DE4424762C1 - Ribozym-Bibliothek, ihre Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
Ribozym-Bibliothek, ihre Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft
die in den Ansprüchen angegebene
Ribozym-Bibliothek, ihre Herstellung
und Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die
Molekularbiologie, die Gentechnik und die Medizin.
Die Inaktivierung von Genfunktionen durch reverses genetisches
Material ist die wichtigste Methode, um bestimmte Gene
abzuschalten. Das ist von großer Bedeutung zur Bekämpfung von
infektiösen und anderen, durch Störung der Genexpression
bedingten Krankheiten (einschließlich AIDS). Eine Genfunktion
kann in verschiedenen Ebenen außer Kraft gesetzt werden: durch
homologe Rekombination auf der DNA-Ebene, durch Antisense-
Nukleinsäuren oder Ribozyme auf der RNA-Ebene oder durch
Antikörper auf der Proteinebene. In der praktischen Umsetzung
haben alle 4 Möglichkeiten Vor- und Nachteile. Für eine
therapeutische Anwendung scheint nur die RNA-Inaktivierung durch
Antisense-Moleküle oder durch Ribozyme durchführbar zu sein.
Beide Verbindungsklassen können durch chemische Synthese oder in
Verbindung mit einem Promoter durch biologische Expression in
vitro oder sogar in vivo hergestellt werden. Das Prinzip der
katalytischen Selbstspaltung von RNA-Molekülen und der Spaltung
in trans hat sich in den letzten 10 Jahren gut etabliert.
Innerhalb der RNA-Moleküle mit Ribozym-Aktivität sind die
Hammerhead-Ribozyme am besten charakterisiert. Nachdem gezeigt
worden ist, daß Hammerhead-Strukturen in heterologe RNA-Sequenzen
integriert werden und dadurch die Ribozym-Aktivität
auf dieses Molekül übertragen können, scheint es naheliegend,
daß katalytische Antisense-Sequenzen für fast jede Zielsequenz
mit einem übereinstimmenden Spaltort vorgesehen werden können.
Das Grundprinzip der Ribozym-Ausstattung ist sehr einfach: Man
wählt eine interessierende Region der RNA aus, die das Triplett
GUC (bzw. CUC) enthält, nimmt 2 Oligonukleotid-Stränge mit je 6-
8 Nukleotiden und fügt die katalytische Hammerhead-Sequenz
dazwischen ein.
Moleküle dieser Art wurden für zahlreiche Zielsequenzen
synthetisiert, sie zeigten katalytische Aktivität in vitro und
in manchen Fällen auch in vivo. Die besten Ergebnisse wurden mit
kurzen Ribozymen und Zielsequenzen erzielt. Eine aktuelle
Herausforderung für die in vivo-Anwendung ist die Konstruktion
von Ribozymgenen, die eine kontinuierliche Expression des
Ribozyms in einer bestimmten Zelle erlauben (Bertrand, E. et al.
[1994] Nucleic Acids Res. 22, 293-300).
Es gibt 5 potentielle Gründe, die eine befriedigende Funktion
von exprimierten Ribozymen innerhalb des komplexen Zellmilieus
behindern.
- 1. Innerhalb der Zelle existiert das mRNA-Substrat vermutlich in einer stark gefalteten Struktur, die außerdem noch durch an Teile der Struktur gebundene Proteine geschützt sein kann. Das Treffen von zugänglichen Orten innerhalb des Substrates zur Hybridisierung mit den komplementären flankierenden Regionen des Ribozyms ist eine Frage der aktuellen Wahrscheinlichkeit. Computergestützte Vorhersagen von möglichen thermodynamisch stabilen Sekundärstrukturen können für die Suche nach Loop-Regionen ohne Basenpaarung nützlich sein, aber die physiologische Relevanz dieser Konformationsmodelle ist noch unsicher.
- 2. Da die Ziel-mRNA sofort aus dem Zellkern heraustransportiert wird, muß das Ribozym muß auch in das Zytoplasma übergehen, bevorzugt auf dem selben Wege. Es ist jedoch schwierig, eine Kolokalisation von Ribozymen und ihrem Substrat zu erreichen.
- 3. Der Einsatz von Ribozymen in vivo erfordert die Einfügung von Ribozymgenen in geeignete Expressionskassetten. Die Trans kription dieser Konstrukte kann mRNAs produzieren, in denen die zentrale katalytische Sekundärstruktur der Ribozyme durch andere, stabilere Basenpaarungen innerhalb der nichtkomple mentären flankierenden Sequenzen verdrängt wird.
- 4. Ein Überschuß (100-1000fach) an Ribozym-Molekülen gegenüber der Zielsequenz ist notwendig, um ein registrierbares Ansteigen des RNA-Niveaus zu erreichen. Die Produktion von 10⁵-10⁶-Ribozym- Molekülen pro Zelle über eine lange Periode hinweg kann jedoch zytotoxische Wirkung haben. Im allgemeinen sind solche hohen Expressionsniveaus nicht stabil. Die Notwendigkeit des Überschusses an Ribozymen wird durch die ungenügende Stabilität der Ribozyme gegenüber Nukleasen, durch den uneffektiven Transport zum Zytoplasma und durch den nicht optimalen Umsatz-Faktor der Spaltungsreaktion hervorgerufen.
- 5. Die Kinetik der Spaltungsreaktion und die Fähigkeit der Ribozyme, Multi-Umsatz-Reaktionen durchzuführen, hängt von den Bindungsparametern und der Struktur der komplementären flankierenden Regionen der Ribozyme ab. Zelluläre Proteine können die Katalyse der Spaltungsreaktion beeinflussen, wahrscheinlich mit Hilfe der Dissoziation des Ribozyms vom Substrat der Spaltung, das die Vorstufe zur nächsten Spaltung darstellt. Bis heute ist es nicht möglich, die optimale Struktur der flankierenden Regionen für ein Ribozym vorherzusagen, um hohe Spezifität und einen hohen Umsatz zu garantieren.
- Insgesamt kann man feststellen, daß trotz vieler Bemühungen zur Konstruktion spezifischer Ribozym-Gene nur Teilerfolge erzielt wurden, meist auf der Basis von "trial and error"-Experimenten.
Die Erfindung hat das Ziel, die Bereitstellung optimaler
Ribozyme für beliebige Zielsequenzen zu ermöglichen. Diese
Ribozyme sollen effektiv exprimierbar, stabil und in vivo
einsetzbar sein, vorzugsweise für die Identifizierung und zum
Abschalten von Genen bei Erkrankungen.
Der Grundgedanke der Erfindung besteht darin, das Verfahren so
zu führen, daß eine gesuchte bzw. für das Abschalten vorgesehene
Zielsequenz sich das passendste Ribozym aus einem Angebot von
Ribozymen mit bekannter Stabilität und Struktur selbst
heraussucht. Das wird erfindungsgemäß dadurch realisiert, daß
eine Ribozym-Bibliothek angelegt wird, die aus einer optimierten
Expressionskassette besteht, welche 10⁹ bis 10¹¹ Ribozymgene
enthält. Diese Ribozyme setzen sich aus einer zentralen
Hammerhead-Struktur definierter Sequenz und flankierenden
Sequenzen auf beiden Seiten der Hammerhead-Struktur
von 6-13 Nukleotiden zufälliger Basenfolge zusammen. Die Hammerhead-Struktur
wird durch ein doppelsträngiges Gen kodiert, in welchem
das Hammerhead auf beiden Seiten von flankierenden Sequenzen
zufälliger Basenfolge eingeschlossen ist.
Die doppelsträngige Hammerhead-Region hat folgende
Sequenz: CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAC, die flankierenden Sequenzen
haben eine Länge von 6-13 Nukleotiden.
Der Aufbau der erfindungsgemäßen Ribozym-Bibliothek geht von
synthetischen Oligonukleotiden mit einer Zufallssequenz von 6-13
Nukleotiden aus. Diese werden mit der Ribozymsequenz verbunden,
in einen Doppelstrang umgewandelt und über flankierende
Restriktionsorte in die entsprechende Insertionsstelle der
Expressionskassette kloniert. In Abb. 1 ist der Aufbau der
Ribozym-Bibliothek schematisch dargestellt.
Abb. 2 zeigt schematisch die Anwendung der Ribozym-
Bibliothek; sie wird nachfolgend am Beispiel des
Wachstumshormons erläutert. Wachstumshormon hat 150 theoretische
Spaltstellen (Ribozym-Bindungsorte, Basenfolgen GUC bzw. CUC).
Nur einige Spaltstellen werden in vivo zugänglich sein. Diese
und die dazu passenden effektivsten Ribozyme sollen isoliert
werden.
Dazu wird zunächst ein Pool von Ribozym-Genen synthetisch
hergestellt, wobei eine zentrale "hammerhead" Ribozymsequenz von
je 13 Nukleotiden zufälliger Reihenfolge flankiert wird. Diese
Gene werden in einen Expressionsvektor (GvaL) für Ribozyme
kloniert, wobei sie auf beiden Seiten von einer identischen
Sequenz von 21 Nukleotiden flankiert werden, die eine
Sekundärstrukturbildung verhindern sollen. Durch die Klonierung
entsteht eine Bibliothek von ca. 10⁹ Klonen. Zur Isolierung eines
spezifischen Ribozyms wird das Zielgen in vitro von einem
geeigneten Konstrukt transkribiert (mit T7-Polymerase oder RNA-
Polymerase III) und die erhaltene RNA mit der ebenfalls in vitro
transkribierten Ribozym-Bibliothek inkubiert. Anschließend
werden die Spaltprodukte elektrophoretisch getrennt. Deutlich
erkennbare Fragmente werden aus dem Gel präpariert und
sequenziert.
Die Sequenz an den Enden der Fragmente erlaubt die Festlegung
der Spaltstelle und Identifizierung des für die Spaltstelle
verantwortlichen Ribozyms. Das betreffende Ribozym wird unter
Verwendung von zwei für seine flankierenden Sequenzen
spezifischen Oligonukleotiden aus der Ribozym-Bibliothek ampli
fiziert und erneut in den Vektor GvaL kloniert (Beispiel 1).
Die Ribozymaktivität der Bibliothek wird durch Inkubation mit
zellulärer RNA und deren Degradation nachgewiesen (Beispiel 2).
Das Vorhandensein von Ribozymen gegen eine bestimmte Ziel-RNA,
z. B. hGH, wird durch Inkubation mit einer in vitro trans
kribierten RNA nachgewiesen (Beispiel 3). Die Lokalisierung der
Spaltstellen erfolgt durch Isolierung von Fragmenten der
gespaltenen Ziel-RNA und deren Sequenzierung (Beispiel 4).
Die Spezifität und Effektivität der aus der Bank isolierten und
reklonierten Ribozyme wird durch deren Inkubation mit der Ziel-RNA
bestimmt (Beispiel 5).
Die biologische Wirksamkeit, d. h. die Ausschaltung der Funktion
der Ziel-RNA in vivo, wird durch Transfektion des reklonierten
Ribozyms mit dem Zielgen in geeignete Zellen (z. B. CHO) und
nachfolgende Bestimmung der spezifischen Proteinsynthese (z. B.
hGH-Sekretion) ermittelt (Beispiel 6).
Die Erfindung soll nachfolgend im einzelnen durch
Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Die Strategie ist schematisch in Abb. 3 dargestellt. Der
mittlere Teil der Abbildung zeigt die Struktur des vorgesehenen
Ribozympools, der obere die aktuellen Sequenzen der zwei Oligo
nukleotide, die angelagert und zur Bildung von doppelsträngigen
Ribozym-Genen aus der Bank verlängert werden. Das entstehende
Fragmentgemisch wurde in die Gval-Kassette als Xhol-Nsil-
Fragment einkloniert. Eine Bibliothek von 10⁹ verschiedenen
Varianten wurde geschaffen. Die Ribozyme wurden in vitro
entweder durch T7-Polymerase oder polIII von einem HeLa-Extrakt
synthetisiert. Als Zielsequenz wurde RNA von CHO-Zellen benutzt,
welche das hGH-Gen stabil exprimiert (5000 RNA-Kopien/Zelle).
Gereinigte RNA wurde mit der in vitro synthetisierten Ribozym-
Bibliothek inkubiert. Nach der Reinigung der Spaltprodukte an
einer oligo-dT-Säule wurde das 5′-Ende der stromabwärts-
Spaltprodukte mittels RACE-Technik wie folgt analysiert: Nach
der reversen Transkription mit oligo-dT-Primern werden die cDNAs
am 3′-Ende mit dG verbunden, mit einem oligodC amplifiziert und
mit hGH-spezifischen Primern behandelt, in pGEMT (Promega)
einkloniert und sequenziert. Die Sequenzen sollten unmittelbar
stromabwärts von der NUH-Erkennungsseite (GUC, CUC) innerhalb
der hGH-RNA starten. Das Gen für das Ribozym, das die Spaltung
eines ausgewählten Ortes bewirkte, wurde durch PCR aus der
Ribozym-Plasmid-Bibliothek amplifiziert, wobei spezifische
degenerierte Primer für die flankierenden Regionen der Ribozym-
Gene verwendet wurden. Nach Amplifikation wurde das entstandene
Fragment zwischen die PstI- und SalI-Orte des Vektors GvaL
kloniert. Unter den sequenzierten 50 Klonen wurden für drei
Ribozym-Spaltorte Ribozyme mit unterschiedlich langen Flanken
(7-13 Nukleotide) gefunden (Abb. 3, unten).
Die Spaltung von zellulärer RNA wurde bei physiologischem pH
(50 mM Tris-Cl, pH 7,5) bei 37°C innerhalb einer Stunde mit oder
ohne vorhergehende Hitzedenaturierung (90 sec bei 95°C) in einem
15 µl Reaktionsgefäß durchgeführt. Folgende Ansätze wurden
gewählt:
- 1./2. Gereinigte Total-RNA (1 µg/Probe) als Ziel. Ribozyme GvaLRz als T7-Transkript, in vitro-Transkript von GvaL diente als Kontrolle.
- 3. Zytoplasmatische RNA/Protein-Fraktion als Ziel. 10⁵ Zellen wurden im 50 mM Tris-HCL (pH 7,5) 10 min in Eis lysiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren, aufgetaut bei 37°C, und die Kerne wurden durch Zentrifugationen entfernt. Als Ribozym wurde ein T7-Transkript von GvaLRz (10 µg) verwendet.
- 4. Zytoplasmatische RNA als Ziel. Das Ribozym wurde durch polIII-Transkription (2 µg/Probe) hergestellt.
Die deutlichsten Spaltungen werden mit T7-Transkripten und
totaler bzw. auch zytoplasmatischer RNA erhalten.
Totale oder zytoplasmatische RNA-Präparationen aus hGH-
produzierenden Zellen werden mit Ribozymen aus der Bibliothek
inkubiert, die entweder mit pol III oder T7-Polymerase
transkribiert wurde. hGH-spezifische 3′-Fragmente werden
revers transkribiert und durch PCR amplifiziert. Die PCR-
Bedingungen werden so gewählt, daß hauptsächlich Fragmente
<1000 bp entstehen. PCR-Produkte werden auf einem 6% PAA-Gel
aufgetrennt, Marker für die Fragmentgröße werden auf der linken
Bahn aufgetragen. Es wurden 6 spezifische Banden gefunden, deren
korrespondierende Fragmentlänge mit einer in 4 Exonorten (E1-E4)
und 2 Intronorten (11, 12) korrelieren. Es ist festzustellen, daß
T7 pol Transkripte leichter nachzuweisen sind und daß es mehr
Spaltstellen in Total-RNA gibt als in zytoplasmatischer RNA.
Die Fragmente E1-E4 und 11, 12 werden aus dem Gel geschnitten,
gereinigt und in pGEMT einkloniert. Von jedem Fragment werden 20
Klone sequenziert. Etwa 50% der Klone starten entweder an einem
CUC- oder einem GUC-Ort. Die anderen 50% repräsentieren
wahrscheinlich Abbauprodukte.
Die Spaltorte gemäß den Fragmenten sind in der Sequenz von hGH
enthalten. E1: 1017 (Exon IV), E2: CTC 1401 (Exon V), E3: CTC
1422 (Exon V), E4: CTC 1441 (Exon V), ES (stammt von einem
gesonderten Experiment): GTC (Exon IV), 12: CTC 1099 (Intron
IV), 11: GTC (Intron 1V) (Abb.4).
B. Mit dem Programm HUSAR, MFOLD, wurde eine graphische
Darstellung mit PLOTFOLD erhalten (Abb. 5).
A. Spaltung mit 3 verschiedenen selektierten Ribozymen. Die
Ribozyme werden mit T7-Polymerase von jeweils einem selektierten
Klon umgeschrieben und mit in vitro transkribierter hGH RNA der
gleichen Molarität (beide 100 nM) für 20 min bei 37°C ohne
Hitzedenaturierung inkubiert. Proben werden auf ein
denaturiertes 6% PAA-Gel aufgebracht. Die entstehenden
Bruchstücke haben die erwartete Größe (E1: 1017, 646; I1: 1099,
564; E5: 952, 711).
- B. Spaltung von hGH RNA durch E1-Ribozym mit verschiedener Länge der komplementären Regionen. Die Inkubation erfolgte wie in A. Die Fragmentabtrennung erfolgte auf einem 4% denaturiertem PAA- Gel. Die Länge der komplementären Region des E1-Ribozyms beträgt 26=13/13, 21=10/11 bzw. 15=8/7 (Abb. 3, unten). Es ist festzu stellen, daß die 2 spezifischen Spaltprodukte nur nach Inkubation mit Ribozymen in der Gegenwart von Magnesium nachweisbar sind. Die effektivste Spaltung ist bei der kürzesten Komplementarität zu finden (15=8/7).
Die Transfektion von CHO-Zellen erfolgte gleichzeitig mit
pCMVhGH, Ribozymen oder Kontrollkonstrukten und pSV2neo. Die
Kurzzeit-Expression wurde nach 3 Tagen und die stabile
Expression nach Selektion mit Geneticin nach 4 Wochen getestet.
Das hGH-Niveau wurde mit ELISA (Nachweisgrenze 3 ng/ml)
festgestellt. Das Niveau des erhaltenen hGH mit pCMVhGH +GvaL
wurde als 100% angesetzt (Kurzzeit: 7 µg hGH/ml/24 hrs; stabile:
2 µg hGH/ml/24 hrs).
Die Resultate eines typischen Experiments sind in Tabelle 1
zusammengestellt.
Claims (10)
1. Ribozym-Bibliothek,
bestehend aus
einer optimierten Expressionskassette, welche Ribozym-Gene
enthält, die aus einer zentralen Hammerhead-Struktur, bestehend
aus doppelsträngiger DNA der Sequenz CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAC
und flankierenden Sequenzen
auf beiden Seiten der Hammerhead-Struktur
von je 6-13 Nukleotiden zufälliger
Basenfolge bestehen.
2. Ribozym-Bibliothek nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die optimierte Expressionskassette einen T7-Promoter, ein
adenovirales va-RNA-Gen und eine stabile Loop-Region enthält.
3. Ribozym-Bibliothek nach Anspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie 10⁹-10¹¹ Ribozym-Gene enthält.
4. Verfahren zur Herstellung der Ribozym-Bibliothek gemäß
Anspruch 1-3,
dadurch gekennzeichnet,
daß synthetische Oligonukleotide mit einer Zufallssequenz von 6-13
Nukleotiden und der Ribozymsequenz hergestellt, in einen
Doppelstrang umgewandelt und über flankierende Restriktionsorte
in die entsprechende Insertionsstelle der Expressionskassette
kloniert werden.
5. Verwendung der Ribozym-Bibliothek gemäß 1-3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das die gewünschte Zielsequenz enthaltende Material mit
der Ribozym-Bibliothek inkubiert, die erhaltenen Spaltprodukte
identifiziert und die für die Spaltung verantwortlichen Ribozyme
isoliert.
6. Verwendung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Material
- - in vitro transkribierte RNS,
- - Total-RNS oder
- - zytoplasmatische RNS von Zellen
eingesetzt und die Inkubation in Anwesenheit von 100 m Mg-Salz
durchgeführt wird.
7. Verwendung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Identifizierung der Spaltprodukte durch die PCR-Reaktion
mit genspezifischen Primern und nachfolgende Gelelektrophorese
erfolgt.
8. Verwendung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß die für die Spaltung verantwortlichen Ribozyme durch
Ausschneiden der Spaltprodukte aus dem Gel und nachfolgende
Sequenzierung der Spaltstellen identifiziert werden.
9. Verwendung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß das als wirksam erkannte Ribozym aus der Bibliothek durch
Hybridisierung mit 2 für dieses Ribozym spezifischen
Oligonukleotiden isoliert und als Expressionsklon verwendet
wird.
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