FI111738B - Rhodococcus rhodochrous-kanta nitriilihydrataasin tuottajana - Google Patents

Rhodococcus rhodochrous-kanta nitriilihydrataasin tuottajana Download PDF

Info

Publication number
FI111738B
FI111738B FI953865A FI953865A FI111738B FI 111738 B FI111738 B FI 111738B FI 953865 A FI953865 A FI 953865A FI 953865 A FI953865 A FI 953865A FI 111738 B FI111738 B FI 111738B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
strain
nitrile hydratase
activity
urea
units
Prior art date
Application number
FI953865A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI953865A (fi
FI953865A0 (fi
Inventor
Alexandr Stepanovich Yanenko
Olga Borisovna Astaurova
Sergei Petrovich Voronin
Tatyana Vasilievna Gerasimova
Nikolai Borisovich Kirsanov
Vladimir Nikolaevich Paukov
Inga Nikolaevna Polyakova
Vladimir Georgievich Debabov
Original Assignee
Gnii Genetiki I Selektsii Prom
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gnii Genetiki I Selektsii Prom filed Critical Gnii Genetiki I Selektsii Prom
Publication of FI953865A0 publication Critical patent/FI953865A0/fi
Publication of FI953865A publication Critical patent/FI953865A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI111738B publication Critical patent/FI111738B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

111738
Rhodococcus rhodochrous -kanta nitriilihydrataasin tuottajana
Tekniikan alue 5 Esillä oleva keksintö koskee bioteknologiaa ja sel laisen uuden bakteerikannan valmistusta, jolla on korkea nitriilihydrataasiaktiivisuus, joka kanta on tarkoitettu käytettäväksi prosesseissa, joissa nitriileistä tuotetaan amidej a.
10 Tekniikan tason yhteenveto
Nitriilihydrataasientsyymi, joka kykenee katalysoimaan nitriilien muutoksen amideiksi, on tunnistettu useissa bakteerisuvuissa. Jotta nitriilihydrataasia tuotettaisiin bakteerin kasvuprosessissa, on ravintoalustaan tar-15 peen lisätä indusoijaa. Indusoijina voidaan käyttää orgaanisten happojen nitriilejä ja amideja (viitteinä US-pa-tentti numero 4 555 487; EP-patentti numero 0 109 083; EP-patentti numero 0 204 555), ureaa tai sen johdannaisia (EP-patenttihakemus numero 0 362 829). Alalla on aiemmin 20 tunnettu Corynebacterium N 774 (US-patentti numero 4 248 968) ja Rhodococcus sp. S-6 -kannat (US-patentti • * numero 5 179 014), jotka eivät vaadi mitään indusoijaa.
: : Kannan N774 haitat ovat sen matala nitriilihydrataasiak- : tiivisuus (sen spesifinen aktiivisuus on 50 - 60 yksik- •'·'; 25 köä/mg, jota tässä ja tämän jälkeen mitataan arvona μΜ : «·. akryyliamidia/min/mg soluja, joka perustuu kuivamateriaa- , · Iin painoon), sen kapea nitriilisubstraattikirjo (ainoas taan alifaattiset nitriilit), sen entsyymien matala lämpö-,, . stabiilisuus (optimaalinen N774-kannan vaikutuslämpötila 30 on 35 °C). Kannan S-6 haitat ovat sen kyky hydratoida tuo- '*··' tetut amidit hapoiksi, jolloin amidien laatuun vaikutetaan : selvästi. Lisäksi kannalla S-6 on matala nitriilihydrataa sin lämpöstabiilisuus (ei enempää kuin 30 °C) ja matala • tuottokyky (se ei kykene akkumuloimaan enempää kuin 20 % 35 akryyliamidista liuoksessa). Kalliita ravintoalustakompo- 2 111738 nentteja (kuten peptonia, hiivauutetta, lihauutetta) käytetään molempien kantojen, N774 ja S-6, kasvatukseen.
Mitä tulee tekniseen olemukseen ja saavutettuun tulokseen, kanta Rhodococcus rhodochrous J1 (EP-patentti-5 hakemus numero 0 362 829), joka sisältää nitriilihydrataa-siaktiivisuuden mitä tulee alifaattisiin ja aromaattisiin nitriileihin, tulee lähimmäksi esillä olevaa keksintöä. Yllä mainittu kanta on kuitenkin epäedullinen sen tosiseikan vuoksi, että sen viljelemiseksi on tarpeen käyttää 10 ravintoalustaa, joka sisältää vitamiineja, hiivauutetta ja peptonia. Toinen haitta on se tosiasia, että kanta J1 tekee tarpeelliseksi korkeiden (7,5 - 12 g/1) ureakonsen-traatioiden käytön indusoijana. Näin ollen kun kantaa kasvatetaan alustassa ilman ureaa, spesifinen nitriilihydra-15 taasiaktiivisuus on niin matala kuin 3,35 yksikköä/mg (ko-konaisaktiivisuus on 17,7 yksikköä/ml, jota tässä ja tämän jälkeen mitataan arvona μΜ akryyliamidia/min/ml viljely-alustaa). Kun alustassa on ureaa 7,5 g/1, spesifinen aktiivisuus saavuttaa arvon 497 yksikköä/mg kokonaisaktiivi-20 suuden ollessa 2 480 yksikköä/ml. On huomattava, että urealla on kaksoisrooli, nimittäin: sitä käytetään typen-f · lähteenä ja nitriilihydrataasin indusoijana. Ureamäärä, ; : joka ei ylitä konsentraatiota 2 g/1, on riittävä kannan kasvamiselle (jolloin kannan J1 spesifinen nitriilihydra-·*·’; 25 taasiaktiivisuus saavuttaa arvon 36,5 yksikköä/mg koko- : naisaktiivisuuden ollessa 189 yksikköä/ml), kun taas kor- * * · * * · · keat ureakonsentraatiot ovat tarpeen ainoastaan induktiota varten. Tästä syystä alustaan jää melkoinen määrä ureaa , sen jälkeen kun siinä on kasvatettu kantaa Jl.
• » I
• ·’ 30 Esillä olevan keksinnön kuvaus • | '...· Esillä olevan keksinnön aihe on tuottaa sellainen : kanta, jolle on ominaista korkea nitriilihydrataasiaktii- ,···, visuus, jota samalla kasvatetaan yksinkertaisessa synteet- tisessä alustassa, joka ei sisällä mitään vitamiineja, ’ 1 35 aminohappoja tai muita yhdisteitä, jotka toimivat nitrii- » * I t « 3 111738 lihydrataasin synteesin indusoivina (nitriilit, amidit tai urea).
Yllä formuloitu aihe suoritetaan kehittämällä kanta Rhodococcus rhodochrous M33, joka kykenee indusoijien 5 poissa ollessa konstitutiivisesti tuottamaan nitriilihyd-rataasia alifaattisten nitriilien, kuten esim. akrylonit-riilin, ja aromaattisten nitriilien, kuten esim. 3-syaani-pyridiinin, hydrolyysin katalysoimiseksi vastaaviksi amideiksi, kuten esim. akryyliamidiksi ja nikotiiniamidiksi. 10 Esillä olevan keksinnön mukainen kanta kykenee urean poissa ollessa tuottamaan nitriilihydrataasia, jonka spesifinen aktiivisuus on 200 - 457 yksikköä/mg, ja kokonaisak-tiivisuus on 360 - 350 yksikköä/ml (riippuen käytetystä hiilenlähteestä), ja kun alustassa on 2 g ureaa/1, 180 15 yksikköä/mg ja 1 368 yksikköä/ml, vastaavasti. Toinen kannan M33 edullinen ominaisuus on käytännössä lähes täydellinen amidaasiaktiivisuuden puute. Idea on se, että ami-daasi on entsyymi, joka katalysoi tuotettujen amidien hyd-rolyysiä vastaaviksi hapoiksi, esim. akryyliamidin hydro-20 lyysiä akryylihapoksi, jolloin tuotettujen amidien laatu huononee selvästi.
: *’: Uusi kanta kasvaa yksinkertaisessa synteettisessä ; ·\· alustassa, joka sisältää hiilenlähteen, kuten pyruvaattia, asetaattia tai glukoosia konsentraatioissa, jotka ovat 25 0,1 - 4 %, ja typenlähdettä, kuten ammoniakkia, nitraat- • · l tisuoloja tai ureaa konsentraatioissa, jotka ovat 0,4 - 2 % niin, että yhtään vitamiineja, aminohappoja, hiivauu-• ’ tetta ei tarvita kannan M33 kasvattamiseksi.
Kanta Rhodococcus rhodochrous M33 on peräisin kan-30 nasta Rhodococcus rhodochrous M8 (RF-patentti numero 1 731 814), jota selektoitiin suoraan kahdessa vaiheessa . käyttäen selektiivisiä alustoja, jotka sisälsivät ensim- .··. mäisessä vaiheessa klooriasetamidia ja toisessa vaiheessa asetamidia.
4 111738
Keksinnön mukainen uusi kanta kykenee tuottamaan nitriilihydrataasia konstitutiivisesti indusoijien, kuten nitriilien, amidien tai urean, poissa ollessa alustasta Taulukko 1 5 Spesifinen aktiivisuus
Viljelyolosuhteet* Nitriilihydrataasi** Amidaasi*** M8 M33 Md M3 3
IndusoiJa-vapaa alusta 8 457 0,01 0,001
Alusta, jossa indusoija 315 425 0,3 0,015 10 (urea, 10 g/X) * Kantoja kasvatettiin Erlenmeyer-pulloissa (tilavuus 750 ml), joista kukin sisälsi 150 ml ravintoalustaa pyru-vaatin (5 g/1) ja NH4Cl:n (2 g/1) kanssa, 24 tuntia 30 °C:ssa voimakkaasti ilmastaen. 24 tunnin kuluttua näin 15 valmistetut viljelmät jaettiin kahteen osaan ja ureaa (määränä 10 g/1) lisättiin niistä toiseen indusoijaksi, jonka jälkeen kasvatusta jatkettiin lisää 48 tuntia. Solut eristettiin sentrifugoimalla ja niitä käytettiin nitriilihydrataasi- ja amidaasiaktiivisuuksien määrittämiseksi. 20 Kunkin valmistetun viljelmän nitriilihydrataasiaktiivisuus määritettiin käyttäen akrylonitriiliä substraattina stan-dardiolosuhteissa, kun taas amidaasiaktiivisuus määritet-, . tiin ammoniakin muodostuksena akryyliamidista, jota käy- tettiin substraattina. Ammoniakkikonsentraatio määritet-25 tiin Nesslerin menetelmällä.
• * » ** μΜ akryyliamidia/min/mg soluja, kuivapaino.
• # · : ",· *** μΜ ammoniakkia/min/mg soluja, kuivapaino.
·,· l Yllä olevan taulukon mukaan on ilmeistä, että nit- : T: riilihydrataasin spesifinen aktiivisuus saavuttaa arvon 30 457 yksikköä/mg, kun kantaa M33 on kasvatettu ravintoalus- V. tässä ilman ureaa. Samoissa olosuhteissa alkuperäisen kan- ···, nan M8 nitriilihydrataasiaktiivisuus on 8 yksikköä/mg.
Tiedetään, että kannan J1 nitriilihydrataasin spesifinen aktiivisuus, kun kantaa kasvatetaan ureavapaassa alustas-35 sa, on 3,4 yksikköä/mg (viitteet EP-patenttihakemus numero 0 362 829; US-patentti numero 5 089 411).
* ♦ i i · » · 111738 5 Näin ollen kanta M33, joka eroaa alkuperäisestä kannasta M8 ja kannasta Jl, kykenee tuottamaan konstitutiivisesta nitriilihydrataasia jopa ilman alustassa olevaa indusoijaa ja siinä on amidaasiaktiivisuus, joka on 20 5 kertaa heikompi.
Kanta M33 on talletettu numerolla VKM Ac-1515 D kokoelmaan All-Russian National Collection of Microorganisms, ja se on karakterisoitu seuraavien morfologisten, viljely- ja fysiologisbiokemiallisten ominaisuuksien suh-10 teen.
Morfologiset ominaisuudet. M33-kannan solut eivät ole liikkuvia ja ovat grampositiivisia. Mitään itiöitä ei tuoteta, solut eivät ole happoresistenttejä. 18 - 20 tunnin ikäisinä solut muodostavat pitkiä (jopa 20 pm), lie-15 västi haaroittuvia filamenttejä, jotka noin 48 - 72 tunnin kuluttua fragmentoituvat lyhyiksi sauva- ja kokkimuotoi-siksi elementeiksi.
Viljelyominaisuudet. Kun on kasvanut 48 tuntia glu- koosi-hiivauuteagarilla, joka on tiheä ravintoalusta (ku- 20 ten MPA, Hot-tinger), kanta M33 tuottaa pyöreitä sileitä pesäkkeitä, joiden halkaisija on 1 mm ja jotka ovat väril- _ · : tään vaaleanpinkinpunaisista pinkinoransseihin. Kun kasva- ; tus tehdään liha-peptonilihaliemessä, muodostuu kalvo ja » · · sedimentti, mitään muutoksia Litmus-maidossa ei havaita.
* · · * • * 25 Fysiologiset ominaisuudet. Kanta edustaa obligaat- • » ; tia aerobia, se pelkistää nitraatteja. MR- ja VP-testit * · · ovat negatiivisia. Kanta muodostaa vetysulfidia, se on « · · * oksidaasinegatiivinen ja katalaasi- ja fosfataasipositii- vinen. Kanta ei hydrolysoi tärkkelystä eikä selluloosaa, • ·’ 30 mutta se hydrolysoi Tween 60 ja 80 -yhdisteitä. Yhtään adeniinia ei käytetä. Solut eivät ole resistenttejä kuu- ; mennukselle kuoritussa maidossa 72 °C:ssa 15 minuutin « » · ajan. Kanta M33 kasvaa pH:ssa 6 - 9 ja lämpötilassa 5 - •( 45 °C. Seuraavista sokereista ja alkoholeista muodostetaan * * » * » 35 happoa: glukoosi, fruktoosi, maltoosi, sakkaroosi, sorbi- * * » * # 6 111738 toll, mannitoli ja glyseroli. Mitään kaasun tuottoa ei havaita yhdestäkään sokerista. Se käyttää ammoniumyhdis-teitä, nitraatteja ja ureaa yksittäisenä typenlähteenä, kun taas yksittäisenä hiilenlähteenä käytetään maltoosia, 5 mannitolia, sorbitolia, glukoosia, glyserolia, laktaattia, pyruvaattia, bentsoaattia, p- ja m-hydroksibentsoaattia, tyrosiinia. Se ei käytä ramnoosia, galaktoosia, inosito-lia, a-ketoglutaraattia.
Biokemiallinen analyysi on osoittanut, että kannan 10 M33 soluseinä sisältää meso-diaminopimeliinihappoa, ara- binoosia ja galaktoosia, jotka ovat ominaisia Coryneform-bakteereille, joilla on tyypin IV soluseinä. Solut sisältävät myös lipidi A -yhdistettä (LCH), joka on ominaista Rhodococci-bakteereille.
15 Näin ollen kanta M33 sisältää ominaisuudet, jotka ovat tyypillisiä Coryneform-bakteereille. Yllä kuvattujen ominaisuuksien valossa ja teoksien Bergy's Manual of Systematic Bacteriology ja Nesterenko's Classification Manual mukaisesti kanta M33 voi olla sukua Rhodococcus-suvun la-20 jille rhodochrous.
Jotta saadaan sellaiset M33-solut, joissa on korkea nitriilihydrataasiaktiivisuus, M33-viljelmä laitetaan ra-, vintoalustaan, jonka jälkeen inkuboidaan 25 - 30 °C:ssa i « · 24 - 72 tuntia.
* · · :v. 25 Solususpensioita, jotka saadaan sentrifugoimalla J » ; viljelmät ja sen jälkeen suspensoimalla solut uudestaan » ♦ t 10 mM fosfaattipuskuriin, käytetään nitriilien muuttami-' * seksi amideiksi.
Tällä menetelmällä saaduissa soluissa on korkea
• · I
• 30 nitriilihydrataasiaktiivisuus ja ne kykenevät katalysoi- ·,,,' maan alifaattisten ja aromaattisten nitriilien hydrolyysiä . vastaaviksi amideiksi laajoissa lämpötilarajoissa, jotka • * t .*>·, vaihtelevat välillä 4-50 °C, ja pH-arvoissa, jotka vaih- • t ’’ televat välillä 3-10.
• » · * * 7 111738
Standarditesti nitriilihydrataasiaktiivisuuden mittaamiseksi suoritetaan seuraavasti: 1 ml liuosta, joka on 2 % nitriili 10 mM fosfaattipuskurissa, jonka pH on 7,6, sekoitetaan 1 ml:n kanssa solususpensiota, joka sisältää 5 0,04 mg soluja perustuen kuivapainosisältöön. Reaktio suo ritetaan 20 °C:ssa 5 minuuttia, jonka jälkeen reaktio lopetetaan lisäämällä 20 ml konsentroitua HCl:oa. Näin muodostuneiden amidien konsentraatio määritetään kaasukromatografialla.
10 Nitriilihydrataasiaktiivisuus ilmoitetaan seuraavi- na yksikköinä:
Yksi yksikkö määritetään siksi määräksi entsyymiä, joka tarvitaan tuottamaan amidia nitriilistä yllä kuvatuissa olosuhteissa nopeudella 1 μΜ/minuutti.
15 Spesifinen aktiivisuus ilmoitetaan arvona μΜ ami- dia/min/mg soluja perustuen kuiva-ainesisältöön tai yksik-köä/mg.
Kokonaisaktiivisuus ilmoitetaan arvona μΜ amidia/ min/ml viljelmää tai yksikköä/ml.
20 Keksintö on kuvattu seuraavilla esimerkeillä.
Esimerkki 1 : j Kannan M33 soluja kasvatettiin urean poissa ollessa : ravintoalustassa, joka sisälsi typenlähteenä natriumnit- raattia. 5 ml kannan M33 viljelmää, jota oli esikasvatettu 25 seuraavan koostumuksen sisältävässä alustassa 48 tuntia ; 30 °C:ssa, laitettiin Erlenmeyer-pulloon (tilavuus 750 ml), johon oli lisätty 150 ml ravintoalustaa, jolla oli sama koostumus (g/1): K2HP04 - 0,5 KH2P04 - 0,6 : 30 MgS04 - 0,5 FeS04 - 0,005
CoCl2 - 0,01 glukoosi - 5 : Pulloa inkuboitiin ravistelijassa 48 tuntia .···. 30 °C:ssa. Solujen nitriilihydrataasiaktiivisuus määritet- • > tiin käyttäen akrylonitriiliä substraattina. Kannan M33 • · · S » 35 nitriilihydrataasin spesifinen aktiivisuus saavutti arvon I I t : · 8 111738 200 yksikköä/mg sen kokonaisaktiivisuuden ollessa 360 yk-sikköä/ml.
Näin ollen kannan M33, jota kasvatettiin ureava-paassa alustassa, spesifinen aktiivisuus on enemmän kuin 5 60 kertaa suurempi kuin kannan J1 aktiivisuus. Lisäksi kaupallisesti helposti saatavia alustakomponentteja, nimittäin glukoosia ja natriumnitraattia, käytetään kannan M33 kasvatukseen.
Esimerkki 2 10 5 ml kannan M33 viljelmää, jota oli esikasvatettu 48 tuntia 30 °C:ssa alustassa, jonka koostumus oli sama kuin esimerkin 1 alustassa paitsi, että glukoosin määrä oli 20 g/1 ja ureaa käytettiin määränä 2 g/1 natriumnitraatin sijasta, laitettiin Erlenmeyer-pulloon (tilavuus 15 750 ml), joka sisälsi 150 ml samaa ravintoalustaa. Pulloa inkuboitiin ravistelijassa 30 °C:ssa 48 tuntia. Nitriili-hydrataasiaktiivisuus määritettiin käyttäen akrylonitrii-liä substraattina. Solusaanto oli 7,6 g/1, spesifinen aktiivisuus 180 yksikköä/mg, kokonaisaktiivisuus 1 386 yk-20 sikköä/ml.
Esimerkki 3 : Kantaa M33 kasvatettiin käyttäen samaa menetelmää ; kuin on kuvattu. Solut erotettiin sentrifugoimalla, pes- • · « tiin 10 mM fosfaattipuskurilla ja suspensoitiin uudelleen 25 10 mM fosfaattipuskuriin. Reaktio suoritettiin standardi- • * ; olosuhteissa käyttäen eri nitriilejä substraatteina. Reak- tio lopetettiin lisäämällä konsentroitua HCl:oa, näin muo-‘ dostuneiden amidien konsentraatio määritettiin kaasukroma tografialla.
9 111738
Taulukko
Substraatti Spesifinen aktiivisuus, %
Asetonitriili 140
Akrylonitriili 100 5 3-syaanipyridiini 54 4-syaanipyridiini 70 2-syaanipyridiini 22 * Spesifinen aktiivisuus oli 100 % käytettäessä akrylonit-riiliä substraattina (200 μΜ/min/mg).
10 Yllä olevasta taulukosta käy ilmi, että kanta M33 kykenee katalysoimaan sekä alifaattisten että aromaattisten nitriilien hydrolyysiä.
Esimerkki 4
Kantaa M33 kasvatettiin kuten esimerkissä 1. Bio-15 massaa, joka sisälsi M33-soluja aina konsentraatioon 0,5 mg/ml asti, ja 3-syaanipyridiiniä aina konsentraatioon 8 % asti, lisättiin 100 ml pulloon, joka sisälsi 40 ml tislattua vettä (pH 7,6). Pulloa inkuboitiin 30 °C:ssa sekoitusolosuhteissa. 60 minuutin kuluttua saatiin 10 % 20 nikotiiniamidiliuos. Nikotiinihappoa ja 3-syaanipyridiiniä ei ollut läsnä reaktioseoksessa. j Esimerkki 5 ; Teräsreaktoriin, jonka tilavuus oli 1,5 1 ja jossa oli mekaaninen sekoitin ja jonka lämpötila oli säädeltä- ;ν. 25 vissä välillä 12 - 20 °C, kaadettiin 400 ml tislattua vet- • · ; tä (pH 7,6), jonka jälkeen siihen suspensoitiin uudelleen 272 mg (perustuen kuiva-ainesisältöön) Rhodococcus rhodo-' chrous M33 -kannan biomassaa, jota oli kasvatettu esimer kin 1 mukaisesti. Sitten reaktioseokseen lisättiin puhdas-·* 30 ta akrylonitriiliä sellaisella nopeudella, että sen kon- sentraatio liuoksessa ei ylittänyt 20 %. Liuoksen kvalita-: tiiviset ja kvantitatiiviset koostumukset määritettiin .***, kaasunestekromatografiällä. Reaktoriin laitettiin kaiken * kaikkiaan 173 g akrylonitriiliä. 8 tunnin kuluttua saatiin ‘ ’ 35 46 % (paino/tilavuus) akryyliamidiliuos. Akryyliamidin 10 111738 saanto oli lähes 99 %. Ei yhtään akrylonitriiliä eikä ak-ryylihappoa tunnistettu sivutuotteina.
Näin ollen vaaditulla kannalla M33 on korkea nit-riilihydrataasiaktiivisuus ja se kykenee hydratoimaan sekä 5 alifaattisia että aromaattisia nitriilejä vastaaviksi amideiksi. Erotuksena sen alalla aiemmin tunnetuista analogeista, mutanttikanta M33 kykenee tuottamaan konstitutii-visesti nitriilihydrataasia silloin kun sitä kasvatetaan alustassa, joka ei sisällä nitriilihydrataasin synteesin 10 indusoijia. Tämä edullinen ominaisuus tekee mahdolliseksi käyttää solujen kasvatuksessa sellaisia alustoja, joissa ei ole vitamiineja, mutta jotka sisältävät glukoosia hii-lenlähteenä ja natriumnitriittiä (tai kaliumnitriittiä) typenlähteenä. Nämä alustat eivät sisällä mitään spesifi-15 siä yhdisteitä nitriilihydrataasin indusoijina (kuten amideja, nitriilejä tai ureaa korkeissa konsentraatioissa). Kannan M33 toinen edullinen ominaisuus on käytännössä täydellinen amidaasiaktiivisuuden poissaolo, joka blokeeraa happojen muodostumisen amideista prosessissa, jossa kata-20 lyyttisesti autetaan nitriilien muutosta.
Rhodococcus rhodochrous M33 -kantaa voidaan suosi-telia nitriilihydrataasientsyymin tuottajaksi ja sitä voi- * · · , daan käyttää prosesseissa alifaattisten ja aromaattisten amidien valmistamiseksi nitriileistä.
> · · • · · • I t * 1 · · tl» • · • » • · » • ·
t i t I I
t M · »

Claims (1)

11 111738 Patenttivaatimus Numerolla VKM Ac-1515 D talletettu Rhodococcus rhodochrous -kanta, tunnettu siitä, että se tuot-5 taa nitriilihydrataasia. • * · « » « · · * i2 111738 Rhodococcus rhodochrous-stam, som är deponerad raed numret VKM Ac-1515 D, kännetecknat av att den producerar nitrilhydratas. » 1 1 ♦ * 1 1 » #
FI953865A 1993-12-17 1995-08-16 Rhodococcus rhodochrous-kanta nitriilihydrataasin tuottajana FI111738B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU9393056089A RU2053300C1 (ru) 1993-12-17 1993-12-17 Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы
RU93056089 1993-12-17
PCT/RU1994/000275 WO1995017505A1 (fr) 1993-12-17 1994-12-15 Souche de rhodococcus rhodochrous productrice de nitrile hydratase
RU9400275 1994-12-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI953865A0 FI953865A0 (fi) 1995-08-16
FI953865A FI953865A (fi) 1995-09-12
FI111738B true FI111738B (fi) 2003-09-15

Family

ID=20150425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953865A FI111738B (fi) 1993-12-17 1995-08-16 Rhodococcus rhodochrous-kanta nitriilihydrataasin tuottajana

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5827699A (fi)
KR (1) KR0131276B1 (fi)
AU (1) AU675379B2 (fi)
CA (1) CA2155635C (fi)
DE (2) DE4480132C2 (fi)
FI (1) FI111738B (fi)
GB (1) GB2290295B (fi)
RU (1) RU2053300C1 (fi)
WO (1) WO1995017505A1 (fi)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.
DK1002122T3 (da) * 1997-07-22 2003-07-14 Lonza Ag Fremgangsmåde til fremstilling af amider
KR100540991B1 (ko) * 1999-10-26 2006-01-10 쇼와 덴코 가부시키가이샤 신규한 로도코커스속 세균, 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴 하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자, 및 이들을 이용한 카르복실산의 제조방법
DE60133130T2 (de) * 2000-12-20 2009-02-26 Dia-Nitrix Co.Ltd. Verfahren zur herstellung einer amidverbindung unter verwendung eines mikrobiellen katalysators
AU2002228036A1 (en) * 2001-01-09 2002-07-24 Lonza Ag Microbiological method for producing amides
DE10120555A1 (de) * 2001-04-26 2002-10-31 Stockhausen Chem Fab Gmbh Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Acrylamidlösung mit einem Biokataysator
DE10120550A1 (de) 2001-04-26 2002-10-31 Stockhausen Chem Fab Gmbh Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Acrylamidlösung mit einem Biokatalysator
DE10120546A1 (de) 2001-04-26 2002-10-31 Stockhausen Chem Fab Gmbh Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Acrylamidlösung mit einem Biokatalysator
US7273889B2 (en) * 2002-09-25 2007-09-25 Innovative Drug Delivery Systems, Inc. NMDA receptor antagonist formulation with reduced neurotoxicity
DE10315376B4 (de) * 2003-04-03 2005-07-14 Stockhausen Gmbh Verfahren zur Kultivierung des Nitrilhydratase-produzierenden Stammes RHODOCOCCUS RHODOCHROUS M33
ATE449860T1 (de) * 2003-12-02 2009-12-15 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Herstellung von amiden
AU2004295409B2 (en) * 2003-12-02 2010-07-29 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Strain of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
GB0327901D0 (en) 2003-12-02 2004-01-07 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Process for producing polymers
US8012758B2 (en) * 2007-02-16 2011-09-06 Nalco Company Method of monitoring microbiological activity in process streams
JP5915649B2 (ja) 2011-05-31 2016-05-11 三菱レイヨン株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
CN104531654B (zh) 2011-06-07 2018-06-12 三菱化学株式会社 改良型腈水合酶
RU2520870C1 (ru) * 2012-12-27 2014-06-27 Кемира Оюй Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида
RU2539033C1 (ru) * 2013-10-21 2015-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Rhodococcus rhodochrous, ОБЛАДАЮЩИЙ КОНСТИТУТИВНОЙ АЦИЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ СИНТЕЗА N-ЗАМЕЩЕННЫХ АКРИЛАМИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА
RU2600868C2 (ru) * 2014-09-22 2016-10-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук Препарат для очистки почв от нефтезагрязнений
WO2016050816A2 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 Basf Se Means and methods for producing amide compounds with less acrylic acid
EP3225693A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-04 Basf Se Method for preparing aqueous acrylamide solutions
ITUA20163572A1 (it) 2016-05-18 2017-11-18 Columbia S R L Metodo biotecnologico per la produzione di acrilammide e relativo nuovo ceppo batterico

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1162484B (it) * 1978-03-29 1987-04-01 Nitto Chemical Industry Co Ltd Procedimento pe produrre acrilammide o metacrilammide impiegando microorganismi
JPS5991879A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
JPS6083581A (ja) * 1983-10-13 1985-05-11 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
JPS61162193A (ja) * 1985-01-08 1986-07-22 Nitto Chem Ind Co Ltd 微生物によるアミド類の製造法
US5179014A (en) * 1985-01-08 1993-01-12 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the preparation of amides using microorganisms
JPH0740948B2 (ja) * 1985-06-04 1995-05-10 旭化成工業株式会社 アミドの微生物学的製造法
US5200331A (en) * 1985-06-04 1993-04-06 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method of producing an amide utilizing a microorganism
US5206158A (en) * 1986-07-02 1993-04-27 Gist-Brocades N.V. Process for the preparation of difluorobenzamide
MX169933B (es) * 1987-09-18 1993-08-02 Hideaki Yamada Procedimiento para la produccion biologica de amidas
CZ280901B6 (cs) * 1988-10-06 1996-05-15 Hideaki Yamada Způsob kultivace bakterií
JP2548051B2 (ja) * 1991-05-22 1996-10-30 日東化学工業株式会社 アクリルアミド水溶液の安定化法
BR9306856A (pt) * 1992-07-10 1998-12-08 Energy Biosystems Corp Molécula de dna recombinante dna purificado vetor de dna recombinante vetor de plasmida de dna microrganismo transformado bactéria transformada método para dessulfurar um combustível fóssil sonda de ácido nucleico e proteína recombinante

Also Published As

Publication number Publication date
FI953865A (fi) 1995-09-12
AU1428195A (en) 1995-07-10
DE4480132T1 (de) 1996-05-09
FI953865A0 (fi) 1995-08-16
GB2290295B (en) 1997-12-03
KR0131276B1 (ko) 1998-04-11
CA2155635A1 (en) 1995-06-29
US5827699A (en) 1998-10-27
DE4480132C2 (de) 1997-03-13
KR950018447A (ko) 1995-07-22
GB2290295A (en) 1995-12-20
GB9516901D0 (en) 1995-10-18
CA2155635C (en) 1998-09-29
WO1995017505A1 (fr) 1995-06-29
AU675379B2 (en) 1997-01-30
RU2053300C1 (ru) 1996-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111738B (fi) Rhodococcus rhodochrous-kanta nitriilihydrataasin tuottajana
US5334519A (en) Process for biological production of amides with R. rhodochrous J-1
SU1512488A3 (ru) Способ получени амида
EP0449648B1 (en) Process for producing R(-)-mandelic acid and derivatives thereof
EP0610049B1 (en) Process for producing optically active alpha-hydroxycarboxylic acid having phenyl group
EP0610048B1 (en) Process for producing optically active alpha-hydrocarboxylic acid having phenyl group
CZ280901B6 (cs) Způsob kultivace bakterií
EP0137076B1 (en) Method for cultivation of pseudomonas bacteria
EP0109083A1 (en) Method for cultivation of pseudomonas bacteria
KR100198039B1 (ko) 발효에 의한 l-글루탐산의 제조방법
JPS60224488A (ja) 微生物学的手段によるｌ−カルニチンの製造
US5563053A (en) Process for production of amide compounds using microorganism
JP2696424B2 (ja) Ｒ（‐）―マンデル酸の製造法
DE69738080T2 (de) Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität
RU2304165C1 (ru) Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий rhodococcus rhodochrous для его осуществления
JPH04365491A (ja) ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法
SU1731814A1 (ru) Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы
JP2001511355A (ja) アミドの調製方法
US5496715A (en) Process for preparing indigo
RU2731289C2 (ru) Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора
RU2177034C1 (ru) Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы
RU2196822C1 (ru) Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы
US5716815A (en) Method for preparing dimethylcarboxylic acid compounds
JP3413294B2 (ja) ２，５−ジヒドロキシピリジンの製造法および２，５−ジヒドロキシピリジン生産菌
CZ279298B6 (cs) Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired