-terminalen Aminosäuresequenz des Proteins gewonnen wurden, unterschiedliche genomische DNA-Fragmente identifiziert und cloniert wurden. Alle drei Clonserien wurden hybridisiert mit Nothern Blots, die die aus induziertem und nichtinduziertem Myzel (Beispiel 6) isolierte mRNA enthielt. Die sauren phosphatasespezifischein Clone wie auch die isolierten inneren 3,1 kb Sall-rragmente aus diesen Clonen hybridisierten ausschließlich zu Induzierten mRNA-Proben. Die durch die sauren phosphatasespezifischen Sonden identifizierte mRNA hat etwa eine Länge von 1800b, was mit betonten Pioteingrößen (68kDa, Ullah und Cummins (19871 Prep. Biochem. 17,397-422) übereinstimmt. Es konnte keine Hybridisierung der phytasespezifischen Clone mit spezifischen mRNA bewiesen werden. Wir schlußfolgerten infolgedessen, daß die obenbaschriebene Methode bei der Clonierung des für Phytase codierenden Gens nicht erforderlich war. Es kann weiterhin geschlußfolgert werden, daß dieser Fehlschlag nicht auf ein Versagen der verwendeten Methode beruht, da diese Methode erfolgreich zur Identifizierung der gencodiorendon sauren Phosphatase angewandt wurde. Der das saure Phosphatasegen enthaltende Lambda-Clon wurde am 24. April, 1989 beim Cetraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer CBS 214.89. Ein 10kb BamHI-Fragment wurde aus Phage Z1 isoliert und in pUC 19 subcloniert. Dieser Subclon enthält das gesamte für saure Phosphatase codierende Gen. Dieser Subclon, pAF1-1 (Figur 5) wurde am 24. April 1989 als CBS 213.89 hinterlegt.
Beispiels
Isolierung des für Phytase codierendons Qens unter Verwendung eines zweiten Satzes von Ollgonucleotldsonden Die Sonden wurden unter Verwendung der N-terminalen Aminosäuresequenz von CNBr-erzeugten Fragmenten (Figur 2 B, Sonde 1295,1296 und 1297) konstruiert und mit gonomischer DNA wie zuvor beschrieben hybridisiert. Die Möglichkeit, diese Sonden bei der Isolierung des für Phytase codierenden Gens zu verwenden, wurde wieder mit Hilfe der Southern Hybridisierung von genomischen Blots mit den Sonden untersucht. Dieses Mal konnten die hybridisierenden Fragmente von entsprechender Länge unter Verwendung der drei Sonden identifiziert warden, trotz der Tatsache, daß die Sonden von nichtüberlappenden Regionen abgeleitet wurden. Es wurde keine Hybridisierung zwischen dem neuen Sondensatz und den unter Verwendung des ersten Sondensatzes isolierten Clonen festgestellt (Beispiel 4). Aus diesem Grunde wurde die genomische DNA-Bank unter Verwendung der drei Sonden in getrennten Versuchen erneut gescreent. Ein Untersatz der Clo.io (Lambda AF201,219,241 und 243), der mit jeder individuellen Sonde isoliert und auch mit den beiden anderen Sonden hybridisiert wurde, zeigt, daß, in diesem Falle unter Verwendung d <r drei unterschiedlichen Sonden, die Clone eus einem einzigen genomischen Bereich isoliert wurden. Es wurden Versuche unternommen, die neu isolierten Clone mit Sonde 1024 und 1068 zu hybridisieren. In beiden Fällen konnte keine Hybridisierung mit den neu isolierten Clonen unter Bedingungen festgestellt werden, bei denen beide Sonden erfolgreich zu den Clonen hybridisierten, die unter Verwendung dieser Sonden(siehe Beispiel 4) isoliert wurden. Dieses stellt klar, daß die neu isolierten Clone keine Homologie mit den von dem N-Terminus der gereinigten Phytase abgeleiteten Sonden aufweisen. Ein Lambda EMBL3-Clon, der alle drei Sonden (1295 bis 1297) hybridisiert, wurde Lambda AF201 (Figur 4) genannt und am 9.März 1989 als CBS 155.89 hinterlegt.
Ein 5,1 kb Ba.nHI-Fragment von Lambda AF 201 (subcloniert in pUC 19 und als pAF2-3 bezeichnet, siehe Figur 4), das zu allen drei Oligonucleotidsonden hybridisierte, wurde zum Sondieren eines Nothern Blot verwendet. In diesem Falle wurde eine diskrete mRNA mit einer Größe von 1800 Basen identifiziert. Diese mRNA wurde nur in induziertem Myzel gefunden. Ähnliche Ergebnisse erhielt man, wenn Oligonucleotide als Sonden verwendet wurden. Daher wurdo unter Verwendung des neuen Sondenansatzes ein gemeinsames DNA-Fragment identifiziert, das speziell zu einer induzierten mRNA hybridisiert. Die Länge dieser mRNA (1800b) reicht aus, um für ein Protein von etwa 6OkDa zu codieren, was etwa der Größe des nichtglycolysierten Proteins entspricht. Selbstverständlich enthalten die isolieren Fragmente mindestens einen Teil des für Phytase codierenden Gens.
Beispiel 6 Isolierung von „Induzierter" und „nlchtinduzierter" mRNA Aus der Literatur ist bekannt, daß die Synthese von Phytase durch A.ficuum Gegenstand einer strengen phosphatabhängigen Regulation (Han und Callagher [1937] J.lndust. Microbiol. 1,295-301) ist. Daher kann die Demonstration, daß ein isoliertes Gen Gegenstand einer ähnlichen Regulation sein kann, dem Beweis Nachdruck verleihen, daß das Gen von Interesse cloniert wurde. Zur Isolierung der sowohl unter produzierenden als auch unter nichtproduzierenden Bedingungen synthetisierten mRNA wurde A.ficuum NRRL3135 wie folgt vermehrt. Die Sporen wurden zuerst über Nacht in einem nichtinduzierenden Medium vermehrt. Am nächsten Tag wurde das Myzel geerntet, mit sterilem Wasser gewaschen und entweder in induzierendes oder
lichtinduzierendes Medium eingeimpft.
Das verwendete Medium enthält (pro Liter): 20g Maisstärke; 7,5g Glucose; 0,5g MgSO4 · 7H2O; 0,2g FeSO4 · 7H2O und 7,2g KNO3. Für die Induktion von Phyiase wurden bis zu 2g/l Maisquellwasser zum Medium zugesetzt, während das
nichtinduzierende Modium 2g/l K2HPO4 enthält. Das Myzel ließ man mindestens weitere 100 Stunden wachsen. Die Proben wurden in ausgewählten Intervallen entnommen. Die Phytaseproduktion wurde wie durch den in Beispiel 2A beschriebenen Phytaseassay durchgeführt. Denatuierte mRNA wurde durch Elektrophorese separiert und auf Genescreen plus geblottert. Die Blots wurden mit "p-markiertem ρAF2-3 oder mit dem isolierten 3,1 kb SaI I-Fragment aus pAF 1-1 (saure Phosphatase) von Beispiel 4 isoliert. Die Ergebnisse worden in Tabelle 2 dargestellt.
Positive Hybridisierung des phytasespezlfischen 6,1 kb BamHI-Fragments und des saure phosphatasespezifischen 3,1 kb SaII-Fragmants mit isolierter mRNA wird nur beobachtet, wenn die Zellen unter Uedingungen vermehrt wurden, die bekannt dafür sind, die Synthese von Phytase und sauren Phusphatasen zu induzieren. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlußfolgert, daß die isolierten Gene wie erwartet für Phytase und saure Phosphatasen reguliert werden.
Tabelle 2
Hybridisierung von Nothern Blots unter Verwendung des phytasespezifischen 5,1 kb BamHI-Fragments (A) oder des sauren Phosphatase-spezif ischen 3,1 kb Salt-Fragments (B) als Sonde; a + weist auf die Anwesenheit von 1800 b Phytase-mRNA oder 1800b saure Phosphatase-mRNA hin. Die relative Phytaseaktivität wurde für 24-h-Proben ermittelt:
Induzierte Kulturen weisen 10mal mehr Phytaseaktivität auf als nichtinduzierte Kulturen.
Zeit nach dem Induziert Nichtinduziert
Beimpfen
A 24 Stunden + -
B 24 Stunden +
Beispiel 7
Beweis für das Clonleren de* Phytasegens
Für den Erhalt eines definierten Beweises für die erfolgreiche Isolierung des für Phytase codierenden Gens und für die Untersuchung der Möglichkeit, die Expression des clonierten Gens zu erhöhen, wurde das Phytasegen in einen geeigneten Vektor subcloniert und zu A. nlger 402 (ATCC 9092) transformiert. Bis dahin wurde des Phytasegen aus dem Lambda Clon AF 201 als ein 10kb Nrul-Fragment isoliert und in die Stul-Stelle des Vektors pAN 8-1 (Mattern, I.E., und Punt, P.J., (1988) Fungal Genetics Newsletter 35,25) cloniert, die das ble-Gen (verleiht Resistenz gegenüber Phleomycin) als Selektionsmarker enthält. Das resultierende Konstrukt wurde mit pAF 28-1 (Figur 4) bezeichnet entsprechend dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren zu A. nlger transformiert, mit der Ausnahme, daß die Protoplasten auf Asperglllus-Mlnimalmedium plattiert wurden, das mit 30pg Phleomycin/ml ergänzt und mit 0,75% Agar verfestigt wurde. Einzelne Transformanten wurden geroinigt und isoliert und wurden wio in den Beispielen 1 und 2 beschrieben für die Produktion in Schüttelgefäßen getestet. Als Kontrollen wurden Transformanten mit nur einem Vektor wie auch die nichttransformierten Wirte geprüft (Tabelle 3). Es stellte sich heraus, daß nur A. nlger 402 mit pAF 28-1 eine Phytase zu produzieren schien, die mit einem gegen A.ficuum-Phytase gerichteten spezifischen monoclonalen Antikörper reagiert. Die mit diesem monoclonalen Antikörper reagierende Phytase konnte aus einer Immunoaffinitätssäule bei pH 2,5 eluciert werden, und es zeigte sich, daß relative Molekülmasse, Glycolysierungsgrad, isoelektrischer Punkt und spezifische Aktivität mit denen von A.ficuum-Phytase identisch sind. Diese Erkenntnisse stellen den klaren Beweis dar, daß A.niger 402-Zellen, die mit pAF 28-1 transformiert wurden, eine Phytase exprimieren, die tatsächlich mit A.ficuum-Phytase identisch ist. Eine ähnliche Expression wurde in keinem Typ der Kotrollzelten beobachtet.
Tabelle 3
Stamm Phytase/AktivitätU/ml % Phytaseaktivität
auf der Immunoaffinitätssäule adsorbiert
A.niger402 0,5 0 ,
A.niger402pAF28-1 0,7 10"
A. nlger pAN 8-1 05 0
Die Stämme wurden unter induzierten Bedingungen (Beispiel έ>) vermehrt. Die Proben wurden nach 96 Stunden Vermehrung genommen.
Beispiel 8
Charakterisierung des Phytasegens
Die das Phytasegen enthaltenden Lambda-Clone wurden durch Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen analysiert.
Eine Karte der genomischen Region, die das Phytasegen umfaßt, wird in Figur 4 dargestellt. Die definierten Resiriktionsfragmente wurden im Clonvektor pUC 19 wie in Figur 4 dargestellt subcloniert.
Es wurde bereits zuvor gezeigt (Beispiel 5), daß das 5,1 kb BamHI-Fragment in pAF 2-3 anwesende Fragmente, mindestens einen Teil des Phytasegens umfaßt. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß die Oligonucleotidsonden 1295 und 1297 (Figur 2B) das Sall-Insert aus pAF 2-7 (Positionen von pAF 2-Cionen werden in Figur 4 dargestellt) hybridisieren, während Sonde 1296 wahrscheinlich die Salt-Stelle zwischen den Fragmenten in pAF 2-6 und pAF 2-7 überspannt. Die Ergebnisse von diesen Versuchen zeigen, daß die für Phytase codierende Sequenz im linksseitigen Teil des BamHI-lnserts von pAF 2-3 liegt.
Anschließend wurden die Mucleotidsequenzen der Inserts der Plasmide pÄF 2-3, pAF 2-6 und pAF 2-7 unter Verwendung des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., [19771 Proc. Natl.Acad. Sei. USA 74,5463-5467) und der Shot-gun-Strategien, wie von Messingetal. (1981, Nucl.AcidsRes.9,309-321) beschrieben, vollständig ermittelt. Zusätzlich wurden spezifische Oligonucleotide synthetisiert, die auf der während des Sequenzierungsverfahrens erhaltenen Nucleotidsequenzinformation beruhen.
Die vollständige Nucleotidsequenzen der Clone pAF 2-3, pAF 2-6 und pAF 2-7, die den chromosomalen Phytasegenlocus umfassen, wird in Figur 6 zusammengefaßt. Eine grafische Darstellung wird in Figur 7 gezeigt.
Die Analyse der Protein codierenden Kapazität der vollständigen Sequenz ergab, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des
maturen Proteins beginnend bei der Nucleotidposition 381 codiert wurde. ( >r von Ullah offenbarte N-Terminus liegt beiPosition 369.)
Darüber hinaus wurde festgestellt, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des 36kDa inneren Peptidfragments (siehe Figur 1B- Sequenzen B und A) an den Nucleotidpositionen 1101 beziehungsweise 154*8 codiert ist. Das offene Leserraster endet
an Nucleotidpcsition 1713.
Die Feststellungen beweisen eindeutig die Identität des charakterisierten chromosomalen Locus als den Ort, der die für die Phytase codierende DNA-Sequenz enthält. Direkt stromaufwärts von der für das mature Phytaseproteln codierenden chromosomalen Sequenz konnte innerhalb des Leserrasters, das an das offene Leserraster des maturen Proteins angrenzt, kein ATG-Starlcodon gefunden werden; jedoch bei Anwendung der Intron-Exon-Grenzcharakteristika kann zwischen den Nucleotidpositionen 254 und 355 ein Intron postuliert
werden, das das ATG-Condon bei Nucleotidposition 210 mit dem für die mature Phytase codierenden offenen Leserraster in das
Raster bringt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieser N-terminalen Extension paßt genau zu den Vorschriften füi eine Sekretionssignalsequenz, wie sie von Von Heyne (1983, Eur. J. Blochem. 133,17-21) veröffentlicht wurde. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde die Phytase-cDNA durch PCR-Amplifikation mit spezifischen Phytasestartern und eine
gesamte mRNA/cDNA-Population als Matrize entsprechend den obenbeschriebenen Verfahren isoliert.
Isolierung von Poly A+-RNA von Asperglllus flcuum Die gesamte RNA wurde aus unter induzierten Bedingungen vermehrtem A.f lcuum wie in Beispiel 6 erwähnt isoliert. Trockenes Myzel wurde mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren und gemahlen. Anschließend wurde das Pulver in 3 M LiCI, 6M Harnstoff bei O0C in einem Ultra-Turrax (volle Geschwindigkeit innerhalb einer Minute) homogenisiort und über Nacht bei 4°C wie von Auffrey & Rougeon (Eur. J. Biochem., 107,303-314,1980) beschrieben aufrechtgehalten. Die gesamte zelluläre RNA wurde nach Zentrifugieren bei 16000g für 30 Minuten und zwei nachfolgenden Extraktionen mit PhenohChloroformilsoamylalcohol (50:48:2)
erhalten. Die RNA wurde mit Ethanol ausgefällt und in 1 ml 10mM Tris-HCI (pH 7,4), 0,5% SDS gelöst. Für die Poly A+-Selektionwurde die gesamte RNA-Probe 5 Minuten bei 60°C erwärmt, auf 0,5 M NaCi eingestellt und anschließend auf eine Oligo(dT)-
Cellulosesäule aufgebracht. Nach mehreren Waschungen mit einer Lösung, die 1OmM Tris-HCI, pH 7,4,0,5% SDS und 0,1 M NaCI enthielt, wurde die PoIyA+-RNA durch Eluieren mit 1OmM Tris-HCI, pH 7,4, und 0,5% SDS gesammelt. Herstellung des mRNA/cDNA-Komplexds Für die Synthese des ersten cDNA-Stranges wurden 5μ9 Poly A+-RNA in 16,5μΙ H2O gelöst, und es wurden die folgenden Bestandteile zugegeben: 2,5μΙ RNasin (30υ/μΙ); 10μΙ eines Puffers, der 5OmM Tris-HCI, pH 7,6,6mM MgCI2 und 4OmM KCI
enthielt; 2μ11M KCI; 5μΙ 0,1 M DTT; 0,5μΙ Oligo (dt),2-,8 (2,5mg/ml); 5μΙ BSA (1 mg/ml) und 2,5μΙ Moloney-MLV-
Umkehrtranskriptase (200 U/ml). Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 370C inkubiert, und die Reaktion wurde durch die Zugabe
von 10μΙ0,2Μ EDTA und 50 μΙ H2O beendet. Es wurde eine Extraktion mit Chloroform durchgeführt, und nach Zentrifugierenwurden nacheinander 110μΙ 5M NH4Ac und 440μΙ Ethanol zu der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt. Die Ausfällung des *mRNA/cDNA-Komplexes wurde in einer trocknen Eis/Ethanol-Lösung über einen Zeitraum von 30 Minuten durchgeführt. DiemRNA/cDNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, anschließend mit 70%igem eiskaltem Ethanol gewaschen und in 20 μΙ H2Ogelöst.
Cionieren von Phytase-cDNA-Frngmenten Isolierung von cDNA-codierenden Phytasesequenzen wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in zwei Fragmenten
durchgeführt. Vier synthetische Oligonucleotid-Starter wurden auf der Grundlage der in Figur 6 dargestellten genomischen
Phytasesequenz konstruiert. Oligo 1: S'-GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA-S' Oligo 2: S'-AGT.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TCG-S' Oligo 3: Ö'-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC-S' Oligo 4: Ö'-AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.GTT.TAA.AGG.G-S' Oligo 1 enthält die Nucleotidsequenz stromabwärts vom Phytase-ATG-Startcodon (Position 210 bis 231), das an der 5'-Grenze
durcl· eine EcorRI-Stelle flankiert wird; Oligo 2 enthält die Nucleotidsequenz unmittelbar stromaufwärts von der Sall-Stelle(Position 1129 jis 1109), die ebenfalls von einer zusätzlichen EcoRI-Stelle flankiert wird; Oligo 3 enthält die um die BamHI-Stelle(Position 845 bis 865) liegende Nucleotidsequenz und Oligo 4 enthält eine Nucleotidsequenz, die stromabwärts vom
Phytasestopcondon (Position 1890 bis 1867) liegt und von einer zusätzlichen Pstl-Stelle flankiert wird. Die Polymerasekettonreaktionen wurden entsprechend dem Hersteller von Taq-Polymerase (Cetus) durchgeführt. Als Matrize
wirde die mRNA/cDNA-Hybriden (wi3 obenbeschrieben) enthaltende Lösung (1,5 μΙ) verwendet, und als Primers wurden 0,3 μς,von jeder der Oligos 1 und 2 bei der Reaktion zur Amplifikation des N-terminalen Phytas'e-cDNA-Teils und die Otigos 3 und 4 beider Reaktion zur Amplifikation des C-terminalen Phytase-cDNA-Teils (siehe Figur 8) verwendet. Nach der Denaturierung(7 Minuten bei 1000C) und Zugabe von 1U Taq-Polymerase wurde das Reaktionsgemisch 25 Amplifikationszyklen (jeder: 2' bei550C, 3' bei 72°C, 1' bei 940C) in einem DNA-Amplifikationsgerät von Perkin-Elmer/Cetus ausgesetzt. Beim letzten Zyklus wurdedie Denaturierungsstufe ausgelassen. Nach dem Digerieren (EcoRI für den N-terminalen cDNA-Teil und BamHI und Pstl für den
C-terminalen cDNA-Teil) wurden beide cDNA-Fragr, iente in die geeigneten Sequenzen von pTZ 18R (Promega) cloniert. Die Nucleotidsequenz von beiden gewonnenen PCR-Fragmenten wurde unter Verwendung des Didesoxy- Kettenabbruchverfahrens (Sanger, siehe oben) mil Hilfe von synthetischen Oligonucleotiden, die nach der chromosomalen Phytasegensequenz konstruiert wurden, als Starter und vollständig amplifizierte DNA wie auch clonierte cDNA-Fragmente als Matrize ermittelt. Die Sequenz der für das Phytaseprotein codierenden cDNA-Region und die abgeleitete Aminosäuresequenz
des Phytaseprotein werden in Figur 8 dargestellt.
Die cDNA-Sequenz bestätigte die Lokalis'arung des zuvor postulierten Introns und zeigte, daß keine anderen Introne in der
chromosomalen Gen jequenz vorhanden sind.
Das Phytasegen codiert für ein primäres Translationsprodukt von 467 Aminosäuren (MW 51091); Processing des primären Translationsproduktes durch Abschneiden des Signalpeptids resultiert in ein matures Phytaseprotein von 444- (MW 48851) oder
448- (enthält wie von Ullah veröffentlicht die ersten vier N-terminalen Aminosäuren, MW 49232)-Aminosäuren.
Beispiel 9 Überexpression von Phytase In Asporgllll durch Einführung von zusatzlichen Phytase -genomischen DNA-Kopien Konstr jktionsexpresslonsvektor pAF 2-2S Alle Konstrukte wurden unter Verwendung von standardmolekularbiologischen Verfahren wie von Maniatis et al. beschrieben,
(19813) Molecular cloning, ein Laborhandbuch, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Es wurde ein Expressionsvektor pAF 2-2S durch Subclonieren des 6kb Pvull DNA-Fragments des Phytase -genomischen Clons Lambda AF201 in die Smal-Stelle von pUC 19 hergestellt. Das abgeleitete Plasmid wurde als pAF 2-2 bezeichnet (Figur 4). Als Selektionsmarker für die Transformation zu Aspergillus wurde das EcoRI/Kpnl-DNA-Fragment von Plasmid pGW325 (Wernars, K., [1986], Dissertation, Landwirtschaftliche Universität, Wageningen, Niederlande), das das homologe Aspergillus nldulans-
amdS-Gen enthielt, in die EcoRI/Kpnl-Stellen von pAF 2-2 inseriert. Der resultierende Expressionsvektor wurde als pAF 2-2 Sbezeichnet und wird in Figur 9 gezeigt.
A. Überexpression von Phytase In A.ficuum NRRL 3135. Das Plasmid pAF2-2S wurde in A. f!cuumNRRL3135 unter Verwendung der durch Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26,205-221 und Kelly, J., & Hynes, M., (1985) EMBO J., 4,475-479 beschriebenen ' .ansformationsverfahren mit den folgenden Modifikationen
eingefügt:
- Das Myzel wurde auf einem Asperglllus-Minimalmedium (Cove, D. [1966] Biochem. Biophys. Acta, 113,51-56), das mit 1OmM Arginin und 1OmM Prolin ergänzt wurde, 16 Stunden bei 3O0C in einem Drehschüttelapparat bei 300U/min vermehrt.
- Ec wurde nur Novozym 234 (NOVO Industri) und keine Helikase für die Bildung von Protoplasten verwendet.
- Nach 90m!nütiger Protoplastenbildung wurde 1 Volumen STC-Puffer (1,2M Sorbit, 1OmM Tris-HCI, pH7,5,5OmM CaCI2) zur Protoplastensuspension zugesetzt und 10 Minuten bei 2 500g bei 4°C in einem Schwingbecher-Rotor zentrifugiert. Die Protoplasten wurden gewaschen und in STC-Puffer bei einer Konzentration von 108 Zellen/ml erneut suspendiert.
- Plasmid-DNA wurde in einem Volumen von 10μί in TE-Puffer (1OmM Tris-HCI, pH7,5,0,1 mM EDTA) zu 100μΙ Protoplastsuspension zugesetzt.
- Nach Inkubieren der DNA-Protoplastsuspension bei 0°C über einen Zeitraum von 25 Minuten, wurden 200μΙ PEG-Lösung tropfenweise (25% PEG 4000 [Marck], 1OmM Tris-HCI, ρ H 7,5,5OmM CaCI2)zugegeben. Anschließend wurde 1 ml PEG-Lösung (60% PEG 4000 in 1OmM Tris-HCI, pH 7,5,5OmM CaCI2) langsam zugegeben, wobei wiederholtes Mischen der Röhrchen erfolgte. Nach dem Inkubieren bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen mit STC-Puffer verdünnt, durch Inversion gemischt und bei 2000g bei 4°C 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Protoplasten wurden erneut behutsam in 200 μΙ STC-Puffer suspendiert und auf Asperglllus-Minimalmedium mit 1OmM Acetamid als einzige Stickstoffquelle, 15mMCsCI, 1 M Saccharose, verfestigt mit 0,75%igem bakteriologischen Agar # 1 (Oxoid), plattiert. Die Vermehrung wurde bei 330C über einen Zeitraum von 6 bis 10 Tagen durchgeführt.
Einzelne Transformanten, die die Bezeichnung SP4, SP7, SP8 trugen, wurden unter Verwendung des in den Beispielen 1 und 2
beschriebenen Verfahrens für die Phytaseproduktion in Schüttelgefäßen isoliert, gereinigt und getestet. Als Kontrolle wurden
Transformanten mit nur einem Vektor (amdS-Gen in pUC 19) wie auch die nichttransformierten Wirte getestet. Die Stämme wurden unter induzierten Bedingungen (siehe Beispiel 6) vermehrt, und die Proben wurden nach 96 Stunden Vermehrung entnommen. Die Analysen wurden anhand der Messung der Phytaseaktivität (Tabelle 4) und isoelektrischer Fokussierungs-Polyacrylamidgelelktrophorese (IEF-PAGE) durchgeführt. Proben gleichen Volumens wurden aus Fermentationen von A.ficuum und A.ficuum pAF 2-2S SP7, die unter identischen Bedingungen vermehrt wurden, entnommen und auf ein IEF-PAGE-GeI (pH-Bereich 4,5 bis 6, Phast-System, Pharmacia)
aufgebracht. Die Elektrophorese wurde entsprechend den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Anschließend wurden die
Gele entweder mit dem herkömmlichen Proteinfärbungsmittel Coomassie Brillantblau (Figur 10B) oder mit der allgemeinen Phosphataseaktivitätsfärbung wie in Beispiel 2 (Figur 10A) beschrieben gefärbt. Des gleichen wurde ein Probe von A.ficuum-Phytase, die bis zur Homogenität (wie im Beispiel 7 beschrieben über Immunoaffinitätschromatographie) gereinigt wurde, ebenfalls entweder alleine oder mit überstehender Kultur vermischt
aufgebracht.
Phytase ist in den verschiedenen Proben in einer Anzahl von Isoformen (mit einem Sternchen gekennzeichnet), wie in dieser Erfindung bereits erwähnt wurde, vorhanden. Die beiden Hauptenzyme in der gereinigten Phytase sind in den Spuren 3 und 4
bei beiden Färbungsmethoden (A und B) deutlich sichtbar. Die Phytasebanden sind in dem A.ficuum-Elternstamm kaumsichtbar, doch signifikant verstärkt in dem pAF 2-2S7-Transformantenstamm.
Tabelle 4 Zunahme der Phytaseproduktion durch Transformation von A.ficuum NRRL 3135 Stamm Phytaseaktivität (U/ml)
A.ficuum 0,6 A.ficuum + Kontrollplasmid 0,6 A.ficuum pAF2-2SSP8 7,6 A.ficuum pAF2-2SSP7 6,7 A.ficuum pAF2-2SSP4 4^3
B. Überexpression von Phytase in A.nlger CBS 513.88 Der Expressionsvektor pAF 2-2S wurde ebenfalls in A. nlger CBS 513.88 durch Transformationsverfahren wie für A.ficuum
beschrieben eingefügt. Einzelne Transformanten wurden wie in Beispiel 6 beschrieben für die Phytaseproduktion in
Schüttelgefäßen unter induzierten Bedingungen isoliert, gereinigt und getestet. Die Phytaseexpressionsniveaus einiger Transformanten (bezeichnet als A. nlger pAF 2-2 S #8, # 20 und # 33) und Kontrollstämme wurden wie in Beispiel 9A beschrieben durchgeführt und werden in Tabelle 5 dargestellt. A.n'ger-Transformanten weisen mit A.ficuum-Transformanten vergleichbare Phytaseoxpressionsniveaus auf. Außerdem zeigt
dieses Ergebnis, daß der A.fIcuum-Phytase-Promotor in A. nlger aktiv ist.
Weitere Analysen wurden auf Kulturmedium von Transformant pAF 2-2 S # 8 durch Elektrophorese auf einem IEF-PAGE-GeI im pH-Bereich von .4,5 bis 6 auf einem Phast-System (Pharmacia) wie obenbeschrieben durchgeführt. Es wurden gleiche Volumen der Kulturüberstände vom A. nlger-Elternstamm und vom Transformant pAF 2-2 S # 8, die unter identischen Bedingungen vermehrt wurden, auf das Gel aufgebracht. Die Gele wurden separiert und anschließend wie obenerwähnt gefärbt. Oer Elternstamm A.nlger erzeugt eine sehr geringe Phytasemenge, die durch Gelelektrophorese nicht nachgewiesen werden konnte. Der Stamm pAF 2-2S #8 erzeugt ungefähr 90mal mehr Phytase, und diese Differenz ist in Figur 11 deutlich erkennbar. Mehrere Isoformen des Phytaseenzyms wurden nachgewiesen (Hinweis durch ein Sternchen). Die allgemeine Proteinfärbung zeigt, daß die Intensität der Phytaseproteinbandan dramatisch zugenommen hat, während keine anderen Hauptproteinbanden in Erscheinung treten.
Tabelle 5 Phytaseprodüktion durch Tranformation von A.niger CBS 513.88 mit pAF 2-2S Stamm Phytaseaktivität(U/ml)
A.nlger 0,2
A. niger + Kontrollplasmid 0,2
A. niger pAF 2-2 S #8 14
A. niger pAF 2-2 S #33 5
A. niger pAF 2-2 S #20 4
Beispiel 10 Phytaseexpresslon In A. niger, die mit Expressionsvektoren transformiert wurde, die das an den Promotor und/oder die Signalsequenzen des A.nlger-Amyloglucosidase (AQ)-Gens fusionierte A.ficuum-Phytasegen enthielten Konstruktionen des Expressionsvektors Zur Erzibiung der Überexpression von Phytase in f·. niger ν urden zusätzliche Expressionskassett6n, in denen das A.f lccum- Phytasegen unter Kontrolle des A. nlger-Amyloglucosidau (AG)-Promotors in Verbindung mit unterschiedlichen Signalsequenzen ist, abgeleitet. In p18FYT3 und p24FYT3 wurden die betreffenden 18- und 24-Aminosäure-(aa)-Leader- Sequenzen des AG-Gens von A. niger zum für das mature Protein codierende Phytasegenfragment fusioniert. In der Expressionskassette ρFYT3 wurde die AG-Promotorsequenz zur Phytase codierenden Sequenz einschließlich der Phytase- Leadersequenz fusioniert. Konstruktion von p18FYT3 Die Verschmelzung des AG-Promotors und der 18 aa AG-Leader-Sequenz zur für das mature Protein codierenden Phytasesequenz wurde mit Hilfe des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR) durchgeführt. Bei den PCR-Reaktionen
wurden zwei unterschiedliche Matrizen verwendet: pAF 2-2 S, die das wie obenbeschriebene gesamte Phytasegen enthielt, undpAB6-1, ein Plasmid, das den gesamten AG-Locus von A. niger enthielt, der aus der A. niger-Plasmid-Bank isoliert wurde, die 13-bis 15kb-Hind Ill-Fragmente in pUC 19 enthielt.
Für dia Isolierung wurden Ag-spezifische Oligos verwendet:
AG-1: 5'-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCc-S'
AG-2: Ö'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-S'
Beide basierten auf der für A.nlger veröffentlichten Nucleotidsequenz (Boel et al. [1984), EMBO J.3,1097-1102; Boel et al. (1984), Mol. and Cell. Biol.4,2306-2315). Die Oligonucleotidsonden wurden aus der das Intron 2 umgebenden Sequenz abgeleitet; Oligo AG-1 wird am 3' des Introns lokalisiert und hat eine Polarität, die mit der von AG-mRNA identisch ist, und Oligo-AG-2 wird
stromaufwärts von Intron 2 festgestellt und antiparallel zur AG-mRNA ausgewählt. Plasmid pAB6-1 enthält das AG-Gen aufeinem 14,5kb-HindIll-Fragment (siehe Figur 12).
Als Starter für die PCR-Amplifikationen wurden vier ynthetische Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen konstruiert: Oligo 1: 5'-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG 3l (eine Ag-spezifische Sequenz, die um die EcoRI-Stelle ungefähr 250bp
stromaufwärts des ATG-Initiierungscodons herum liegt) Oligo 18-2: S'-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-S'
Reife Phytase« 18AA-AG-Leader Oligo 18-3: ö'-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-S'
18 aa AG-Leader <-> Reife Phytase Oligo 4: ö'-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-S' (eine phytasespezifische Sequenz, die an der BamHi-Stelle auf
Position 861 lierjt.)
Das PCR wurde wie von Saiki et al. in (1988), Science 239,487-491, beschrieben mit geringfügigen Modifikationen (siehe Beispiel 8) durchgeführt.
Zur Verschmelzung der AG-Sequenzen zu den Phytase codierenden Sequenzen wurden zwei getrennte Polymerase-Ketten-Reaktionsverfahren durchgeführt: Die erste Reaktion mit ρ AB 6-1 als Matrize und den Oligos 1 und 18-2 als Starter zur Amplifikation eines 300bp DNA-Fragments, das den 3'-Teil des AG-Promotors und die 18aa AG-Leadersequenz, die an der 3'-Grenze durch die Nucleotide des Phytasegens flankiert wird, enthält, und die zweite Reaktion mit pAF 2-2 S als Matrize und den Oligos 18-3 und 4 als Starter zur Amplifikation eines 600 bp DNA-Fragments, das den 5'-Teil des Phytasegens enthält, das an der 5'-Grenze durch 18 Nucleotide des AG-Signalpeptids flankiert wird. Eine schematische Ansicht dieser Amplifikationen wird in Figur 13 dargestellt. .
Die beiden erzeugten DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese und Ethanolpräzititation gereinigt und als Matrizen bei dem dritten PCR mit den Oligos 1 und4 als Starter zur Erzeugung der AG-Phytase-Verschmelzung verwendet. Die gewonnenen DNA-Fragmente wurden mit EcoR 1 und BamHI digeriert und in pTZ 18 R subcloniert. Die entstandene Fusion wurde sequenziert und mit p18FYT1 bezeichnet.
Der verbleibende (3,5kb) Stromaufwärtsbereich des AG-Promotors wurde durch Digerieren von ρ AB 6-1 mit Kpn 1 und teilweise mit EcoRI gewonnen und mit dem 1,1 kb-EcoRI/BamHI-Fragment von p18FYT1 ligiert und anschließend in die Kpn1/BamHI-Stellen von pZT 18R cloniert. Das so gewonnene Plasmid ρ 18FYT2 wird in Figur 15 dargestellt. Durch Inserieren des synthetischen Fragments wurde eine zusätzliche Hindlll-Restriktionsstelle
5'AATTCAAGCTTG 3'
3' GTTCGAACTTAA 5'
in die EcoRI-Stelle (die das amdS-Gen flankiert) von pAF 2-2 S eingefügt. Das gewonnene Plasmid wurde mit pAF 2-2 SH (Figur 14) bezeichnet und wurde als Starterplasmid verwendet, um die Phytasepromotorsequenzen durch die PCR-AG-Phytase-Fusion-DNA-Fragmente auszutauschen.
Für die endgültige Konstruktion wurden p18FYT2 und pAF2-2SH mit Kpnl und teilweise mit BamHI digeriert. Das 4,6kb DNA-Fragment von ρ 18FYT2 und das 11 kb DNA-Fragment von pAF2-2 SH wurden isoliert und durch Gelelektrophorese gereinigt, anschließend ligiert und zu E. coil transferiert. Die abgeleitete Expressionskassette wurde mit ρ 18FYT3 (Figur 15) bezeichnet. Konstruktion von p24FYT3
Die Verschmelzung des AG-Promotors und der 24 aa AG-Leadersequenz zur mature Phytase codierenden Sequenz wurde durch PCR-Amplifikation wie oben für die Konstruktion von ρ 18FYT3 beschrieben mit Ausnahme der verwendeten Starter durchgeführt. Es wurden zwei neue Starter mit der folgenden Sequenz synthetisiert: Oligo24-2: 5'-CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATt-S'
Mature Phytase <-> 24 AA AG-Leader Oligo24-3: ö'-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-S'
24aa AG-Leader «-> Mature Phytase
Es wurden zwei unabhängige PCR durchgeführt: Die erste Reaktion mit pAB 6-1 als Matrize und den Oligos 1 und 24-2 als Starter zur Amplification eines 318 bp DNA-Fragments, das den 3'-Teil des AG-Promotors und die 24 aa AG-Leedersequenz, die an der 3'-Grenze durch 18 Nucleotide des Phytasegens flankiert wird, enthält, und die zweite Reaktion mit pAF 2-2 S als Matrize und den Oligos 24-3 und 4 als Starter zur Amplifikation eines DNA-Fragments, das den 5'-Teil des Phytasegens enthält, das an der 5'-Grenze durch 18 Nucleotide des 24 aa AG-Leaders flankiert wird. Eine schematische Ansicht dieser Amplifikationen wird in Figur 13 dargestellt.
Für die Konstruktion der endgültigen Expressionskassette ρ24FYT3 über die intermediären Plasmide p24FYT1 und ρ24FYT2 wurde der wie für ρ 18FYT1 und ρ 18FYT2 zur Ableitung der Expressionskassetto ρ 18FYT3 (Figur 15) beschriebene Clonierungsweg/-verfahren angewendet
Konstruktion von pFYT3
Die Verschmelzung des AG-Promotors mit der Phytasegen-(einschließlich der Phytase-Leader-) sequenz wurde wie oben für die Konstruktion von ρ 18FYT3 beschrieben durch PCR-Amplifikation mit Ausnahme der verwendeten Starter durchgeführt. Zwei zusätzliche Starter wurden mit der folgenden Sequenz erzeugt: Oligofyt-2: 5'-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATCs
Phytase-Leader«-»AG-Promotor Oligo fyt-3: B'-CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-S'
AG-Promotor «-> Phytase-Leader
Es wurden zwei getrennte PCRd rchgeführt: Die erste Reaktion mit pAB 6-1 als Matrize und den Oligos 1 und fyt-2 als Starter zur Amplifikation eines 282 bp DNA -igments, das den 3'-Teil des AG-Promotors enthält, der an der 3'-Grenze durch 18 Nucleotide des Phytasegens I!; iert wird, und die zweite Reaktion mit pAF 2-2S als Matrize und den Oligos fyt-3 und 4 als Starter zur Amplifikation eines DNA-Fragments, das den 5'-Teil des Phytasegens (einschließlich des Phytase-Leaders) enthält und das an der δ'-Grenze durch 18 Nucleotide des AG-Promotors flankiert wird. Eine schematische Ansicht dieser Amplifikationen wird in Figur 13 dargestellt.
Für die Konstruktion der endgültigen Expressionskassette ρFYT3 entlang der intermediären Plasmide ρFYT1 und ρFYT2 wurde der wie für ρ 18FYT1 und ρ 18FYT 2 zur Ableitung der Expressionskassette ρ 18FYT3 (Figur 15) beschriebene Clonierungsweg/-verfahren angewendet. . '
Expression des Phytaseyens unter Kontrolle des AG-Promotors In A. niger
E. coll-Sequenzen wurden aus den obenbeschriebenen Expressionskassetten durch Hindlll-Digerieren entfernt. Anschließend wurde der A.niger-Stamm CBS 513.88 (am 10. Oktober 1988 hinterlegt) mit 10pg DNA-Fragment durch wie in Beispiel 9 beschriebene Verfahren transformiert. Einzelne A. niger-Transformanten aus jeder Expressionskassette wurden isoliert und die Sporen wurden auf selektive Acetamid-Agar-Platten aufgestrichen. Die Sporen eines jeden Transformanten wurden aus Zellen gesammelt, die 3 Tage bei 370C auf 0,4%iger Kartoffeldextrose (Oxoid, England)-Agarplatten vermehrt wurden. Die Phytaseproduktion wurde in Schüttelgefäßen unter den folgenden Bedingungen geprüft:
Ungefähr 1 x 108 Sporen wurden in 100ml Vorkulturmedium eingeimpft, das pro Liter enthielt: 1 g KH2PO4; 30g Maltose; 5g Hefeextrakt; 10g Caseinhydrolysat; 0,5g MgSO4 · 7H2O und 3g Tween 80. Der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt. Nach dem Vermehren über Nacht bei 340C in einem Rotationsschüttelapparat wurden 1 ml der vermehrten Kultur in 100ml Hauptkultur eingeimpft, die pro Liter enthielt: 2g KH2PO4; 70g Maltosedextrin (Maldex MDO3, Amylum); 12,5g Hefeextrakt; 25g Caseinhydrolysat; 2g K2SO4; 0,5g MgSO4 · 7H2O; 0,03g ZnCI2; 0,02g CaCI2; 0,05g MnSO4 · 4H2O und FeSO4. Der pH-Wert wurde auf 5,6 eingestellt.
Das Myzel wurde über einen Zeitraum von mindestens 140 Stunden vermehrt. Die Phytaseproduktion wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen. Die Produktionsergebnisse von mehreren, zufälligen Transformanten, die aus jeder Expressionskassette gewonnen wurden, werden in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Phytaseproduktion von mehreren A.nlger CBS 513.88-Stämmen, die mit Plasmiden transformiert wurden, die A.flcuum- Phytasegen unter Kontrolle des A.nlger-AG-Promotors in Verbindung mit verschiedenen Leadersequenzen enthielten. ExprossionskasseUe Transformat Phytaseaktivität(U/ml)
P18FYT3 p18FYT3#240 82
(AG-Promotor/ p18FYT3 4*242 84
18aaAG-Leader) p18FYT3tt243 62
p18FYT3tt244 43
p18FYT3#245 80
p18FYT3#246 82
p18FYT3#250 110
P24FYT3 p24FYT3#256 8
(AG-Promotor/ p24FYT3 # 257 30
24 aa AG-Leader) p24FYT3#258 13
P24FYT3 # 259 33
p24FYT3tt260 17
p24FYT3#261 28
p24FYT3#262 18 P24FYT3 # 265 12
pFYT3 pFYT3 # 205 50
(AG-Promotor/ pFYT3 tt 282 280
Phytase Leader) pFYT3 # 299 96
pFYT3 # 302 220
pFYT3 # 303 175
pFYT3#304 150
pFYT3#305 150 pFYT3#312 140
Die Daten zeigen deutlich die hohen Phytaseexpressionsniveaus in A.nlgor-Transformanten, die das Phytasegen unter der Kontrolle des A. nlger AG-Promotors enthielten. Die Werte zeigen auch, daß die höchste Phytaseproduktion mit dem pFYT3-Expressionsvektor erzielt wurde, der die Phytase-Leader-Sequenz enthielt. Ähnliche Expressionsvektoren, die ein intronfreies Phytasegen nach Transformation zu A. niger enthielten, ergeben Phytaseexpressionsniveaus, die mit denen von pFYT3-Transformanten von A. niger vergleichbar waren.
Darüber hinaus wurde Elektrophorese auf einem IEF-PAGE-GeI im pH-Bereich von 4,5 bis 6 auf Kulturüberständen der Transformanten ρFYT3 # 205 und # 282 durchgeführt. Gleiche Volumen der Kulturüberstände des A. nlger-Elternstamms und der beiden Transformanten, die unter identischen Bedingungen vermehrt wurden, wurden auf das Gel aufgebracht, separiert, und anschließend wie in Beispiel 9 beschrieben, gefärbt. Der Elternstamm A. produzierte eine sehr geringe Phytasemenge, die in diesem Versuch nicht nachgewiesen werden konnte. Die Stämme pFYT3 # 205 und # 283 erzeugten ungefähr 250- bis 1400mal mehr Phytase (vergleiche Phytasemengen in Tabelle 4 und 5), und dieser Unterschied ist in Figur 11 deutlich erkennbar. Mehrere Isoformen des Phytasenzyms wurdon nachgewiesen (Kennzeichnung durch ein Sternchen). Die allgemeine Proteinfärbung zeigte, daß die Intensität der Phytaseproteinbanden dramatisch zugenommen hatte, während keine anderen Hacptproteinbanden in Erscheinung traten.
Beispiel 11 Überexpression von Phytase in A.ficuum und A. niger, die In industriellem Maßstabe vermehrt wurden
A. A.ficuum
Die Stämme A.ficuum pAF 2-2S # 4 und A.ficuum NRRL 3135 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt. Der Tranformant
produzierte ungefähr 50mal mehr Phytase als vergleichsweise der Wildtyp-Stamm.
Tabelle 7 Überexpression von Phytase durch einen Transformanten von A.ficuum, der multiple Phytasegene enthielt. Die Zellen wurden
wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt.
Stundennach Phytaseaktivität (Z/ml Fermentationsdem Beimpfen A.ficuum NRKL 3135 brühe) A.ficuum pAF2-2S#4
0 0 0
24 0 0
92 2 142
141 5 270
B. A.niger
Der Stamm A. niger pAF 2-2S # 8, einTransformat vom A.niger-Stamm CBS 513.88 und der A. niger-Elternstamm selbst wurden wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt. Der Transformant produzierte ungefähr 10OOmal mehr Phytase als vergleichsweise der Ursprüngliche A.niger-Elternstamm (Tabelle 8).
Tabelle 8
Überexpression von Phytase durch einen Transformnnten von A.nlger (CBS 513.88), der multiple Phytasegene enthielt. Die
Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt.
Stundennach Phytaseaktlvität (U/ml Fermentations
dem Beimpfen A. nlger CBS 513.88 brühe) A. nlger
pAF2.2tt8
0 0 0
24 0 5
92 0,1 65
141 0,1 95
Beispiel 12
Zur Konstruktion dos Vektors pREPFYT3, mit dom gleichzeitig die Phytaseexpression und AG-Gensubstitution erreicht werden, wurde pFYT3 mit Kpnl digeriert. Mit dem gewonnenen linearen Kpnl-DNA-Fragment wurden zwoi getrennte Ligationen durchgeführt.
Ligation 1 mitdemKpnl-Hlncllll-Adaptor:
5' CGGGGA -3'
3'- catggccccttcga-s1
Kpnl Hind III Ligation 2 mit dem Kpnl-Hlndlir-Adaptor, in dem sich der Hlndlll-Restriktionsort nach der Ligation nicht wiederherstellt:
5'- CGGGGG -3'
3"- CTAGGCCCCCTCGA-5'
Kpnl IUrIdIII +
Anschließend wurde Ligation 1 teilweise mit Hindill digeriert. Nach Entfernung des amdS-enlhaltenden Fragments durch Gelelektrophorese wurde das übriggebliebene DNA-Fragment durch Ligation rezirkularisiert und zu E. coil transferiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pFYT3 amdS (siehe Figur 16) bezeichnet.
Ligation 2 wurde ebenfalls mit HInIII digeriert, und das 4kb DNA HlndlH/HlndlT-Fragment, das das amdS-Gen enthielt, wurde durch Gelelektrophorese isoliert, anschließend mit einer teilweisen Hindlll-Verdauung von pFYT3 amdS ligiert und zu E.coli transferiert. Das Plasmid, das das amdS-Gen am 3'-Ende des Phytasegens enthält, wurde mit pFYT3INT (siehe Figur 17) bezeichnet.
Zum Einfügen das ungefähr 6k'o umfassenden Sall/Hlndlll DNA-Fragments von pAB6-1, das die 3'-flr.nkierende AG-Sequenz enthält, wurde pFYT3INT teilweise mit Hindill digeriert, zuerst mit dem Adaptor.
51- AGCTAGGGGG -31 31- TCCCCCAGCT-51
HindIII* Sail
(in dem sich der Hlndlir-Restriktionsort nach der Ligation nicht wiederherstellt) und anschließend mit dem Sall/Hlndlll-Fragment von pAB6-1 ligiert. Nach Transformation zu E.coli wurde das gewünschte Plasmid pREPFYT3, das die 3' AG-flankierende Sequenz an der korrekten Position enthält, gewonnen (Figur 18)
Expression von Phytase In A. nlger durch AG-Gensubstitution
Vor Transformation von A.niger mit pREPFYT3 wurden die E.coli-Sequenzen in dem Plasmid durch Hindlll-Digestion und Gelelektrophorese entfernt. Der A.nlger-Stamm CBS 513 88 wurde mit 10pg DNA-Fragment durch wie in Beispiel 9 beschriebene Verfahren entfernt. Selektion und Vermehrung der Transformanten werden wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt. Nur eine kleine Anzahl der selektierten Transformanten verlor die AG-Aktivität (ungefähr 20%). Die Southern-Analyse von chromosomaler DNA wurde auf AG-negativen und Phytasepositiven Transformanten durchgeführt, um zu verifizieren, daß das AG-Gen tatsächlich durch das Phytasegen substituiert wurde.
Beispiel 13
Konservierung des Phytasegens in unterschiedlichen Spezies
Damit ermittelt werden kann, ob das Phytasegen innerhalb der mikrowellen Spezies sehr gut konserviert wurde, wurden Southorn-Analysen von chromosomaler DNA auf zehn verschiedenen Spezies mit der A.ficuum-Phytase-cDNA als Sonde durchgeführt.
Diese chromosomalen DNA-Analysen wurden auf Spezies von fädigen Pilzen, Hefen und Bakterien durchgeführt. Aus diesem Grunde wurde aus jeder Gruppe nur eine begrenzte Anzahl ausgewählt, zum Beispiel für fädige Pilze Penicillium chrysogenum und Asperglllus niger; für Hefe Saccharomyces cerevislae und Kluyveromyces lactis; und für prokaroyntische Organismen die grampositiven Spezies Bacillus subtilis, Clostridum thermocellum und Streptomyces lividans und als Beispiel für gramnegatives Bakterium Pseudomonas aeruginosa.
Chromosomale ΠΝΑ mit einer hohen relativen Molekülmasse von diesen Spezies wurde mit Pvull und BamHI getrennt digeriert
und anschließend auf 0,7%igem Agarosegel elektrophorisiort.
Nach dem Transfer auf Nitrocellulosefiltnr wui Je die Hybridisierung über Nacht bei einer niedrigen Strenge (6x SSC; SO0C) mit
einem "p-markierten 5'-Phytase-cDNA-Fragment (in Beispiel 8 beschrieben) durchgeführt. Die Blots wurden in 6x SSC bei
Raumtemperatur gewaschen und 18 Stunden lang Röntgenbestrahlung ausgesetzt. Wie aus Figur 19a und 19b hervorgeht, wurden beinahe in jeder Spur diskrete Banden beobac!-tet, die einen hohön Homologiegrad der Phytasegene zwischen den mikrowellen Spezies voraussagten.

Claims (31)

1. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Poptid oder Protein mit Phytaseaktivität codiert.
2. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer mikrowellen Quelle abgeleitet wird.
3. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer Pilzquelle abgeleitet wird.
4. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer Aspergillus-Quelle abgeleitet wird.
5. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von eine; Asperylllus flcuum, oder einer Aspergillus nlger-Quelle abgeleitet wird.
6. Gareinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die für eine Phytase codierende Sequenz die folgenden Charakteristika aufweist:
a) eine einzelne Bande bei 85kDa auf SDS-PAGE, wenn sie in einem Aspergillus-Wirt exprimiert wird,
b) eine scheinbare relative Molekülmasse nach Declycosylierung im Bereich von etwa 48 bis 56,5 kDa,
c) eine spezifische Aktivität von etwa 100 U/mg Protein.
7. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz mindestens eins der folgenden Charakteristika umfaßt:
a) Hybridisierung zu einer Oligonucleotidsonde, die von der in Figur 6 offenbarten DNA-Sequenz abgeleitet wird;
b) Hybridisierung zu einer Oligonucleotidsonde, die von der in Figur 8 offenbarten cDNA-Sequenz abgeleitet wird.
8. Expressionskonstrukt, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 operabel mit einem Regulationsbereich verbunden wird, der in der Lage ist, die Expression eines Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität in einem geeigneten Expressionswirt zu lenken.
9. Expressionskonstrukt nach Anspruch 8, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß der Regulationsbereich auch eine sekretorische Leader-Sequenz enthält, die für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität sorgt.
10. Expressionskonstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der AG-Promotor zur Lenkung der Expression des Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität verwendet wird.
11. Expressionskonstrukt nach Anspruch 10, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß eine homologe Phytase-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
12. Exprdssionskonstrukt nach Anspruch 10, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 18-Aminosäure-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
13. Expressionskonstrukt nach Anspruch 10 weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 24-Amonosäure-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
14. Expressionskonstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein homologer Phytasepromotor verwendet wird, um die Expression des Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu lenken.
15. Expressionskonstrukt nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß eine homologe Phytase-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
16. Expressionskonstrukt nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, caß die 18-Aininosäuren-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
17. Expressionskonstrukt nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 24-Aminosäure-AG-Leador-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
18. Vektor, der in der Lage ist, eine Wirtszelle zu transformieren, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 8 bis 17 enthält.
19. Vektor nach Anspruch 18, woitei hin dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist.
20. Vektor nach Anspruch 18, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß dor Vektor ein aus den aus pAF 28-1, pAF 2-2S, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2-4, pAF 2-6, pAF 2-7, p18FYT3, p24FYT3 und pFYT3 bestehenden Gruppen ausgewähltes Plasmid ist.
21. Transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit einem nach jeinem der Ansprüche 18 bis 20 transformierten Vektor gekennzeichnet ist.
22. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer aus Bakterien, Hefen und Pilzen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
23. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, oaß sie aus der aus Asperglllus,Trlchoderma, Penicllllum, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces und Saccharomyces bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
24. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der aus Aspergillus nlger, Asperglllus ficuum, Asperglllus awamori, Asperglllus oryzae, Trichoderma reesel, Mucor mlehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisfae, Bacillus subtills und Bacillus licheniformls bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
25. Verfahren für die Produktion eines Peptide oder Proteins mit Phytaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß eine transformierte Wirtszelle nach einem der Ansprüche 21 bis 24 unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Produktion des Peptids oder Proteins mit Phytaseaktivität förderlich sind.
26. Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität durch ein Verfahren nach Anspruch 25 erzeugt wird.
27. Phytase, dadurch gekennzeichnet, daß die Phytase die folgenden Charakteristika aufweist:
a) eine einzelne Bande bei 85 kDa auf SDS-PAGE, wenn sie in einem Aspergillus-Wirt exprimiert wird;
b) eine scheinbare relative Molekülmasse nach Deglycolysierrung im Bereich von etwa 48 bis 56,5 kDa;
c) eine spezifische Aktivität von etwa 100 U/mg Protein.
28. Futtermittel für Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß das Futtermittel ein Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität nach einem der Ansprüche 26 und 27 enthält.
29. Verwendung eines Peptids oder Proteins mit Phytaseaktivität nach einem der Ansprüche 26 und 27, gekennzeichnet durch die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat.
30. Verfahren zur Förderung des Wachstums von Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit einem Nahrungsmittel gefüttert wird, das ein mit einer Phytase nach einem der Ansprüche 26 und 27 ergänztes Futtermittel umfaßt.
31. Verfahren zur Reduzierung der Phytatanteile in Tierdung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit einem Γ hrungsmittel gefüttert wird, das ein mit einer Phytase nach einem der Ansprüche 26 und 27 ergänztes Futtermittel in einer Menge umfaßt, die bei der Umwandlung des in dem Futtermittel enthaltenen Phytats in Inositol und anorganisches Phosphat wirksam ist
DD344227A 1989-09-27 1990-09-26 Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase DD300886A5 (de)

Priority Applications (29)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK4663-90A SK466390A3 (en) 1989-09-27 1990-09-25 Purified and isolated dna sequence, construct, vector, transformed cell, peptide or protein having phytase activity, process for its preparation, and its use
CZ19904663A CZ289014B6 (cs) 1989-09-27 1990-09-25 Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy
DD344227A DD300886A5 (de) 1989-09-27 1990-09-26 Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase
IL9580390A IL95803A (en) 1989-09-27 1990-09-26 Cloning and expression of bacterial phytase
ES90202565T ES2072834T3 (es) 1989-09-27 1990-09-27 Produccion microbiana de fitasa.
CN90108977A CN1053013C (zh) 1989-09-27 1990-09-27 微生物植酸酶的克隆及表达
DE69033103T DE69033103T2 (de) 1989-09-27 1990-09-27 Klonierung und Expression mikrobieller Phytase
PT95447A PT95447B (pt) 1989-09-27 1990-09-27 Processo para a preparacao de adn,construcoes de expressao e vectores que codificam para fitase e de peptideos e proteinas que possuem actividade de fitase
AU65011/90A AU636673B2 (en) 1989-09-27 1990-09-27 Cloning and expression of microbial phytase
CA002042054A CA2042054C (en) 1989-09-27 1990-09-27 Cloning and expression of microbial phytase
CA002341081A CA2341081C (en) 1989-09-27 1990-09-27 Cloning and expression of microbial phytase
EP96202943A EP0779037A1 (de) 1989-09-27 1990-09-27 Klonierung und Expression mikrobieller Phytase
SU4895487A RU2113468C1 (ru) 1989-09-27 1990-09-27 Днк, кодирующая фитазу aspergillus niger, рекомбинантная плазмидная днк для экспрессии фитазы (варианты), штаммы-продуценты фитазы (варианты), способ получения фитазы и рекомбинантная фитаза aspergillus niger
PCT/NL1990/000140 WO1991005053A1 (en) 1989-09-27 1990-09-27 Cloning and expression of microbial phytase
NZ235478A NZ235478A (en) 1989-09-27 1990-09-27 Peptide or protein with phytase activity; dna encoding it; expression constructs; vectors; transformed host cells and animal feeds containing the peptide or protein
DK90202565T DK0420358T3 (da) 1989-09-27 1990-09-27 Kloning og ekspression af mikrobiel phytase
JP02513672A JP3105920B2 (ja) 1989-09-27 1990-09-27 細菌性フィターゼをコードする配列、及びフィターゼ活性を有するタンパク質
AT90202565T ATE180014T1 (de) 1989-09-27 1990-09-27 Klonierung und expression mikrobieller phytase
KR1019910700528A KR0159782B1 (ko) 1989-09-27 1990-09-27 미생물 피타아제의 클로닝 및 발현
HU907465A HU215179B (hu) 1989-09-27 1990-09-27 Eljárás gomba eredetű fitázaktivitással rendelkező polipeptidek rekombináns úton történő előállítására és felhasználására
EP90202565A EP0420358B1 (de) 1989-09-27 1990-09-27 Klonierung und Expression mikrobieller Phytase
DE0420358T DE420358T1 (de) 1989-09-27 1990-09-27 Klonierung und Expression mikrobieller Phytase.
FI912530A FI104380B (fi) 1989-09-27 1991-05-24 Mikrobifytaasin kloonaus ja ilmentäminen
NO912011A NO303988B1 (no) 1989-09-27 1991-05-24 Rekombinant fytase, dyrefôr som inneholder den samt anvendelser av den
BG94500A BG60108B2 (en) 1989-09-27 1991-05-27 Method for the preparation of microbial phytase
LVP-93-1302A LV10310B (en) 1989-09-27 1993-12-03 Cloning and expression of microbial phytase
GR990401907T GR3030819T3 (en) 1989-09-27 1999-07-20 Cloning and expression of microbial phytase
FI992420A FI108299B (fi) 1989-09-27 1999-11-10 Mikrobifytaasia sisältävä koostumus ja sen käyttö
US11/036,272 US20060063243A1 (en) 1989-09-27 2005-01-14 Cloning and expression of microbial phytase

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP89202436 1989-09-27
EP90202231 1990-08-17
DD344227A DD300886A5 (de) 1989-09-27 1990-09-26 Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase
EP90202565A EP0420358B1 (de) 1989-09-27 1990-09-27 Klonierung und Expression mikrobieller Phytase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DD300886A5 true DD300886A5 (de) 1992-08-27

Family

ID=37728159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DD344227A DD300886A5 (de) 1989-09-27 1990-09-26 Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20060063243A1 (de)
EP (2) EP0420358B1 (de)
JP (1) JP3105920B2 (de)
KR (1) KR0159782B1 (de)
CN (1) CN1053013C (de)
AT (1) ATE180014T1 (de)
AU (1) AU636673B2 (de)
BG (1) BG60108B2 (de)
CA (2) CA2341081C (de)
CZ (1) CZ289014B6 (de)
DD (1) DD300886A5 (de)
DE (2) DE69033103T2 (de)
DK (1) DK0420358T3 (de)
ES (1) ES2072834T3 (de)
FI (2) FI104380B (de)
GR (1) GR3030819T3 (de)
HU (1) HU215179B (de)
IL (1) IL95803A (de)
LV (1) LV10310B (de)
NO (1) NO303988B1 (de)
NZ (1) NZ235478A (de)
PT (1) PT95447B (de)
RU (1) RU2113468C1 (de)
SK (1) SK466390A3 (de)
WO (1) WO1991005053A1 (de)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK122686D0 (da) * 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5780292A (en) * 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7033627B2 (en) 1990-03-23 2006-04-25 Syngenta Mogen B.V. Production of enzymes in seeds and their use
US5543576A (en) * 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
KR100225087B1 (ko) * 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
US5593963A (en) * 1990-09-21 1997-01-14 Mogen International Expression of phytase in plants
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
EP0549062B1 (de) * 1991-12-23 1999-03-17 Gist-Brocades N.V. Eukaryotisches Expressionssystem
AU3628493A (en) * 1992-02-13 1993-09-03 Gist-Brocades N.V. Stabilized aqueous liquid formulations of phytase
DK0655890T3 (da) * 1992-07-31 2005-06-06 Ab Enzymes Gmbh Rekombinante celler, DNA-konstruktioner, vektorer og fremgangsmåder til ekspression af phytatnedbrydende enzymer i önskede forhold
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
EP1142485B1 (de) * 1994-04-22 2008-02-27 Novozymes A/S Verfahren zur Verbesserung von der Löslichkeit von pflanzlichen Proteinen
US6291221B1 (en) 1994-04-25 2001-09-18 Roche Vitamins Inc. Heat tolerant phytases
US6358722B1 (en) * 1994-04-25 2002-03-19 Roche Vitamins, Inc. Heat tolerant phytases
US6699704B1 (en) 1994-04-25 2004-03-02 Roche Vitamins Inc. Heat tolerant phytases
ES2268687T3 (es) * 1994-04-25 2007-03-16 Dsm Ip Assets B.V. Polipeptidos con actividad fitasa.
US5830732A (en) 1994-07-05 1998-11-03 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Phytase
US6051431A (en) * 1994-07-22 2000-04-18 Dsm N.V. Selection marker gene free recombinant strains: a method for obtaining them and the use of these strains
AU716471B2 (en) 1995-10-13 2000-02-24 Gist-Brocades B.V. Fungal cellulases
AU2077197A (en) 1996-03-18 1997-10-10 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phytase activity and nucleic acids encoding same
US5939303A (en) * 1996-06-14 1999-08-17 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada Phytases of ruminal microorganisms
US5985605A (en) * 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
FR2751987B1 (fr) * 1996-08-01 1998-12-31 Biocem Phytases de plantes et applications biotechnologiques
GB2316082A (en) * 1996-08-13 1998-02-18 Finnfeeds Int Ltd Phytase
EA003632B1 (ru) 1996-09-25 2003-08-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Фитазы из микроорганизма monascus anka, способ их получения и корм для животных, содержащий указанные фитазы
DE69739288D1 (de) * 1996-12-20 2009-04-16 Novozymes As Polypeptide mit phytase-aktivität
US6039942A (en) 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
US6235517B1 (en) 1997-03-07 2001-05-22 Food Industry Research & Development Institute Phytase-producing bacteria, phytase and production method of phytase
CA2231948C (en) 1997-03-25 2010-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified phytases
KR100206453B1 (ko) 1997-03-27 1999-07-01 박원훈 신규한플라즈미드를이용하여형질전환시킨균주 이.채씨오엘아이.피와이로부터생산된피타제
CN1169961C (zh) 1997-04-11 2004-10-06 Dsm公司 基因转变作为工具用于构建重组的工业化丝状真菌
NZ501408A (en) * 1997-06-04 2002-02-01 Dsm N Carbohydrate-based enzyme granulates
TW409035B (en) 1997-06-04 2000-10-21 Gist Brocades Bv Starch-based enzyme granulates
CN100526459C (zh) * 1997-06-04 2009-08-12 巴斯福股份公司 高活性植酸酶组合物
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
US6720014B1 (en) * 1997-08-13 2004-04-13 Diversa Corporation Phytase-containing foodstuffs and methods of making and using them
CN1062309C (zh) * 1997-12-16 2001-02-21 中国农业科学院饲料研究所 植酸酶及其基因的克隆和表达
US6514495B1 (en) 1998-03-23 2003-02-04 Novozymes A/S Phytase varinats
CN1309699A (zh) * 1998-03-23 2001-08-22 诺维信公司 植酸酶变体
CN1295443A (zh) * 1998-04-01 2001-05-16 Dsm公司 肌醇六磷酸酶在具有低含量肌醇六磷酸酯的饲料中的应用
US6451572B1 (en) * 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
US7220542B2 (en) 2000-07-17 2007-05-22 Van Den Brink Johannes Maarten Expression cloning in filamentous fungi
ATE338110T1 (de) * 1999-01-22 2006-09-15 Novozymes As Verbesserte phytasen
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
ES2248067T3 (es) 1999-03-31 2006-03-16 Cornell Research Foundation, Inc. Fosfatasas con actividad de fitasa mejorada.
DE60036815T2 (de) 1999-10-01 2008-07-31 Novozymes A/S Enzymgranulat
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
KR100377380B1 (ko) * 2000-07-28 2003-03-26 대한제당 주식회사 파이테이즈 생산 재조합 효모
US7510831B2 (en) 2001-10-26 2009-03-31 Genencor International, Inc. Trichoderma reesei phytase enzymes, nucleic acids encoding such phytase enzymes, vectors and host cells incorporating same and methods of making and using same
AU2002356855A1 (en) 2001-10-26 2003-05-12 Genencor International, Inc. Phytase enzymes, nucleic acid sequences encoding phytase enzymes and vectors and host cells incorporating same
CA2465202C (en) 2001-10-31 2014-01-21 Phytex, Llc Phytase-containing animal food and method
CN101177675B (zh) 2002-02-08 2014-05-21 诺维信公司 肌醇六磷酸酶变体
DE60335497D1 (de) 2002-09-13 2011-02-03 Cornell Res Foundation Inc Ergillus-phytasen
US20040063184A1 (en) 2002-09-26 2004-04-01 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes and compositions
US7442398B2 (en) 2003-03-25 2008-10-28 Republic Of National Fisheries Research And Development Institute Phytase produced from Citrobacter braakii
US20040253696A1 (en) 2003-06-10 2004-12-16 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes and compositions
CN1302112C (zh) * 2003-09-17 2007-02-28 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶
PL2160950T3 (pl) 2004-09-27 2015-10-30 Novozymes As Granulki z enzymem
FR2888249B1 (fr) * 2005-07-08 2007-08-17 Adisseo France Sas Soc Par Act Effet synergique de l'association de phytases sur l'hydrolyse de l'acide phytique
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US8540984B2 (en) 2006-08-03 2013-09-24 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
CN101500430B (zh) 2006-08-07 2014-02-19 诺维信公司 用于动物饲料的酶团粒
ES2577430T3 (es) 2006-08-07 2016-07-14 Novozymes A/S Gránulos de enzima para pienso para animales
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
EP2116136A1 (de) * 2008-05-08 2009-11-11 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Neue Phytasen
EP2445509B1 (de) 2009-06-24 2016-11-30 Charles N.S. Soparkar Zinkergänzung zur erhöhung der ansprechrate auf eine metalloproteasetherapie
RU2567000C2 (ru) 2009-10-22 2015-10-27 Басф Се Фитаза, ее применение, корм и кормовая добавка для животных, содержащие ее
CN102102094B (zh) * 2009-12-16 2013-03-27 福建福大百特科技发展有限公司 热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途
ES2553458T3 (es) 2011-04-21 2015-12-09 Basf Se Variantes sintéticas de fitasa
HUE027001T2 (en) 2011-04-21 2016-10-28 Basf Se Synthetic phytase variants
CN102583776B (zh) * 2012-02-29 2013-04-24 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种改良养殖水体环境的复合菌酶制剂及制备方法
WO2014067933A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 C-Lecta Gmbh Bioactive carrier preparation for enhanced safety in care products and food
ES2800477T3 (es) 2013-09-11 2020-12-30 Novozymes As Procesos para producir productos de fermentación
CN106455630B (zh) 2014-06-27 2021-08-24 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进动物饲料的营养价值的方法
CA3006992A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novozymes A/S Processes for improving fermentation product yield using phospholipase c
WO2019055455A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Novozymes A/S MIXTURES OF ENZYMES AND METHODS FOR IMPROVING THE NUTRITIONAL QUALITY OF ANIMAL FEED
US11326187B2 (en) 2017-10-23 2022-05-10 Novozymes A/S Processes for producing a fermentation product
MX2020004831A (es) 2017-11-09 2020-10-16 Basf Se Recubrimientos de particulas de enzima que comprenden pigmentos blancos organicos.
US20210198618A1 (en) 2018-05-31 2021-07-01 Novozymes A/S Processes for enhancing yeast growth and productivity
WO2020160126A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed
AR119596A1 (es) 2019-08-05 2021-12-29 Novozymes As Mezclas de enzimas y procesos para producir un ingrediente alimenticio de alto contenido proteico a partir de un subproducto de la vinaza entera
WO2021126966A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
CN115605094A (zh) 2020-05-15 2023-01-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司（Nl） 用于改善动物饲料的营养价值的方法
CN111849858B (zh) * 2020-07-20 2023-01-10 浙江农林大学 毛竹原生质体的制备及瞬时转化体系的建立
CN114181952A (zh) * 2021-11-26 2022-03-15 中农华威生物制药(湖北)有限公司 提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3297548A (en) * 1964-07-28 1967-01-10 Int Minerals & Chem Corp Preparation of acid phytase
FI881496A (fi) * 1987-04-06 1988-10-07 Gist Brocades Nv Foerfarande foer framstaellning eller extraktion av aminosyror ur dynga.
UA27702C2 (uk) * 1989-09-27 2000-10-16 Гіст-Брокейдс Н.В. Фрагмент геномної днк, що кодує фітазу aspergillus niger,фрагмент кднк, що кодує фітазу aspergillus niger, рекомбінантна плазмідна днк для експресії фітази в aspergillus (варіанти), штам aspergillus-продуцент фітази aspergillus (варіанти), спосіб одержання фітази, рекомбінанта фітаза aspergillus niger
US5593963A (en) * 1990-09-21 1997-01-14 Mogen International Expression of phytase in plants
US6057491A (en) * 1997-05-29 2000-05-02 Borad Of Regents For University Of Oklahoma Protein having insecticidal activities and method of use

Also Published As

Publication number Publication date
DE69033103D1 (de) 1999-06-17
FI108299B (fi) 2001-12-31
DK0420358T3 (da) 1999-11-01
PT95447B (pt) 1998-04-30
GR3030819T3 (en) 1999-11-30
HU215179B (hu) 1998-10-28
JPH04506007A (ja) 1992-10-22
WO1991005053A1 (en) 1991-04-18
LV10310A (lv) 1994-10-20
LV10310B (en) 1995-10-20
NO912011L (no) 1991-07-24
HU907465D0 (en) 1991-10-28
CA2042054A1 (en) 1991-03-28
PT95447A (pt) 1991-05-22
RU2113468C1 (ru) 1998-06-20
FI912530A0 (fi) 1991-05-24
DE420358T1 (de) 1995-10-12
HUT58809A (en) 1992-03-30
SK280670B6 (sk) 2000-05-16
CA2042054C (en) 2001-07-17
SK466390A3 (en) 2000-05-16
NO303988B1 (no) 1998-10-05
FI19992420A (fi) 1999-11-10
CN1053013C (zh) 2000-05-31
KR0159782B1 (ko) 1998-11-16
CZ466390A3 (cs) 2000-08-16
JP3105920B2 (ja) 2000-11-06
US20060063243A1 (en) 2006-03-23
CN1051058A (zh) 1991-05-01
DE69033103T2 (de) 1999-12-09
NZ235478A (en) 1993-03-26
BG60108B2 (en) 1993-10-29
EP0779037A1 (de) 1997-06-18
ATE180014T1 (de) 1999-05-15
EP0420358B1 (de) 1999-05-12
EP0420358A1 (de) 1991-04-03
CZ289014B6 (cs) 2001-10-17
ES2072834T1 (es) 1995-08-01
FI104380B (fi) 2000-01-14
CA2341081A1 (en) 1991-04-18
AU636673B2 (en) 1993-05-06
IL95803A0 (en) 1991-06-30
IL95803A (en) 1999-03-12
AU6501190A (en) 1991-04-28
CA2341081C (en) 2005-08-02
ES2072834T3 (es) 1999-11-01
NO912011D0 (no) 1991-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69033103T2 (de) Klonierung und Expression mikrobieller Phytase
US6350602B1 (en) Cloning and expression of phytase from aspergillus
DE69133201T2 (de) Klonierung und Expression von Xylanasegenen schimmeliger Herkunft
DE69427812T2 (de) Enzymhaltiger futterzusatz und diesen enthaltendes futter
DE69617641T2 (de) Xylanase beinhaltende futterzusätze für tiere
DE69333747T2 (de) Rekombinante zelle, dna-konstruktionen, vektoren und methoden zur expression von phytatabbauenden enzymen in gewünschten verhältnissen
DE69333766T2 (de) Herstellung von phytat-degradierenden enzymen in trichoderma
DE69231995T2 (de) Verfahren zur Herstellung/Sekretion eines Proteins durch einen transformiertenSchimmelpilz unter Verwendung von Expressions-/Sekretions- Regulationsregionenaus Aspergillus
EP2102334B1 (de) Polypeptid mit phytaseaktivität und erhöhter temperaturstabilität der enzymaktivität sowie dieses codierende nukleotidsequenz
WO2008012028A1 (de) Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle
US20030119163A1 (en) Cloning and expression of microbial phytase
PL168470B1 (pl) Sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu PL

Legal Events

Date Code Title Description
ASS Change of applicant or owner

Owner name: DSM N.V., 6411 TE HEERLEN

Effective date: 19990420

IF04 In force in the year 2004

Expiry date: 20100927