DE69735684T2

DE69735684T2 - Katalytische Nukleinsäure und deren medizinische Verwendung

Info

Publication number: DE69735684T2
Application number: DE69735684T
Authority: DE
Inventors: Nathan Givat Sharett Asher; Andy Bloomington Ellington; Yaron Tikochinski
Original assignee: GENETICO Ltd
Current assignee: GENETICO Ltd
Priority date: 1996-08-26
Filing date: 1997-08-26
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2017-08-27
Also published as: ATE323180T1; AU3862097A; NZ334492A; EP1350854B1; CN1232509A; WO1998008974A2; EP0922114A2; JP2000517181A; DE69735684D1; DE69725861D1; CA2264246A1; WO1998008974A3; US6387617B1; ATE253128T1; EP1350854A1; NO990850D0; DE69725861T2; AU717736B2; EP0922114B1; NO990850L

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Moleküle und Verfahren zum Nachweis spezifischer Mittel in einem Medium.
Hintergrund der Erfindung
Ribozyme sind typischerweise RNA-Moleküle, die enzymartige katalytische Aktivitäten haben, die üblicherweise mit Spaltung, Spleißen oder Ligation von Nucleinsäure-Sequenzen verbunden sind. Die typischen Substrate für katalytische Aktivitäten von Ribozymen sind RNA-Moleküle, obwohl Ribozyme Reaktionen, in denen DNA-Moleküle (oder möglicherweise sogar Proteine) als Substrate dienen, katalysieren können.
Ribozyme, die intrazellulär aktiv sind, arbeiten cis, wobei sie nur eine einzige Umsetzung katalysieren, und sind üblicherweise während der Reaktion selbst-modifiziert. Ribozyme können jedoch so konstruiert werden, dass sie trans wirken, in echt katalytischer Weise mit einem Umsatz von größer als eins und ohne Selbst-Modifizierung. In einem Ribozym können zwei verschiedene Bereiche identifiziert werden: der Bindungsbereich, der dem Ribozym durch Hybridisierung an eine spezifische Nucleinsäure-Sequenz (und möglicherweise auch an spezifische Proteine) seine Spezifität gibt, und ein katalytischer Bereich, der dem Ribozym die Aktivität für Spaltung, Ligation oder Spleißen gibt.
Es wurde kürzlich vorgeschlagen, Ribozyme zur Behandlung von Krankheiten oder genetischen Störungen zu verwenden, indem sie eine Ziel-RNA wie eine virale RNA oder eine Boten-RNA, die von Genen, die abgeschaltet werden sollten, transkribiert wurde, abspalten. Dies wurde als eine Alternative zur Blockierung des RNA-Transkripts durch die Verwendung von Antisense-Sequenzen vorgeschlagen. Wegen der katalytischen Natur des Ribozyms spaltet ein einziges Ribozym-Molekül viele Moleküle Ziel-RNA, und daher wird eine therapeutische Aktivität in relativ geringeren Konzentrationen als denjenigen, die in einer Antisense-Behandlung erforderlich sind (WO 96/23569), erreicht.
Die Verwendung von Ribozymen für diagnostische Zwecke wurde nur selten erwähnt. WO 94/13833 beschreibt ein Verfahren zum Nachweisen von Nucleinsäure-Molekülen in einer Lösung durch Maßschneidern eines spezifischen Ribozym-Moleküls mit zwei Bereichen, wobei einer zu der nachzuweisenden Nucleinsäure-Sequenz komplementär ist und der andere zu einem Co-Zielmolekül, das eine nachweisbare Markierung trägt, komplementär ist. Das Ribozym ist in der Lage, spezifisch und reversibel sowohl an eine ausgewählte Ziel-Nucleinsäure-Sequenz als auch an das markierte Co-Ziel zu binden. Wenn sowohl das Ziel als auch das Co-Ziel gebunden sind, macht das Ribozym eine Konformationsveränderung durch, die es aktiv und fähig macht, die Markierung des Co-Ziels abzuspalten, und die freie Markierung kann dann nachgewiesen werden. Wenn das Co-Ziel gespalten ist, ist das Ribozym in der Lage, sich mit einem zusätzlichen Co-Ziel zu verbinden; wodurch es mehr Markierung abspaltet und mehr nachweisbare Signale erzeugt.
WO 94/13791 betrifft ein regulierbares Ribozym-Molekül, das bei Bindung an einen Liganden seine Aktivität bezüglich einer Ziel-RNA-Sequenz verändert. Wiederum bewirkt, wie in WO 94/13833, die Bindung an das Ziel eine Konformationsveränderung in den Ribozymen, die sie aktiv macht. Ein Beispiel für eine solche Veränderung liegt in der Anwesenheit einer redundanten Sequenz in dem Ribozym, die den Kernbereich des Ribozyms maskiert. Nur bei Bindung der Ziel-Sequenz an die redundante Sequenz wird der Kern unmaskiert und daher aktiv.
Das US-Patent 5 472 840 (Stefano, J. E.) offenbart eine Nucleinsäure-Sequenz mit dem MDV-1-Motiv (befähigt zur autokatalytischen Replikation in Anwesenheit des Enzyms der Q-Beta-Replikase), die nur aktiv wird, wenn sie mit einem Ziel-Nucleinsäure-Molekül eine spezifische Struktur bildet, die die Sequenz GAAA aufweist. Das Ribozym von Stefano wird durch Modifizieren eines bestehenden Ribozyms hergestellt und zeigt die Spaltungsaktivität nur in Anwesenheit eines sehr eingeschränkten Bereichs von Ziel-Molekülen.
Lizardi, M. P. und Helena Porta (Biotechnology 13: 161–164 (1995)) offenbaren ein allosterisches Hammerkopf-Ribozym, das a priori inaktiv ist und durch spezifische Wechselwirkung mit einem allosterischen DNA-Effektor, der zu einer einzelsträngigen Schleife in dem RNA-Strang-Ribozym komplementär ist, ausgelöst wird. Diese Veröffentlichung offenbart ein Ribozym, das aktiv wird, wenn ein Teil davon doppelsträngig wird.
Die obigen Veröffentlichungen offenbaren Ribozyme, die entweder wegen einer Konformationsveränderung oder wegen einer Hybridisierungsreaktion, die sie doppelsträngig macht, katalytisch aktiv werden. Diese Reaktionstypen können auch spontan auftreten, beispielsweise kann, wenn ein Ribozym wegen der Anwesenheit einer redundanten Sequenz, das seinen Kernbereich maskiert, inaktiv ist, diese redundante Sequenz selbst in Abwesenheit des Ziels entweder brechen oder sich öffnen, und daher wird das Ribozym selbst ohne ein Ziel katalytisch aktiv. Spontane Reversion in einen aktiven Zustand macht die Ribozyme natürlich für diagnostische Zwecke unbrauchbar.
Die israelischen Patentanmeldungen 112799 und 115772 (die PCT/US96/02380 entsprechen) offenbaren Verfahren zum Nachweis katalytisch aktiver Ribozyme in einem Medium, bei denen typischerweise das katalytisch aktive Ribozym als Reporter für die Anwesenheit anderer Biomoleküle in einer Testprobe verwendet wird. Gemäß den in diesen Anmeldungen offenbarten Verfahren ergibt katalytisch aktives Ribozym, wenn es in einem untersuchten Medium vorhanden ist, eine Reaktionskaskade, in der in einer von verschiedenen Ausführungsformen, die in diesen Anmeldungen angegeben sind, in einer positiven Rückkopplung mehr katalytisch aktive Ribozyme erzeugt werden. Das katalytisch aktive Ribozym kann nur in Anwesenheit eines untersuchten Moleküls erzeugt oder aktiviert werden.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Im folgenden wird der Begriff "Nucleozym" verwendet, um ein Oligonucleotid oder einen zwischen einem Oligonucleotid und einer Nucleinsäure-Sequenz oder zwischen einem Oligonucleotid und einem anderen Molekül, z. B. einem Oligonucleotid, einem Protein oder einem Polypeptid, etc., gebildeten Komplex, der eine katalytische Aktivität besitzt, zu bezeichnen. Ein Beispiel für ein Nucleozym ist ein Ribozym.
Der Begriff "Proto-Nucleozym" wird verwendet, um ein Nucleinsäure-Molekül oder einen Komplex aus zwei oder mehreren solchen Molekülen, das (der) a priori keine katalytische Aktivität hat, aber bei Bildung eines Komplexes mit einem Cofaktor katalytisch aktiv wird, zu bezeichnen. Ein Proto-Nucleozym ist tatsächlich ein Nucleozym mit einem fehlenden Bestandteil, wobei der fehlende Bestandteil von dem Cofaktor ergänzt wird. Der Komplex zwischen dem Proto-Nucleozym und dem Cofaktor kann auch gelegentlich als "katalytischer Komplex" bezeichnet werden und ist tatsächlich ein Nucleozym, da er katalytische Aktivität hat. Das Proto-Nucleozym kann aus Deoxynucleotiden (dNTP's) Ribonucleotiden (rNTP's) sowie anderen Nucleotiden wie 2'-O-Methyl-nucleotiden oder irgendwelchen Kombinationen von diesen bestehen.
Der Begriff "katalytische Aktivität" soll alle möglichen katalytischen Aktivitäten von Nucleozymen umfassen, einschließlich Spaltung, Ligation, Ausspleißen (Abspalten beider Enden einer kurzen Nucleinsäure-Sequenz, um sie von einer längeren Sequenz zu entfernen, und Verknüpfen der Enden der geschnittenen Sequenz), Einspleißen (öffnendes Spalten einer Nucleinsäure-Sequenz, Einsetzen einer anderen kurzen Nucleinsäure-Sequenz und Verknüpfen der Enden der geschnittenen Sequenz), Umordnung, sowie weitere katalytische Aktivitäten wie Phosphorylierung, kinaseartige Aktivität, Hinzufügung oder Entfernung anderer chemischer Baueinheiten, Biotinilation, Füllen von Lücken fehlender Nucleotide, Polymerisation, etc..
Der Begriff "Cofaktor" wird verwendet, um ein Molekül oder einen Teil innerhalb eines Moleküls (z. B. eine bestimmte DNA-Sequenz innerhalb eines größeren DNA-Moleküls), das (der) mit dem Proto-Nucleozym eine Komplexierung eingeht, um einen katalytischen Komplex, nämlich ein aktives Nucleozym zu ergeben, zu bezeichnen. Der Cofaktor ergänzt einen fehlenden Bereich des Proto-Necleozyms, so dass es katalytisch aktiv werden und zu einem Nucleozym werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proto-Nucleozyme und ihre Verwendung. Die Proto-Nucleozyme der Erfindung haben im wesentlichen keine katalytische Aktivität, da ihnen ein kritischer Bestandteil fehlt, der für die katalytische Aktivität essentiell ist, wobei der fehlende Bestandteil durch den Cofaktor ergänzt wird. Mit anderen Worten, um katalytisch aktiv zu werden, müssen die Proto-Nucleozyme mit dem Cofaktor komplexieren, um einen katalytischen Komplex (das Nucleozym), der eine katalytische Aktivität ausüben kann, zu bilden. Der Begriff "im wesentlichen keine katalytische Aktivität haben" soll bedeuten, dass das Proto-Nucleozym entweder keine katalytische Aktivität besitzt oder eine katalytische Aktivität besitzt, die sehr viel geringer ist (typischerweise um mehrere Größenordnungen) als diejenige des katalytischen Komplexes.
Wie oben dargelegt wurde, sind Ribozyme bekannt, die mit einem Faktor (auch Ziel genannt), z. B. einem Protein oder einer anderen Nucleinsäure-Sequenz, eine Komlexierung eingehen, was die Ribozyme dazu veranlaßt, eine Konformationsveränderung durchzumachen, wodurch die katalytische Aktivität des Ribozyms ausgeprägter wird. Im Unterschied zu derartigen Ribozymen des Stands der Technik fehlt dem Proto-Nucleozym der Erfindung jedoch a priori ein essentieller Bestandteil und der Cofaktor liefert den fehlenden Bestandteil. Beispiele für solche fehlenden Bestandteile sind Sequenzen im Kernbereich des Nucleozyms. Der Cofaktor kann eine Nucleinsäure-Sequenz sein, die in der Lage ist, zwischen zwei freien Enden des Proto-Nucleozyms eine Bindung auszubilden, wodurch sie eine Lücke füllt.
Bei den strukturellen und funktionellen Merkmalen des Proto-Nucleozyms hat es, wenn es sich in Lösung befindet, nicht die Fähigkeit, sich spontan in eine katalytisch aktive Form umzuwandeln, da seine Aktivierung nicht nur von einer Konformationsveränderung, die spontan auftreten kann, sondern vielmehr von der Ergänzung eines fehlenden Bestandteils abhängt. Dieses Merkmal ist ein weiterer Unterschied zu inaktiven Ribozymen des Stands der Technik, die die Fähigkeit haben, spontan eine Konformationsveränderung einzugehen, wenn auch in geringem Maß, und selbst in Abwesenheit eines Cofaktors eine gewisse katalytische Aktivität zeigen. Daher gibt es, wenn die Ribozyme der Erfindung verwendet werden, anders als bei inaktiven Ribozymen des Stands der Technik wie denjenigen, die oben in dem Abschnitt Hintergrund der Erfindung dieser Beschreibung beschrieben wurden, in Abwesenheit des Cofaktors im wesentlichen keine Hintergrundaktivität. Beispielsweise gibt es, wenn Proto-Nucleozyme der Erfindung bei der Diagnose verwendet werden, im wesentlichen kein "Rauschen", es gibt nämlich ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und es gibt praktisch keine falsch-positiven Ergebnisse. Als ein anderes Beispiel, die Proto-Nucleozyme der Erfindung zeigen, wenn sie bei Therapien verwendet werden, eine sehr hohe Ziel-Spezifität, und der katalytische Komplex (das Nucleozym) wird nur in Anwesenheit eines geeigneten Ziels gebildet und übt seine Aktivität aus.
Die Proto-Nucleozyme der Erfindung können sowohl durch in vitro-Entwicklung in einer unten zu beschreibenden Weise oder mittels rationellem Aufbau durch Nucleinsäure-Synthese hergestellt werden, beispielsweise durch Verwenden einer Sequenz eines bekannten Ribozyms und Freilassen einer Lücke von mehreren fehlenden Nucleotiden in seinem Kernbereich.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Proto-Nucleozym, das ein Nucleinsäure-Molekül oder ein Komplex von Nucleinsäure-Molekülen ist, das (der) im wesentlichen keine katalytische Aktivität hat, aber mit einem Cofaktor einen Komplex bilden kann, um ein Nucleozym zu bilden, das eine katalytische Aktivität besitzt, wobei dem Proto-Nucleozym ein für die katalytische Aktivität des Nucleozyms essentieller Bestandteil fehlt und der Cofaktor den Bestandteil liefert.
Der Bestandteil, der in dem Proto-Nucleozym fehlt und der von dem Cofaktor zur Umwandlung des Proto-Nucleozyms in ein katalytisch aktives Nucleozym geliefert wird, ist ein fehlender Nucleinsäure-Abschnitt von einem oder mehreren Nucleotiden (hierin im folgenden "Lücke"). Der Cofaktor ist ein Nucleinsäure-Ab schnitt, der die Lücke überbrücken kann. Zu diesem Zweck hat ein derartiger Co-faktor-Nucleinsäure-Abschnitt Sequenzen, die mit komplementären Sequenzen in den beiden Strängen an beiden Seiten der Lücke hybridisieren können, und kann auch die fehlende Sequenz aufweisen. Es sollte beachtet werden, dass der Co-faktor-Abschnitt gelegentlich an zwei andere Nucleinsäure-Stücke des Proto-Nucleozyms als diejenigen, die die Lücke unmittelbar flankieren, hybridisieren und eine Brücke zwischen ihnen schaffen kann. Die Lücke kann zwischen zwei verschiedenen Oligonucleotid-Strängen sein, die von dem Cofaktor funktionell miteinander verbunden werden, oder kann zwischen Enden desselben Oligonucleotids sein, wobei der Cofaktor als solcher die Funktion einer funktionell geschlossenen Oligonucleotid-Schleife erbringt.
Derartige Proto-Nucleozyme können mittels in vitro-Entwicklung oder mittels rationalem Aufbau erhalten ("gentechnologisch erzeugt") werden.
Der spezifische Cofaktor ist eine Nucleinsäure-Sequenz (DNA- oder RNA-Sequenz).
Gelegentlich kann es erwünscht sein, das Proto-Nucleozym zu modifizieren, um seine Nuclease-Beständigkeit zu erhöhen, was durch Ersetzen einiger der natürlichen Nucleotide durch nicht-natürliche Nucleotide wie 2'-O-Methyl-Nucleotide erreicht werden kann (Usman et al., Nucleic Acids Symposium Series, 31: 163–164, 1994).
Eine gegenwärtig bevorzugte, aber nicht ausschließliche Verwendung der Proto-Nucleozyme der Erfindung ist als ein diagnostisches Werkzeug zum Nachweis der Anwesenheit eines bestimmten Mittels in einem Medium. Zu diesem Zweck wird ein Proto-Nucleozym so aufgebaut, dass das Mittel der spezifische Cofaktor ist. Wenn das Mittel in dem getesteten Medium anwesend ist, bildet sich ein katalytischer Komplex, und die katalytische Aktivität, die dann analysiert wird, dient dann als ein Anzeiger der Anwesenheit des Mittels in dem Medium.
Für diese bevorzugte Ausführungsform ist es bevorzugt, Proto-Nucleozyme zu verwenden, die absolut keine oder eine unmeßbare katalytische Aktivität besitzen, und die katalytische Aktivität zeigt sich dann im wesentlichen nur bei der Bildung des katalytischen Komplexes. In einem derartigen Fall gibt es ein Hintergrundsignal von im wesentlichen Null, und ein Nachweis einer katalytischen Aktivität ist dann eine eindeutige ("alles oder nichts") Anzeige der Anwesenheit des Mittels (das der spezifische Cofaktor ist) in dem Medium. Wenn ein Proto-Nucleozym verwendet wird, das eine gewisse kleine katalytische Aktivität besitzt, muß das Ausmaß der katalytischen Aktivität bestimmt werden, um die Anwesenheit des Mittels in dem Medium zu untersuchen.
Die vorliegende Erfindung liefert außerdem ein Verfahren zum Nachweis eines Mittels in einem Medium, das die folgenden Schritte aufweist:

(a) in Berührung bringen des Mediums mit einem Proto-Nucleozym der Erfindung, wobei das Mittel der für die Bildung eines katalytischen Komplexes erforderliche spezifische Cofaktor ist;
(b) Bereitstellen oder Aufrechterhalten von Bedingungen, die eine katalytische Aktivität des katalytischen Komplexes erlauben; und
(c) Testen auf Anwesenheit von Produkten der katalytischen Aktivität in dem Medium, wobei eine derartige Anwesenheit die Anwesenheit des Mittels in dem Medium anzeigt.

Ein Beispiel des Typs von katalytischer Aktivität, die in dem obigen Schritt (c) bestimmt werden kann, ist die Spaltung einer Nucleinsäure-Sequenz. Beispielsweise kann der katalytische Komplex von einem immobilisierten Nucleinsäure-Substrat ein kleines Fragment, das eine nachweisbare Markierung trägt, abspalten. Dann zeigt ein Nachweis einer freien Markierung in dem Reaktionsmedium die Aktivität des katalytischen Komplexes an, was wiederum eine Anzeige der Anwesenheit des getesteten Mittels in dem Medium ist.
Andere Beispiele für katalytische Aktivität, die in Schritt (c) bestimmt werden können, sind Ligation, Ausspleißen, Einspleißen, etc.. Alle der obigen drei katalytischen Aktivitäten führen zu einer Veränderung des Abstands zwischen zwei Se quenzen von Nucleotiden, die die Substrate für die Reaktion sind. Bei Ligation und Ausspleißen werden zwei Sequenzen zusammengebracht, und beim Spleißen werden zwei Sequenzen voneinander beabstandet. Eine dieser Sequenzen kann beispielsweise einen Fluoreszenzstoff enthaltenden Teil (z. B. Rhodamin) tragen, und die andere Sequenz kann einen Fluoreszenz-Löscher (z. B. Fluorescein) enthaltenden Teil oder einen fluoreszenzsteigernden Teil tragen; die Veränderung des Abstands zwischen den beiden Sequenzen kann dann bestimmt werden durch Messen der Veränderung der Fluoreszenzemission, die gelöscht (im Falle eines Fluoreszenz-Löschers) oder gesteigert (im Falle eines fluoreszenzsteigernden Stoffes) wird, wenn die beiden Sequenzen einander benachbart sind, und gesteigert bzw. gelöscht wird, wenn die zwei Sequenzen beabstandet sind.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Testen auf die Produkte der katalytischen Aktivität ist mittels der selbst-amplifizierenden Ribozym-Kaskadenreaktion, die in der internationalen Anmeldung PCT/US96/02380 und den entsprechenden israelischen Patentanmeldungen 112799 und 115772, deren Inhalte hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden, offenbart ist. In Kürze, sobald der katalytische Komplex (oder das Nucleozym) gebildet ist, katalysiert er eine Reaktion, die zur Aktivierung von a priori inaktiven Nucleozymen (in den oben angeführten Anmeldungen als Ribozyme bezeichnet) führt, und jene katalytisch aktiven Nucleozyme wirken dann in einer selbst-amplifizierenden Reaktionskaskade mit positiver Rückkopplung katalytisch, um zusätzliche Ribozyme zu aktivieren, und so weiter. Dieses amplifizierte Signal dient daher als ein Anzeiger der Anwesenheit des katalytisch aktiven Ausgangsnucleozyms in dem Medium; die Anwesenheit eines derartigen katalytisch aktiven Ausgangsnucleozyms wiederum ist ein Hinweis auf die Anwesenheit des spezifischen Cofaktors, der das nachzuweisende Mittel ist und der mit den Proto-Nucleozymen Komplexe bildet, um den katalytischen Komplex des Ausgangsribozyms in dem Medium zu bilden.
Die einzigartige Fähigkeit der Proto-Nucleozyme, in Anwesenheit eines spezifischen Cofaktors katalytisch aktiv zu werden, macht sie auch als therapeutische Mittel in bestimmten gezielten Therapien brauchbar. Bei manchen Krankheiten unterscheiden sich krankheitsbefallene Zellen von normalen Zellen in der Ex pression bestimmter Expressionsprodukte. Dies ist beispielsweise bei Viruskrankheiten der Fall, wo sich erkrankte Zellen von anderen Zellen durch die Tatsache unterscheiden, dass sie Virusproteine exprimieren. Proto-Nucleozyme können gentechnologisch so konstruiert werden, dass es bei Komplexierung mit einem Virus-spezifischen Protein (das der spezifische Cofaktor ist) eine bestimmte zytotoxische katalytische Aktivität hat oder seine katalytische Aktivität ein zytotoxisches Reaktionsprodukt liefert. Die katalytische Aktivität kann auf eine spezifische Nucleinsäure-Sequenz oder ein Genexpressions-Produkt zielen, so dass die unerwünschte Genexpression (z. B. von viralem Ursprung oder von zellulärem Ursprung) gehemmt wird. Beispielsweise kann die katalytische Aktivität die Sequenz einer unerwünschten mRNA abspalten, wodurch sie die Erzeugung eines unerwünschten Proteins hemmt. Derartige Proto-Nucleozyme können in Formulierungen bereitgestellt werden, die ihren Eintritt in die Zelle erlauben, z. B. eine Liposom-Formulierung, und während die Proto-Nucleozyme in viele Zellen eindringen, nehmen sie ihre katalytische Aktivität an und zerstören auf diese Weise beispielsweise nur die gewünschte Zellpopulation oder hemmen die Expression unerwünschter Gene nur in den Viren tragenden Zellen.
Zusätzlich zu Viruskrankheiten gibt es auch andere Krankheiten, bei denen erkrankte Zellen Produkte exprimieren oder enthalten, die man in normalen Zellen nicht findet oder in den letzteren Zellen nur in kleinen Mengen findet. Derartiges ist beispielsweise der Fall bei Krebs, bei einer Vielzahl von Infektionskrankheiten außer Viruskrankheiten, bei verschiedenen genetischen Erkrankungen, bei denen erkrankte Zellen in erkrankten Individuen ein mutiertes Gen und abnorme Expressionsprodukte enthalten etc..
Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum selektiven Zerstören einer spezifischen Zellpopulation, die ein spezifisches Mittel enthält oder exprimiert, wobei das Verfahren aufweist:

(a) Bereitstellen eines Proto-Nucleozyms eines Nucleozyms der Erfindung, wobei das Nucleozym eine katalytische Aktivität hat, die für die Zelle zytotoxisch ist, oder zytotoxische Reaktionsprodukte hat, und wobei das Mittel ein spezifischer Cofaktor für das Proto-Nucleozym ist;
(b) Einführen des Proto-Nucleozyms in Zellen, die das Mittel enthalten oder exprimieren, oder Anwenden der Proto-Nucleozyme auf Gewebe, von dem vermutet wird, dass es eine Zellpopulation enthält, die das Mittel enthält oder exprimiert, unter Bedingungen oder unter Verwendung eines Vehikels dergestalt, dass das Proto-Nucleozym in die Zellen eingeführt wird.

Die Zytotoxitität des Nucleozyms kann sich in vielerlei Weise manifestieren. Beispielsweise kann ein Nucleozym, sobald es aktiv wird, eine Reaktion katalysieren, die die Bildung zytotoxischer Reaktionsprodukte ergibt. Derartige zytotoxische Reaktionsprodukte können beispielsweise Reaktionsprodukte sein, die einen oder mehrere essentielle metabolische oder katabolische Wege in den Zellen kompetitiv hemmen. Als ein anderes Beispiel, die katalytische Aktivität des zytotoxischen Ribozyms kann selbst zur Spaltung von Substanzen führen, die in den Zellen erzeugt werden oder durch die Zellmembranen in die Zellen hineintransportiert werden, die für das Wachstum und Überleben der Zellen essentiell sind. Andere Beispiele können Nucleozyme sein, die mRNA abbauen, entweder allgemein oder solche mit spezifischen Sequenzen, Nucleozyme, die tRNAs spalten, Nucleozyme, die eine Vielzahl von Proteinen abbauen, und andere.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Hemmung der Expression unerwünschter Gene in Zellen, aufweisend:

(a) Bereitstellen eines Proto-Nucleozyms eines Nucleozyms der Erfindung, wobei das Nucleozym eine katalytische Aktivität hat, die auf eine spezifische Nucleinsäure-Sequenz oder ein spezifisches Gen-Expressionsprodukt zielt, so dass die unerwünschte Genexpression gehemmt wird, sobald es in einer Zelle aktiv ist;
(b) Einführen des Proto-Nucleozyms in Zellen, die das Gen enthalten oder exprimieren, oder Anwenden des Proto-Nucleozyms auf Gewebe, von denen vermutet wird, dass sie eine Zellpopulation aufweisen, die das Gen enthält oder exprimiert, unter Bedingungen oder unter Verwendung eines Vehikels dergestalt, dass das Proto-Nucleozym in die Zellen eingeführt wird.

In einer Ausführungsform dieses letzteren Aspekts ist der Cofaktor des Proto-Nucleozyms entweder eine Nucleinsäure-Sequenz eines solchen Gens oder ein Transkriptionsprodukt des Gens.
Die Hemmung der DNA-Expression nach diesem letzteren Verfahren kann beispielsweise durch Spaltung der spezifischen mRNA, Spaltung eines Expressionsprodukts des Gens oder Spaltung von Regulatorsubstanzen, die die Expression des Gens regulieren, stattfinden.
Die obigen Verfahren, bei denen das Proto-Nucleozym in Zellen eingeführt wird, können in der Humantherapie nützlich sein. Im Rahmen solcher Therapien können die Proto-Nucleozyme in vivo verabreicht werden oder ex vivo mit Zellen in Kontakt gebracht werden, wobei die Zellen dann wieder in den Körper eingeführt werden.
Gemäß ihrem therapeutischen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, z. B. zur Verwendung zur Vernichtung einer speziellen Zellpopulation, bereit, die ein Proto-Nucleozym der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist. Der Träger ist bevorzugt von der Art, die die Einführung des Proto-Nucleozyms in Zellen erlaubt, z. B. ein Liposomträger oder irgendein anderer in der Technik bekannter Träger.
Wie oben erläutert, kann das Nucleozym der Erfindung durch rationalen Aufbau oder mittels in vitro-Entwicklung erzeugt werden.
Wie weiter unten erläutert werden wird, erfordert die in vitro-Entwicklung keinerlei Vorabentscheidung hinsichtlich des genauen Bildungsmechanismus des katalytischen Komplexes zwischen Proto-Nucleozym und dem spezifischen Cofaktor. Der genaue Aktivierungsmechanismus entwickelt sich während einer derartigen in vitro-Entwicklung.
Der Begriff "in vitro-Entwicklung" bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung und zur Selektion von Nucleinsäure-Sequenzen (die DNA- oder RNA-Sequenzen oder Sequenzen, die sowohl dNTP's als auch rNTP's aufweisen, sein können, wobei sie natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Nucleotide aufweisen) mit gewünschten Eigenschaften, ohne a priori den genauen Aufbau der ausgewählten Nucleinsäure-Sequenz zu kennen. Typischerweise erfordert es die Erzeugung einer riesigen Anzahl beliebiger oder teilweise beliebiger Nucleinsäure-Sequenzen oder von Komplexen, die eine oder mehrere Nucleinsäure-Sequenzen) enthalten, dann die Bereitstellung der Bedingungen, die zur Selektion derjenigen Sequenzen, die eine spezifische Eigenschaft aufweisen, erforderlich sind (beispielsweise Zugabe eines Proteins und Auswahl nur jener Nucleinsäure-Sequenzen, die eine katalytische Aktivität nur in Anwesenheit des Proteins zeigen). Die ausgewählten Nucleinsäure-Sequenzen werden dann amplifiziert, beispielsweise durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction), und dann werden Selektions- und Amplifikationsschritte über viele Zyklen, z. B. im Bereich von 10 bis 100, wiederholt, was zu einer Anreicherung des Reaktionsgemisches an jenen Nucleinsäure-Sequenzen oder Komplexen, die die gewünschte Eigenschaft aufweisen, führt. Es ist gelegentlich nützlich, die Schwellenkriterien nur Selektion in jeder Selektions- und Amplifikationsrunde progressiv zu erhöhen. Beispielsweise werden, wenn die Schritte der in vitro-Entwicklung fortschreiten, nur Spezies mit progressiv höherer Affinität zu dem gewünschten Protein ausgewählt.
In vitro-Selektionsmethodiken zur Untersuchung von RNA-Funktion und -Strukturen sind in einer Übersicht von Conrad, R. C., Molecular Diversity 1: 69–78 (1995) zusammengefaßt und wurden in Modellen für die autokatalytische Replikation von RNA von Giver et al. (G. R. Fleischaker et al. (Herausgeber), Self-Production of Supramolecular Structures 137–146, (1994), Klewer Academic Publishers) studiert.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein in vitro-Entwicklungsverfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Proto-Nucleozyms, das bei Bildung eines katalytischen Komplexes mit einem spezifischen Cofaktor eine spezifische katalytische Aktivität manifestiert, die in dem Proto-Nucleozym entweder fehlt oder erheblich geringer ist. Das Verfahren, das sowohl positive als auch negative Selektions-Schritte hat, weist auf:

(a) Herstellen einer Palette unterschiedlicher Nucleinsäure-Moleküle, wobei mindestens ein Teil der Sequenz in den Molekülen der Palette eine beliebige oder eine teilweise beliebige Sequenz ist, so dass der Teil in verschiedenen Molekülen der Palette eine verschiedene Sequenz hat;
(b) Zugeben des Cofaktors zu der Palette und Inkubieren unter Bedingungen, die die katalytische Aktivität erlauben;
(c) Trennen zwischen den Nucleinsäure-Molekülen der Palette, die die katalytische Aktivität aufweisen, und denen, die sie nicht aufweisen, um eine erste ausgewählte Palette von Nucleinsäure-Molekülen, die die katalytische Aktivität aufweisen, zu erhalten;
(d) Amplifizieren der Nucleinsäure-Moleküle der ersten ausgewählten Palette;
(e) Inkubieren der ersten ausgewählten Palette mit einem Reaktionsgemisch, das frei von dem Cofaktor ist, unter Bedingungen, die die katalytische Aktivität erlauben;
(f) Entfernen von Nucleinsäure-Molekülen, die katalytische Aktivität aufweisen, wodurch eine von den entfernten Nucleinsäure-Molekülen freie, zweite ausgewählte Palette von Nucleinsäure-Molekülen erhalten wird; und
(g) Wiederholen der Schritte (b)–(f) über eine Mehrzahl von Zyklen, z. B. etwa 10 bis 100 Zyklen, um das Proto-Nucleozym zu erhalten.

In einer Ausführungsform bestehen die Moleküle in der Palette aus einer völlig beliebigen Sequenz mit Ausnahme von zwei kurzen flankierenden Sequenzen zur Anlagerung der PCR-Primer. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Moleküle in der Palette auf der Basis einer bekannten Nucleozym-Sequenz aufgebaut. Beispielsweise kann das Molekül aus einer konstanten, Ribozym-abgeleiteten Sequenz, die an eine beliebige oder halbbeliebige Sequenz angelagert ist, bestehen. Allgemein kann eine beliebige Sequenz beispielsweise durch Verwendung eines Nucleinsäure-Syntheseautomats hergestellt werden.
Bei dem obigen Verfahren gehen positive Selektions-Schritte (Schritte (b)–(d)) den negativen Selektions-Schritten (Schritte (e)–(f)) voraus, wobei dies eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist. Es ist jedoch auch möglich, das Verfahren in umgekehrter Reihenfolge durchzuführen, nämlich zuerst die negativen Selektions-Schritte und dann die positiven Selektions-Schritte.
Ein anderes Beispiel ist eine Palette von Molekülen, die alle auf einer bekannten Ribozym-Sequenz basieren, und worin die Nucleotide in dem gesamten Molekül oder in einem Teil davon eine gewisse Wahrscheinlichkeit (z. B. 70 bis 99%) haben, mit der bekannten Sequenz identisch zu sein. Eine solche halbbeliebige Sequenz bedeutet, dass jedes Nucleotid eine gewisse Wahrscheinlichkeit hat, von dem entsprechenden Nucleotid in dem ursprünglichen Ribozym verschieden zu sein (z. B. ist diese Wahrscheinlichkeit dementsprechend 30 bis 1%). Die Herstellung der Palette beginnt mit einer bekannten Nucleozym-Sequenz, und dann werden auf deren Basis durch Ersetzen einiger der Nucleotide durch die verschiedenen, beliebigen Nucleotide ("Dotieren") halbbeliebige Sequenzen erzeugt. Der Dotierungsgrad ist typischerweise 1 bis 30%. Das Dotieren kann auch in jedem Zyklus oder einmal in mehreren Zyklen durchgeführt werden, wodurch man es langsam zur Entwicklung eines Proto-Nucleozyms mit einer hohen Spezifität gegenüber dem spezifischen Cofaktor bringt.
Ein Beispiel dafür, wie eine derartige Selektion durchgeführt wird, kann aus dem speziellen Fall abgeleitet werden, wo die katalytische Aktivität cis-Spaltung ist. Zu Beginn können alle Glieder der Palette auf einem festen Träger immobilisiert werden. Jene Sequenzen, die die katalytische Aktivität der cis-Spaltung in den positiven Selektions-Schritten, d. h. in Anwesenheit des spezifischen Cofaktors, besitzen (Schritte (b)–(d)) werden in das Reaktionsgemisch freigesetzt und werden gesammelt und amplifiziert, beispielsweise unter Verwendung von PCR. Nach der Amplifizierung läßt man die gesammelten Sequenzen in Abwesenheit des spezifischen Cofaktors spalten, und diejenigen, die in den negativen Selektions-Schritten (Schritte (e)–(f)) freigesetzt werden, werden entfernt.
In den Selektions-Schritten ist es gelegentlich erwünscht, die genauen Bedingungen anzuwenden, unter denen das Proto-Nucleozym schließlich verwendet werden wird. Wenn das Proto-Nucleozym zur Verwendung im Rahmen eines diagnostischen Tests gedacht ist, sind die Selektionsbedingungen typischerweise ähnlich denjenigen in dem diagnostischen Test.
Im folgenden wird ein bevorzugtes in vitro-Entwicklungsverfahren, das zur Herstellung von erfindungsgemäßen Proto-Nucleozymen brauchbar ist, beschrieben. Es sollte jedoch beachtet werden, dass dieses in vitro-Entwicklungsverfahren ein Beispiel ist und dass die Erfindung weder auf die Herstellung von Proto-Nucleozymen nach diesem speziellen beschriebenen Verfahren, noch auf Herstellungsverfahren durch in vitro-Entwicklung allgemein beschränkt ist.
Ein bevorzugtes in vitro-Entwicklungsverfahren
Ein Hauptproblem in einem in vitro-Entwicklungsverfahren zur Herstellung eines Proto-Nucleozyms mit den oben angegebenen Merkmalen ist die Schwierigkeit, zwischen Proto-Nucleozym-Kandidaten, die katalytische Aktivität nur in Anwesenheit des spezifischen Cofaktors aufweisen, und jenen, die die spezifische katalytische Aktivität sowohl in Anwesenheit des Cofaktors als auch in seiner Abwesenheit oder in Anwesenheit anderer Mittel aufweisen, zu trennen. Mit anderen Worten, es gibt eine Schwierigkeit bei der Beseitigung der unerwünschten Kandidaten.
Viele Male gibt es, insbesondere in den anfänglichen Zyklen der in vitro-Entwicklung, Moleküle, die katalytische Aktivität auch in Abwesenheit des spezifischen Cofaktors aufweisen (Moleküle, die entfernt werden sollten), dies aber mit sehr geringer Effizienz tun; daher kann der negative Selektions-Schritt, in dem solche Moleküle entfernt werden, extrem verlängerte Inkubationszeiten erfordern, was das gesamte Verfahren der in vito-Entwicklung (das vielfache Zyklen negativer Selektionsschritte erfordert) unbrauchbar macht. Unter Standardinkubationszeiten weist nur ein kleiner Prozentsatz der Moleküle, die langsam wirken, aber auch in Abwesenheit des Cofaktors eine katalytische Aktivität aufweisen, die aber in den negativen Selektions-Schritten entfernt werden sollten, in der gegebenen Inkubationszeit tatsächlich die katalytische Aktivität auf. Dies kann zu einer unvollständigen Entfernung unerwünschter Moleküle in den negativen Selektions-Schritten führen, und wenn die Proto-Nucleozyme zur Diagnose verwendet werden, kann es schließlich zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Prinzipiell können die während des negativen Selektions-Schritts entfernten Moleküle gesammelt werden und verwendet werden, um andere identische Moleküle derselben Spezies von Proto-Nucleozymen – Kandidaten, die hätten entfernt werden sollen, aber wegen der kurzen Inkubationszeit keine Gelegenheit hatten, die katalytische Aktivität aufzuweisen – durch Hybridisierung "herauszufischen". Jedoch können die Sequenzen in Frage kommender Proto-Nucleozyme, die katalytische Aktivität sowohl in Anwesenheit des spezifischen Cofaktors als auch in Anwesenheit anderer Mittel zeigen (zu entfernen), und die Sequenzen der in Frage kommenden Proto-Nucleozyme, die die gewünschte Eigenschaft nur in Anwesenheit des Cofaktors aufweisen (beizubehalten), sehr ähnlich sein (der Unterschied in der Sequenz der beiden kann relativ zu der großen Größe der in Frage kommenden Proto-Nucleozyme sehr klein sein), so dass es praktisch unmöglich ist, durch Hybridisierung zwischen den beiden zu unterscheiden.
Die Lösung dieses Problems ist die Hinzufügung einer beliebigen tag-Sequenz an jedes in Frage kommende Proto-Nucleozym in dem Ausgangs-Oligonucleotidgemisch, das eine Palette unterschiedlicher, in Frage kommender Proto-Nucleozyme aufweist, so dass nach der Amplifizierung alle Oligonucleotide derselben Spezies (d. h. alle von einem ursprünglichen Ausgangsmolekül amplifizierten Moleküle) dieselbe beliebige tag-Sequenz haben. Diese tag-Sequenz bildet nicht einen Teil der funktionellen Sequenz des Nucleozyms (d. h. die tag ist eine redundante Sequenz). Die funktionelle Sequenz ist der Teil, der, wenn das Proto-Nucleozym mit dem Cofaktor reagiert, der der Teil ist, der die katalytische Aktivität verleiht. Die tag-Sequenz ist an eine variable Sequenz (die zur Entwicklung der funktionellen Sequenz in Frage kommt) gebunden. Während die variable Sequenz verschiedener Oligonucleotid-Spezies ähnlich sein kann (beispielsweise, da alle variablen Sequenzen ausgehend von einer bekannten Ausgangssequenz eines Ribozyms "dotiert" wurden), ist die tag-Sequenz von einer Oligonucleotid-Spezies zur anderen völlig verschieden.
Daher ist es dann, wenn nach einem negativen Selektions-Schritt Oligonucleotide, die in Abwesenheit des Cofaktors katalytische Aktivität aufweisen, gesammelt werden, um entfernt zu werden, möglich, zuerst die spaltbare Sequenz abzuspalten und so separat nur die tag-Sequenzen der unerwünschten Oligonucleotide zu sammeln. Diese tag-Sequenzen, die beliebig sind, haben eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit, in jeder Spezies von Oligonucleotid-Molekülen unterschiedlich zu sein, und können daher verwendet werden, um wirkungsvoll komplementäre tag-Sequenzen anderer Mitglieder der zu entfernenden, unerwünschten Oligonucleotid-Spezies "herauszufischen", und sind daher in der Lage, "latente" Oligonucleotide, die selbst in Abwesenheit des Cofaktors katalytische Aktivität aufgewiesen hätten, wenn die Inkubationszeit lang genug gewesen wäre, zu entdecken. Da das "Herausfischen", d. h. das Beseitigungsverfahren, nur auf der Hybridisierung der einzigen tag-Sequenz (die von den tag-Sequenzen der anderen Spezies verschieden ist) basiert, stört die Tatsache, dass die variable Sequenz der Oligonucleotide, die entfernt werden sollen, der variablen Sequenz der Oligonucleotide, die beibehalten werden sollen, sehr ähnlich ist, den Selektionsprozeß nicht.
Daher weist das in vitro-Entwicklungsverfahren zum Erhalten des Proto-Nucleozyms der Erfindung, das zusammen mit einem Cofaktor einen katalytischen Komplex mit einer katalytischen Aktivität, die von einer funktionellen Sequenz des Proto-Nucleozyms verliehen wird, bildet, die Schritte auf:

(a) Herstellen eines Gemisches verschiedener, zur Entwicklung zu den Proto-Nucleozymen in Frage kommender Oligonucleotide, von denen jedes eine variable Sequenz, die zur Entwicklung zu der funktionellen Sequenz in Frage kommt, und eine tag-Sequenz aufweist, wobei jede der zwei Sequenzen von entsprechenden Sequenzen verschiedener Oligonucleotide in dem Gemisch verschieden ist, wobei die variable Sequenz und die tag-Sequenz durch mindestens eine spaltbare Sequenz verbunden sind;
(b) Behandeln des Gemisches durch positive und negative Selektions-Schritte, wobei jedem Schritt gewünschtenfalls ein Oligonucleotid-Amplifikations schritt folgt, wobei es mindestens einen positiven Selektions-Schritt und mindestens einen negativen Selektions-Schritt gibt, wobei diese Schritte aufweisen:
(ba) einen positiven Selektions-Schritt, aufweisend das Anwenden des spezifischen Cofaktors und das Trennen zwischen den Oligonucleotiden, die katalytische Aktivität haben, und denen, die keine katalytische Aktivität haben, um ein erstes ausgewähltes Gemisch, aufweisend eine erste Gruppe von Oligonucleotiden, die in Anwesenheit des Cofaktors katalytische Aktivität aufweisen, zu erhalten;
(bb) Amplifizieren der ersten Gruppe von Oligonucleotiden in dem ersten ausgewählten Gemisch, um eine Mehrzahl von Kopien eines jeden Oligonucleotids der ersten Gruppe von Oligonucleotiden zu erzeugen, um ein erstes amplifiziertes Gemisch zu erhalten;
(bc) einen negativen Selektions-Schritt, aufweisend:
(bca) Anwenden eines Reaktionsgemisches, das von dem spezifischen Cofaktor frei ist, und Trennen zwischen einer zweiten Gruppe von Oligonucleotiden, die in Abwesenheit des Cofaktors keine katalytische Aktivität besitzen, und einer dritten Gruppe von Oligonucleotiden, die in Abwesenheit des Cofaktors die katalytische Aktivität besitzen, um ein zweites ausgewähltes Gemisch, aufweisend die zweite Gruppe von Oligonucleotiden, und ein drittes ausgewähltes Gemisch, aufweisend die dritte Gruppe von Oligonucleotiden, zu erhalten;
(bcb) Amplifizieren der dritten Gruppe von Oligonucleotiden in dem dritten ausgewählten Gemisch, um eine Mehrzahl von Kopien eines jeden Oligonucleotids der dritten Gruppe von Oligonucleotiden zu erzeugen, um ein zweites amplifiziertes Gemisch zu erhalten;
(bcc) Abspalten der spaltbaren Sequenz der Oligonucleotide in dem zweiten amplifizierten Gemisch, Trennen zwischen den variablen Sequenzen und den tag-Sequenzen und Sammeln der tag-Sequenzen;
(bcd) in Berührung bringen der gesammelten tag-Sequenzen mit dem zweiten ausgewählten Gemisch unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen und Entfernen hybridisierter Oligonucleotide von anderen Oligonucleotiden des zweiten Gemisches, wodurch ein viertes ausgewähltes Gemisch von Oligonucleotiden, das im wesentlichen frei ist von Oligonucleotiden, die in Abwesenheit des Cofaktors katalytische Aktivität besitzen, erhalten wird;

Bevorzugt sollte der positive Selektions-Schritt dem negativen Selektions-Schritt vorangehen. Es ist bevorzugt, dass in dem positiven Selektions-Schritt eines jeden der aufeinanderfolgenden Zyklen die Bedingungen mehr und mehr stringent werden, beispielsweise kürzere Versuchszeiten, strengere Probenherstellungsbedingungen, etc.; während in dem negativen Selektions-Schritt die Bedingungen weniger und weniger stringent werden, was selbst denjenigen Oligonucleotiden mit einer sehr kleinen katalytischen Aktivität in Abwesenheit des Cofaktors erlaubt, ihre katalytische Aktivität auszuüben (und daher entfernt zu werden), beispielsweise durch Verwendung längerer Inkubationszeiten, etc..
Wenn der negative Selektions-Schritt mehrfach wiederholt wird, kann jeder Schritt oder können mehrere Schritte in Anwesenheit eines anderen Mittels, das nicht der Cofaktor ist, durchgeführt werden.
Es sollte beachtet werden, dass durch das obige in vitro-Entwicklungsverfahren Proto-Nucleozyme, die durch bloße Konformationsveränderung in Nucleozyme umgewandelt werden, beseitigt werden. Derartige Proto-Nucleozyme können sich sogar spontan, ohne den Cofaktor, in eine katalytisch aktive Form (d. h. in das Nucleozym) umwandeln, wenn auch mit geringer Wahrscheinlichkeit.
Wegen des einzigartigen und hochgradig empfindlichen negativen Selektionsschritts, der in dem obigen in vitro-Entwicklungsverfahren verwendet wird, werden alle derartigen Proto-Nucleozyme identifiziert und entfernt, wobei nur jene Proto-Nucleozyme zurückbehalten werden, die im wesentlichen keine katalytische Aktivität haben und den Cofaktor, der den fehlenden Bestandteil ergänzt, benötigen, um katalytisch aktiv zu werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen mit gelegentlicher Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen veranschaulicht:
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Proto-Nucleozyms, wobei der spezifische Cofaktor ein Protein ist;
2A, 2B und 2C zeigen Nucleinsäure-Konstrukte, die ein Proto-Nucleozym sind, wobei der Cofaktor eine Nucleinsäure-Sequenz ist;
3 zeigt eine Verbesserung des negativen Selektions-Schritts des Verfahrens von 1;
4A zeigt die dreidimensionale Struktur des Gruppe I-Intron-Ribozyms;
4B zeigt die konservierte Nucleotid-Struktur und die Sekundärstruktur des Gruppe I-Intron-Ribozyms;
4C und 4D zeigen verschiedene Modifikationen des Ribozyms SunY;
4E zeigt verschiedene Bereiche des Ribozyms SunY;
5 zeigt einen Vergleich der Ligationsprodukt-Ausbeute (%) zwischen verschiedenen SunY-Konstrukten;
6 und 7 zeigen Elektrophorese-Gele der Ligationsprodukte von Ribozymen in verschiedenen Experimenten, die erhalten wurden unter Verwendung veränderlicher Verhältnisse von Ribozymen zu Substraten, erfaßt zu unterschiedlichen Zeiten;
8 zeigt ein Diagramm der Konzentration des Ligationsprodukts (nM), das von einem Ribozym SunY P910 bei verschiedenen Verhältnissen von Ribozym zu Substrat erzeugt wurde, als eine Funktion der Zeit;
9 zeigt ein doppelt-reziprokes (oder Lineweaver-Burt) Diagramm auf der Basis der Parameter von 8;
10 zeigt die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von SDS, GITC, Harnstoff und Phenol (re-extrahiert mit Chloroform) auf die Ribozym-Reaktion;
11 zeigt die Auswirkung veränderlicher Konzentrationen der PCR-Hemmstoffe Isopropanol, EtOH, Harnstoff, GITC und SDS auf die Ribozym-Reaktion;
12 zeigt die Auswirkung von Phenol (entweder nicht extrahiert oder mit Chloroform re-extrahiert) und eines im Handel erhältlichen Probenherstellungs-Kits auf die Ribozym-Reaktion;
13 zeigt die Auswirkung veränderlicher Konzentrationen an GITC auf die Ribozym-Reaktion (Dehnung von 10);
14 zeigt die Auswirkung veränderlicher Konzentrationen von ATA, Spermidin, DMF, DMSO, Triton, Nonidet und Tween 40 auf die Ribozym-Reaktion;
15 zeigt die Auswirkung veränderlicher Konzentrationen von Spermidin, Triton X-100 und Tween 40 auf die Ribozym-Reaktion (Dehnung von 14);
16 zeigt den Aufbau des unveränderten Ribozyms SunY;
17 zeigt das SunY-Konstrukt, in dem das Fragment B (im Text in fettgedruckten Buchstaben angegeben) durch die 16s rRNA-Sequenz von Chlamydia ersetzt wurde;
18 zeigt ein Elektrophorese-Gel, das die Ligationsaktivität verschiedener Gruppe I-Intron-Ribozyme auf der Basis von Chlamydia anzeigt;
19 zeigt fluoreszenzmarkierte RNA-Konstrukte, die als Ribozym-Substrate verwendet wurden;
20 zeigt die Auswirkung von denaturierender PAGE nach FRET-Überwachung;
21 zeigt die relative Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit, die die Ribozym-Ligationsaktivität in Anwesenheit von 5% SDS 100 mM Harnstoff oder ohne Zusätze anzeigt;
22 zeigt eine schematische Darstellung eines RNA-Sequenzpools, der einer Selektion durch in vitro-Entwicklung unterliegt; und
23 zeigt die Ligationsaktivität von Proto-Nucleotiden, die Cofaktor- (auch bezeichnet als "Effektor-") abhängig ist.
In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe und Definitionen verwendet:
Gruppe I-Intron-Ein Intron mit einer dreidimensionalen Struktur, wie in 3A dargestellt, und mit einer in 3B dargestellten konservierten Nucleotid-Struktur und Sekundärstruktur.

6.2 – ein Substrat für SunY-Ligation mit der Sequenz 5'CCCUCU3'.
P1 – Rechterhand von 4E gezeigt
P1 = wenn N G ist
P1RL = P1 wie in 4E, wenn N = 5'GGAGAAU3'
P2 – gezeigt in dem Ribozym von 4E
P2A = eine Modifikation von P2, worin die Sequenz 5'GGC UUA GAG AAG AAA UUC UUU AA 3' zwischen # (–23) und 0 eingeführt wurde
P2H = eine Modifikation von P2, worin die Sequenz 5'GGU AA 3' zwischen # (5) und 0 eingeführt wurde
P5 – gezeigt in dem Ribozym von 4E
P5SA = eine Modifikation von P5, worin die Sequenz 5'AGC UAU A3' zwischen die Basen # 28 und # 32 eingeführt wurde
P5LA = eine Modifikation von P5, worin die Sequenz 5'AGC UAU AGA CAA GGC AAU CC 3' zwischen die Basen # 28 und # 32 eingeführt wurde
P9.0 – gezeigt in dem Ribozym von 4E
P9L = eine Modifikation von P9.0 mit der Sequenz 5'AUU CUC 3'
P910 = eine Modifikation von P9.0 mit der Sequenz 5'AUU CUC CAC C3'
P9A = eine Modifikation von P9 mit der Sequenz 5'AAA GCC AAU AGG CAG UAG CGA AAG CUG CGG 3' [Substitution von P9 nach P9.0]
P9JD = eine Modifikation von P9 mit der Sequenz 5'GGG GUG ACC CGA UC 3' [Substitution von P9 nach P9.0]
F910 – eine von F9 abgeleitete Sequenz mit 10 Basenpaaren mit der Sequenz 5' AUU CUC CAC C 3'.

Das folgende ist eine Auflistung von Chimären verschiedener SunY-Konstrukte, die hierin verwendet werden:
Beispiele
In den folgenden Beispielen geben die Zahlen in Klammern die Nummer des relevanten Schritts in der entsprechenden Figur an. Die Beispiele 1, 2 und 5 sind zur Bezugnahme enthalten, betreffen aber nicht die Proto-Nucleozyme der Erfindung.
Beispiel 1 In vitro-Entwicklung, wobei der Cofaktor ein Protein ist.
i. Herstellen einer statistischen Palette von Nucleinsäure-Seauenzen (1)
Eine statistische Palette von DNA-Sequenzen wird mit einem Standard-Nucleinsäure-Syntheseautomaten unter Verwendung eines Programms zur Erzeugung statistischer Sequenzen hergestellt.
Eine typische Sequenz ist gezeigt in 1 Schritt (1) und weist auf einen Promotor (P) von etwa 20 bp, eine in der Figur als "Substrat" (S) bezeichnete Sequenz von etwa 10 bp, die von einem katalytisch aktiven Ribozym cis-spaltbar ist (diese beiden Sequenzen sind konstant und nicht beliebig), eine beliebig erzeugte Sequenz (R) von 50–8000 bp, im Mittel 100, und zwei Sequenzen, die als Primer für die PCR dienen (M), eine stromauf von der beliebigen Sequenz eine stromab davon.
ii. Herstellung immobilisierter Nucleinsäure-Sequenzen (2 und 3)
Die DNA-Sequenzen von i. oben werden unter Verwendung eines Primers mit Biotin (B) am 5'-Ende transkribiert (1, Schritt 2). Das Biotin wird dann mit Avidin reagieren lassen, das auf einem festen Träger wie Streptavidin-Perlen (SA) vorliegt, so dass jedes Molekül der statistischen Menge auf einem festen Träger immobilisiert wird (1, Schritt 3).
iii. Negativer Selektionsschritt (4 und 5)
Ein Reaktionsgemisch, dem das getestete Cofaktor-Protein fehlt, das aber Magnesiumionen enthält, die für die katalytische Aktivität von Ribozymen erforderlich sind, wird zu den oben hergestellten Nucleinsäure-Sequenzen zugegeben. Alternativ ist es möglich, ein Reaktionsgemisch zuzugeben, das ein anderes Protein (Pro') enthält, das von dem beabsichtigten spezifischen Cofaktor verschieden ist (1, Schritt 4a). Dann werden zu dem Reaktionsmedium Moleküle zugegeben, die für eine katalytische Aktivität erforderlich sein können, wie Mg⁺⁺ oder GTP (1, Schritt 4b). Jene Nucleinsäure-Sequenzen, die entweder spontan gespalten werden (Schritt 4b(ii)) oder eine normale Spaltungsaktivität von Ribozymen mit dem nicht getesteten Cofaktor (Pro') besitzen (Schritt 4b(i)), werden in das Medium freigesetzt und werden entfernt. Nach dieser negativen Selektion werden nur Nucleinsäure-Sequenzen beibehalten, die keinerlei Aktivität zeigen (Schritt 4b(iii)). Daher enthält das nachfolgende Reaktionsgemisch nur diese Sequenzen (erhalten in Schritt 4b(iii)).
iv. Positiver Selektionsschritt (5)
Der spezifische Cofaktor, Protein (Pro), wird dann zu dem Reaktionsgemisch zugegeben (1, Schritt 5a).
Dann wird zu dem Reaktionsgemisch Magnesium zugegeben, um die katalytische cis-Spaltungsaktivität der statistischen Nucleinsäure-Sequenzen zu ermöglichen (1, Schritt 5b).
Die Nucleinsäure-Sequenzen in dem Medium können in drei Gruppen eingeteilt werden, wie in Schritt 5b gezeigt:

Gruppe i. Erfindungsgemäße Proto-Nucleozyme, die nur bei Bildung eines katalytischen Komplexes mit dem spezifischen Cofaktor-Protein aktiviert werden;
Gruppe ii. Nucleinsäure-Sequenzen, die mit dem Protein-Cofaktor einen Komplex bilden, aber keinerlei katalytische Aktivität aufweisen;
Gruppe iii. (Die die Mehrheit der Nucleinsäure-Sequenzen enthält) Nucleinsäure-Sequenzen, die mit dem Protein-Cofaktor keinen Komplex bildeten.

Der letzte Schritt der positiven Selektion umfaßt die Entfernung jener Nucleinsäure-Sequenzen, die von den immobilisierten Perlen freigesetzt wurden (Gruppe i).
v. Amplifizierung von abgetrennter Sequenz (6)
Sequenzen, die in iv. oben ausgewählt wurden, werden amplifiziert. Die amplifizierten Produkte werden transkribiert, an Biotin gebunden und an einem festen Träger befestigt, wie in (ii) oben angegeben.
Die Schritte (2)–(6) werden dann für etwa 10 bis 100 Zyklen wiederholt, wodurch das Reaktionsgemisch allmählich mit den Proto-Nucleozymen mit der neuen Aktivität, d. h. dass sie nur in Anwesenheit des spezifischen Cofaktor-Proteins kata lytisch aktiv sind, angereichert wird. Es sollte beachtet werden, dass der positive Selektionsschritt dem negativen Selektionsschritt vorangehen kann.
Beispiel 2 Herstellung von Haptenen, die den Cofaktor binden
Als ein vorbereitender Schritt vor der Herstellung der DNA-Sequenzen von Schritt 1 (in 1) ist es möglich, zuerst kurze Sequenzen (Haptene) zu finden, die in der Lage sind, den gewünschten Cofaktor (Protein) zu binden.
Das Verfahren zur Herstellung derartiger Haptene ist wie folgt:

1. Kurze beliebige Sequenzen (etwa 80 Basenpaare) werden hergestellt und mit dem Protein-Cofaktor reagieren lassen.
2. Diejenigen Sequenzen, die das Cofaktor-Protein binden, werden identifiziert, beispielsweise durch die Verwendung von Antikörpern gegen das Protein, durch Absorption eines Proteins an einer zur Absorption von Proteinen befähigten Membran, etc., und werden von den anderen Sequenzen, die keine Bindung mit dem Protein eingegangen sind, abgetrennt.
3. Sequenzen, die in Schritt 2 erhalten wurden, werden amplifiziert.
4. Die Schritte 2 und 3 oben werden für 10 bis 30 Zyklen wiederholt, so dass das Reaktionsgemisch mit Haptenen angereichert wird, die in der Lage sind, das spezifische Cofaktor-Protein zu binden.

Diese kurzen Haptene dienen dann als Teil der beliebigen Sequenz (R), die in Schritt 1 von 1 gezeigt ist.
Beispiel 3 Herstellung einer halbbeliebigen Nucleinsäure-Sequenz
Manchmal ist es für die Zwecke der in vitro-Entwicklung erwünscht, dass die neu hergestellte Palette von Sequenzen in einem gewissen Grad einer bekannten Sequenz, beispielsweise derjenigen eines Ribozyms, ähnelt. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, dass die halbbeliebige Sequenz 70% mittlere Ähnlichkeit mit einer spezifischen Nucleinsäure-Sequenz hat, ist es möglich, den Nucleinsäure-Syntheseautomaten statt mit vier reinen Lösungen, die jedes der Nucleotide (A, T, G und C) enthalten, mit vier Flaschen auszustatten, von denen jede eine Lösung enthält, die aus 70% eines Nucleotids (beispielsweise A) und 10% eines jeden der anderen drei Nucleotide (10% G, 10% T und 10% C) zusammengesetzt ist. Durch Anweisen des Syntheseautomaten, eine Sequenz unter Verwendung dieser vier Gemische aufzubauen, ist es möglich, eine Sequenz zu erhalten, die eine 70%ige Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz hat. Natürlich können andere Ähnlichkeits-Prozentsätze verwendet werden.
Beispiel 4 In vitro-Entwicklung, wobei der Cofaktor eine Nucleinsäure-Sequenz ist
I. Ein Proto-Nucleozym zur Verwendung beim Nachweis eines Cofaktors mit einer kurzen Nucleinsäure-Sequenz (2A):
Es wird eine bekannte Ribozym-Sequenz mit einem spezifischen Kernbereich (C) gewählt. Der Kernbereich wird auf die Sequenzen, die dem Nucleinsäure-Cofaktor am meisten ähneln, durchgemustert. Die ähnlichen Sequenzen werden alle zusammen entfernt (2, Schritt 2a), oder sie werden durch eine völlig beliebige Sequenz (R) ersetzt (2, Schritt 2b).
Die Sequenzen stromauf und stromab von dem fehlenden Kernbereich oder dem beliebigen Bereich werden mit zwei flankierenden Sequenzen (F) versehen, die zu den Sequenzen, die den beabsichtigten Cofaktor flankieren, komplementär sind (Schritt 3(a) und 3(b)). Die ursprünglichen Ribozym-Sequenzen des in Schritt 3(b) erhaltenen Ribozyms werden dann dotiert, d. h. um halbbeliebig (R') zu werden, wie in Beispiel 3 (Schritt 4(b)) erläutert, beispielsweise indem sie 70% Ähnlichkeit mit der ursprünglichen Ribozym-Sequenz haben.
Was die zwei Teile des in Schritt 3(a) erhaltenen Vorläufers betrifft, wird nur die ursprüngliche Ribozym-Sequenz eines Teils halbbeliebig gemacht (R'), während der andere Teil konstant bleibt (Schritt 4(a)).
Die in 4(a) oder 4(b) erhaltenen Sequenzen können dann dieselben Schritte der in vitro-Entwicklung von Beispiel I (ii)–(v) durchmachen.
Alternativ ist es möglich, eine Sequenz herzustellen, die von 5'→3' eine völlig beliebige Sequenz (R), eine flankierende Sequenz (F) und eine halbbeliebige Sequenz (R') mit 70% Ähnlichkeit mit einem bekannten Ribozym (2B) oder dieselbe Sequenz in der 3'→5'-Ausrichtung (2) aufweist.
II. Ein Proto-Nucleozym zur Verwendung beim Nachweis von Cofaktoren mit langen Nucleinsäure-Sequenzen
Die Vorgehensweise von Beispiel 4(I) oben wird im wesentlichen wiederholt, jedoch ohne die flankierenden Sequenzen (F) in die Sequenz einzuführen. Da der nachzuweisende Cofaktor selbst eine sehr lange Nucleinsäure-Sequenz ist (beispielsweise ribosomale RNA), wird angenommen, dass selbst ohne Manipulation einige der Sequenzen des langen Cofaktors zu Sequenzen des Kerns, die nicht entfernt oder durch beliebige Sequenzen ersetzt wurden, komplementär sein werden (in einem gewissen Ausmaß).
III. Ein Proto-Nucleozym zur Verwendung beim Nachweis eines Cofaktors mit einer Nucleinsäure-Sequenz, die unbekannt ist
Gelegentlich ist nicht a priori genau bekannt, was die Sequenz des Ziel-Cofaktors ist, beispielsweise kann sie eine von vielen Sequenzen eines Virus oder eines Bakteriums sein, dessen Anwesenheit nachzuweisen ist. In einem solchen Fall ist es am besten, einige Sequenzen aus dem Kern eines Ribozyms in statistischer Weise zu entfernen und dann die verbleibenden Teile halbbeliebig zu machen. Es ist erwünscht, dass die entfernten Sequenzen durch die Sequenzen der unbekannten Bakterien ergänzt werden.
Wenn die Schritte (ii)–(v) von Beispiel 1 mit dem wie oben hergestellten Konstrukt wiederholt werden, ist es notwendig, dass bei der negativen Selektion, Schritt (iii), die Sequenzen von Viren oder Bakterien, die zu dem Reaktionsmedium zugegeben werden, der nachzuweisenden Sequenz ähnlich sind, um irgendwelche Nucleinsäure-Sequenzen, die durch andere Viren oder Bakterien aktiviert werden, auszuschließen. In den Wiederholungszyklen können andere Arten von Viren oder Bakterien für den negativen Selektionsschritt zugegeben werden.
Beispiel 5 Verbesserung des negativen Selektionsschritts unter Verwendung einer tag-Sequenz
i. Herstellen einer statistischen Palette von Nucleinsäure-Sequenzen (1)
Eine Palette von DNA-Sequenzen wird mit einem Standard-Nucleinsäure-Syntheseautomaten unter Verwendung eines Programms zur Erzeugung gewünschter Sequenzen hergestellt.
Eine typische Sequenz ist in 3, Schritt (1) gezeigt und weist auf einen Promotor (P) von etwa 20 Basen, ein Substrat S, das durch ein katalytisch aktives Oligonucleotid cis-gespalten werden kann, einen ersten Primer für die PCR-Amplifikation (PCR1), eine erste Restriktionsstelle C, von etwa 4 bis 8 Basen, eine beliebige tag(TAG)-Sequenz von etwa 15 Basen, eine zweite Restriktionsstelle C₂ von etwa 4 bis 8 Basen (diese beiden Sequenzen sind konstant und nicht beliebig), eine variable Sequenz (V) von 50 bis 8000 bp mit einem Mittel bei 100, wobei die variable Sequenz dafür in Frage kommt, zur Entwicklung zu einer funktionellen Sequenz in der Lage zu sein. Die variable Sequenz kann variablen Sequenzen anderer Nucleotid-Spezies ähnlich sein, beispielsweise da alle Sequenzen dotiert sind, d. h. einen gewissen Prozentsatz an Nucleinsäure, die mit denjenigen eines bekannten Ribozyms identisch sind, und einen gewissen Prozentsatz an Beliebigkeit haben; und eine zweite PCR-Primersequenz (PCR2). Die variable Sequenz kommt dafür in Frage, sich zu einer Sequenz zu entwickeln, die nach Komplexierung mit einem spezifischen Cofaktor, der einen fehlenden Bestandteil ergänzt, katalytisch aktiv wird.
ii. Herstellung von immobilisierten Nucleinsäure-Sequenzen (2 und 3)
Die DNA-Sequenzen von i. oben werden unter Verwendung eines Primers mit Biotin (B) am 5'-Ende transkribiert (3, Schritt 2). Dann läßt man das Biotin mit Avidin reagieren, das auf einem festen Träger wie Streptavidin-Perlen (SA) vorliegt, so dass jedes Oligonucleotid der Palette auf einem festen Träger immobilisiert wird (3, Schritt 3).
iii. Positiver Selektionsschritt (4)
Das spezifische getestete Mittel, das ein Protein ist (das als der ausgewählte Satz von Bedingungen dient) (Pro), wird dann zu dem Reaktionsgemisch zugegeben (3, Schritt 4(a)).
Magnesium und/oder andere Cofaktoren, die für die katalytische Aktivität erforderlich sind, werden dann zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, um die katalytische cis-Spaltungsaktivität der variablen Sequenzen der Oligonucleotide bezüglich Substrat-Sequenzen S zu erlauben (3, Schritt 4(a)).
Die Oligonucleotid-Sequenzen in dem Medium können in drei Klassen eingeteilt werden, wie in Schritt 4(b) gezeigt:

Klasse i. Oligonucleotide, die nur bei Bildung eines katalytischen Komplexes mit dem spezifischen Cofaktor Pro aktiviert werden und das Substrat S spalten und daher in das Medium freigesetzt werden;
Klasse ii. Oligonucleotide, die selbst ohne ein Protein katalytische Aktivität aufweisen;
Klasse iii. (Die die Mehrheit der Nucleinsäure-Sequenzen aufweist) Oligonucleotide, die bei dem vorliegenden Cofaktor keine katalytische Aktivität zeigten.

Der letzte Schritt der positiven Selektion umfaßt das Sammeln derjenigen Oligonucleotide, die von den immobilisierten Perlen freigesetzt wurden (Klasse i und Klasse ii).
iv. Amplifikation einer abgetrennten Sequenz (5)
Gewünschtenfalls kann an den Oligonucleotiden haftendes Protein durch Denaturierung durch Erhitzen oder durch Phenol-Chloroform-Extraktion entfernt werden.
Die in Schritt 4 oben gesammelten Sequenzen werden revers transkribiert und durch PCR amplifiziert. Da die Substrat-Sequenz S abgespalten wurde (Schritt 4b), sollte diese Sequenz wieder hergestellt werden durch Verwendung von Primern entweder zum Zweck reverser Transkription oder für PCR-Zwecke, wobei die Primer die Sequenz des abgespaltenen Substrats enthalten, und so ist das amplifizierte und wieder hergestellte Produkt wiederum mit 1 identisch. Die amplifizierten Produkte werden transkribiert, an Biotin gebunden und an einem festen Träger befestigt wie oben angegeben (Schritt 6).
v. Negativer Selektionsschrit (7)
Die amplifizierten und immobilisierten Oligonucleotide von Schritt 6 werden einem negativen Selektionsschritt unterzogen. In diesem Schritt wird die katalytische Aktivität entweder in Abwesenheit irgendeines Proteins oder in Anwesenheit von Nicht-Cofaktor-Mitteln, die dem spezifischen Cofaktor ähnlich sind, der zu dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, wobei die Mittel ein Protein sind, das dem spezifischen Cofaktor ähnlich ist (Pro') (Schritt 7a), bestimmt; Magnesium und/oder andere für die katalytische Aktivität erforderliche Reagenzien werden zugegeben (Schritt 7b).
Die durch Spaltung der Substrat-Sequenz S in das Medium freigesetzten Oligonucleotide gehören drei Klassen an:

Klasse i. in der das Nicht-Cofaktor-Protein die Spaltung der Substrat-Sequenz bewirkte;
Klasse ii. die Oligonucleotide enthält, die ohne Erfordernis irgendeines externen Cofaktors, welcher Art auch immer, spalteten; und
Klasse iii. die überhaupt nicht gespalten werden.

Die beiden Klassen i. und ii. werden gesammelt (Schritt 7c), und das Protein wird entfernt (Schritt 7d). Die Sequenzen werden revers transkribiert und durch PCR amplifiziert, um ein doppelsträngiges Konstrukt herzustellen (Schritt 8). Geeignete Restriktionsenzyme werden zugegeben, um die Sequenzen C₁ und C₂ zu spalten, wobei eine Spaltstelle ein glattes Ende und eine ein klebriges Ende bildet (Schritt 9). Das klebrige Ende wird mit Hilfe von biotinierten Nucleotiden ergänzt und dann wird die abgetrennte TAG-Sequenz an einem festen Träger (Avidin) immobilisiert und denaturiert, so dass eine einzelsträngige denaturierte immobilisierte tag-Sequenz zurückbleibt.
Die immobilisierten tag-Sequenzen von Schritt 10 werden mit in Schritt 4(b) gesammelten Nucleotiden (Klasse i und Klasse ii) in Berührung gebracht (Schritt 11). Moleküle der, Gruppe, die mit der immobilisierten TAG-Sequenz hybridisieren, werden entfernt (Schritt 12), so dass nur Moleküle zurückbleiben, die in Anwesenheit des spezifischen Cofaktors (Pro) Spaltung aufweisen, und ohne irgendein Protein oder in Anwesenheit eines Nicht-Cofaktor-Mittels (Pro') keine Spaltungsaktivität aufweisen.
Die in Schritt 11 erhaltenen Oligonucleotide werden wiederum für 2 bis 1000 Zyklen, bevorzugt 10 bis 100 Zyklen, besonders bevorzugt 20 bis 30 Zyklen, allen vorhergehenden Schritten unterzogen.
Beispiel 6 Ligation der Substrate PIRL und 6.2: Vergleich zwischen 15 verschiedenen SunY-Ribozymen
Ein Vergleich der Fähigkeit zur Ligation der Substrate PIRL und 6.2 wurde zwischen den folgenden 15 von SunY abgeleiteten Ribozymen durchgeführt:

– SNYP9L;
– SNYP2P9L;
– SNYP910;
– SNYP2P910;
– SNYP2HP9L;
– SNYP2AP9A (auf);
– SNYP2AP9A (ab);
– SNYP9JD;
– SNYP2AP9JD;
– SNYP5SAP9L;
– SNYP2P5SAP9L;
– SNYP2HP5SAP9L;
– SNYP5LAP9L;
– SNYP2P5LAP9L;
– SNYP2HP5LAP9L;
– SNYP9L.

Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
Molverhältnis Ribozym: PIRL:6.2 = 1:5:5
Ribozym-Endkonzentration: 0,5 μM.
Das Reaktionsgemisch, das das Ribozym, PIRL und das 6.2-Substrat enthielt, wurde zwei Minuten lang bei 58°C in einem Puffer, der 30 mM tris-HCl, pH 7,4 (bei 25°C)/10 mM NH₄Cl/0,4 M KCl/20% Ethanol enthielt, vorinkubiert. Die Lösung wurde auf 45°C abgekühlt, und die Reaktion begann durch den Zusatz von endgültigen 90 mM MgCl₂ in einem Reaktionsvolumen von 5 μl. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten beendet durch den Zusatz von 10 μl Puffer, 2 × eingebracht, der 7 M Harnstoff enthielt. Die Proben wurden 2 bis 3 Minuten lang bei 80°C erhitzt und auf ein 20%iges PAA-Gel, das 7 M Harnstoff enthielt, aufgebracht. Die radioaktiven Gele wurden mit Hilfe eines Biorad Phosphoimager-Systems analysiert.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Wie man sehen kann, behalten verschiedene Ribozyme, die von dem SunY-Ribozym abgeleitet wurden, die Fähigkeit zur Ligation von Substraten bei.
Beispiel 7 Kinetische Studien an dem Ribozym SunY P910 unter Verwendung der Substrate PIRL und 6.2
Das Ribozym SunY P910 wurde zur Ligation der Substrate PIRL und 6.2 verwendet.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
Molverhältnisse zwischen Ribozym: PIRL:6.2 = 1:2,5:2,5 bis 1:20:20
Ribozym-Endkonzentration: 0,25 μM.
Das Reaktionsgemisch, das das Ribozym und die Substrate PIRL und 6.2 enthielt, wurde 2 Minuten lang bei 58°C in einem Puffer, der 30 mM tris-HCL, pH 7,4 (bei 25°C)/10 mM NH₄Cl/0,4 M KCl/20% Ethanol enthielt, vorinkubiert. Die Lösung wurde auf 45°C abgekühlt und die Reaktion begann durch den Zusatz von endgültigen 90 mM MgCl₂-Konzentration in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 5 μl.
Zu den bezeichneten Zeiten wurden die Reaktionen durch den Zusatz von 10 μl Puffer, zweimal eingebracht, der 7 M Harnstoff enthielt, beendet. Die Proben wurden 2 bis 3 Minuten lang bei 80°C erhitzt und auf ein 20%iges PAA-Gel, das 7 M Harnstoff enthielt, aufgebracht.
Die radioaktiven Gele wurden in einem Biorad Phosphoimager-System analysiert. Die Ergebnisse sind in den 6 und 7 gezeigt.
Diese Ergebnisse wurden zur Aufzeichnung der in 8 dargestellten kinetischen Graphik verwendet, die zur Erzeugung der Lineweaver-Burt-Graphik von 9 verwendet wurde. Der berechnete Km war 4,7 μm und der berechnete K_cat war 6 Minuten^–1. Diese Ergebnisse zeigen eine gewaltige Verbesserung bei Km und eine Verbesserung um 1800 bei K_cat, verglichen mit den vorher (Daten nicht gezeigt) mit dem unveränderten Ribozym SunY erhaltenen Ergebnissen.
Beispiel 8 Auswirkung der Lyse-Bedingungen auf die Ribozym-Kinetik Konventionelle Amplifikationssysteme basieren auf Protein-Enzymen. Daher sind entweder mühselige Reinigungsschritte erforderlich oder es müssen sehr spezielle und milde Lyse-Bedingungen ausgearbeitet werden. Im Gegensatz dazu sind Ribozym-Reaktionen sehr robust und unempfindlich gegenüber scharfen Bedingungen wie:

– hohen Konzentrationen des starken, ionischen Detergens SDA (bis zur Löslichkeitsgrenze: 5% bei 45°C in Anwesenheit von 400 mM KCl)
– hohen Konzentrationen des nichtionischen Detergens Triton X-100 (10% bei 45°C sind sogar stimulierend)
– Denaturierungsmitteln wie Harnstoff (100 mM haben keine Wirkung)
– Nuclease-Hemmstoff EDTA
– Ribonuclease-Hemmstoff ATA
– organischen Lösungsmitteln wie Isopropanol, Ethanol.

Die Auswirkungen aller Zusatzstoffe auf die Ribozym-Reaktionen wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und sind hierin im folgenden gezeigt.
I. Auswirkung von Denaturierungsmitteln (SDA, GITC, Harnstoff und Phenol) auf die Ribozym-Reaktionsgeschwindigkeit
Reaktionsbedingungen:
0,5 μM und 5 μM P1 BS und 5 μM ³²P-markiertes Substrat 6.2 wurden bei 58°C in Reaktionspuffer, der SDS, GITC, Harnstoff oder Chloroform in den in 9 angegebenen Konzentrationen, oder 25% (v/v) des wässerigen Überstands über der Phenol- oder Phenol/Chloroform-Phase enthielt, inkubiert. Der Pfeil oben an der Figur zeigt eine erneute Extraktion der wässerigen Phase mit Chloroform an; wieder wurden 25% des wässerigen Überstands zu der Ribozym-Reaktion zugegeben. Nach langsamem Abkühlen auf 45°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von MgCl₂ in einer Endkonzentration von 150 mM in Gang gesetzt. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion durch Löschen mit 8 M Harnstoff beendet.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Wie man sehen kann, veränderte der Zusatz von Denaturierungsmitteln oder Phenol nach erneuter Extraktion mit Chloroform das Ribozym im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant.
II. Auswirkung von PCR-Hemmstoffen (Isopropanol EtOH, Harnstoff, GITC und SDS) auf die Ribozym-Reaktionsgeschwindiqkeit
0,5 μM SunY und 5 μM ³²P-markiertes Substrat 6.2 und 5 μM PI BS wurden bei 58°C in Reaktionspuffer, der die angegebenen Konzentrationen verschiedener PCR-Hemmstoffe enthielt (EtOH wie angegeben, alle anderen enthalten 10% EtOH), vorinkubiert und langsam abgekühlt. Nachdem die Reaktion 45°C erreicht hatte, wurde die Reaktion durch Zugabe von MgCl₂ zu einer Endkonzentration von 150 mM gestartet. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion durch Löschen mit 8 M Harnstoff beendet. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
Wie man sehen kann, beeinflussen verschiedene Mittel, die PCR-Reaktionsmittel hemmen, Reaktionen auf Ribozym-Basis nicht signifikant, was Reaktionsmittel auf Ribozym-Basis für Nachweiszwecke attraktiver macht.
III. Auswirkung von Phenol und im Handel erhältlichem Probenherstellungs-Kit auf die Ribozym-Reaktionsgeschwindigkeit
0,5 μM SunY und 5 μM PI BS und 5 μM ³²P-PIP wurden bei 58°C in Reaktionspuffer vorinkubiert, wobei der Puffer die folgenden Zusätze enthielt: 25% (v/v) der wässerigen Schicht über Phenol oder Phenol/Chloroform. Der Pfeil zeigt eine erneute Extraktion mit Chloroform an; wieder wurden 25% der wässerigen Schicht zugegeben. Die folgenden Lösungen wurden von dem im Handel erhältlichen Amplicor CT/NG-Kit (Chlamydia trachomatia/Nelsseria gonorrhoe) Specimen Prep Kit (Roche) zugegeben: 25% oder 10% (v/v) Urin-Waschpuffer; 25% oder 10% CT/NG Probenverdünnungsmittel; 25%, 10% oder 8,3% CT/NG-Lysepuffer, der ein nicht-spezifiziertes, nicht-ionisches Detergens enthält.
Nachdem die Temperatur 45°C erreicht hatte, wurde die Reaktion durch die Zugabe von MgCl₂ zu einer Endkonzentration von 150 mM gestartet. Die Reaktion wurde nach 60 Minuten durch Löschen mit 8 M Harnstoff beendet. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
Wie man sehen kann, beeinflußte weder Phenol, das in verschiedenen Laboratorien umfangreich zur Probenherstellung verwendet wird (nach erneuter Extraktion durch Chloroform), noch ein im Handel erhältlicher Probenherstellungskit die Ribozym-Reaktion. Das in Anwesenheit von Phenol durchgeführte Laborverfahren sollte einen erneuten Extraktionsschritt durch Chloroform enthalten, bevor die Probe der Ribozym-Reaktion unterzogen wird.
IV. Auswirkung variierender Konzentrationen von GITC auf die Ribozym-Reaktionsgeschwindigkeit
0,25 μM SunY und 5 μM ³²P-markierte Substrate 6.2 und 5 μM PI BS wurden bei 58°C in Reaktionspuffer vorinkubiert, wobei der Puffer GITC in Zuwächsen von 100 mM von 0 bis 1 M enthielt, und langsam abgekühlt. Nachdem die Temperatur 45°C erreicht hatte, wurde die Reaktion durch Zugabe von MgCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 150 mM gestartet. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Löschen mit 8 M Harnstoff beendet.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Wie man sehen kann, beeinflußte GITC bis zu 300 mM die Reaktionsgeschwindigkeit nicht.
V. Auswirkung verschiedener Zusätze (ATA, Spermidin, DMF, DMSO, Triton Nonidet und Tween 40 auf die Ribozym-Reaktion
0,5 μM SunY und 5 μM PI BS und 5 μM ³²P-markierte Substrate 6.2 wurden bei 58°C in Reaktionspuffer, der die angegebenen Zusätze enthielt, vorinkubiert. Nach langsamem Abkühlen auf 45°C wurde die Reaktion durch Zugabe von MgCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 150 mM gestartet. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion durch Löschen mit 8 M Harnstoff beendet. Die relativen Produktausbeuten sind angegeben: Der Wert für die Kontrolle ohne Zusätze wurde als 100 festgelegt. Die signifikante Stimulierung mit Triton X-100 ist fettgedruckt.
Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt. Wie man sehen kann, verringerten die meisten der Zusätze die Ribozym-Reaktion nicht signifikant, während Triton X-100 die Ribozym-Aktivität um 80% erhöhte.
VI. Auswirkung von Zusätzen (Spermidin, Triton X-100 und Tween 40) auf die Reaktionsgeschwindigkeiten
0,5 μM SunY und 5 μM PI BS und 5 μM ³²P-markierte Substrate 6.2 wurden bei 58°C in Reaktionspuffer, der die in 14 angegebenen Zusätze enthielt, inkubiert. Nach langsamem Abkühlen auf 45°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von MgCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 150 mM gestartet. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion durch Löschen mit 8 M Harnstoff beeendet. Relative Produktausbeuten sind angegeben: Der Wert für die Kontrolle ohne Zusatz wurde als 100 festgelegt. Die signifikante Stimmulierung mit Triton X-100 ist fettgedruckt. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt.
Wie aus den verwendeten Zusätzen ersichtlich ist, hemmte nur Tween 40 bei einer Konzentration von 20% die Reaktion signifikant. Triton X-100 war bei allen getesteten Konzentrationen in der Lage, die Aktivität um 28% bis 85% zu erhöhen.
Beispiel 9 Proto-Nucleozyme auf der Basis von Chlamydia
Ein Teil des katalytischen Kerns eines entwickelten SunY-Ribozyms wurde durch 16s rRNA-Sequenzen von Chlamydia trachomatis ersetzt. Entsprechende Veränderungen wurden in das Ribozym eingeführt, um den Chlamydia-Ersatz unterzubringen. 16 zeigt den Ribozym-Wildtyp mit der zu ersetzenden Sequenz in Fettdruck. 17 verschiedene Ribozym-Sequenzen wurden hinsichtlich Spleißaktivität getestet. 17 zeigt die tatsächliche Sequenz des Ribozyms (Option 29), die aktiv ist, wenn ein Teil seiner Kernsequenz durch Chlamydia-Sequenzen (die letzteren fett gedruckt dargestellt) ersetzt wurde.
Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt.
In 18 wurden 2 μM eines jeden der 17 mutmaßlichen Chlamydia-abhängigen Ribozyme 18 Stunden lang bei 45°C mit 4 μM Substrat zur Reaktion gebracht. Der SunY-Ribozym-Wildtyp wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Reaktionen wurden mit 5 mM EDTA und 3,5 M Harnstoff, Endkonzentration, beendet und dann auf einem 20% PAA-7M Harnstoff-Gel laufen lassen. Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Ribozym (Option 29), bei dem ein Teil seiner Nucleotide durch 16s rRNA-Sequenzen von Chlamydia trachomatis ersetzt wurde, katalytisch aktiv sein kann. Dieses Ribozym ohne die Chlamydia-Sequenz kann als ein erfindungsgemäßes Proto-Nucleozym dienen und in einem Test zum Nachweisen der Anwesenheit von Chlamydia verwendet werden, da die Chlamydia-Sequenzen (die als Cofaktoren dienen) seine fehlenden Sequenzen ergänzen und daher ein katalytisch aktives Nucleozym bilden können.
Beispiel 10 Nachweis der Ribozym-Ligationsreaktion unter Verwendung von Fluoreszenzenergieübertragung (FRET, fluoresence energy transfer)
Ein geeignetes Modell zum Nachweisen von Ribozym-Aktivität, die Spaltung, Spleißen oder Ligation sein kann, ist die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs wie Fluorescein (F) und eines Löscherfarbstoffs CY-5. Wenn die zwei Farbstoffe zusammengebracht werden (beispielsweise aufgrund von Ligation oder Spleißen) kann der Reporter-Farbstoff (F) Licht absorbieren, aber die Fluoreszenz wird durch FRET gelöscht: Die Energie wird an den Löscher-Farbstoff CY-5 übertragen, der sein deutlich unterschiedliches Fluoreszenzlicht bei 670 nm emittiert. Als eine Folge der Ligations- oder Spleiß-Reaktion wird das/werden die F-markierte(n) Nucleotid(e) freigesetzt. Nun kann der Reporter-Farbstoff seine eigene, charakteristische Fluoreszenz bei 522 nm emittieren.
Es wurden zwei kleine RNAs, die gut charakterisierte Substrate für die Ligation durch Gruppe I-Ribozyme sind, gewählt.
Jede RNA wird mit nur einem Farbstoff markiert:

– die große RNA trägt den "Reporter-" Farbstoff Fluorescein (F) an ihrem 5'-Ende
– die kleine RNA trägt den "Löscher-" Farbstoff CY-5 an ihrem 5'-Ende.

Beide RNAs assoziieren unter Reaktionsbedingungen.
Die Ribozym-Konstrukte sind in 19 gezeigt.
Vor der Ribozym-Reaktion hybridisieren beide RNA-Substrate unter Bildung einer Haarnadel mit Strangbruch. Einfallendes Licht (hν; in der Figur als durchgehender Pfeil dargestellt) wird durch Fluorescein (F) absorbiert und an CY-5 übertragen (gestrichelter Pfeil), das daraufhin seine eigene charakteristische Fluoreszenz bei 670 nm (hν; Zickzack-Pfeil) emittiert.
Nach der Reaktion wird das Fluorescein markierte Trinucleotid (F-UGG) freigesetzt, und das absorbierte Licht wird direkt von Fluorescein mit der charakteristischen Wellenlänge von 522 nm emittiert.
Diagramm 11: Ein Beispiel für Echtzeitüberwachung
FRET kann gemessen werden durch Berechnen des Verhältnisses des Signals von dem Reporter-Farbstoff F (bei 522 nm) zu einem inerten Signal bei 500 nm.
Dieses Verhältnis wird gegen die Zeitachse aufgetragen: nach Inkubationsintervallen von 5 Minuten wurde die Fluoreszenz 30 Sekunden lang gemessen.
Jede Messung wird durch einen kleinen Peak deutlich: wegen des Photobleichens fällt das Signal während der Meßdauer ab und regeneriert sich während des Dunkelintervalls. Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt.
Reaktionsbedinungen: 1 μM SunY und 1 μM 5'-Fluorecein-markiertes PI BS und 5 μM 5'-CY-5-markiertes PIP wurden zur Echtzeitüberwachung in dem ABI Prisma 7700 inkubiert. Die Inkubation wurde bei 45°C 180 Minuten lang mit Datensammlung in Intervallen von 5 Minuten durchgeführt. Gezeigt ist die Veränderung der relativen Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs Fluorescein. Zur wei teren Analyse wurden 10 μl-Teilmengen der Proben durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert (gezeigt in 19). Der Vergleich zeigt, dass GITC das Fluorescein-Signal löscht, die Ribozym-Reaktion aber nicht hemmt.
Die Ergebnisse sind in 20 gezeigt, die auch die Auswirkung von Denaturierungsmitteln auf die Reaktionsgeschwindigkeit und den Nachweis zeigt.
In der Abwesenheit von Ribozym gibt es keine Veränderung des FRET-Signals. Bei Anwesenheit von Ribozym ohne weitere Zusätze verändert sich das Signal von einem Anfangswert "4.2" zu einem Endwert "6.2".
Sehr ähnliche Veränderungen wurden beobachtet, wenn 200 mM Harnstoff oder 5% SDS zugegeben wurden, was anzeigt, dass diese Zusätze weder die Reaktionsgeschwindigkeit noch das nachweisbare Signal signifikant verändern.
Obwohl 100 mM Guanidinium-isothiocyanat (GITC) die Ribozym-Reaktion nicht hemmen (12), ist es unmöglich, GITC aufzunehmen, wenn Fluorscein als Reporter-Farbstoff verwendet wird, da GITC ein sehr starker Löscher für Fluorescein ist. Die Wirkung von GITC ist jedoch spezifisch für den Farbstoff, da mit anderen Fluorochromen wie CY-5 keine Löschung beobachtet wurde (Daten nun gezeigt).
Beispiel 12
I. Erzeugung von Ziel-abhängigen Ribozym-Proto-Nucleozymen aus einer statistischen Sequenz
In vitro-Entwicklung wurde verwendet, um Proto-Nucleozyme herzustellen, die nur in Anwesenheit eines Cofaktors katalytisch aktiv sind.
Das Selektionsschema ist ähnlich demjenigen, das von Bartel und Szotstak (Science, 261: 1411–1418 (1993)) verwendet wurde. Ein Pool statistischer RNA-Sequenzen (N90) beginnt mit einem 5'-Triphosphat. Der Pool wird an einer Affinitätsmatrix, die zu dem 3'-Ende des Pools komplementär ist, festgehalten und mit einem RNA-Substrat, an das eine DNA-Sequenz angehängt ist, gemischt. Nach der Ligation kann die RNA aus der Säule eluiert, mittels eines cDNA-Primers revers transkribiert und mittels eines Primers, der zu dem neu verknüpften DNA-tag komplementär ist, PCR-amplifiziert werden. Eine verschachtelte PCR-Reaktion unter Verwendung eines inneren Primers erzeugt eine Matrize, die wiederum transkribiert werden kann, um ausgewählte Ligasen neu zu bilden. Dieser Zyklus kann zur Selektion der schnellsten und aktivsten Ligasen verwendet werden.
Der schematische Pool von RNA-Sequenzen, an dem die Selektion durchgeführt wird, ist in 22 zusammen mit der Sequenz seines 3'-Endes und seinem komplementären cDNA-Primer gezeigt.
Nach mehreren Selektionsrunden wurde der Pool kloniert und einzelne Klone wurden hinsichtlich Aktivität und Cofaktorsequenz-Abhängigkeit untersucht.
Die Hauptklasse ausgewählter Ligasen kann die Anfügung des gemischten markierten RNA-DNA-Substrats an sich selbst effizient katalisieren. Unter Standard-Testbedingungen wurde eine Zeitfolge durchgeführt, und die Ligationsprodukte wurden von unverknüpften Ribozymen durch Trennung auf einem denaturierenden PAA-Gel abgetrennt. In Abwesenheit von entweder Mg⁺² oder des Cofaktors, der eine spezifische Nucleinsäure-Sequenz war, wurde keine Reaktion beobachtet. Die relative Menge an radioaktiver Markierung in verknüpften und unverküpften Ribozymen wurde unter Verwendung eines Phosphoimagers bestimmt, der Hintergrund in Abwesenheit von Cofaktor wurde von diesen Werten abgezogen, und das Ausmaß der Reaktion wurde als eine Funktion der Zeit aufgetragen. Anfangsgeschwindigkeiten und das volle Ausmaß der Reaktionen wurden unter Verwendung von Standard-Kurvenanpassungsverfahren bestimmt und sind in 23 gezeigt. Wie man sehen kann, wurden in Abwesenheit von Cofaktor oder Mg⁺² keine verknüpften Produkte erzeugt.
Die Klone wurden außerdem hinsichtlich Spezifität untersucht. Eine Reihe von DNA- oder RNA-Nucleotidsequenz-Cofaktoren wurde synthetisiert, und ihre Fähigkeiten zur Aktivierung der Proto-Nucleozyme wurden bestimmt. Die Werte wurden wie oben beschrieben berechnet, wobei "–" bedeutet, dass relativ zum Hintergrund keine Aktivität gemessen werden konnte. Doppelt oder dreifach ausgeführte Experimente zeigten an, dass die relativen Aktivitäten von "aktiven" (z. B. Zeilen (1) und (9) und "inaktiven" (z. B. Zeilen (6) und (10)) Cofaktoren zwischen den Experimenten konsistent sind.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt.
Eine Vielfalt möglicher Cofaktoren wurde synthetisiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Steigerung der Ligaseaktivität untersucht; die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle III gezeigt. Oligonucleotid-Cofaktoren, die die Komplementarität in Richtung des 5'-Endes der RNA verlängerten oder in Richtung des 3'-Endes verkürzten, zeigten wenig oder gar keine Aktivierung relativ zu Kontrollen ohne Effektor (Tabelle III, Zeilen (2) und (3)). Diese Ergebnisse schienen anzuzeigen, dass die Position des Cofaktors für die Aktivität wesentlich ist und dass das 3'-Ende des Cofaktors eine Rolle bei der Aktivierung spielen könnte. Ein Cofaktor mit einer Substitution von G zu A am 3'-Ende wurde synthetisiert. Die C:A-Fehlpaarung war viel weniger aktiv als der voll komplementäre Effektor (Zeile (4)). Der Aktivitätsverlust, den man bei der Änderung von G zu A in dem Effektor sieht, konnte jedoch durch eine ausgleichende Veränderung von C zu U in dem Ribozym unterdrückt werden (Zeile (5)). Diese Ergebnisse scheinten anzuzeigen, dass das 3'-Ende des Ribozyms wie eine "terminale Guidesequenz" (TGS) wirkte. Der Cofaktor, der in einem Dideoxy-Nucleotid endete, konnte die Katalyse nicht aktivieren (Zeile 6)). Im Gegensatz dazu aktivierte ein AlI-RNA-Cofaktor die Katalyse nahezu so gut (relative Aktivität = 0,72; Zeile (7)) wie der ursprüngliche AlI-DNA-Effektor. Insgesamt genommen heben diese Ergebnisse hervor, dass das Ribozym zur spezifischen Erkennung seines spezifischen Oligonucleotid-Cofaktors in der Lage ist.
II. Aktivierung in Anwesenheit statistischer Sequenzen
Das oben in I beschriebene Experiment wurde mit einem Cofaktor von 12 monomeren Einheiten in Anwesenheit einer beliebigen Sequenz von 12 Nucelotiden oder in Anwesenheit sowohl der beliebigen Sequenz als auch des Cofaktors, wenn entweder beide dieselbe Konzentration hatten (1,3 μM) oder die beliebige Sequenz im Überschuß vorlag (10:1), wiederholt.
Die Ergebnisse sind in 23 gezeigt. Wie man sehen kann, war ein Cofaktor von 12 monomeren Einheiten in der Lage, bei mehreren Konzentrationen das Proto-Nucleozym zu aktivieren, während der Pool beliebiger Sequenzen keine derartige Aktivierung zeigte. Darüber hinaus beeinflußt der Pool beliebiger Sequenzen selbst in Überschußkonzentration nicht die Fähigkeit des korrekten Cofaktors, das Proto-Nucleozym zu aktivieren. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität des erfindungsgemäßen Proto-Nucleozyms für seinen spezifischen Cofaktor und beweisen, dass die Anwesenheit anderer Sequenzen diese Spezifität nicht beeinflußt.

Claims

Proto-Nucleozym, das ein Nucleinsäure-Molekül oder ein Komplex von Nucleinsäure-Molekülen mit im wesentlichen keiner katalytischen Aktivität ist, das aber mit einem spezifischen Nucleinsäure-Cofaktor einen Komplex bilden kann, um ein Nucleozym zu bilden, das katalytische Aktivität besitzt; wobei der Cofaktor ein Nucleinsäure-Molekül oder eine Nucleinsäure-Sequenz in einem Nucleinsäure-Molekül ist; wobei dem Proto-Nucleozym ein Segment aus einem oder mehreren Nucleotiden fehlt, dessen Ergänzung das Proto-Nucleozym in ein katalytisch aktives Nucleozym umwandelt, und wobei der Cofaktor das fehlende Segment liefert, wobei das Proto-Nucleozym, wenn es sich in Lösung befindet, nicht die Fähigkeit hat, sich spontan in eine katalytisch aktive Form umzuwandeln.
Proto-Nucleozym nach Anspruch 1, bei dem das Proto-Nucleozym eine fehlende Sequenz in seinem katalytischen Kernbereich hat.
Proto-Nucleozym nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem das Nucleozym ein Ribozym ist.
Proto-Nucleozym nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ein Produkt einer in vitro-Entwicklung ist.
Verfahren zum Nachweis eines Mittels in einem Medium, das die folgenden Schritte aufweist: (a) in Berührung bringen des Mediums mit einem Proto-Nucleozym nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Mittel der für die Bildung des katalytischen Komplexes erforderliche spezifische Cofaktor ist; (b) Bereitstellen oder Aufrechterhalten von Bedingungen, die eine katalytische Aktivität des katalytischen Komplexes erlauben; und (c) Testen auf Anwesenheit von Produkten der katalytischen Aktivität in dem Medium, wobei eine solche Anwesenheit die Anwesenheit des Mittels in dem Medium anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die katalytische Aktivität Spaltung ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die katalytische Aktivität Ligation ist.
In vitro-Entwicklungsverfahren zur Erzeugung eines Proto-Nucleozyms nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren aufweist: (a) Herstellen einer Palette unterschiedlicher Nucleinsäure-Moleküle, wobei mindestens ein Teil der Sequenz in den Molekülen der Palette eine beliebige oder teilweise beliebige Sequenz ist, so dass der Teil in verschiedenen Molekülen der Palette eine verschiedene Sequenz hat; (b) Zugeben des Cofaktors zu der Palette und Inkubieren unter Bedingungen, die die katalytische Aktivität erlauben; (c) Trennen zwischen den Nucleinsäure-Molekülen der Palette, die die katalytische Aktivität aufweisen und denen, die sie nicht aufweisen, um eine erste ausgewählte Palette von Nucleinsäure-Molekülen, die die katalytische Aktivität aufweisen, zu erhalten; (d) Amplifizieren der Nucleinsäure-Moleküle der ersten ausgewählten Palette; (e) Inkubieren der ersten ausgewählten Palette mit einem Reaktionsgemisch, das frei von dem Cofaktor ist, unter Bedingungen, die die katalytische Aktivität erlauben; (f) Entfernen von Nucleinsäure-Molekülen, die katalytische Aktivität aufwiesen, wodurch eine von den entfernten Nucleinsäure-Molekülen freie, zweite ausgewählte Palette von Nucleinsäure-Molekülen erhalten wird; und (g) Wiederholen der Schritte (b) bis (f) über eine Mehrzahl von Zyklen, um das Proto-Nucleozym zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Zyklen 10- bis 100-mal wiederholt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, bei dem die Moleküle der Palette von Nucleinsäure-Molekülen in Schritt (a) eine Sequenz haben, die von einer bekannten Nucleozym-Sequenz abgeleitet ist, wobei ein gewisser Anteil der Nucleotide durch andere Nucleotide ersetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der gewisse Anteil etwa 1 bis 30% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, aufweisend mindestens einen geänderten Zyklus, bei dem der Amplifikations-Schritt der Moleküle der ausgewählten Palette auch ein Ersetzen eines kleinen Teils der Nucleotide in den Molekülen der ausgewählten Palette aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, aufweisend eine Mehrzahl derartiger geänderter Zyklen.
In vitro-Entwicklungsverfahren zur Erzeugung des Proto-Nucleozyms nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das zusammen mit einem Cofaktor einen katalytischen Komplex mit einer katalytischen Aktivität, die von einer funktionellen Sequenz des Proto-Nucleozyms verliehen wird, bildet, wobei das Verfahren aufweist: (a) Herstellen eines Gemisches verschiedener, zur Entwicklung zu dem Proto-Nucleozym in Frage kommender Oligonucleotide, von denen jedes eine variable Sequenz, die zur Entwicklung zu der funktionellen Sequenz in Frage kommt, und eine tag-Sequenz aufweist, wobei jede der zwei Sequenzen von entsprechenden Sequenzen verschiedener Oligonucleotide in dem Gemisch verschieden ist, wobei die variable Sequenz und die tag-Sequenz durch mindestens eine spaltbare Sequenz verbunden sind; (b) Behandeln des Gemisches durch positive und negative Selektions-Schritte, wobei jedem Schritt gewünschtenfalls ein Oligonucleotid-Amplifikationsschritt folgt, wobei es mindestens einen positiven Selektions-Schritt und mindestens einen negativen Selektions-Schritt gibt, welche aufweisen: (ba) einen positiven Selektions-Schritt, aufweisend das Anwenden des spezifischen Cofaktors und das Trennen zwischen den Oligonucleotiden, die die katalytische Aktivität haben, und denen, die sie nicht haben, um ein erstes ausgewähltes Gemisch, aufweisend eine erste Gruppe von Oligonucleotiden, die in Anwesenheit des Cofaktors katalytische Aktivität aufweisen, zu erhalten; (bb) einen Amplifikations-Schritt, aufweisend das Amplifizieren der ersten Gruppe von Oligonucleotiden in dem ersten ausgewählten Gemisch, um eine Mehrzahl von Kopien eines jeden Oligonucleotids der ersten Gruppe von Oligonucleotiden zu erzeugen, um ein erstes amplifiziertes Gemisch zu erhalten: (bc) einen negativen Selektions-Schritt, aufweisend: (bca) Anwenden eines Reaktionsgemisches, das von dem spezifischen Cofaktor frei ist, und Trennen zwischen einer zweiten Gruppe von Oligonucleotiden, die die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Cofaktors nicht besitzen, und einer dritten Gruppe von Oligonucleotiden, die die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Cofaktors besitzen, um ein zweites ausgewähltes Gemisch, aufweisend die zweite Gruppe von Oligonucleotiden, und ein drittes ausgewähltes Gemisch, aufweisend die dritte Gruppe von Oligonucleotiden, zu erhalten; (bcb) Amplifizieren der dritten Gruppe von Oligonucleotiden in dem dritten ausgewählten Gemisch, um eine Mehrzahl von Kopien eines jeden Oligonucleotids der dritten Gruppe von Oligonucleotiden zu erzeugen, um ein zweites amplifiziertes Gemisch zu erhalten; (bcc) Spalten der spaltbaren Sequenz der Oligonucleotide in dem zweiten amplifizierten Gemisch, Trennen zwischen den variablen Sequenzen und den tag-Sequenzen und Sammeln der tag-Sequenzen; (bcd) in Berührung bringen der gesammelten tag-Sequenzen mit dem zweiten ausgewählten Gemisch unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen und Entfernen hybridisierter Oligonucleotide von anderen Oligonucleotiden des zweiten Gemisches, wodurch ein viertes ausgewähltes Gemisch von Oligonucleotiden, das im wesentlichen frei ist von Oligonucleotiden, die in Abwesenheit des Cofaktors katalytische Aktivität besitzen, erhalten wird, wobei, wenn der positive Selektions-Schritt dem negativen Selektions-Schritt vorangeht, der positive Selektions-Schritt auf das in Schritt (a) hergestellte Gemisch angewendet wird und der negative Selektions-Schritt auf das erste amplifizierte Gemisch angewendet wird; und wenn der negative Selektions-Schritt dem positiven Selektions-Schritt vorangeht, der negative Selektions-Schritt auf das in Schritt (a) erhaltene Gemisch angewendet wird und der positive Selektions-Schritt auf das vierte Gemisch angewendet wird.
In vitro-Verfahren zum selektiven Zerstören einer speziellen Zellpopulation, die ein spezielles Mittel enthält oder exprimiert, wobei das Verfahren aufweist: (a) Bereitstellen eines Proto-Nucleozyms nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das, wenn es in dem katalytischen Komplex vorhanden ist, eine katalytische Aktivität besitzt, die für die Zellen zytotoxisch ist, oder zytotoxische Reaktionsprodukte hat, und wobei das Mittel ein spezifischer Cofaktor für das Proto-Nucleozym ist; (b) Einführen des Proto-Nucleozyms in Zellen, die das Mittel enthalten oder exprimieren, oder Anwenden der Proto-Nucleozyme auf Gewebe, von dem vermutet wird, dass es eine Zellpopulation enthält, die das Mittel enthält oder exprimiert, unter Bedingungen oder unter Verwendung eines Vehikels dergestalt, dass das Proto-Nucleozym in die Zellen eingeführt wird.
In vitro-Verfahren zur Hemmung der Expression unerwünschter Gene in Zellen, aufweisend: (a) Bereitstellen eines Proto-Nucleozyms nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nucleozym eine katalytische Aktivität besitzt, die auf eine spezielle Nucleinsäure-Sequenz oder ein spezielles Gen-Expressionsprodukt zielt, so dass die unerwünschte Genexpression gehemmt wird, sobald es in einer Zelle aktiv ist; (b) Einführen des Proto-Nucleozyms in Zellen, die das Gen enthalten oder exprimieren, oder Anwenden des Proto-Nucleozyms auf Gewebe, von denen vermutet wird, dass sie eine Zellpopulation aufweisen, die das Gen enthält oder exprimiert, unter Bedingungen oder unter Verwendung eines Vehikels dergestalt, dass das Proto-Nucleozym in die Zellen eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Cofaktor des Proto-Nucleozyms ein Transkriptionsprodukt des Gens ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend ein Proto-Nucleozym nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der der Träger Liposome aufweist.