DE4120213A1 - Monoklonale antikoerper gegen das tnf-bindende protein i (tnf-bp i) - Google Patents
Monoklonale antikoerper gegen das tnf-bindende protein i (tnf-bp i)Info
- Publication number
- DE4120213A1 DE4120213A1 DE4120213A DE4120213A DE4120213A1 DE 4120213 A1 DE4120213 A1 DE 4120213A1 DE 4120213 A DE4120213 A DE 4120213A DE 4120213 A DE4120213 A DE 4120213A DE 4120213 A1 DE4120213 A1 DE 4120213A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- tbp
- tnf
- antibody
- serum
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf monoklonale
Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I)
und auf Hybridom-Zellinien, die diese sezernieren.
Die zwei strukturell verwandten Zytokine
Tumornekrosefaktor (TNF-α) und Lymphotoxin (TNF-β)
wurden ursprünglich aufgrund ihrer zytotoxischen in
vitro Aktivität gegen Tumorzellen und ihrer Fähigkeit,
hämorrhagische Nekrosen von Tumoren in einem Mausmodell
zu induzieren, entdeckt. Die Klonierung ihrer cDNAs und
deren Expression in E.coli haben die Verfügbarkeit
dieser Proteine in praktisch unbegrenztem Ausmaß und
die Entwicklung hochspezifischer Antikörper und
empfindlicher Immunoassays ermöglicht. Es existiert
eine Fülle von Information über die biologischen
Aktivitäten dieser Proteine, ihre physiologischen
Rollen als pleotrope Mediatoren von entzündlichen
Prozessen und ihre Beteiligung bei pathologischen
Zuständen. Insbesondere wurde eine erhöhte Produktion
von TNF-α mit der Pathogenese von z. B. septischem
Schock, Gewebeschädigungen bei der "Graft-versus-host"-
Erkrankung und der zerebralen Malaria sowie von
Kachexie in Zusammenhang gebracht (Beutler, 1988;
Paul und Ruddle, 1988; Beutler und Cerami, 1989).
Die möglichen unerwünschten Wirkungen von TNF-α haben
zur Suche nach natürlichen Inhibitoren dieses Zytokins
veranlaßt. Ein Protein, das an TNF-α bindet und dadurch
dessen Aktivität inhibiert, wurde ursprünglich im Harn
von Patienten mit Nierenversagen (Peetre et al., 1988)
und von Fieberpatienten (Seckinger et al., 1988)
identifiziert. Dieses Protein mit einem scheinbaren
Molekulargewicht von ca. 30 kDa wurde zur Homogenität
gereinigt, teilweise sequenziert (EP-A 23 08 378) und
die cDNA kloniert (Olsson et al., 1989; Engelmann
et al., 1989; Himmler et al., 1990; Schall et al.,
1990). Die Struktur der cDNA zeigte, daß dieses Protein
mit der Bezeichnung TNF-BP das extrazelluläre Fragment
eines TNF-Rezeptors (TNF-R) darstellt. (Es wurde
angenommen, daß dieses Fragment durch proteolytische
Spaltung freigesetzt wird.) Diese Ergebnisse wurden
durch die Isolierung des intakten Membranrezeptors für
TNF-α, die unabhängig davon von anderen Arbeitsgruppen
durchgeführt wurde (Loetscher et al., 1990), bestätigt.
Das gesamte Rezeptorprotein besteht aus 455 Aminosäuren
(55-60 kDa); TNF-BP umfaßt den größten Teil der
extrazellulären Domäne des Rezeptors und enthält alle
drei N-Glykosylierungsstellen. Es wurde gefunden, daß
aus Harn isoliertes TNF-BP am N-Terminus aufgrund
proteolytischer Spaltung heterogen ist und daher eine
Mischung von zwei molekularen Formen, bestehend aus
161 Aminosäuren (Hauptfraktion) bzw. 172 Aminosäuren,
darstellt (Himmler et al., 1990). Kürzlich wurde die
Existenz eines zweiten TNF-bindenden Proteins
nachgewiesen, das ein Fragment eines zweiten
TNF-Rezeptor-Typs mit einem höheren Molekulargewicht
(75-80 kDa; Engelmann et al., 1990a; Smith et al.,
1990; Kohno et al., 1990) darstellt. Die beiden
Rezeptoren und Bindungsproteine wurden daraufhin
TNF-R I/TNF-BP I und TNF-R II/TNF-BP II (für den
60 kDa bzw. 80 kDa Rezeptor) bezeichnet. Der
Sequenzvergleich zeigte, daß die beiden Proteine
strukturverwandt sind; insbesondere ist die Anzahl und
Verteilung der Cysteinreste sehr ähnlich. Die beiden
Rezeptoren unterscheiden sich jedoch immunologisch
voneinander (Engelmann et al., 1990a; Brockhaus
et al., 1990).
Der humane 60 kDa TNF-Rezeptor spielt eine wesentliche
Rolle bei der TNF-α-Signalübertragung. Die Aktivität
des Rezeptors ist auf Proteinbasis mehreren
regulatorischen Effekten unterworfen: Die Behandlung
von Zellen mit Phorbolestern oder anderen Aktivatoren
der Proteinkinase C hat eine rasche Verringerung in der
Anzahl der zellulären Bindungsstellen für TNF-α zur
Folge. Damit geht die Freisetzung des extrazellulären
Teils des Rezeptors, entsprechend dem TNF-BP I, durch
proteolytische Spaltung einher. Ähnliche Effekte, wenn
auch mit unterschiedlicher Kinetik, werden durch
verschiedene andere Substanzen, insbesondere durch die
physiologischen Liganden TNF-α und TNF-β,
hervorgerufen. Die Spaltstellen für die Protease auf
dem humanen und dem Ratten-TNF-R I sind konserviert,
sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Struktur von
der Spezifität aller bekannten Proteasen. Es ist daher
wahrscheinlich, daß ein hochspezifisches
proteolytisches Enzym Bestandteil eines Regelkreises
ist, der die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber TNFs
kontrolliert; der genaue Mechanismus dieser Ereignisse
ist noch unbekannt. Kürzlich wurde dieses Phänomen auch
in vivo beobachtet: Es wurde gefunden, daß die
Verabreichung von TNF-α an Krebspatienten zu einer
deutlichen Zunahme von TNF-BP I im Serum führt (Lantz
et al., 1990a).
Die Konzentration von TNF-BP I in Kulturüberständen
oder Körperflüssigkeiten ist daher ein Indikator für
die Aktivierung des TNF-Rezeptor-Systems in vitro bzw.
in vivo aufgrund von Wechselwirkungen mit den Liganden
oder Transmodulation durch andere Mediatoren; die TNF-
BP I-Konzentration in Körperflüssigkeiten kann somit
als nützlicher Marker für verschiedene Krankheiten
angesehen werden.
Es bestand daher der Bedarf nach effizienten,
empfindlichen Nachweismethoden für TNF-BP I sowie nach
Kits, die für derartige Nachweismethoden einsetzbar
sind.
Es sind monoklonale Antikörper gegen TNF-R I
beschrieben, die durch Immunisierung mit dem
solubilisierten Rezeptor (Brockhaus et al., 1990; EP A2
334 165; Thoma et al., 1990) oder mit gereinigtem TNF-
BP I (Engelmann et al., 1990b) hergestellt wurden; von
diesen Antikörpern wurde jedoch nicht gezeigt, daß sie
sich zur Verwendung in Immuno-Assays für TNF-BP I
eignen.
Lantz et al. (1990a) haben einen kompetitiven ELISA
entwickelt, bei dem in einer dreistufigen Testmethode
mit TNF-BP I beschichtete Testplatten, polyklonale
Kaninchenantikörper gegen TNF-BP I, Biotin-markierte
Ziegenantikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin und
Avidin-gekoppelte alkalische Phosphatase verwendet
wurden. Mit Hilfe dieses Assays wurden die Gegenwart
von TNF-BP I im Serum von normalen Spendern und erhöhte
TNF-BP I-Konzentrationen in Seren von Patienten mit
Nierenversagen oder von Krebspatienten, die mit TNF-α
behandelt wurden, nachgewiesen.
In der EP-A 14 12 486 werden monoklonale Antikörper
gegen TNF-BP I beschrieben. Einer dieser Antikörper
wurde in einem Sandwich-ELISA als Beschichtungs-
Antikörper verwendet; als zweiter Antikörper wurden
polyklonale Kaninchen-Anti-TNF-BP-I-Antikörper, als
dritter, enzymgekoppelter Antikörper polyklonale
Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper verwendet.
Die vorbekannten Assays sind vom Aufbau und der
Durchführung her kompliziert, außerdem bedingt der
Einsatz polyklonaler Antikörper die Verwendung von
Tieren, die zu vermeiden man zunehmend bestrebt ist.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
monoklonale Antikörper mit Spezifität für TNF-BP I
bereitzustellen, die sich zur Verwendung in einem
einfach durchzuführenden, hochempfindlichen Immunoassay
zum Nachweis von TNF-BP I eignen.
Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale
Antikörper gegen TNF-BP I der Bezeichnung tbp-1 und
tbp-2, aktive Fragmente davon sowie die Hybridom-
Zellinien TBP-1 und TBP-2, die diese Antikörper
produzieren.
Die erfindungsgemäßen Hybridom-Zellinien wurden
erhalten, indem Mäuse mit aus menschlichem Harn
hochgereinigtem TNF-BP I (Olsson et al., 1989) nach an
sich bekannten Methoden immunisiert und Milzzellen von
Mäusen mit positiver Antikörper-Reaktion zur
Fusionierung mit Myelomzellen verwendet wurden, um
Hybridomzellen zu erhalten, die monoklonale Antikörper
gegen TNF-BP I sezernieren. Die erste Zellfusion ergab
zwei Kulturen, die monoklonale Antikörper gegen
TNF-BP I produzieren; eine zweite Zellfusion ergab
einen dritten Antikörper. Die erhaltenen Antikörper
wurden als tbp-1, tbp-2 und tbp-6 bezeichnet. Die
Antikörper wurden gereinigt und charakterisiert:
tbp-1 und tbp-6 sind IgG1-Antikörper, tbp-2 ist ein
IgG2b-Antikörper. Alle drei Antikörper waren in der
Lage, TNF-BP I in Western Blots zu erkennen, wobei
tbp-1 die stärkste Reaktivität zeigte. tbp-2 reagierte
schwächer, tbp-6 ergab die schwächste Färbung. Zur
Charakterisierung der Epitope, die von den Antikörpern
erkannt werden, wurden die drei Antikörper sowie ein
vierter Antikörper mit der Bezeichnung H398, der durch
Immunisierung mit solubilisiertem TNF-Rezeptor erhalten
worden war (Thoma et al., 1990), untersucht. Die
untersuchten Antikörper erkennen drei verschiedene
Epitope auf dem TNF-BP I-Molekül, wobei tbp-2 und
H398 dasselbe oder überlappende Epitope erkennen.
Die Hybridomzellinien mit der Bezeichnung TBP-1 und
TBP-2 wurden am 5. Juni 1991 bei der European
Collection of Animal Cell Cultures (ECACC; Salisbury,
Vereinigtes Königreich) nach dem Budapester Vertrag
über die Hinterlegung von Mikroorganismen für
Patentzwecke hinterlegt (TBP-1: Hinterlegungsnummer
9 10 60 555, TBP 2: Hinterlegungsnummer 9 10 60 556).
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren
Aspekt die Verwendung von tbp-1 und/oder tbp-2 zum
Nachweis von TNF-BP I in Körperflüssigkeiten oder
Zellkulturüberständen mittels Immunoassay. (Unter die
Bezeichnung tbp-1 oder tbp-2 fallen im Zusammenhang mit
der Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper im folgenden auch die aktiven Fragmente der
monoklonalen Antikörper, die an TNF-BP I binden. Dem
Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet sind Methoden zur
Herstellung aktiver Antikörper-Fragmente (Fab-
Fragmente), z. B. mittels Enzymverdau, geläufig.)
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbaren
Immunoassays beruhen auf Standardmethoden, die dem
Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind und
von denen ein großes Angebot zur Verfügung steht. Diese
Methoden basieren auf der Bildung eines Komplexes
zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und
einem oder mehreren Antikörpern. Einer oder mehrere der
Komplexpartner ist dabei markiert, sodaß das Antigen
nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt werden kann.
Die Markierung kann z. B. in Form eines gekoppelten
Enzyms, Radioisotops, Metallchelats, oder einer
fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder
biolumineszierenden Substanz, vorliegen.
Im Falle eines kompetitiven Immunoassays konkurriert
das Antigen in der zu analysierenden Probe mit einer
bekannten Menge von markiertem Antigen um die Bindung
an die Antikörper-Bindungstellen. Die Menge von
markiertem Antigen, gebunden an den Antikörper, ist
daher verkehrt proportional zur Antigenmenge in der
Probe.
Bei Tests, in denen markierte Antikörper verwendet
werden, ist die Menge an markiertem, gebundenem
Antikörper direkt proportional zur Menge an Antigen.
Assays, die auf der Bildung eines
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes basieren, wobei
zwei Antikörper eingesetzt werden, die einander bei der
Bindung an das Antigen nicht behindern, werden als
"Sandwich"-Immunoassays bezeichnet.
Da monoklonale Antikörper in unbegrenzter Menge in
konstanter Qualität verfügbar sind, weisen Immunoassays
unter Verwendung monoklonaler Antikörper aufgrund ihrer
konstanten Qualität und Reproduzierbarkeit gegenüber
Assays, die sich polyklonaler Antikörper bedienen,
entscheidende Vorteile auf. Außerdem wird der mit
polyklonalen Antikörpern verbundene Nachteil, für deren
Herstellung laufend Tiere einsetzen zu müssen,
vermieden.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay, insbesondere
in einem Sandwich-ELISA verwendet.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind in
Sandwich-Immunoassays als Beschichtungs- und
Markierungs-gekoppelte Antikörper einsetzbar und machen
somit den Einsatz polyklonaler Antikörper überflüssig.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende
Erfindung Immunoassay-Kits, insbesondere Sandwich-
Immunoassay-Kits, die tbp-1 und/oder tbp-2 enthalten.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein
Sandwich-Immunoassay-Kit, vorzugsweise ein Sandwich-
ELISA-Kit, in dem tbp-1 den Beschichtungsantikörper und
tbp-2 den markierten, vorzugsweise enzymgekoppelten
Antikörper darstellt.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich,
in einem Sandwich-Immunoassay tbp-1 oder tbp-2 durch
einen anderen Antikörper zu ersetzen, der in der
Lage ist, mit tbp-2 bzw. tbp-1 einen
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden.
Im Falle des Ersatzes von tbp-1 oder tbp-2 durch einen
anderen Antikörper wird bevorzugt ein Antikörper
verwendet, der jeweils dasselbe Epitop von TNF-BP I
oder einen Bereich davon erkennt wie der zu ersetzende
tbp-1 bzw. tbp-2.
Antikörper, die sich in dem erfindungsgemäßen
Immunoassay aufgrund ihrer Fähigkeit, mit tbp-2 bzw.
tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu
bilden, als Ersatz für tbp-1 oder tbp-2 eignen, können
mit Hilfe von Sandwich-Immunoassays ermittelt werden.
Dabei werden Immunoassay-Platten mit tbp-1 oder tbp-2
beschichtet, das Antigen aufgegeben und die zu
untersuchenden, markierten Antikörper aufgetragen.
Antikörper, die mit tbp-1 bzw. tbp-2 einen
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex bilden können,
was durch Messung der Markierung des Testantikörpers
feststellbar ist, erkennen ein anderes Epitop auf dem
Antigen als tbp-1 bzw. tbp-2. Antikörper, die nicht in
der Lage sind, ein Sandwich mit tbp-1 bzw. tbp-2 zu
bilden, weisen dieselbe oder überlappende
Epitoperkennung auf wie diese Antikörper.
Im Falle des Ersatzes eines der erfindungsgemäßen
Antikörper im Sandwich-Immunoassay wird bevorzugt der
Markierungs-gekoppelte Antikörper tbp-2 durch einen
Antikörper ersetzt, der dieselbe oder überlappende
Epitop-Spezifität aufweist wie tbp-2. Ein Beispiel für
einen geeigneten Antikörper ist der von Thoma et al.
(1990) beschriebene monoklonale Antikörper H398, von
dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden
konnte, daß er an ein identisches oder überlappendes
Epitop bindet.
Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Sandwich-ELISAs
konnte TNF-BP I in Humanserum, Plasma, Harn und
Zellkulturüberständen bei einer Empfindlichkeit von
ca. 200 ng/l und einer Genauigkeit von mehr als 10%
nachgewiesen werden.
Es wurde überraschend festgestellt, daß die natürlichen
Liganden für den TNF-Rezeptor, TNF-α und TNF-β, die
Aussagekraft des erfindungsgemäßen Immunoassays nicht
beeinträchtigen: TNF-β übt keinen meßbaren Einfluß auf
den Assay aus, TNF-α zeigt erst bei Konzentrationen von
10 µg/l eine meßbare Änderung des Signals. Da die
TNF-α-Konzentrationen in gesunden Personen für
gewöhnlich 20 ng/l betragen und selbst bei ernsten
pathologischen Zuständen die TNF-α-Konzentrationen nur
in seltenen Fällen 1 µg/l übersteigen (z. B. Lähdevirta
et al., 1988; Offner et al., 1990), kann eine
Beeinträchtigung des erfindungsgemäßen Immunoassays
durch endogenen TNF-α ausgeschlossen werden.
Aufgrund seiner Empfindlichkeit ist ein Immunoassay auf
Basis der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper
auch geeignet, nach unten von den Normwerten
abweichende Konzentrationen von TNF-BP I nachzuweisen.
Damit können Funktionsstörungen des Organismus
diagnostisch erfaßt werden, die mit einer verminderten
Produktion von TNF-BP I einhergehen.
Außer für den Nachweis von TNF-BP I in Serum, Plasma
und Harn sowie in Zellkulturüberständen können die
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper auch für den
Nachweis von TNF-BP I in anderen Körperflüssigkeiten,
z. B. in der Zerebrospinalflüssigkeit oder in
Bronchoalveolarsekreten, verwendet werden.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung wird somit eine
hochempfindliche Nachweismethode für TNF-BP I
bereitgestellt, mit der die Aktivierung des
TNF-Rezeptors durch seine physiologischen Liganden
TNF-α und TNF-β sowie seine Transmodulation durch
andere Mediatoren in verschiedenen pathologischen
Zuständen festgestellt werden kann. Der Nachweis von
TNF-BP I dient somit vor allem zur Diagnose von
pathologischen Zuständen, die mit einer erhöhten
TNF-α-Produktion einhergehen bzw. zur Absicherung
solcher Diagnosen.
Ein Vorteil der TNF-BP I-Bestimmung gegenüber der
TNF-α-Bestimmung ergibt sich dadurch, daß von TNF-BP I
Normalwerte im Serum gefunden werden, wodurch eine
Bestimmung auch geringfügig erhöhter Werte und damit
eine Diagnose möglich ist.
Trotz des deutlichen Zusammenhanges zwischen der
Induktion von TNF-α und dem Auftreten von
septikämischen und endotoxämischen Reaktionen in Tieren
brachte die Bestimmung von TNF-α in schwer an
gram-negativen Infektionen erkrankten Patienten
widersprüchliche Ergebnisse. Dies dürfte mit den
Mechanismen in Zusammenhang stehen, die die Synthese
und Ausscheidung von TNF-α kontrollieren. Nach Anregung
durch einen geeigneten Stimulus wird TNF-α rasch von
Makrophagen ausgeschüttet, im Anschluß daran dürften
die Makrophagen gegen weitere Stimulierung resistent
sein. Außerdem ist die Halbwertszeit im Plasma kurz,
sie beträgt im Menschen nur 15 bis 17 min. Diese
Phänomene dürften die Ursache dafür sein, daß das
Auftreten von TNF-α im Blutkreislauf rasch und
kurzlebig und daher schwierig nachweisbar ist
(Michie et al., 1988). Wenn dem Patienten daher nicht
rechtzeitig Blut abgenommen wird, ist es möglich, daß
zum Zeitpunkt der Analyse die Erhöhung der
TNF-α-Konzentration nicht mehr nachweisbar ist. Von
Lantz et al. (1990a) wurde festgestellt, daß nach
Infusion mit TNF-α der TNF-BP I-Spiegel im Serum
wesentlich langsamer abfällt als der Serum-TNF-Spiegel.
Dieser Befund zeigt, daß die Bestimmung von
TNF-BP I-Konzentrationen als Grundlage für eine
Diagnose insbesondere dann von Vorteil ist, wenn
pathologische Zustände diagnostiziert werden sollen,
die mit einer Aktivierung des TNF-Rezeptor-Systems,
insbesondere durch TNF-α, verbunden sind und bei denen
der TNF-α-Spiegel im Vergleich zum TNF-BP I-Spiegel
rascher absinkt.
Beispiele für Erkrankungen, für deren Diagnose die
Bestimmung von TNF-BP I herangezogen werden kann, sind
gramnegative oder allgemeine bakterielle Infektionen,
septischer Schock, Gewebeschädigungen bei der
"Graft-versus-host"-Erkrankung und der zerebralen
Malaria sowie Kachexie.
Der erfindungsgemäße Bioassay ist insbesondere bei der
Diagnose von septischem Schock, der bei nicht
rechtzeitig vorgenommener Therapie eine
lebensbedrohende Erkrankung darstellt, von Vorteil.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Bioassays konnte
TNF-BP I im Serum von normalen Spendern bei einer
Durchschnittskonzentration von ca. 2 µg/l nachgewiesen
werden. Erhöhte Werte wurden im Serum von Patienten mit
schweren Verbrennungen bestimmt; sehr hohe Werte wurden
in Dialysepatienten nachgewiesen, während die Seren von
Patienten mit chronischer Polyarthritis keine erhöhten
TNF-BP I-Konzentrationen aufwiesen.
Mit dem erfindungsgemäßen Bioassay wird außerdem
erstmals eine einfache immunologische Nachweismethode
für TNF-BP I im Harn bereitgestellt; in Harnproben von
normalen Spendern wurde eine TNF-BP I-
Durchschnittskonzentration von ca. 2 µg/l bestimmt.
Der erfindungsgemäße Bioassay kann somit zur Diagnose
von pathologischen Zuständen, bei denen eine
Korrelation von erhöhten TNF-BP I-Konzentrationen im
Harn und im Serum besteht, wie sie bei Nierenversagen
festgestellt wurde, eingesetzt werden, indem die
TNF-BP I-Konzentration im Harn bestimmt wird. Diese
Methode bietet den Vorteil, auf eine Blutabnahme
verzichten und die Diagnose aufgrund der für den
Patienten wesentlich angenehmeren Harnanalyse erstellen
zu können.
Unter den Begriff "Diagnose" für die der
erfindungsgemäße Bioassay verwendet werden kann, fällt
auch die Überwachung des Verlaufs einer Erkrankung, die
mit einer Aktivierung des TNF-Rezeptorsystems verbunden
ist, bzw. des Verlaufs der Therapie zur Behandlung
einer solchen Erkrankung, z. B. einer Therapie mit
Antikörpern gegen TNF-α. Die Verwendung des
erfindungsgemäßen Bioassays ist weiters zweckmäßig für
die Überwachung des Verlaufs von Therapien, bei denen
TNF-α oder TNF-β verabreicht werden. Im Zuge dieser
diagnostischen Anwendungen wird im allgemeinen in
regelmäßigen Zeitabständen die Probe einer
Körperflüssigkeit aus dem Patienten entnommen und deren
Gehalt an TNF-BP I bestimmt.
Außer für die Bestimmung von TNF-BP I in
Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen können
die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in
immobilisierter Form für die Reinigung von TNF-BP I
mittels Affinitätschromatographie verwendet werden.
Weiters können die erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper, insbesondere tbp-1, für den Nachweis von
TNF-BP I in Immunoblots verwendet werden.
Fig. 1 ELISAs für TNF-BP I unter Verwendung
monoklonaler Antikörper;
Fig. 2 Repräsentative Eichkurven für TNF-BP I ELISAs
von Serum- und Harnproben;
Fig. 3 Einfluß von TNF-α auf die Immunreaktivität von
TNF-BP I;
Fig. 4 TNF-BP I-Konzentrationen in Humanserum und
Harn.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher
erläutert:
Drei ca. 6 Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse wurden mit
dem nach der in der EP A2 393 438 beschriebenen Methode
zur Homogenität gereinigten TNF-BP I nach folgendem
Schema immunisiert:
1. Immunisierung:
9 µg TNF-BP I pro Maus in komplettem Freundschem Adjuvans, intraperitoneal;
2. Immunisierung:
9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freundschem Adjuvans, intraperitoneal, 3 Wochen nach der 1. Immunisierung;
3. Immunisierung:
9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freundschem Adjuvans, intraperitoneal, 5 Wochen nach der 2. Immunisierung.
9 µg TNF-BP I pro Maus in komplettem Freundschem Adjuvans, intraperitoneal;
2. Immunisierung:
9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freundschem Adjuvans, intraperitoneal, 3 Wochen nach der 1. Immunisierung;
3. Immunisierung:
9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freundschem Adjuvans, intraperitoneal, 5 Wochen nach der 2. Immunisierung.
8 Tage danach wurden den Mäusen Serumproben entnommen
und mittels eines Sandwich-ELISA auf die Bildung von
Antikörpern gegen TNF-BP I untersucht. Dazu wurde
TNF-BP I an mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I
beschichtete Testplatten gebunden und spezifische
Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten
Kaninchenantikörpern gegen Mäuse-Immunglobulin
nachgewiesen. Die Testseren wurden in Verdünnungen von
1 : 102, 1 : 103, 1 : 104 und 1 : 105 aufgelegt. Es zeigten
alle drei Mäuse positive Reaktion (Absorption mehr als
zweifacher Untergrund) bei bis zu 105facher Verdünnung.
Die Maus mit dem höchsten Titer wurde ca. 8 Wochen nach
der 3. Immunisierung an drei aufeinanderfolgenden Tagen
mit je 4 µg TNF-BP I in PBS geboostert; die Milzzellen
dieser Maus wurden am folgenden Tag für die Fusion mit
Hybridomzellen verwendet.
In ähnlicher Weise wurde eine zweite Immunisierung
durchgeführt mit dem Unterschied, daß die dazu
verwendete Maus zusätzlich 8 Monate nach der dritten
Immunisierung eine vierte Dosis TNF-BP I (15 µg)
erhielt und 7 Wochen danach geboostert wurde.
Die Milz der Maus wurde einen Tag nach der letzten
Injektion steril entnommen, mechanisch zerkleinert und
mit serumfreiem Kulturmedium (RPMI 1640) gewaschen.
Ca. 108 Milzzellen wurden nach der Methode von Köhler
und Milstein (1975) in Gegenwart von PEG 4000
(Merck, 40% in serumfreiem Kulturmedium) mit
ca. 5×107 P3X63Ag8.653 BALB/c-Myelomzellen (Kearney et
al., 1979) fusioniert. Danach wurden die Zellen in
HAT-Selektionsmedium (RPMI 1640 - komplettiert mit
100 U/ml Natrium-Penicillin G, 50 U/ml Streptomycin und
20% FCS - mit 10-4 M Hypoxanthin, 4×10-7 M Aminopterin
und 1.6×10-5 M Thymidin) suspendiert und in 16 96-Loch-
Mikrotiter-Platten, die peritoneale Mäusezellen als
"Feeder Layer" enthielten, verteilt. Nach 11 Tagen
wurden Überstände entnommen und auf
Antikörperproduktion getestet. Von den 1500 Kulturen,
die in selektives Medium ausgesät wurden, zeigten mehr
als 90% Wachstum von Hybridomen.
Sofern nicht anders angegeben, wurden für alle
ELISA-Versuche die folgenden Puffer verwendet:
Beschichtungspuffer: 0.05 M Natriumcarbonat pH 9.6 Waschmedium: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7.4 (PBS) enthaltend Tween 20 zu 0.5 g/l
Testpuffer: PBS mit Rinderserumalbumin (5 g/l) und Tween 20 (0.5 g/l)
Substratlösung: Tetramethylbenzidindihydrochlorid (0.1 g/l) und Natriumperborat (0.05 g/l) in 0.05 M Kaliumcitrat pH 5.0 Stopp-Lösung: 2 M Schwefelsäure
96-Loch-Immunoassay-Platten wurden mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I, teilweise gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fällung (50% Sättigung), in Beschichtungspuffer bei einer Konzentration entsprechend einer 1 : 3000 Serumverdünnung (50 µl/Vertiefung, Inkubation über Nacht bei 4°C oder während einer Stunde bei 37°C) beschichtet. Die Platten wurden einmal gewaschen und eine Stunde lang mit Testpuffer bei Raumtemperatur blockiert. Daraufhin wurden Hybridomüberstände (50 µl) zusammen mit dem Antigen (50 µl, 10 µg TNF-BP I/l in Testpuffer) zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden einmal gewaschen, eine Lösung von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern gegen Maus-Immunglobuline (DAKO, Dänemark, Verdünnung 1 : 5000 im Testpuffer, 50 µl/Vertiefung) hinzugefügt und 2 h lang bei Raumtemperatur bebrütet. Daraufhin wurden die Platten 3× gewaschen und in jede Vertiefung 200 µl Substratlösung gegeben. Nach 20 bis 40 min wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 50 µl Stopp-Lösung unterbrochen. Die Absorption der Lösung wurde in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenz: 690 nm) gemessen, wobei Kulturmedium als negative und verdünntes Mausimmunserum als positive Kontrolle verwendet wurden.
Beschichtungspuffer: 0.05 M Natriumcarbonat pH 9.6 Waschmedium: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7.4 (PBS) enthaltend Tween 20 zu 0.5 g/l
Testpuffer: PBS mit Rinderserumalbumin (5 g/l) und Tween 20 (0.5 g/l)
Substratlösung: Tetramethylbenzidindihydrochlorid (0.1 g/l) und Natriumperborat (0.05 g/l) in 0.05 M Kaliumcitrat pH 5.0 Stopp-Lösung: 2 M Schwefelsäure
96-Loch-Immunoassay-Platten wurden mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I, teilweise gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fällung (50% Sättigung), in Beschichtungspuffer bei einer Konzentration entsprechend einer 1 : 3000 Serumverdünnung (50 µl/Vertiefung, Inkubation über Nacht bei 4°C oder während einer Stunde bei 37°C) beschichtet. Die Platten wurden einmal gewaschen und eine Stunde lang mit Testpuffer bei Raumtemperatur blockiert. Daraufhin wurden Hybridomüberstände (50 µl) zusammen mit dem Antigen (50 µl, 10 µg TNF-BP I/l in Testpuffer) zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden einmal gewaschen, eine Lösung von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern gegen Maus-Immunglobuline (DAKO, Dänemark, Verdünnung 1 : 5000 im Testpuffer, 50 µl/Vertiefung) hinzugefügt und 2 h lang bei Raumtemperatur bebrütet. Daraufhin wurden die Platten 3× gewaschen und in jede Vertiefung 200 µl Substratlösung gegeben. Nach 20 bis 40 min wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 50 µl Stopp-Lösung unterbrochen. Die Absorption der Lösung wurde in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenz: 690 nm) gemessen, wobei Kulturmedium als negative und verdünntes Mausimmunserum als positive Kontrolle verwendet wurden.
Nur zwei von den untersuchten Kulturen aus der ersten
Immunisierung zeigten Antikörperproduktion
(TBP-1 und TBP-2); die zweite Fusion ergab eine
dritte Antikörper-positive Zellinie (TBP-6).
Die positiven Kulturen wurden nach ca. 25 Tagen von
HAT-Medium in HT-Medium überführt, nach weiteren
10 Tagen auf normales Kulturmedium (RPMI 1640 komplett,
1% Antibiotika, 10% L-Glutamin, 10% FCS) umgestellt.
Die positiven Kulturen wurden nach der Methode
der limitierenden Verdünnung ("limiting dilution")
kloniert. Dabei wurde derart verdünnt, daß
100 µl Kulturmedium 1 Zelle enthielten, worauf die
Vertiefungen einer 96-Loch-Platte mit diesem Volumen
beschickt wurden (es wurden insgesamt 3 Platten
angesetzt, die am Vortag je Vertiefung mit
100 µl Maus-Peritoneal-Makrophagensuspension beschickt
worden waren). Die Kulturüberstände wurden mittels
ELISA, wie oben beschrieben getestet; positive Klone
jeder Kultur wurden gepoolt, expandiert und
eingefroren.
Zur Produktion von Antikörpern in vivo wurden von den
Hybridomkulturen je ca. 107 Zellen intraperitoneal in
BALB/c Mäuse injiziert, die 2 bzw. 3 Tage vorher mit
0.5 ml inkomplettem Freundschem Adjuvans konditioniert
worden waren. Nach ca. 10 bis 14 Tagen wurde die
Ascitesflüssigkeit entnommen. Die gebildeten
monoklonalen Antikörper wurden nach Ammonsulfatfällung
mittels Affinitätschromatographie über trägergebundenes
Protein-G gereinigt.
Für die Antikörperproduktion in Zellkultur wurde
fötales Kälberserum (FCS) durch Chromatographie auf
Protein G Sepharose gereinigt, um Rinder-IgG zu
entfernen; dieses Serumpräparat wurde in einer
Konzentration von 5% für die Hybridomkulturen
verwendet. Aus den Kulturüberständen wurden die
Antikörper erneut über Protein-G-Sepharose isoliert.
Alternativ wurden die Zellen in serumfreiem Medium
(Serum-free and protein-free hybridoma medium,
Fa. SIGMA, Kat.Nr. 5-2772; USA) gezüchtet und
die Antikörper ebenso durch Chromatographie an
Protein-G-Sepharose isoliert.
Die Antikörper-Subisotypen wurden unter Verwendung
von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern
(Serotec, Oxford, GB) bestimmt: tbp-1 und tbp-6 sind
IgG1-Antikörper, tbp-2 ist ein IgG2b-Antikörper.
Im Western Blot erkannten alle drei Antikörper
TNF-BP I; tbp-1 zeigte starke Reaktivität,
tbp-2 reagierte schwächer, tbp-6 ergab nur eine
sehr schwache Färbung.
Zur Bestimmung der Epitope, die von den Antikörpern
erkannt werden, wurden die drei Antikörper tbp-1,
tbp-2 und tbp-6 sowie der von Thoma et al., (1990) durch
Immunisierung mit solubilisiertem TNF-Rezeptor
entwickelte Antikörper H398 an Meerrettich-Peroxidase
gekoppelt und mittels ELISA charakterisiert:
Testplatten wurden jeweils mit einem der unmarkierten
Antikörper (10 mg/l) beschichtet, worauf eine
Verdünnungsserie des Antigens zugegeben und
anschließend jeweils einer der Enzym-gekoppelten
Antikörper aufgetragen wurde. Dieser Versuch wurde in
allen möglichen Anordnungen durchgeführt (Fig. 1:
A: tbp-1; B: tbp-2, C: tbp-6, D: H398. Die Symbole
zeigen die Peroxidase-Konjugate: tbp-1 (gefüllte
Kreise), tbp-2 (gefüllte Quadrate), tbp-6 (gefüllte
Dreiecke), H398 (offene Kreise)). Es zeigte sich, daß
keine der einzelnen Antikörper-Spezies in der Lage war,
ein "Sandwich" zu bilden, was darauf hindeutet, daß das
Antigen als Monomer vorliegt. Kombinationen der
Antikörper tbp-1 mit tbp-2, tbp-6 oder H398 sowie
Kombinationen von tbp-2 mit tbp-6 oder tbp-6 mit
H398 waren in der Lage, dosisabhängige Signale zu
geben, während tbp-2 in Kombination mit H398 nicht
reagierte. Daraus wurde gefolgert, daß die Antikörper
drei verschiedene Epitope auf dem TNF-BP I-Molekül
erkennen; tbp-2 und H398 binden an identische oder
überlappende Epitope. Für die weitere Entwicklung wurde
eine Testanordnung gewählt, in der tbp-1 den
Beschichtungsantikörper und tbp-2 den Peroxidase
gekoppelten Antikörper darstellt.
Im Hinblick auf die Anwendung der ELISAs zum Nachweis
von TNF-BP I in Humanserum wurden zunächst verschiedene
Medien auf ihre Eignung als Verdünnungsmedium für
Proben und Standard untersucht. Während sowohl FCS als
auch Kälberserum brauchbare Dosis-Wirkungskurven
ergaben, zeigte gepooltes normales Humanserum einen
sehr hohen Leerwert. Um zu überprüfen, ob dieses
Phänomen auf unspezifische Reaktivität oder auf die
Gegenwart von Antigen zurückzuführen ist, wurde humanes
Serum über eine Affinitätssäule, enthaltend
immobilisierten TNF-α, geschickt. Als der Durchfluß der
Chromatographiesäule als Verdünnungsmedium verwendet
wurde, betrug der Leerwert etwa gleich viel wie mit
Kälberserum. Dies deutete darauf hin, daß normales
Humanserum immunreaktives und biologisch aktives
TNF-BP I enthält. Die Konzentration von TNF-BP I in dem
verwendeten Serum-Pool wurde auf ca. 1 µg/l geschätzt.
Standardkurven, die mit 50% Kälberserum erstellt
wurden, waren von denen mit 50% Humanserum, aus dem
TNF-BP I entfernt worden war, nicht zu unterscheiden.
Daher wurde das erstere Medium für alle folgenden
Versuche verwendet (von allen verwendeten Lieferungen
von Kälberserum, die von verschiedenen Firmen bezogen
wurden, erwiesen sich nur zwei als geeignet; alle
anderen zeigten niedrige Wiederfindung).
Die Etablierung und Durchführung der Tests erfolgte
nach Standardmethoden.
Zunächst wurde in Vorversuchen für die Entwicklung
eines Assays zur Bestimmung von TNF-BP I in Serum
festgestellt, daß ein sog. "zweistufiger" Assay, das
ist eine Methode, in der an die Inkubation der Probe
ein Waschschritt angeschlossen wird und die Inkubation
mit dem Antikörper-Enzymkonjugat getrennt durchgeführt
wird, keinen Vorteil gegenüber der schnelleren und
bequemeren "einstufigen" Methode bringt. In
Vorversuchen wurde weiters die Konzentration des
Beschichtungs-Antikörpers variiert, ebenso die
Inkubationszeit für die Immunreaktion.
Der optimierte Assay wurde für die Bestimmung von
TNF-BP I im Serum wie folgt durchgeführt:
96-Loch-Immunoassayplatten wurden mit dem monoklonalen
Antikörper tbp-1 bei einer Konzentration von 3 mg/l in
Beschichtungspuffer beschichtet (über Nacht bei 4°C
oder 1 h lang bei Raumtemperatur; 100 µl/Vertiefung).
Die Vertiefungen wurden einmal gewaschen und die
verbleibenden Bindungsstellen mit 200 µl Testpuffer
1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem
weiteren Waschzyklus wurden die Vertiefungen der Reihen
2 und 11 mit 100 µl 50% Kälberserum/50% PBS befüllt.
Eine Standardlösung TNF-BP I (vgl. Beispiel 1a, 20 µg/l
in 50% Kälberserum/50% PBS, 100 µl) wurde in die
Vertiefungen A2 und A11 pipettiert; serielle
Verdünnungen im Verhältnis 1 : 2 wurden in den Reihen
2 und 11 direkt in den Vertiefungen vorgenommen. Alle
anderen Vertiefungen erhielten 50 µl PBS, und die
Serumproben wurden jeweils zweifach auspipettiert
(50 µl/Vertiefung). In alle Vertiefungen wurden
50 µl einer Lösung von Peroxidase-gekoppeltem
Antikörper tbp-2 in Testpuffer gegeben, nachdem in
Vorversuchen die geeignete Verdünnung bestimmt worden
war. (Die Kopplung der Antikörper mit Meerrettich-
Peroxidase (Boehringer Mannheim) wurde nach der von
Wilson und Nakane (1978) beschriebenen Methode
durchgeführt). Die Platten wurden 3 h lang auf einem
Platten-Schüttelgerät bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Platten wurden daraufhin 3× gewaschen, Substratlösung
hinzugefügt (200 µl), die Reaktion durch Zugabe von
50 µl Stopp-Lösung unterbrochen und die
Absorptionswerte, wie oben angegeben, bestimmt. Die
Konzentrationen von TNF-BP I in den Proben wurden mit
Hilfe des Titercalc-Programms (Hewlett Packard)
berechnet.
In analoger Weise wurde ein Assay für die Analyse von
Zellkulturüberständen aufgebaut, mit dem Unterschied,
daß bei der Erstellung der Eichkurve Zellkulturmedium
mit einem Gehalt von 10% FCS eingesetzt und die Proben
unverdünnt verwendet wurden.
Für die Bestimmung von TNF-BP I im Harn wurde eine
modifizierte (zweistufige) Methode entwickelt. Die
Notwendigkeit dafür ergab sich, weil der niedrige
pH-Wert einiger Proben sowie andere, ungeklärte,
Faktoren den Test störten. Der durch den pH-Wert
bedingte Effekt konnte durch den Standard-Testpuffer
aufgrund zu geringer Pufferkapazität nicht kompensiert
werden. Es war ein starker Phosphatpuffer (0.5 M)
erforderlich, um sicherzustellen, daß auch die
sauersten Proben (pH 5) auf neutralen pH-Wert gebracht
werden konnten. Diese Maßnahme war noch nicht
ausreichend, weil einige Proben noch immer eine geringe
Wiederfindung ergaben. Dieses Problem wurde durch
Anwendung einer zweistufigen Testmethode
(aufeinanderfolgende Inkubation von Proben und
Konjugat) gelöst: Die Platten wurden beschichtet,
blockiert und gewaschen, wie für den Serum-Assay
beschrieben. Anschließend wurde eine Lösung, bestehend
aus Rinderserumalbumin (5 g/l) und Tween 20 (0.5 g/l)
in 0.5 molarem Natriumphosphatpuffer pH 7.4 in die
Vertiefungen der Platte pipettiert (50 µl/Vertiefung).
Die Eichkurve wurde mit derselben Lösung hergestellt.
Daraufhin wurden Harnproben (50 µl/Vertiefung;
2fach-Bestimmung) hinzugefügt und die Platten auf einem
Schüttelgerät 2 h lang inkubiert. Die Platten wurden
anschließend gewaschen und 100 µl einer Lösung von
Enzymkonjugat in Testpuffer zugegeben, worauf weitere
2 h inkubiert wurde. Die abschließende Behandlung der
Platten und die quantitative Bestimmung von TNF-BP I
wurden vorgenommen, wie oben für den Serumtest
angegeben.
Eine typische Eichkurve ist in Fig. 2 dargestellt
(gefüllte Kreise: Serumproben; offene Kreise:
Harnproben); sie erlaubt eine quantitative Bestimmung
von TNF-BP I in einem Konzentrationsbereich zwischen
0.3 und 10 µg/l. Die nachweisbare Mindestmenge im
Serum, definiert als Konzentration, die ein Signal
entsprechend dem Blindwertsignal plus drei
Standardabweichungen ergibt, wurde mit 0.2 µg/l
bestimmt (Mittelwert, 4 unabhängige Assays). Bei
Konzentrationen bis zu 1 mg/l (100facher Überschuß
gegenüber dem normalen Testbereich) konnte kein
"high-dose hook"-Effekt (Antigen im Überschuß)
festgestellt werden. Die Empfindlichkeit des Tests für
Harnproben war vergleichbar. Die Empfindlichkeit für
Zellkulturproben liegt im Bereich von 0.1 µg/l, da
diese Proben unverdünnt eingesetzt werden.
Die Genauigkeit des Serum-Asssays wurde überprüft,
indem Serumproben mit einem Gehalt an TNF-BP I bei
Konzentrationen von 2 und 10 µg/l in sechs
verschiedenen Tests analysiert wurden. Die Intra-Assay-
Variationskoeffizienten betrugen 4.7% bzw. 5.9%; die
Inter-Assay-Variationskoeffizienten 6.6% bzw. 7.5%.
Die Linearität wurde bestimmt, indem eine Serie von
externen Zweifachverdünnungen von TNF-BP I im Serum
(Konzentrationen zwischen 0.3 und 10 µg/l) untersucht
und die lineare Regression der experimentell bestimmten
Werte gegenüber den erwarteten Werten berechnet wurde.
In drei unabhängigen Versuchen wurden
Korrelationskoeffizienten zwischen 0.998 und
1 erhalten.
Die Wiederfindung von TNF-BP I mittels Serum-Assay
wurde untersucht, indem exogenes TNF-BP I in zwei
verschiedenen Konzentrationen (1 und 5 µg/l) dem Serum
von 7 Normalspendern zugesetzt wurde. Dieser Versuch
wurde dadurch erschwert, daß alle Proben endogenes
TNF-BP I in verschiedenen Konzentrationen enthielten;
diese Werte mußten daher vor der Berechnung der
Wiederfindung abgezogen werden. Die durchschnittliche
Wiederfindung wurde mit 83±15% bei 1 µg/l und mit
85±13% bei 5 µg/l (Bereich: 62-101% bzw.
65-105%) bestimmt.
Die Wiederfindung von TNF-BP I mittels des
modifizierten Harn-Assays in 14 Harnproben, denen
exogenes TNF-BP I zugesetzt wurde, wurde analog wie für
die Serumproben untersucht; die durchschnittliche
Wiederfindung bei einer nominalen Konzentration von
5 µg/l betrug 83±15% (Bereich: 52-104%).
Um zu bestimmen, ob die physiologischen Liganden des
TNF-Rezeptors die Wechselwirkung von TNF-BP I mit den
Antikörpern beeinflussen, wurde der ELISA bei einer
konstanten Konzentration von TNF-BP I (5 µg/l) in
Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von
rekombinantem TNF-α (Gray et al., 1984) und
rekombinantem TNF-β (Pennica et al., 1984), jeweils aus
E. coli und mit einer Reinheit von <99%, durchgeführt.
Wie sich aus Fig. 3 ergibt (in C ist der Assay-
Untergrund bei Fehlen von TNF-BP I dargestellt),
inhibiert TNF-α die Reaktivität von TNF-BP I mit den
Antikörpern bei Konzentrationen 10 µg/l; im Gegensatz
dazu zeigte TNF-β keine Wirkung auch bei sehr hohen
Konzentrationen (bis zu 100 mg/l).
Filtersterilisierte Proben von gepooltem Normalserum
wurden 24 h lang bei verschiedenen Temperaturen
gelagert; außerdem wurden die Proben mehreren
Einfrier/Auftauzyklen unterworfen. Wie sich aus Tab. 1
ergibt, beeinträchtigten weder die Inkubation bei
Temperaturen von 37°C noch das mehrfache Gefrieren und
Wiederauftauen die Immunreaktivität von TNF-BP I. Die
Proben bestanden aus gepooltem Humanserum mit einem
Gehalt von endogenem TNF-BP I (Probe 1: 1.2 µg/l) und
derselben Serumprobe mit Zusatz von exogenem TNF-BP I
(Probe 2: Endkonzentration 5 µg/l).
Die Versuche wurden durchgeführt, wie unter a)
angegeben, wobei drei Proben untersucht wurden, die ein
breites Spektrum von pH-Werten repräsentierten. Wie aus
Tab. 1 hervorgeht, war TNF-BP I in allen Proben nach
Gefrieren und Wiederauftauen stabil. Alle Proben
konnten 24 h lang bei Temperaturen bis 37°C gelagert
werden, ohne Aktivität einzubüßen. Die Harnproben
stammten von drei verschiedenen Spendern (Probe 1:
pH 5.1, 1.9 µg/l; Probe 2: pH 5.9, 4.0 µg/l; Probe 3:
pH 7.2, 3.7 µg/l). "nd" bedeutet "nicht bestimmt".
Seren von 42 normalen Spendern (Blutspender und
Laborpersonal) wurden mit Hilfe des in Beispiel 3
beschriebenen Serum-Sandwich-ELISAs untersucht.
TNF-BP I-Konzentrationen variierten zwischen 0.5 und
5.4 µg/l, bei einem Mittelwert von 2.1 µg/l
(Standardabweichung 1.0 µg/l; Fig. 4). Von zwei
Personen waren Serum, EDTA-Plasma, Citratplasma und
Heparinplasma, gewonnen zum selben Zeitpunkt,
verfügbar; die TNF-BP I-Konzentrationen unterschieden
sich nicht signifikant (Spender A: 1.7, 2.0, 1.6 und
1.9 µg/l; Spender B: 1.8, 1.8, 1.8 und 1.9 µg/l). Die
TNF-BP I-Konzentrationen in Seren von 15 Patienten mit
chronischer Polyarthritis unterschieden sich nicht
signifikant von denen gesunder Personen
(2.3±0.79 µg/l; Bereich: 1.2-3.9 µg/l). Signifikant
erhöhte Werte wurden in Seren von Patienten mit
schweren Verbrennungen gefunden (6.5±1.7 µg/l;
Bereich: 3.1-9.1 µg/l; n=10). Patienten mit
Nierenversagen (n=6) zeigten bemerkenswert hohe
Konzentrationen in einem Bereich von 20-69 µg/l
(Mittelwert±Standardabweichung: 49±17 µg/l).
Unter Verwendung des in Beispiel 3 spezifisch für
Harnproben entwickelten Sandwich-ELISA wurden die
TNF-BP I-Konzentrationen in Harnproben von
16 Normalspendern bestimmt. Sie variierten zwischen
0.78 und 4.3 µg/l (Mittelwert±Standardabweichung:
2.2±1.2 µg/l). Es gab keinen signifikanten
Unterschied zwischen weiblichen (2.1±1.4 µg/l; n=9)
und männlichen (2.2±1.0 µg/l; n=7) Spendern.
Um festzustellen, ob der entwickelte ELISA sich für den
Nachweis von TNF-BP I eignet, das von humanen
Zellkulturen produziert wird, wurde eine Reihe von
Zellinien untersucht. Kulturmedien (mit einem Gehalt
von 10% FCS) wurden von dichten Kulturen geerntet, im
allgemeinen mehrere Tage nach Verdünnung mit frischem
Medium oder nach Passage von adhärenten Zellen.
Kulturmedium mit einem Gehalt von 10% FCS wurde als
Standardverdünnungsmittel verwendet; die Assays wurden
in der einstufigen Version durchgeführt. TNF-BP I war
in Überständen der Zellinien A549 (Lungenkarzinom,;
1.1 µg/l), HeLa (Zervixkarzinom; 0.38 µg/l) und Namalwa
(Burkitt-Lymphom; 0.25 µg/l) nachweisbar, lag jedoch
unterhalb der Nachweisgrenze (100 ng/l) in den
Zellinien U937 (Histiozyten-Lymphom),
EoL-3 (eosinophile Leukämie), Raji (Burkitt-Lymphom),
HL-60 (myeloide Leukämie), U266 (Myelom) und
LuKII (B-lymphoblastoide Zellinie, immortalisiert durch
Epstein-Barr Virus). In Übereinstimmung mit früheren
Ergebnissen (Lantz et al., 1990b) wurde beobachtet, daß
HL-60-Zellen, die in Gegenwart von TNF-β (10 µg/l)
kultiviert wurden, erhöhte Mengen von TNF-BP I
freisetzten; nach 4 Tagen dieser Behandlung wurde eine
Konzentration von 0.45 µg/l erreicht.
Literatur:
Beutler B., 1988, Am. J. Med. 85, 287-288;
Beutler B. und Cerami A., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7, 625-655;
Brockhaus M. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3127-3131;
Engelmann H. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 11 974-11 980;
Engelmann H. et al., 1990 a, J. Biol. Chem. 265, 1531-1536;
Engelmann H. et al., 1990 b, J. Biol. Chem. 265, 14 497-14 504;
Gray P. W. et al., 1984, Nature 312, 721-724;
Himmler A. et al., 1990, DNA Cell Biol. 9, 705-715;
Kearney J. F. et al., 1979, J. Immunology 123, 1548-1550;
Köhler G. und Milstein C., 1975, Nature 265, 495-497;
Kohno T. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335;
Lähdevirta J. et al., 1988, Am. J. Med. 85, 289-291;
Lantz M. et al., 1990 a, Cytokine 2, 1-5;
Lantz M. et al., 1990 b, J. Clin. Invest. 86, 1396-1402;
Loetscher H. et al., 1990, Cell 61, 351-359;
Michie H. R. et al., 1988, J. Medicine 318, 1481-1486;
Offner F. et al., 1990, J. Lab. Clin. Med. 116, 100-105;
Olsson I. et al., 1989, Eur. J. Haematol. 42, 270-275;
Paul N. L. und Ruddle N., 1988, Ann. Rev. Immunol. 6, 407-438;
Peetre C. et al., 1988, Eur. J. Haematol. 41, 414-419;
Pennica D. et al., 1984, Nature 312, 724-728;
Schall T. J. et al., 1990, Cell 61, 361-370;
Seckinger P. et al., 1988, J. Exp. Med. 167, 1511-1516;
Smith C. A. et al., 1990, Science 248, 1019-1023;
Thoma B. et al., 1990, J. Exp. Med. 172, 1019-1023;
Wilson M. B. und Nakane P. K., 1978, Immunfluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier-North Holland, Amsterdam, 215-224.
Beutler B. und Cerami A., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7, 625-655;
Brockhaus M. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3127-3131;
Engelmann H. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 11 974-11 980;
Engelmann H. et al., 1990 a, J. Biol. Chem. 265, 1531-1536;
Engelmann H. et al., 1990 b, J. Biol. Chem. 265, 14 497-14 504;
Gray P. W. et al., 1984, Nature 312, 721-724;
Himmler A. et al., 1990, DNA Cell Biol. 9, 705-715;
Kearney J. F. et al., 1979, J. Immunology 123, 1548-1550;
Köhler G. und Milstein C., 1975, Nature 265, 495-497;
Kohno T. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335;
Lähdevirta J. et al., 1988, Am. J. Med. 85, 289-291;
Lantz M. et al., 1990 a, Cytokine 2, 1-5;
Lantz M. et al., 1990 b, J. Clin. Invest. 86, 1396-1402;
Loetscher H. et al., 1990, Cell 61, 351-359;
Michie H. R. et al., 1988, J. Medicine 318, 1481-1486;
Offner F. et al., 1990, J. Lab. Clin. Med. 116, 100-105;
Olsson I. et al., 1989, Eur. J. Haematol. 42, 270-275;
Paul N. L. und Ruddle N., 1988, Ann. Rev. Immunol. 6, 407-438;
Peetre C. et al., 1988, Eur. J. Haematol. 41, 414-419;
Pennica D. et al., 1984, Nature 312, 724-728;
Schall T. J. et al., 1990, Cell 61, 361-370;
Seckinger P. et al., 1988, J. Exp. Med. 167, 1511-1516;
Smith C. A. et al., 1990, Science 248, 1019-1023;
Thoma B. et al., 1990, J. Exp. Med. 172, 1019-1023;
Wilson M. B. und Nakane P. K., 1978, Immunfluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier-North Holland, Amsterdam, 215-224.
Claims (21)
1. Monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I mit der
Bezeichnung tbp-1 und tbp-2, die von den
Hybridomzellinien TBP-1 bzw. TBP-2 sezerniert
werden, oder aktive Fragmente davon.
2. Hybridomzellinien TBP-1 und TBP-2, hinterlegt bei
der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 9 10 60 555
(TBP-1) bzw. 9 10 60 556 (TBP-2).
3. Verfahren zur Bestimmung von TNF-BP I in einer
Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit
tbp-1 und/oder mit tbp-2 in Kontakt gebracht wird
und die Bildung eines binären oder ternären
Komplexes zwischen dem in der Probe enthaltenen
TNF-BP I und dem bzw. den Antikörper(n) bestimmt
wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildung eines ternären
Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes bestimmt
wird, wobei als erster Antikörper tbp-1 oder tbp-2
und als zweiter Antikörper ein solcher eingesetzt
wird, der die Fähigkeit besitzt, mit dem ersten
Antikörper einen Antikörper/Antigen/Antikörper-
Komplex zu bilden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß als erster Antikörper tbp-1 und als zweiter
Antikörper tbp-2 eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine
Körperflüssigkeit ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Körperflüssigkeit Serum ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Körperflüssigkeit Plasma ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Körperflüssigkeit Harn ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ein
Zellkulturüberstand ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß
- a) die Probe mit trägergebundenem tbp-1 in Kontakt gebracht wird,
- b) der in a) gebildete Komplex mit tbp-2 oder einem Antikörper, der in der Lage ist, mit tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper- Komplex zu bilden, in Berührung gebracht wird, wobei der in diesem Schritt eingesetzte Antikörper eine meßbare Markierung aufweist,
- c) die Menge des gebildeten Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes durch Messung der Markierung bestimmt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß in b) ein Antikörper
eingesetzt wird, der dasselbe Epitop von TNF-BP I
oder einen Bereich davon erkennt wie tbp-2.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, daß in b) ein Enzym-gekoppelter
Antikörper eingesetzt wird.
14. Verfahren zur Diagnose von pathologischen
Zuständen des menschlichen Körpers, die mit einer
Aktivierung des TNF-Rezeptorsystems verbunden
sind, insbesonderen von Zuständen, bei denen die
TNF-α-Konzentration rascher absinkt als die TNF-BP
I-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß man
in einer Körperflüssigkeit die Konzentration von
TNF-BP I bestimmt.
15. Verfahren nach Anspruch 14 zur Diagnose von
septischem Schock.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum
ist.
17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Plasma
ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration
von TNF-BP I immunologisch bestimmt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Konzentration von TNF-
BP I über dessen Bindung an tbp-1 und/oder tbp-2
bestimmt.
20. Sandwich-Immunoassay-Kit zur Durchführung des
Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, daß er in einem Behälter
tbp-1 und in einem weiteren Behälter tbp-2
enthält, wobei einer der beiden Antikörper
gegebenenfalls an einen festen Träger gebunden ist
und wobei der jeweils andere Antikörper eine
meßbare Markierung aufweist und wobei
gegebenenfalls tbp-1 oder tbp-2 durch einen
anderen Antikörper ersetzt ist, der die Fähigkeit
aufweist, mit tbp-2 bzw. tbp-1 einen
Antikörper/Antigen/ Antikörper-Komplex zu bilden.
21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß
der tbp-1 oder tbp-2 ersetzende Antikörper an
dasselbe oder an ein überlappendes Epitop von TNF-
BP I bindet wie tbp-1 bzw. tbp-2.
Priority Applications (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4120213A DE4120213C2 (de) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I) |
PCT/EP1992/001335 WO1992022666A1 (de) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | Monoklonale antikörper gegen das humane tnf-bindende protein i (tnf-bp i) |
AT92912366T ATE198770T1 (de) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | Monoklonale antikörper gegen das humane tnf- bindende protein i (tnf-bp i) |
JP51105292A JP3425146B2 (ja) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | ヒトtnf結合タンパク質▲i▼(tnf−bp▲i▼)に対するモノクローナル抗体 |
CA002107340A CA2107340C (en) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | Monoclonal antibodies against human tnf-binding protein i (tnf-bp i) |
AU19745/92A AU668351B2 (en) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) |
DE59209888T DE59209888D1 (de) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | Monoklonale antikörper gegen das humane tnf-bindende protein i (tnf-bp i) |
EP92912366A EP0589982B1 (de) | 1991-06-19 | 1992-06-13 | Monoklonale antikörper gegen das humane tnf-bindende protein i (tnf-bp i) |
US08/365,161 US5582998A (en) | 1991-06-19 | 1994-12-28 | Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) and immunoassays therefor |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4120213A DE4120213C2 (de) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4120213A1 true DE4120213A1 (de) | 1992-12-24 |
DE4120213C2 DE4120213C2 (de) | 2000-01-05 |
Family
ID=6434285
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4120213A Expired - Fee Related DE4120213C2 (de) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I) |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3425146B2 (de) |
DE (1) | DE4120213C2 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19534139A1 (de) * | 1995-09-14 | 1998-06-04 | Elsdale Ltd | Verfahren und Vorrichtung zur Vereinfachung von Verwaltungs- und Steuerungsaufgaben einer Vielzahl von Fahrzeugen |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2276049A1 (en) | 1996-12-27 | 1998-07-09 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for elevating the concentration of free insulin-like growth factor |
FR2783326B1 (fr) * | 1998-09-10 | 2000-12-01 | Immunotech Sa | Procede de detection ou de quantification des basophiles et des eosinophiles |
US9028822B2 (en) | 2002-06-28 | 2015-05-12 | Domantis Limited | Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0412486A1 (de) * | 1989-08-06 | 1991-02-13 | Yeda Research And Development Company, Ltd. | Antikörper gegen TNF-Bindungsprotein I und deren F(ab)-Fragmente |
-
1991
- 1991-06-19 DE DE4120213A patent/DE4120213C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-06-13 JP JP51105292A patent/JP3425146B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0412486A1 (de) * | 1989-08-06 | 1991-02-13 | Yeda Research And Development Company, Ltd. | Antikörper gegen TNF-Bindungsprotein I und deren F(ab)-Fragmente |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. of Immunological Methods 143, 1991, S.127-136 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19534139A1 (de) * | 1995-09-14 | 1998-06-04 | Elsdale Ltd | Verfahren und Vorrichtung zur Vereinfachung von Verwaltungs- und Steuerungsaufgaben einer Vielzahl von Fahrzeugen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3425146B2 (ja) | 2003-07-07 |
DE4120213C2 (de) | 2000-01-05 |
JPH06508743A (ja) | 1994-10-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69014474T2 (de) | Antikörper gegen TNF-Bindungsprotein I und deren F(ab)-Fragmente. | |
DE3888224T2 (de) | Bestimmung vom Tumornekrosefaktor; monoklonaler Antikörper und Zusammensetzung. | |
DE3486262T3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifizität für vernetzte Fibrinderivate und ein Testverfahren mittels dieses Antikörpers. | |
DE69432629T2 (de) | Antikörper gegen beta-amyloid oder derivative davon und seine verwendung | |
DE68924372T2 (de) | Behandlung von diabetes mellitus typ 2. | |
DE3785038T2 (de) | Monoklonale antikoerper gegen nicht reduzierte, nicht enzymatisch glykolysierte proteine. | |
DE69531311T2 (de) | Monoklonale antikörper spezifisch für endprodukte der fortgeschrittenen glycosylation in biologischen proben | |
DE68921374T2 (de) | Monoklonaler Antikörper gegen menschliche Mangan-Superoxiddismutase, Verfahren zu dessen Herstellung, Testreagens, Kit und Testmethode unter Verwendung desselben, Verfahren zur Diagnose von menschlichem Eierstockkrebs und von Herzinfarkt. | |
US5582998A (en) | Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) and immunoassays therefor | |
EP0443599B1 (de) | Nachweisverfahren von tumorassoziierten Antigenen | |
EP0589982B1 (de) | Monoklonale antikörper gegen das humane tnf-bindende protein i (tnf-bp i) | |
DE69225169T2 (de) | Gegen menschliches stromelysin gerichteter monoklonaler antikörper und diagnose rheumatischer arthritis mittels enzym-immuntest | |
DE4120213C2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I) | |
DE3485965T2 (de) | Monoklonaler antikoerper mit spezifitaet gegen nur einen typ eines isozyms der schweren kette des menschlichen herzmyosins. | |
DE69026875T2 (de) | Immunobestimmung von menschlichem osteocalcin, reagenz und satz dafür | |
DE69322847T2 (de) | Monoklonaler Antikörper gegen menschliches Ceruloplasmin | |
DE69526542T2 (de) | uPA-Bindungstelle auf 2+3 Domäne von uPAR und damit reagierende Antikörper | |
DE4107765A1 (de) | Pankreas-elastase-1-spezifischer antikoerper, ein verfahren zu seiner gewinnung und ein testkit der solche antikoerper enthaelt | |
DE3850993T2 (de) | Monoklonaler Antikörper spezifisch gegen humane Pankreas-Phospholipase-A2. | |
DE69628713T2 (de) | Marker und Reagenz für Diabetes mellitus und Diabetes-mellitus-Komplikationen | |
DE3888604T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen Antithrombinbindende Substanz und seine Verwendungen. | |
DE3686599T2 (de) | Verfahren zur bestimmung der leichten kette von myosin. | |
DE68911574T2 (de) | Reagenzsystem zur Bestimmung des Komplexes des menschlichen Plasminogenaktivator-Inhibitors und des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators und Testsatz dafür. | |
DE69129582T2 (de) | Antikörper gegen menschlichen plasmin-alpha 2-plasmininhibitor-komplex, hybridoma und immunoassay | |
DE60014616T2 (de) | Antikörper gegen plazentaprotein 13 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |