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Gegenstand
der Erfindung ist eine neue Verwendung eines Materials als eine
Semiochemikalie, zum Beispiel ein Pflanzenstresssignal, und ein
Verfahren zum Ändern
der Physiologie von Pflanzen, umfassend die Exposition von Pflanzen
gegenüber
diesem Material.
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Es
wurde berichtet, dass Methylsalicylat die Schwarze Bohnenblattlaus,
Aphis fabae, und die Getreideblattläuse, einschließlich der
Großen
Getreideblattlaus, Sitobion avenae, abwehrt und auch das Anlocken zu
ihren Wirtspflanzen inhibiert. Siehe J. Chem. Ecol. 20, 2565–2574 (1994)
(Petterson et al.) und J. Chem. Ecol. 20, 2847–2855 (1994) (Hardie et al.).
Es wurde vorgeschlagen, dass dieses Abwehren aus der Beziehung des
Methylsalicylats zu Salicylsäure
und den induzierbaren Abwehrmechanismen der Pflanze entstand, wobei
der Metabolit Methylsalicylat als ein flüchtiges und dadurch externes
Signal wirkt; das Vorliegen von Methylsalicylat signalisierte, dass
die chemische Abwehr induziert wurde und die anderweitig anlockenden
Wirtspflanzen folglich von den Blattlaus-Schädlingen als ungeeignete Wirte
wahrgenommen wurden.
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In
letzter Zeit wurde gezeigt, dass Methylsalicylat auch als ein Resistenz
gegen Pflanzenpathogene vermittelndes luftbürtiges Signal wirkt. See Nature
385, 718–721
(1997) (Shulaev et al.). Methylsalicyat wurde initial von Pettersson
et al. als eine Blattlaus-Semiochemikalie (zum Beispiel eine das
Verhalten kontrollierende Chemikalie oder ein Signal, das anderweitig
die Physiologie des Organismus beeinflusst) mittels der Gaschromatographie
(GC), die direkt an eine Aufzeichnung einzelner Zellen (Single Cell
Recording; SCR) gekoppelt ist, aus den als olfaktorischen Organen
dienenden Fühlern
identifiziert. In der Folge wurde gefunden, dass mehr als dreißig Insektenspezies,
sowohl Pflanzenfresser als auch ihre natürlichen Feinde, aus vier Ordnungen,
hochspezifische und empfindliche olfaktorische Rezeptoren für diese
Verbindung besitzen.
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WO-A-91119512
(Washington State University Research Foundation) offenbart ein
Verfahren zum Induzieren von Pflanzenabwehrmechanismen unter Verwendung
von Jasmonsäure
oder ihren Estern oder substituierte Derivate davon. Die Verbindung
induziert die Bildung der Pflanzen-Abwehrproteine, wie zum Beispiel Proteinase-Inhibitoren
und kann die Resistenz gegen Insekten, Pathogene oder Viren in Pflanzen
durch Induktion der Expression von Pflanzenabwehrgenen fördern. Die
Pflanzen können
mit der Verbindung durch direkte Applikation auf das Pflanzengewebe
oder durch luftbürtige Übertragung
der Verbindung kontaktiert werden. Die Expression der Pflanzenabwehrproteine
ist beim Schutz der Pflanzen vor den Wirkungen von Insektenattacken
nützlich,
hindert aber die zur Frage stehenden Insekten nicht daran, die Pflanzen
anzugreifen. Die Pflanzen, zusammen mit jedweden unmittelbar benachbarten
Pflanzen werden weiterhin von den Räubern angegriffen. Die Wirkung
hält überdies
im Allgemeinen nur kurz an und klingt nach der Entfernung des Stimulus wieder
ab.
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Jasmonsäure und
Methyljasmonat zusammen mit einer Anzahl anderer Materialien werden
auch von Karban und Baldwin in Induced Responses to Herbivory 12–46 (The
University of Chicago Press, Chicago, 1997) besprochen.
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Ein
anderes Material, cis-Jasmon, ist weithin als eine flüchtige Komponente
von Pflanzen bekannt, und seine Freigabe kann durch Schädigung,
zum Beispiel während
des Fressens von Baumwolle, durch Schmetterlingslarven, induziert
werden. Siehe J. Chem. Ecol., 21, 1217–1227 (1995) (Loughrin et al.).
Es ist ein Duftstoff und ist häufig
aufgrund dieser wünschenswerten
Eigenschaft verwendet worden.
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US-A-4788164
(Che et al./Hoechst Celanese Corporation) offenbart eine Zusammensetzung
mit hinhaltender Freigabe, einschließlich eines Duftstoffes oder
eines Insekten-Repellents. Ein Beispiel (Beispiel IV) verwendet
eine Lösung,
die Jasmon enthält,
um den Duft von Jasmin zu verleihen.
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US 5665344 (Pair et al./Die
Vereinigten Staaten von Amerika wie durch den Landwirtschaftsminister vertreten)
weist darauf hin, dass gefunden wurde, dass die Zusammensetzungen
von cis-Jasmon adulte Lepidoptera anlocken. Das cis-Jasmon kann
allein oder in Kombination mit einem oder mehr anderen flüchtigen Stoff(en)
der Blüte
des Japanischen Geißblatts,
insbesondere Linalool und/oder Phenylacetaldehyd, verwendet werden.
Es wird darauf hingewiesen, dass Attraktants durch Anlocken der
adulten Lepidoptera an attraktizide Köder und/oder Feldfallen für die Kontrolle
und Überwachung
dieser landwirtschftlichen Schädlinge
nützlich
sind. Das cis-Jasmon kann mit einem Insektengift oder Pestizid zum
Abtöten
dieser Schädlinge
kombiniert werden.
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WO
98 00023 A offenbart ein Verfahren zum Schutz einer Pflanze gegen
ein Pathogen, umfassend eine Verbindung, welche die Expression eines
Pflanzendefensin-Gens durch Stimulation des Jasmonat-Pfades induziert.
Als Induktoren werden Jasminsäure,
Jasmonat und Jasmonat-ähnliche
Verbindungen beschrieben.
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Chemical
Abstracts, Vol. 124, Nr. 3; 15. Januar 1996, Abstract Nr. 23889
und J. Agric. Food Chem., Vol. 44, Nr. 1, 1996, Seiten 206–209, beschreibt
ein Gemisch, das aus einer Blüte
(Japanischem Geißblatt) freigegeben
wird, das zum Anlocken von Lepidoptera fähig ist. Das Gemisch enthält 27 Verbindungen.
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Chemical
Abstracts, Vol. 99, Nr. 21, 21. November 1983; Abstract Nr. 172845
und J. Agric. Food Chem., Vol. 31, Nr. 6, 1983, Seiten 1167–1170, beschreibt
das Gemisch, das aus Akazien (Acacia berlandieri und Acacia rigidula)
freigegeben wird, das eine Fliege, Cochliomyia homonivorax, anlockt.
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Chemical
Abstracts, Vol. 114, Nr. 5, 4. Februar 1991; Abstract Nr. 39576,
und J. Chem. Ecol., Vol. 16, Nr. 9, 1990, Seiten 2647–2666, untersucht
die Riechempfindlichkeit von zwei sympatrischen Spezies von Rice Leaf
Folders (Cnaphalocrocis medinalis) für flüchtige Pflanzenstoffe einschließlich cis-Jasmon,
gegenüber
denen die Insekten empfindlich sind. Die Verbindung wird als ein
potenzielles Attraktant gehalten.
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Chemical
Abstracts, Vol. 126, Nr. 4, 27. Januar 1997; Abstract Nr. 45169
und J. Chem. Ecol., Vol. 22, Nr. 10, 1996, Seiten 1735–1766, beschreibt
die Riechempfindlichkeit von Motten gegenüber flüchtigen Pflanzenstoffen, einschließlich cis-Jasmon,
für das
ein wichtiges Signal gezeigt wird und das als ein potenzielles Attraktant
beschrieben wird.
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Chemical
Abstracts, Vol. 127, Nr. 1, 5. Januar 1998; Abstract Nr. 366208,
Helv. Chim. Acta, Vol. 80, Nr. 3, 1997, Seiten 838–850, offenbart
die Biosynthese von cis-Jasmon aus Jasmonsäure und Methyl-1,2-didehydrojasmonat
in Pflanzen.
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Chemical
Abstracts, Vol. 113, Nr. 15, 8. Oktober 1990; Abstract Nr. 129467
und Shokubutso No Kagaku Chosetsu, Vol. 24, Nr. 2, 1989, Seiten
147–150,
gibt an, dass cis-Jasmon gegenüber
der Induktion der Kartoffelknollenbildung inaktiv ist.
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Chemical
Abstracts, Vol. 122, Nr. 7, 13. Februar 1995; Abstract Nr. 76939
und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, Nr. 25, 1994, Seiten 11836–11840,
beschreibt die Emission flüchtiger
Verbindungen aus Baumwollpflanzen, die von Pflanzen fressenden Insekten
angegriffen wurden, einschließlich
cis-Jasmon.
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Biological
Abstracts, I, Vol. 96, Philadelphia, PA, USA; Abstract Nr. 467116
und Nature Biotechnology, Vol. 14, Nr. 9, 1996, Seiten 1129–1132, beschreibt
die Bildung von Paclitaxel und Baccatin, die von cis-Jasmon in der
Zellsuspensionskultur induziert wurden.
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Die
Datenbank Chemabs [online] Chemical Abstracts Service, Zugriffsnummer
129; 64289 CA und Environ Entomol., Vol. 27, Nr. 2, 1998, Seiten
395–400,
offenbart die Anlockung von Käfern
durch cis-Jasmon-Zusammensetzungen.
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Pesticide
Science, Vol. 55, Nr. 3, März
1999 (1999-03), Seiten 225–235,
bezieht sich auf semiochemische Verbindungen.
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Wir
haben nun entdeckt, dass cis-Jasmon auch direkte Signalrollen mit
Pflanzen fressenden Blattläusen
beim Anlocken von Blattlaus-Räubern
und -Parasitoiden und als eine luftbürtige Signal-induzierende Produktion
flüchtiger
Pflanzenkomponenten, einschließlich
des Monoterpens, (E)-β-Ocimen,
das die Nahrungssuche durch Parasitoide stimuliert, aufweist. Diese
Signalrolle unterscheidet sich qualitativ von der des biosynthetisch
verwandten Methyljasmonats und führt
zu einer lang anhaltenden Wirkung nach der Entfernung des Stimulus.
Im Gegensatz zu dem, was der Stand der Technik vorschlägt, kann
es zum Anlocken von Insekten, die für die Pflanzen, die sich mit
unerwünschten
Insekten befassen, oder zum Abwehren derselben vorteilhaft sein.
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Folglich
wird erfindungsgemäß die Verwendung
von cis-Jasmon als eine die Physiologie von Pflanzen verändernde
Semiochemikalie bereitgestellt.
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Eine
Semiochemikalie kann als ein chemisches Signal angesehen werden,
das eine Verhaltensänderung
oder eine andere physiologische Änderung
veranlasst, ohne im Allgemeinen jedoch direkt an diesem Verfahren
beteiligt zu sein.
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Gegenstand
der Erfindung ist die Verwendung von cis-Jasmon als ein Pflanzenstresssignal
oder anderweitig, und trifft insbesondere zu, wenn cis-Jasmon an
Pflanzen verwendet wird, um auf diese Weise das Abwehren oder Anlocken
von Insekten zu veranlassen.
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Die
Begriffe „vorteilhaft" und „unerwünscht", wenn im Zusammenhang
mit Insekten verwendet, geben entweder ihre „Erwünschtheit" für
Menschen zu erkennen oder wenn cis-Jasmon an Pflanzen verwendet
wird, ihre Erwünschtheit
für die
betreffende Pflanze zu erkennen. Wenn das cis-Jasmon jedoch an Pflanzen
zur Veränderung
der Physiologie dieser Pflanzen verwendet wird, ist die Erfindung
nicht auf die Fähigkeit
der Verbindung beschränkt,
vorteilhafte Insekten anzulocken oder unerwünschte Insekten abzuwehren.
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cis-Jasmon
kann als ein Repellent gegen Pflanzen fressende Insekten, wie zum
Beispiel Pflanzen fressende Blattläuse verwendet werden. Es ist
jedoch besonders nützlich
als ein Attraktant von vorteilhaften Insekten, einschließlich Insektenräubern und
Insektenparasitoiden, insbesondere Räubern oder Parasitoiden von
Pflanzen fressenden Blattläusen.
Es kann auch, durch Andeutung einer Pflanze unter Stress, einige
Pflanzenfresser anregen, die scheinbar geschwächte Pflanze anzugreifen.
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cis-Jasmon
kann zur Induktion der Produktion flüchtiger Pflanzen-Semiochemikalien,
wie zum Beispiel (E)-β-Ocimen,
(E,E)-α-Farnesen,
(–)-β-Caryophyllen
und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien, verwendet werden. Wir haben
gefunden, dass (E)-β-Ocimen
nach der Exposition von Pflanzen gegenüber cis-Jasmon, besonders wenn
es zur Induktion der Produktion flüchtiger Semiochemikalien aus
Bohnenpflanzen verwendet wird, besonders prävalent ist.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
wird ein Verfahren zur Veränderung
der Physiologie von Pflanzen, umfassend die Exposition der Pflanzen
gegenüber
cis-Jasmon bereitgestellt.
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Das
cis-Jasmon kann durch Applikation auf die Blätter direkt auf Pflanzengewebe
appliziert werden, bevorzugt werden Pflanzen jedoch cis-Jasmon enthaltender
Luft ausgesetzt. Das cis-Jasmon wird in einer Konzentration von
10–1000 μg pro Liter
Luft verwendet, besonders günstige
Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn das cis-Jasmon in einer
Konzentration von 50–200 μg pro Liter
Luft, insbesondere 74–125 μg pro Liter
Luft und besonders im Bereich von 100 μg pro Liter Luft verwendet wird.
Dies könnte
erreicht werden, wenn cis-Jasmon in eine enkapsulierte Form zur
Freigabe in die Luft gebracht wird.
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Das
cis-Jasmon kann zum Abwehren von Insekten von den Pflanzen oder
zum Anlocken von Insekten an die Pflanzen, wie zum Beispiel dem
Abwehren von Pflanzen fressenden Insekten, wie zum Beispiel Blattläusen, führen. Es
ist besonders nützlich,
wenn es zum Anlocken von Insektenräubern oder Insektenparasitoiden,
besonders Räubern
oder Parasitoiden Pflanzen fressender Blattläuse führt. Dieses Signal wäre von unermesslichem
Wert für
die vielen Bereiche, in denen die Regulierung der Gen-Expression,
d. h. das „Switch-on" von Genen für die verschiedenen
Anforderungen des Pflanzenschutzes, der Ernährung oder dem Zeitpunkt des
Ertrags, bevorzugt wäre.
Es wird auf das Buch Induced Responses to Herbivory (The University of
Chicago Press, Chicago, 1997) von Karban und Baldwin aufmerksam
gemacht, in dem der Bedarf an Signalen zur Induktion der Pflanzenabwehr,
wie zum Beispiel die, die den Gegenstand der Erfindung bilden, hervorgehoben
wird. Die Verwendung eines Signals führt dazu, dass die Pflanzenenergie
nicht vergeudet wird. Probleme hinsichtlich der Schädlingsresistenz
würden
durch nützliche
Gene, die ihre Produkte nur exprimieren, wenn sie benötigt werden,
umgangen.
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Folglich
schließt
die Erfindung die Verwendung von cis-Jasmon als eine Semiochemikalie
ein, welche die Physiologie von Pflanzen verändert, worin das cis-Jasmon
zur Bewirkung der Gen-Expression verwendet wird.
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Zum
besseren Verständnis
der Erfindung wird sie nun unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen
beschrieben, worin –
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1 rücktransformierte
mittlere Zahlen von Getreideblattläusen pro 60 Bestockungstrieben
von Winterweizen, Triticum aestivum, nach der Behandlung mit cis-Jasmon
am 5. Mai und 11. Juni 1999 zeigt, wobei ein Sternchen (*) einen
signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen kennzeichnet;
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2 die
von Bohnenpflanzen, Vicia faba (Fabaceae), während 48-stündigen Entrainments nach 24-stündiger Exposition
gegenüber
cis-Jasmon (100 μg/l
in Luft), produzierten (E)-β-Ocimen-Konzentrationen zeigt;
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3 zum
Vergleich mit dem vorstehenden cis-Jasmon-Beispiel, von V. faba
während
48-stündigen Entrainments
nach 24-stündiger
Exposition gegenüber
Methyljasmonat (100 μg/l
in Luft) produzierte (E)-β-Ocimen-Konzentrationen
zeigt; und
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4 die
differenzielle Expression einer Gen-spezifischen Sequenz (D251)
in Pflanzen von Vicia faba zeigt. Die Gesamt-RNA wurde aus dem Stengel-
oder Blattgewebe von Pflanzen, die der Luft, Methyljasmonat oder
cis-Jasmon ausgesetzt wurden, isoliert. Es wurden 10 μg RNA pro
Probe geladen und auf einem Formaldehydgel getrennt (Platte A).
Die Proben wurden dann an eine Nylonmembran transferiert und mit
der D251-Sequenz sondiert (Platte B). Lane 1 = Luftbehandlung (Kontrolle);
Lane 2 = Behandlung mit cis-Jasmon; Lane 3 = Behandlung mit Methyljasmonat.
Im Fall der aus dem Blattgewebe isolierten RNA resultierte nur die Behandlung
mit cis-Jasmon in Up-Regulation.
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Folgendes
bildet keinen hier beanspruchten erfindungsgemäßen Teil:
cis-Jasmon wurde
auch auf Verhaltensaktivität
mit den Alata-Formen der Salatblattlaus, Nasonovia ribis-nigri (Homoptera:
Aphidiae) in einem 4-Wege-Olfaktometer untersucht, und es wurde
als signifikant abwehrend befunden (die mittlere Zahl der Einschlüsse in den
Behandlungsarm betrug 2,0 ± 0,58,
wohingegen die mittlere Zahl der Einschlüsse in die Kontrollarme 4,3 ± 0,58
betrug; die im Behandlungsarm verbrachte mittlere Zeit betrug 0,5 ± 0,16
Minuten, wohingegen die in den Kontrollarmen verbrachte mittlere
Zeit 2,1 ± 0,36
Minuten betrug; P = < 0,05).
Die Abwehr wurde auch in vorläufigen
Feldversuchen mit Sommermorphen der Hopfenblattlaus, Phorodon humuli,
mit der das Fangen in Wasserfallen mit visueller (gelber) Anlockung
durch eine langsame Freisetzung von cis-Jasmon (2,05 μg/Tag/Falle)
um 40% reduziert war (P < 0,04).
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Es
wurden auch Experimente mit dem Fangen in Fallen im Feld unter Verwendung
von cis-Jasmon gegen Rapsglanzkäfer
(Meligethes spp.) durchgeführt.
Anlockende gelbe Schalenfallen in einer Höhe von 1 m und mit einem Abstand
von 10 m wurden im Design eines lateinischen Quadrats platziert
(eine Reihe des lateinischen Quadrats = ein Replikat; die Fallen
werden auf die nächste
Reihe des Quadrats rerandomisiert, wenn ein Mittelwert von 10 Käfern pro
Falle gefangen wird). Die Fänge
in einer Schale ohne Köder
wurden mit den Schalen verglichen, die als Köder cis-Jasmon enthielten,
das in zwei verschiedenen Raten freigesetzt wurde. Die Analyse wurde
mittels ANOVA an Daten des transformierten Gesamtfanges vorgenommen.
Die verwendete Transformation betrug x = log10(y
+ 1), worin x und y die transformierten bzw. nicht transformierten Daten
darstellen. Die transformierten Mittelwerte wurden unter Verwendung
des LSD-Tests (LSD = Least Standard Difference) verglichen und rücktransformiert,
um die in Tabelle 1 ersichtlichen Ergebnisse zu geben.
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TABELLE
1. Experimente mit dem Fangen mit Fallen im Feld unter Verwendung
von cis-Jasmon gegen Rapsglanzkäfer.
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Die
Mittelwerte in der gleichen Spalte, gefolgt von den verschiedenen
Buchstaben, sind signifikant unterschiedlich. P < 0,05. Die Zahlen in Klammern stellen
die prozentuale Reduktion des Fanges in der Falle im Vergleich zur
Falle ohne Köder
dar.
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1 zeigt
den Vergleich der mittleren Zahlen der Getreideblattläuse auf
mit cis-Jasmon behandelten und nicht behandeltem Land in Feldstudien
an fünf
Stichprobendaten. Die Daten wurden zur einfacheren Präsentation
aus den logarithmischen Werten rücktransformiert.
Die Blattlauszahlen waren in Landstücken mit cis-Jasmon konsistent
niedriger und unterschieden sich an den letzten zwei Stichprobendaten
signifikant von der Kontrolle. Bei den prädominanten Blattlausspezies
handelte es sich um Metopolophium dirhodum, die Bleiche Getreideblattlaus.
S. avenae und Rhopalosiphum padi waren auch vorhanden, aber die
Zahlen waren sehr niedrig. Die Zahlen parasitisierter Blattläuse waren
auch niedrig, und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen
den Behandlungen beobachtet.
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Da
Semiochemikalien, die als Repellents oder Inhibitoren der Wirtsanlockung
für Pflanzen
fressende Insekten wirken, die häufig
am Prädatismus
oder Parasitismus beteiligt sind, wurde auch die Aktivität von cis-Jasmon
bei höheren
trophischen Konzentrationen untersucht. Folglich wurde gezeigt,
dass der Siebenpunkt-Marienkäfer,
Coccinella septempunctata (Coleoptera: Coccinellidae), ein wichtiger
Blattlausräuber,
an eine Quelle der Verbindung im Olfaktometer angelockt wird (die
mittlere Anzahl der Beobachtungen im Behandlungsarm betrug 4,1 ± 1,55,
wohingegen die mittlere Anzahl der Beobachtungen in den Kontrollarmen
2,4 ± 0,69
betrug; P = < 0,005).
Die Responses des Blattlaus-Parasitoiden Aphidius ervi (Hymenoptera:
Braconidae), der vorzugsweise Blattläuse angreift, die Pflanzen
in den Fabaceae kolonisieren, wurden auch in einem Windtunnel untersucht
und wiesen nach, dass cis-Jasmon in einem Single-Choice-Test als
Attraktant wirkte (Tabelle 2). Diese Experimente deuten auf eine
Verhaltensrolle für
cis-Jasmon bei der Beeinflussung der Interaktionen zwischen Pflanzen,
Pflanzen fressenden Insekten und ihren Räubern und Parasitoiden hin.
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TABELLE
2. Responses von A. ervi im Windtunnel auf synthetische Verbindungen
(10 μg)
auf Filterpapier (Single-Choice-Test).
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ANOVA-Analyse
F = 16,19, P = < 0,01.
Die Werte, gefolgt von einem anderen Buchstaben sind bei P = < 0,05 signifikant
unterschiedlich (Tukey's
Multiple Comparison-Test).
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Unter
Rückkehr
zur beanspruchten Erfindung wurde eine mögliche Rolle für die Verbindung
als ein luftbürtiges
Pflanzensignal unter Verwendung der Ackerbohne, V. faba (cv. The
Sutton) untersucht. Die Pflanzen wurden 24 Stunden in reiner Luft
oder in Luft gehalten, die cis-Jasmon bei 100 μg/l inkorporierte; anschließend wurden
Proben von flüchtigen
Stoffen, die durch die Pflanze freigegeben wurden, durch Entrainment über 4 Perioden
von 48 Stunden, d. h. bis zu 192 Stunden nach dem Ende der Behandlung
erhalten. Das cis-Jasmon selbst war nach 48 Stunden nicht nachweisbar.
Die (E)-β-Ocimen-Konzentrationen,
die durch die dem cis-Jasmon exponierten Pflanzen freigegeben wurden, erhöhte sich über die
Entrainment-Periode von 192 Stunden signifikant und waren in allen
4 Proben 2½-
bis 3-mal höher
als die von den Kontrollpflanzen (
2). Es lag auch
von einigen Replikaten eine Steigerung von (E,E)-α-Farnesen,
(–)-β-Caryophyllen
und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien vor. Alle diese Verbindungen
waren bei der von Pflanzen fressenden Insekten-induzierten Produktion
impliziert und erhöhten
die Nahrungssuche von Parasitoiden. Das Nonatrien kann auch von
Natur aus durch Pflanzen produziert werden, die die Schädigung zur
Abwehr gegen Pflanzenfresser imitieren und die folglich für Parasitoide
attraktiv sind. (E)-β-Ocimen
und (E,E)-α-Farnesen
wurden mit A. ervi im Windtunnel untersucht, und es erwies sich,
dass beide Verbindungen im Single-Choice-Test anlockend sind (Tabelle
2). Diese Aktivität
und die erhöhten
Konzentrationen dieser Verbindungen, die durch V. faba nach der
Behandlung mit cis-Jasmon produziert wurden, wiesen darauf hin,
dass eine vermehrte Nahrungssuche und Anlockung von A. ervi an die
behandelten Pflanzen im Vergleich mit den Kontrollen vorhanden sein
könnte.
Tatsächlich
waren V. faba-Pflanzen, die 48 Stunden nach der Behandlung gewonnen
wurden, als die cis-Jasmon-Konzentrationen nicht nachweisbar waren,
im Single-Choice-Test signifikant attraktiver für A. ervi im Windtunnel als
unbehandelte Pflanzen (Tabelle 3a). Ein Windtunnel-Experiment, in
dem A. ervi eine Auswahl behandelter oder nicht behandelter Pflanzen
angeboten wurde, wies überdies
nach, dass im Vergleich zur Kontrolle über 3-mal so viele Parasitoide
in Richtung der mit cis-Jasmon behandelten Pflanze gerichtet waren
(Tabelle 3b). TABELLE
3. Responses von A. ervi im Windtunnel auf V. faba-Pflanzen 48 h
nach Exposition gegenüber cis-Jasmon
(100 μg/l
in Luft) (a)
Single-Choice-Test
![Figure 00070001](https://patentimages.storage.***apis.com/c1/ad/7b/cfc41b8106586c/00070001.png)
χ
2 = 6,62 (Kontingenz-Test unter Verwendung
von Pearson am GenStat). P = < 0,01. b)
Dual-Choice-Test (behandelte Pflanze versus Kontrollpflanze)
χ
2 = 5,762 (χ
2-Test).
P = 0,05.
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Zum
Vergleich mit cis-Jasmon untersuchten wir auch die Aktivität von Methyljasmonat
mit V. faba unter den gleichen Bedingungen wie für cis-Jasmon. In diesem System
erhöhte
die Exposition gegenüber
Methyljasmonat nicht signifikant die freigegebenen (E)-β-Ocimen-Konzentrationen
(3). Dies weist darauf hin, dass cis-Jasmon, als
ein luftbürtiges
Signal, Eigenschaften aufweist, die sich von denen von Methyljasmonat unterscheiden.
cis-Jasmon ist eng mit der Jasmonsäure verwandt, wobei es sich
um das Produkt von weiterer Katabolisierung, d. h. β-Oxidation,
Dehydratation und Decarboxylierung handelt, obwohl die genaue Route noch
nicht berichtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass cis-Jasmon, anstelle
lediglich als ein anderer sich von Lipooxygenase herleitender flüchtiger
Stoff und eine Senke für
Jasmonsäure
angesehen zu werden, es vielmehr als ein potenziell wichtiges luftbürtiges Pflanzensignal betrachtet
werden sollte, das sich auf andere Aspekte der Pflanzensignalvorgänge bezieht.
Es sollte auch zur Kenntnis genommen werden, dass cis-Jasmon viel
flüchtiger
als Methyljasmonat ist und als solches eine wirksamere Signal-Verbindung
darstellen könnte.
Wir haben nachgewiesen, dass cis-Jasmon alles andere als biologisch
inaktiv ist, sondern bei allen drei in dieser Studie untersuchten
trophischen Konzentrationen über
eine Aktivität
verfügt.
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Wir
haben deshalb eine Verbindung identifiziert, die zur Induktion der
Produktion dieser Verbindungstypen als ein luftbürtiges Signal, nämlich cis-Jasmon,
einer extrem benignen Verbindung, die für Menschen ein angenehmes Aroma
aufweist, fähig
ist.
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VERFAHREN
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Elektrophysiologie
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Es
wurden Elektroantennogramm-Aufzeichnungen (EAG-Aufzeichnungen) von
Alata von N. ribis-nigri unter Verwendung von mit Kochsalzlösung gefüllten Ag-AgCl-Glaselektroden,
wie in J. Exp. Biol. 51, 71–97 (1969)
(Maddrell), aber ohne die Glucose, hergestellt. Das Insekt wurde
durch Kühlen
anästhesiert,
und der Kopf wurde exzidiert und auf der indifferenten Elektrode
aufgezogen. Die Spitze der Aufzeichnungselektrode wurde entfernt,
so dass ihr Innendurchmesser gerade weit genug war, um den terminalen
Fortsatz der Fühler aufzunehmen.
Die Signale wurden durch einen Verstärker mit hoher Impedanz (UN-03b,
Syntech) geleitet und auf einem Oszilloskop angezeigt.
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Gekoppelte Gaschromatographie
(GC)-Elektrophysiologie
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Das
gekoppelte GC-Elektrophysiologiesystem, in dem der Ablauf aus der
Kapillarsäulen-GC
simultan zur Fühler-Präparation
und an den zuvor beschriebenen GC-Detektor geleitet wird. Siehe
Wadhams in Chromatography and Isolation of Insect Hormones and Pheromones
(Hrsg. McCaffery et al.) 289–298
(Plenum Press, New York, 1990). Die Trennung der Luft-Entrainment-Probe
wurde an einem AI 93 G erreicht, der mit einem kalten On-Column-Injektor
und einem Flammenionisationsdetektor (FID) ausgerüstet war.
Die Säule
(30 m × 0,53
mm ID, HP-1) wurde 2 min bei 40°C
gehalten und dann bei 10°C/min
auf 250°C
programmiert. Das Trägergas
war Wasserstoff Die Ausgänge
aus dem EAG-Amplifier und des FID wurden simultan an einem Registrierschreiber überwacht.
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Olfaktometrie: Blattläuse
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Es
wurden Verhaltensassays in einem PerspexTM-Olfaktometer, ähnlich dem
in J. Entomol. Scand. 1, 63–73
(1970) (Pettersson) beschriebenen, mit einem schwachen Luftstrom
der in Richtung des Zentrums von jedem der 4 Seitenarme gerichtet,
durchgeführt.
Die Testverbindung (1 μg)
in Hexan (10 μl)
wurde auf Filterpapier (Whatman Nr. 1) am Ende eines der Seitenarme
gegeben, wobei Hexan allein als eine Kontrolle in den anderen Armen
verwendet wurde. Eine Virginopara alata von N. ribis-nigri wurde
in das Zentrum der Arena gegeben und ihre Bewegungen über 10 min
beobachtet. Der Apparat, der bei 24°C gehalten wurde, wurde von oben
durch das Fluoreszenzrohr erleuchtet und wurde alle 2,5 min um 90° rotiert,
um jedwede Richtungsverzerrung zu vermeiden. Das Experiment wurde
6-mal wiederholt und die Ergebnisse anhand des Studentschen t-Tests
analysiert.
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Olfaktometrie: Marienkäfer
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Der
Apparat und die Methodik waren ähnlich
denen, die für
Blattläuse
(vorstehend) eingesetzt wurden. Die Testverbindung wurde in 0,5 μl fassenden
Microcaps (Drummond Sci. Co.) am Ende von einem der Seitenarme appliziert,
und jeder Arm wurde mit feuchtem Filterpapier zur Minimierung der
Unterschiede der relativen Feuchtigkeit versehen. In das Zentrum
der Arena wurden individuelle C. septempunctata eingeführt und ihre
Positionen über
20 min alle 2 min notiert. Das Experiment wurde 8-mal wiederholt
und die Ergebnisse wie vorstehend analysiert.
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Windtunnel-Studien
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Naive
weibliche A. ervi wurden, wie in J. Chem. Ecol. 16, 381–396 (1996)
(Poppy et al.) beschrieben, in einen Windtunnel geflogen. Die Parasitoide
wurden 25 cm in Windrichtung (Single Choice Test) oder 40 cm in
Windrichtung (Dual-Choice-Test) des Targets freigesetzt, bei dem
es sich entweder um eine Pflanze oder synthetische Verbindung (10 μg in 10 μl Hexan)
handelte, die auf einen 2 × 1
cm großen
Filterpapierstreifen (Whatman Nr. 1), umgeben von einem Ring aus
grünem
Krepppapier gegeben wurde. Die Anteile der Parasitoide, die auf
die synthetischen Chemikalien mit einem gerichteten Flug reagierten,
wurden an drei separaten Tagen jeden Tag berechnet. Diese Werte
wurden dann einer Logit-Transformation zur Normalisierung der Daten
vor der Analyse mittels ANOVA, gefolgt von den Tukey's Post-hoc-Tests
unterzogen. Die Anzahl der Parasitoiden, die sich gegen den Wind
an das Einzelpflanzentarget richten, wurden aufgezeichnet und einem χ2-Kontingenz-Test (Pearson-Verfahren am GenStat – siehe
GenStat 5 Ausschuss. GenStat 5 Reference Manual, Release 3 (Clarendon
Press, Oxford, 1993)) zur Bestimmung, ob eine Richtungs-Response
mit dem Typ der Pflanzenbehandlung verknüpft war. Die Zahlen, die sich
im Dual-Choice-Test an jede Pflanze richteten, wurden mittels eines χ2 zur Bestimmung analysiert, ob eine Pflanze
anlockender als die andere war.
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Feldstudien
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Landstücke (6 m × 6 m) mit
Winterweizen, Triticum aestivum (cv. Consort) wurden in einem 5 × 5 quasi-kompletten
lateinischen Quadratdesign angeordnet. Die fünf mit cis-Jasmon behandelten
Landstücke
wurden am 5. Mai und 11. Juni 1999 unter Verwendung einer Handhydraulikvorrichtung
bei einer Rate von 50 g Wirkstoff/ha in 200 l/ha wässrigem
Ethylan BV (0,1%) gesprüht.
Die Kontrolllandstücke
waren unbehandelt. Die Getreideblattläuse und parasitisierten Blättläuse wurden
bei 8 Gelegenheiten zwischen Anfang Mai und Mitte Juli gezählt. Bei
jeder Zählung
wurden fünf
Bestockungstriebe an 12 getrennten Orten an zwei diagonalen Transekten,
insgesamt 60 Bestockungstriebe pro Landstück, untersucht. Transformierte
Daten (y = log(y + 1)) wurden ANOVA unterzogen und die Quadratsummen
der Behandlungen wurden zum Testen auf signifikante Unterschiede
verteilt.
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Induktionsstudien
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Bohnenpflanzen,
V. faba (cv. The Sutton) wurden unter Standard-Gewächshausbedingungen
bis zum 2- bis 4-Blattstadium gezogen, an welchem Zeitpunkt die
Erde von ihnen abgespült
wurde und sie in ofengetrocknete, gewaschenen Sand enthaltende Glassgefäße, mit
3 Pflanzen pro Gefäß, transplantiert
wurden. Diese wurden zum Akklimatisieren 1–2 Tage stehen lassen. Die
zu behandelnden Pflanzen (drei Behälter mit je drei Pflanzen)
wurden 24 h in einem 25 l fassenden Glastank eingeschlossen, wobei
entweder cis-Jasmon oder Methyljasmonat (2,5 mg) auf ein Stück Filterpapier
(Whatman Nr. 1) appliziert und auf den Boden des Tanks gebracht
wurde. Behandelte oder unbehandelte Pflanzen wurden dann in 101
fassende Entrainment-Glasgefäße gegeben
und die flüchtigen
Stoffe aus jedem über
48-Stunden-Perioden über
192 Stunden gesammelt. Siehe Blight in Chromatography and Isolation
of Insect Hormones and Pheromones (Hrsg. McCaffery et al.) 289–298 (Plenum,
New York, 1990). Flüchtige
Stoffe wurden aus Glasrohren, enthaltend Porapak Q (50 mg), unter
Verwendung von frisch destilliertem Diethylether (500 μl) eluiert
und dann auf 100 μl
zur Analyse mittels GC und GC-MS konzentriert.
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Analyse
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Die
GC-Analyse wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard 5890 GC,
der mit einem Temperatur-programmierbaren On-Column-Injektor und
FID ausgerüstet
war, durchgeführt.
Dieser wurde mit HP-1-Säulen
(50 m × 0,32
mm ID) und SPB-35 (30 m × 0,32
mm ID) mit Wasserstoff als Trägergas
versehen. Der Ofen wurde 1 min bei 40°C gehalten, dann bei 10°C/min auf
250°C programmiert.
Die GC-MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard 5890
GC durchgeführt,
der an ein VG Autospec-Massenspektrometer (Fisons Instruments) angeschlossen
war. Die Ionisierung erfolgte durch Elektronenstoß bei 70
eV, 230°C.
Die GC wurde 5 min bei 30°C
aufrechterhalten, dann bei 5°C/min
auf 180°C
programmiert. Die Nachweisgrenzen für cis-Jasmon in den Entrainment-Proben
betrugen 40 pg/Stunde für
GC und 400 pg/Stunde für GC-MS.
Die anhand der GC/GC-MS identifizierten Verbindungen wurden durch
Coinjektion von authentischen Proben auf HP-1-Säulen (nicht polar) und SPB-35-Säulen (polar)
identifiziert. Authentische Proben wurden aus gewerblichen Quellen
erhalten, mit Ausnahme von (E)-β-Ocimen,
(E,E)-α-Farnesen
und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien, die anhand von Standardverfahren
wie folgt synthetisiert wurden.
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(E,E)-α-Farnesen und (E)-β-Ocimen
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(E,E)-α-Farnesen
und (E)-β-Ocimen
wurden aus 3-Methyl-2,5-dihydrothiophen-1,1-dioxid synthetisiert.
Siehe J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1984, 1323 (Chou et al.). Die Schwefeldioxid-Elimination
wurde unter Verwendung von einem Überschuss Lithiumaluminiumhydrid
unter Befolgung eines modifizierten Protokolls, das auf dem in Tetrahedron
Lett., 1977, 11, 947 (Gaoni) basierte, erreicht.
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Einer
gerührten
Suspension aus Lithiumaluminiumhydrid (1 Gew.-Äquiv.) in einem rückfließenden trockenen
Diethylether (10 mmol/ml) wurde tropfenweise über eine Spritze eine Lösung aus
dem Dihydrothiophen-1,1-dioxid (1 Äquiv.) in trockenem Diethylether
(1 ml) zugefügt.
Nach 1-stündigem
Rückfluss
wurde das gekühlte
(0°C) Gemisch
mit 15% NaOH (1 ml), Wasser (3 ml) behandelt und das Gemisch durch
CeliteTM filtriert. Die Verdampfung des
Filtrats unter reduziertem Druck, gefolgt von der Säulenchromatographie über Florisil
(100% Hexan) ergab das Produkt als ein farbloses Öl.
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4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien
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4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien
wurde in zwei Schritten aus Geraniol synthetisiert. Geraniol (7,0
g, 0,045 mol, 1 Äquiv.),
Mangan(IV)-dioxid (100,0 g) und Dichlormethan (500 ml) wurden bei
Umgebungstemperatur über
Nacht zusammen gerührt.
Das Gemisch wurde durch CeliteTM filtriert,
und das Filtrat unter Vakuum konzentriert, um Geranial (5,42 g,
80%) zu ergeben. Eine gekühlte
(–15°C) gerührte Suspension
aus Methyltriphenylphosphoniumiodid (16,0 g, 0,039 mol, 1,1 Äquiv.) in
Tetrahydrofuran (50 ml) und Diethylether (50 ml) wurde mit n-Butyllithium
(2,5 M; 16 ml, 0,039 mol, 1,1 Äquiv.)
behandelt. Nach 0,25 Stunden wurde Geranial (5,42 g, 0,036 mol,
1 Äquiv.)
zugefügt,
und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur rühren lassen. Das
Gemisch wurde zwischen Diethylether (200 ml), Wasser (200 ml) und
Petrolether, S. P. 40–60°C (200 ml), verteilt
und die organische Schicht getrocknet (MgSO4)
und unter Vakuum konzentriert, um ein Rohöl zu ergeben, das der Säulenchromatographie über FlorisilTM (100% Hexan) unterzogen wurde, um das
Nonatrien als ein farbloses Öl
(3,42 g, 64%) zu erhalten.
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DIFFERENTIAL
DISPLAY
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Zur
Bestimmung, ob cis-Jasmon zur Induktion von Änderungen der Pflanzengenexpression
in der Lage war, wurde das empfindliche Verfahren des Differential
Display an RNA durchgeführt,
die aus Pflanzen extrahiert wurde, die der Luft, Methyljasmonat
oder cis-Jasmon ausgesetzt worden waren. Es wurde beobachtet, dass
eine Anzahl der resultierenden PCR-Produkte in Gegenwart von cis-Jasmon Änderungen
in ihrer Abundanz erkennen ließen.
Zur Bestätigung
dieser Beobachtung wurden Bande von Interesse durch Exzision aus
dem getrockneten Gel rückgewonnen
und mit dem entsprechenden Paar von Oligonukleotid-Primern reamplifiziert.
Die resultierenden PCR-Produkte wurden zur Bestätigung der homogenen Beschaffenheit
des amplifizierten Produkts kloniert und sequenziert. Diese Sequenzen
wurden dann zum Sondieren der aus der Kontrolle oder behandelten
Pflanzen von V. faba isolierten RNA verwendet. Wie aus 4 ersichtlich
ist, wurde von einer bestimmten Sequenz (D251) gezeigt, dass sie
in Blattgewebe nur in Gegenwart von cis-Jasmon up-reguliert wurde.
Wenn diese gleiche (klonierte) Sequenz interessanterweise zum Sondieren
von aus den Stengelgeweben von V. faba isolierter RNA verwendet
wurde, wurde sie in Pflanzen, die mit entweder cis-Jasmon oder Methyljasmonat
behandelt wurden, auf ein ähnliches
Niveau up-reguliert. Es ist wichtig, dass man zur Kenntnis nimmt,
dass die Beschaffenheit des Differential Display-Verfahrens kurze
Gen-spezifische Sonden, enthaltend hauptsächlich 3' untranslatierte Regionen transkribierter
Sequenzen herbeiführt,
und deshalb der funktionelle Teil des differenziell exprimierten
Genes unbekannt ist.
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Folglich
haben wir unter Verwendung des Differential Display und des bestätigenden
Northern Blotting gefunden, dass Methyljasmonat und cis-Jasmon scheinbar
distinkte Wirkungen auf die Expression von Pflanzengenen aufweisen.
In dieser Studie wurde das durch Differential Display angezeigte
PCR-Produkt D251 kloniert und zum Sondieren von Northern Blots aus
Blatt- und Stengelgeweben von mit Luft, Methyljasmonat und cis-Jasmon
behandelten Pflanzen von V. faba verwendet. Hierbei zeigte sich
deutlich (4), dass während die D251-Sequenz durch
Behandlung mit Dämpfen
von beiden Verbindungen in Stengelgewebe up-reguliert wurde, nur
cis-Jasmon zu einer Steigerung des Transkript-Niveaus im Steady-state
dieser Sequenz in Blattgewebe führte.
Folglich weisen die beiden Verbindungen eine distinkte Wirkung auf
die Expression des Pflanzengens auf, und die Response dieser Signal-Verbindungen
könnte
gewebespezifisch sein.