DE3852539T3

DE3852539T3 - Ribozyme.

Info

Publication number: DE3852539T3
Application number: DE3852539T
Authority: DE
Inventors: Wayne Lyle Hughes Austr. Capital Territory Gerlach; James Phillip O'Connor Austr. Capital Territory Haseloff; Philip Anthony West Chatswood New South Wales Jennings; Fiona Helen Forestville New South Wales Cameron
Original assignee: Gene Shears Pty Ltd
Current assignee: Gene Shears Pty Ltd
Priority date: 1987-12-15
Filing date: 1988-12-14
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2008-12-15
Also published as: NZ227332A; NO312105B1; EP0321201B2; NO308610B1; AR243935A1; HU211891A9; NO20000369L; EP0321201A2; EP0321201A3; KR970010758B1; RO114469B1; NO902661D0; AU2800789A; WO1989005852A1; FI902923A0; MC2115A1; FI104562B; KR900700603A; DK143390D0; HUT54407A

Description

Die Erfindung betrifft eine Klasse synthetischer RNA-Moleküle und Derivate hiervon, die nachfolgend als Ribozyme bezeichnet werden, die eine hochspezifische Endoribonuclease-Aktivität besitzen.
Eine Anzahl natürlich vorkommender RNA-Moleküle, beispielsweise das Avocado Sunblotch-Viroid (ASBV), die Satelliten-RNAs des Tobacco Ringspot-Virus (sTobRV) und das Lucerne Transient Streak-Virus (sLTSV) unterliegen einer selbstkatalysierten Spaltung. Eine derartige Spaltung scheint ein wesentlicher und einzigartiger Teil im Lebenszyklus dieser und anderer RNAs zu sein.
Selbstkatalysierte RNA-Spaltungsreaktionen erfordern alle zweiwertige Metallionen und einen neutralen oder höheren pH, und sie ergeben RNA mit 5'-Hydroxyl- und 2',3'-zyklischen Phosphatgruppen an ihren Enden (Prody et al., Science 231: 1577–1580 (1986) und Buzayan et al., Virology 151: 186–199 (1986)). Die Spaltungsreaktionen werden von den RNAs selbst katalysiert, wahrscheinlich aufgrund ihrer Konformation, die die reaktiven Gruppen in enge Nachbarschaft bringt. Die Stellen der selbstkatalysierten Spaltung bei natürlich vorkommenden RNAs sind in hochkonservierten Bereichen der sekundären RNA-Struktur lokalisiert (Buzayan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8859–8862 (1986) und Forster, A.C. und Symons, R.H. Cell 50: 9–16 (1987)).
An den Satelliten-RNAs des Tobacco Ringspot-Virus (sTobRV) wurden von uns Versuche durchgeführt, die zur Entwicklung neuer Endoribonucleasen (im folgenden als "Ribozyme" bezeichnet) führten, d.h. von Enzymen aus RNA, die die spezifische Spaltung von RNA-Targetmolekülen katalysieren.
Der Ausdruck Ribozym, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet Moleküle, die vollständig aus RNA oder Derivaten hiervon bestehen.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von der RNA-Endoribonuclease, die natürlicherweise in Tetrahymena thermophila vorkommt (bekannt als die IVS- oder L-19 IVS-RNA), die von Thomas Cech und Mitarbeitern ausführlich beschrieben wurde (Zaug, A.J. et al., Science (1984) 224: 574–578; Zaug, A.J. und Cech, T.R., Science (1986)231: 470–475; Zaug, A.J., et al., Nature (1986) 324: 429–433; offengelegte internationale Patentanmeldung Nr. WO 88/04300, Anmelder: University Patents Inc.). Die Endoribonuclease von Cech weist eine aktive Stelle von acht Basenpaaren auf, die an eine Target-RNA-Sequenz hybridisiert, worauf die Spaltung der Target-RNA stattfindet, wozu freies Guanosin oder freie Guanosinderivate erforderlich sind. Die durch die Spaltung entstehenden Fragmente enthalten terminale 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppen. Die beschränkte Anzahl an Nucleotiden, die zur Hybridisierung an ein RNA-Substrat zur Verfügung steht, beschränkt die Wirksamkeit oder Effizienz der Endoribonuclease von Cech, da im allgemeinen Oligonucleotide mit weniger als 12 Nucleotiden an Targetsequenzen schwach hybridisieren. Es scheint ebenfalls, daß eine Anzahl von Nucleotiden in der aktiven Stelle der Endoribonuclease von Cech für eine effiziente Endoribonuclease-Aktivität konserviert werden muß. Dies beschränkt die Anzahl der Permutationen der Sequenzen an der aktiven Stelle, die manipuliert werden können, um eine Hybridisierung an die Targetsequenzen zu bewirken, wodurch der Bereich an RNA-Targetsequenzen, die von der Endoribonuclease von Cech spaltbar sind, eingeschränkt wird. Weiterhin modifiziert die Endoribonuclease von Cech RNA durch Hinzufügen eines freien Guanosin-Nucleotids an das 5'-Ende geschnittener RNA.
Im Gegensatz dazu hybridisieren die Ribozyme der vorliegenden Erfindung effizient mit einem weiten Bereich von RNA-Targetsequenzen, und sie modifizieren die geschnittene Target-RNA nicht.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung weisen einen Hybridisierungbereich auf, der in seiner Nucleotidsequenz zu wenigstens einem Teil einer Target-RNA komplementär ist, und einen katalytischen Bereich, der so ausgelegt ist, daß er die Target-RNA schneidet. Der hybridisierende Bereich enthält 9 oder mehr Nucleotide.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Ribozyme der vorliegenden Erfindung einen hybridisierenden Bereich mit einem oder mehreren, aus einzelsträngiger RNA gebildeten Armen und eine Sequenz auf, die zu wenigstens einem Teil einer Target-RNA komplementär ist, wobei einer oder mehrere der Arme mit einem katalytischen Bereich in Verbindung steht, der zur Spaltung der Target-RNA in der Lage ist und wobei der hybridisierende Bereich einen einzelnen Arm aus RNA aufweist, der wenigstens 9 Nucleotide enthält, und wobei der hybridisierende Bereich 2 oder mehr Arme aus RNA aufweist, wobei die Summe der Nucleotide in den Armen größer als 9 Nucleotide beträgt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Ribozym der Formel 1 bereitgestellt:
worin bedeuten:
jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann;
jeder Rest (X)_n-1 und (X)_n' ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen C-A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist;
jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährleisten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt;
jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind;
jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, liefert;
jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl, die 1 entspricht, und (X)_b ein Oligoribonucleotid, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl steht, die 2 entspricht.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Inaktivierung einer Target-RNA in einer Zelle bereitgestellt, die keine Zelle in einem Menschen oder in einem Tier ist, umfassend das In-Berührung-Bringen der Target-RNA in der Zelle mit der Verbindung der obigen Formel 1 oder mit einer Verbindung der Formel 2:
worin bedeuten:
jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann;
jeder Rest (X)_n und (X)_n' ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A- kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist;
jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährleisten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt;
jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind;
jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind, liefert;
a eine ganze Zahl, die eine Zahl von Ribonucleotiden definiert, wobei gilt, dass a 0 oder 1 sein kann, und dass wenn a 0 ist, der 5' von (X)_a angeordnete Rest A an den 3' von (X)_a angeordneten Rest G gebunden ist;
jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl größer oder gleich 1;
jede der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden liefert, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, oder die Abwesenheit irgendeiner derartigen chemischen Bindung; und
(X)_b ein Oligoribonucleotid, das anwesend oder abwesend sein kann, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl größer oder gleich 2 steht, wenn (X)_b vorhanden ist;
wobei die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung unter Bedingungen derart zu Wechselwirken vermag, dass die Verbindung durch Basenpaarung mit der Target-RNA stabil wechselwirkt und die Target-RNA gespalten wird,
oder mit einer Verbindung der Formel (3): 3'-[-(Y)_r-Q-(Y)_s-]_z-5' (3)worin Q für eine Verbindung der Formel 1 oder Formel 2 steht,
jeder Rest Y für ein Ribonucleotid steht, das gleich oder verschieden sein kann,
jeder der Indices r und s für eine ganze Zahl steht, die größer oder gleich 0 sein kann,
und z für eine ganze Zahl größer als 1 steht.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung können durch an sich aus dem für die Synthese von RNA-Molekülen bekannte, dem Stand der Technik entsprechende Verfahren hergestellt werden (beispielsweise gemäß den empfohlenen Protokollen von Promega, Madison, WI, USA). Insbesondere können die erfindungsgemäßen Ribozyme aus einer entsprechenden DNA-Sequenz (DNA, die bei Transkription ein Ribozym ergibt und die gemäß den an sich aus dem Stand der Technik zur Synthese von DNA bekannten Verfahren synthetisierbar ist), die in wirksamer Weise an einen RNA-Polymerase-Promotor gebunden ist, beispielsweise einen Promotor für die T7-RNA-Polymerase oder die SP6-RNA-Polymerase, hergestellt werden. Eine DNA-Sequenz, die einem Ribozym der vorliegenden Erfindung entspricht, kann in einen DNA-Transfervektor ligiert werden, beispielsweise in ein Plasmid oder in eine Bakteriophagen-DNA. Wo der Transfervektor einen RNA-Polymerase-Promotor enthält, der in wirksamer Weise an eine einem Ribozym entsprechende DNA gebunden ist, kann das Ribozym in herkömmlicher Weise durch Inkubation mit einer RNA-Polymerase hergestellt werden. Ribozyme können deshalb in vitro durch Inkubation von RNA-Polymerase mit einem RNA-Polymerase-Promotor, der in wirksamer Weise an eine einem Ribozym entsprechende DNA gebunden ist, in Gegenwart von Ribonucleotiden hergestellt werden. In vivo können prokaryontische oder eukaryontische Zellen (einschließlich Säugetierzellen und Pflanzenzellen) mit einem geeigneten Tranfervektor transfiziert werden, der einem erfindungsgemäßen Ribozym entsprechendes genetisches Material enthält und der in solcher Weise an einen RNA-Poymerase-Promotor gebunden ist, daß das Ribozym in der Wirtszelle transkribiert wird. Transfervektoren können bakterielle Plasmide oder virale RNA oder DNA sein. Ribozymen entsprechende Nucleotidsequenzen werden im allgemeinen unter die Kontrolle starker Promotoren gesetzt, beispielsweise unter die Kontrolle der lac-, SV40 späte -, SV40 frühe -, Metallothionein- oder λ-Promotoren. Ribozyme können direkt in vivo von einem Transfervektor transkribiert werden, oder sie können alternativ hierzu als Teil eines größeren RNA-Moleküls transkribiert werden. Beispielsweise kann Ribozymsequenzen entsprechende DNA in das 3'-Ende eines Carrier-Gens ligiert werden, beispielsweise nach einem Translations-Stopsignal. Größere RNA-Moleküle können helfen, die Ribozym-Moleküle gegen Nuclease-Abbau in den Zellen zu stabilisieren. Bei Translation kann das Carrier-Gen ein Protein ergeben, dessen Vorliegen direkt getestet werden kann, beispielsweise durch eine enzymatische Reaktion. Das Carrier-Gen kann beispielsweise für ein Enzym kodieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Transfervektor bereitgestellt, der eine einem Ribozym der Formel 1 oder Formel 3 entsprechende DNA-Sequenz enthält, die in wirksamer Weise an einen Promotor gebunden ist, um eine Transkription des Ribozyms zu ermöglichen.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines Ribozyms werden zwei synthetische Oligonucleotide mit komplementärer Sequenz durch Standardverfahren hergestellt (beispielsweise unter Verwendung des Applied Biosystems DNA-Syntheseapparats Modell 380A (Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornien 94404)) und zusammen hybridisiert. Eines der Oligonucleotide kodiert ein gewünschtes Ribozym. Die jeweiligen Enden der hybridisierten Oligonucleotide entsprechen verschiedenen Restriktionsenzymstellen, z.B. Eco R1 an einem Ende und Pst 1 am anderen Ende. Nach dem Schneiden mit geeigneten Restriktionsenzymen (Eco R1 und Pst 1 im obigen Beispiel) kann das doppelsträngige DNA-Fragment in einen Transfervektor kloniert werden. Wo der Plasmidvektor einen RNA-Polymerase-Promotor stromaufwärts von der einem erfindungsgemäßen Ribozym entsprechenden DNA-Sequenz enthält, können dem Ribozym entsprechende RNA-Transkripte in herkömmlicher Weise entweder in vitro oder in vivo hergestellt werden. Wo das Ribozym aus zwei Hälften besteht, die durch Basenpaarung zwischen komplementären Nucleotiden zusammengehalten werden, kann jede Ribozymhälfte entsprechend den oben genannten Verfahren hergestellt werden, und die Hälften werden zusammen inkubiert, um das Ribozym zu bilden.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Ribozyme der Formel 1 schneiden Target-RNA, die die Sequenz X°UY enthält, wobei X° Guanidin ist, U Uracil ist und Y Adenin, Cytosin oder Uracil ist. X°U bildet einen Teil eines Basenpaar-flankierenden Bereichs, und Y ist nicht basengepaart. Vorzugsweise, aber keinesfalls ausschließlich, ist X°UY für Ribozyme der Formel 1 GUC oder GUA. Jedes beliebige, diese Sequenzen enthaltende RNA-Molekül kann mit den erfindungsgemäßen Ribozymen geschnitten werden. Wenn einmal die Sequenz eines die Sequenz X^oUY enthaltenden RNA-Transkripts bestimmt wurde, können die Arme der Ribozymsequenz synthetisiert werden, um zur RNA auf der Targetsequenz, die die X^oUY-Sequenz flankiert, komplementär und damit zu ihr hybridisierbar zu sein. Bei Hybridisierung der Arme des Ribozyms an die RNA-Targetsequenz, die die X^oUY-Sequenz flankiert, schneidet der katalytische Bereich des Ribozyms die Target-RNA in der X^oUY-Sequenz. Die RNA-Spaltung wird in Gegenwart von Magnesium oder einem anderen zweiwertigen Kation bei einem pH von ungefähr 8,0 erleichtert.
Ribozyme der Formel 2, die in dem oben beschriebenen Verfahren zur Inaktivierung einer Target-RNA in einer Zelle, die keine Zelle in einem Menschen oder in einem Tier ist, verwendet werden und bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit einer Target-RNA in Verbindung stehenden Zustands bei Mensch und Tier verwendet werden, und bei der Herstellung einer Zubereitung zur Inaktivierung einer Target-RNA in Pflanzen verwendet werden, schneiden Target-RNA, welche die Sequenz X°UY umfaßt, wobei X° ein beliebiges Ribonucleotid ist, U Uracil ist und Y Adenin, Cytosin oder Uracil ist. X°U bildet einen Teil einen Basenpaar-flankierenden Bereichs, und Y ist nicht basengepaart.
Demgemäß können die bevorzugten Ribozyme der vorliegenden Erfindung so gestaltet werden, daß sie eine beliebige RNA schneiden, deren Sequenz bekannt ist. Die hohe Frequenz an Resten, die von den Ribozymen in der RNA geschnitten wird (1:64 für GUC in einer RNA mit zufälliger und gleicher Häufigkeit der Basenverteilung), bedeutet, daß eine Anzahl möglicher Stellen zum Ribozymschnitt in einer beliebigen gegebenen Target-RNA zuverlässig voraussagbar ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Inaktivierung einer RNA-Targetsequenz bereitgestellt, das das Umsetzen der RNA-Targetsequenz mit einem erfindungsgemäßen Ribozym umfaßt.
In vivo, d.h. in der Zelle oder in den Zellen eines Organismus, kann ein Transfervektor wie ein bakterielles Plasmid oder eine virale RNA oder DNA, die für eine oder mehrere Ribozyme kodiert, beispielsweise in die Zellen transfiziert werden (Llewellyn et al., J. Mol. Bial. (1987) 195: 115–123; Hanahan et al. J. Mo. Biol. (1983) 166). Wenn er einmal in der Zelle ist, kann der Transfervektor replizieren, und er kann durch zelluläre Polymerasen trankribiert werden, um Ribozym-RNAs herzustellen, die dann eine gewünschte Target-RNA inaktivieren. Alternativ hierzu kann ein Transfervektor, der eine oder mehrere Ribozymsequenzen enthält, in Zellen transfiziert oder in Zellen durch Mikromanipulationstechniken, beispielsweise durch eine Mikroinjektion, eingeführt werden, so daß der Transfervektor oder ein Teil hiervon in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Bei Transkription des integrierten genetischen Materials ergeben sich Ribozyme, die eine gewünschte Target-RNA inaktivieren können.
Die erfindungsgemäßen Ribozyme weisen breite therapeutische und biologische Anwendungen auf. Beispielsweise können krankheitserregende Viren bei Mensch und Tier durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Ribozyms, das so angepaßt wurde, daß es an RNA-Transkripte des Virus hybridisieren und diese schneiden kann, an einen mit einem Virus infizierten Organismus inaktiviert werden. Derartige Ribozyme können durch parenterale oder andere Verabreichungsformen zugeführt werden. Alternativ hierzu kann einem mit einem kranheitserregenden Virus infizierten Organismus ein nichtvirulentes Virus, beispielsweise Vaccinia oder Adenovirus, verabreicht werden, das genetisch so verändert wurde, daß es einem Ribozym entsprechende DNA enthält, die in wirksamer Weise an einen RNA-Promotor gebunden ist, so daß das Ribozym in den Zellen des Wirtstieres transkribiert wird, mit dem veränderten Virus transfiziert werden, um eine Spaltung oder Inaktivierung des RNA-Target-Transkripts des krankheitserregenden Virus zu bewirken. Die erfindungsgemäßen Ribozyme sind insbesondere auf virale Erkrankungen anwendbar, die beispielsweise durch das Herpes-simplex-Virus (HSV) oder das AIDS-Virus (HIV) verursacht werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Verbindung der Formel 1, Formel 2 oder Formel 3 oder eines Transfer-Vektors, der aus DNA oder RNA oder einer Kombination hiervon besteht und eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche bei Transkription eine Verbindung der Formel 1, Formel 2 oder Formel 3 liefert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit einer Target-RNA in Verbindung stehenden Zustands bei Mensch und Tier.
Die erfindungsgemäßen Ribozyme sind ebenfalls insbesondere bei der Inaktivierung von RNA-Transkripten in Bakterien und anderen prokaryontischen Zellen, Pflanzen und Tieren anwendbar. In Bakterien können RNA-Transkripte, beispielsweise von Bakteriophagen, die den Zelltod der Bakterien verursachen, durch Transfektion einer Zelle mit einem DNA-Transfervektor inaktiviert werden, der zur Produktion eines Ribozyms gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, das die Phagen-DNA inaktiviert. Alternativ hierzu kann das Ribozym selbst zur Bakterienzelle zugegeben und von ihr aufgenommen werden, um eine Spaltung der Phagen-RNA zu bewirken.
RNA-Transkripte in Pflanzen können unter Verwendung von durch einen Transfervektor wie dem Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens kodierten Ribozymen inaktiviert werden. Wenn derartige Vektoren in eine Pflanzenzelle transfiziert werden, werden die Ribozyme unter der Wirkung der RNA-Polymerase hergestellt, und sie können die Spaltung einer spezifischen RNA-Targetsequenz bewirken. Demgemäß können Pflanzenviren, deren RNA-Sequenz bekannt ist, oder die RNA-Transkripte pflanzlicher Gene unter Verwendung von Ribozymen inaktiviert werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Verbindung der Formel 1, Formel 2 oder Formel 3 oder eines Transfer-Vektors, der aus DNA oder RNA oder einer Kombination hiervon besteht und eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche bei Transkription eine Verbindung der Formel 1, Formel 2 oder Formel 3 liefert, bei der Herstellung einer Zubereitung zur Inaktivierung einer Target-RNA in Pflanzen.
Endogene Gentranskripte in Pflanzen, Tieren oder anderen Zellarten können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ribozyme inaktiviert werden. Demgemäß können unerwünschte Phänotypen oder Eigenschaften moduliert werden. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ribozyme kann es beispielsweise möglich sein, Steine aus Früchten zu entfernen oder Erbkrankheiten bei Menschen zu behandeln, die durch die Produktion eines gesundheitsschädlichen Proteins oder die Überproduktion eines speziellen Proteins verursacht werden.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die nachfolgenden, nicht beschränkenden Beispiele und die Figuren in nicht beschränkender, beispielhafter Weise weiter veranschaulicht.
Die Figuren zeigen:
1 RNA-Selbstschnittstellen von RNA des Wildtyps und von mutierten RNAs; weiterhin ein Elektrophoresemuster mit selbstkatalysierten RNA-Schnittprodukten.

(a) faßt die konservierten Strukturen zusammen, die mit natürlicherweise vorkommenden RNA-Schnittstellen in ASBV, newt satellite DNA-Transkripten und den Satelliten-RNAs von sTobRV, LTSV, Velvet Tobacco Mottle-Virus, Solanum Nodiflorum Mottle-Virus und Subterranean Clover Mottle-Virus assoziiert sind. Es werden Nucleotidsequenzen gezeigt, die zwischen diesem Strukturen konserviert sind, während andere als X bezeichnet sind. Basenpaarung wird durch "*" angegeben, und die RNA-Schnittstelle ist mit einem Pfeil markiert.
(b) zeigt die konservierte Nucleotidsequenz, die mit der Spaltung des (+)-Strangs von sTobRV-RNA assoziiert ist. Die Schnittstelle ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
(c) Es wird eine in vitro-Mutante von sTobRV gezeigt, die eine Insertion von acht Nucleotiden (eingerahmt) zusammen mit einer flankierenden Duplikation von drei Nucleotiden (UGU-Resten 7 bis 9) enthält.
(d) Subklonierte Hae III-Fragmente des Wildtyps sTobRV und die D-51 in vitro-Mutante wurden jeweils sowohl in der (+)- als auch der (–)-Orientierung transkibiert und die radioaktiv markierten Transkripte durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Positionen der nicht geschnittenen 159- und 170-Basen Transkripte von den Wildtyp (WT) – und Mutanten (D-51)-Sequenzen sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die Größen der Spaltprodukte sind angegeben.

2 die Nucleotidsequenz eines Ribozyms und die Produkte der Ribozymspaltung, aufgetrennt durch Gelelektrophorese.

(a) Die in die D-51-Mutante (1c) insertierten Nucleotide enthalten eine BamHI-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle. BamHI wurde verwendet, um die Mutanten-DNA zu spalten, und die zwei Sequenzen wurden subkloniert und getrennt in vitro transkribiert. Die RNA-Transkripte sind schematisch aufgezeigt, wobei mögliche Basenpaarungen zwischen RNAs mit "*" gekennzeichnet sind. Das Fragment, das die mit einem Pfeil markierte Stelle zur Spaltung enthält, wird mit S-RNA bezeichnet, das das Ribozym enthaltende Fragment mit Rz-RNA.
(b) [³²P]-Rz-RNA (101 Basen) wurde alleine (Spur 1) und mit unmarkierter S-RNA (Spur 2) inkubiert. [³²P]-S-RNA wurde alleine (Spur 3) und mit unmarkierter und ³²P-markierter Rz-RNA (Spuren 4 bzw. 5) inkubiert.

3 ein schematisches Modell eines Ribozyms gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. Der Bereich A stellt die Schnittsequenz in der Target-RNA dar. Der Bereich B stellt einen katalytischen Bereich dar, und die Bereiche C stellen die Arme des Ribozyms dar.
4 den Plan von Ribozymen, die gegen das CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase)-Gentranskript gerichtet sind. Ribozyme, die mit RzCAT-1, 2 und 3 bezeichnet wurden, wurden gegen drei Stellen in einem 835 Basen umfassenden in vitro-Transkript des CAT-Gens gerichtet. Die relativen Anordnungen der Schnittstellen auf dem Transkript sind schematisch dargestellt, wobei die flankierenden Basen numeriert sind (a). Die drei Ribozymsequenzen sind mit ihren Targetsequenzen angegeben ((b) bis (d)). Die Aminosäuresequenzen des CAT-Gens sind numeriert, und die vorhergesagten Stellen für die RNA-Spaltung mit Pfeilen gekennzeichnet. RzCAT-1 und 3 enthalten 24 Basensequenzen, die aus dem (+)-Strang von sTobRV (Bereich B, 3) stammen, während RzCAT-2 einen einzigen U-A-Austausch in diesem Bereich enthält.
5 die Ergebnisse der CAT-RNA-Spaltung mit den Ribozymen RzCAT-1 bis 3.

(a) Die [³²P]-CAT-RNAs wurden nach Inkubation alleine (–) oder mit einem der drei Ribozyme, RzCAT-1 bis 3 (Spuren 1, 2 bzw. 3) auf einem Gel aufgetrennt. Die Lage des Transkripts mit voller Länge ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
(b) Analyse der 5'-terminalen Base. Die durch die Ribozymspaltung von CAT-mRNA produzierten 3'-Fragmente wurden [5'-³²P]-kinasebehandelt, gelgereinigt, einem vollständigen Nucleaseverdau unterzogen, und die freigesetzten terminalen Reste über Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei pH 3,5 aufgetrennt. Die 5'-terminalen Nucleotide, bestimmt durch Marker (Spur M) als Referenz, waren A, U und G für die von RzCAT-1 bis 3 (Spuren 1, 2 bzw. 3) produzierten Fragmente.

6 einen Zeitverlauf der katalytischen Aktivität des Ribozyms (RzCAT-1) gegen CAT-RNA. Die Mengen des 139 Nucleotid-Schnittprodukts wurden quantifiziert und aufgetragen. Die Nebenfigur zeigt die Akkumulation des 139 Basenfragments über die Zeit nach der Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
7 die relativen Schnittgeschwindigkeiten von CAT-RNA unter verschiedenen Temperaturbedingungen. Die Substrat-RNA wird durch eine durchgezogene Linie dargestellt. In jedem Fall wird das Schnittprodukt durch eine gestrichelte Linie dargestellt.
8 drei Ribozyme (entsprechend RzCAT-2) mit Armen oder einer flankierenden Sequenz unterschiedlicher Länge.
9 ein Herstellungsschema eines Ribozyms mit katalytischer Anti-Sense-RNA, das jede der Schnittdomänen RzCAT-1 bis 3 enthält.
10 Ribozyme, die gegen Target-Sequenzen hybridisieren, die GUA (10a)- und GW (10b)-Motive in der CAT-mRNA enthalten.
11 Stellen selbstkatalysierter RNA-Spaltung in Citrus Exocortis-Viroid (CEV)-RNA und sein Komplement.
12 das Ribozym RzCEV25x(+), hybridisiert gegen Target-CEV-RNA(a), und ein Gelelektrophoresemuster von (+)-CEV-RNA und komplementärer (–)-CEV-RNA, inkubiert mit RzCEV25x(+) (b, Spuren 1 bzw. 2). Das Schnittprodukt ist mit einem Pfeil markiert.
13 das Ribozym RzCAT-2, das mit seiner Targetsequenz hybridisiert (a) und Ribozym RzSCMoV(b). Die katalytische Domäne in jedem Ribozym ist eingerahmt. Unterschiede im katalytischen Abschnitt von RzSCMoV, verglichen mit RzCAT-2, sind markiert.
14 das Ribozym RzCEV-2, das an eine Targetsequenz in der Citrus Exocortis-Viroid (CEV)-RNA hybridisiert. Die Schnittstelle entspricht einem Nucleotid-336 in der CEV-RNA-Sequenz. Die Alteration in der Nucleotidsequenz in der katalytischen Domäne, verglichen mit der katalytischen Domäne von sTobRV, ist eingekreist (a). 14(b) zeigt ein Elektrophoresemuster einer Kontroll [(–)-Strang von CEV]-RNA, Spur 7 und des (+)-Strangs von CEV-RNA Spur 8, nach Inkubation mit RzCEV2.
15 das Ribozym RzCAT-2 (a), verglichen mit dem Ribozym RzCAT-2B (b). Die katalytischen Domänen sind eingerahmt. Veränderungen in der katalytischen Domäne von RzCAT-2B, verglichen mit RzCAT-2, sind ebenfalls eingerahmt.
16 eine Karte des Plasmids pJ35SN; und
17 eine graphische Darstellung des Mittelwerts von vier Versuchen zur Hemmung der CAT-Expression in Pflanzen (Tabakprotoplasten).
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, und die Erfindung ist nicht hierauf beschränkt.
Reaktionen und Manipulationen an DNA, beispielsweise Ligationen, Restriktionsenzymverdaus, bakterielle Transformation, DNA-Sequenzierung usw., wurden entsprechend den Standardtechniken durchgeführt, beispielsweise den Techniken, die von Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982) beschrieben wurden. Manipulationen an RNA wurden ebenfalls entsprechend den Standardtechniken durchgeführt, beispielsweise den Techniken, die von Uhlenbeck (Nature 328, 596–600 (1987)) und Haseloff und Gerlach (Nature 334, 585–591 (1988)) beschrieben wurden.
BEISPIEL 1
Selbst-katalysierte Spaltung mutierter sTobRV-RNA:
Ein Konsensus der Domänen, die assoziiert sind mit natürlich vorkommenden RNA-Schnittstellen in ASBV, newt-Satelliten-DNA-Transkripten und den Satelliten-RNAs von sTobRV, LTSV, Velvet Tobacco Mottle-Virus (VMoV), Solanum Nodiflorum Mottle-Virus (SNMV) und Subterranean Clover Mottle-Virus (SCMoV), gezeigt in 1a. Es sind diejenigen Nucleotidsequenzen gezeigt, die zwischen diesen Strukturen konserviert sind, während nichtkonservierte Sequenzen mit X bezeichnet sind. Ein Extra-U ist nach dem Rest ¹A im LTSV(+)-Strang positioniert.
Die mit der selbstkatalysierten Spaltung des (+)-Strangs von sTobRV assoziierte Domäne wurde untersucht, um die enzymatische Substrataktivität in dieser Domäne zu ermitteln. Zunächst wurden klonierte sTobRV-cDNAs unter Verwendung eines Oligonucleotid-Linker (BamH1)-Insertionsprotokolls mutagenisiert.
Konstruktion eines Vektors für die in vitro-Expression von sTobRV:
Ein 160 Basenpaare Taq 1-Spe 1-Fragment von sTobRV-cDNA wurde aus pSP653 isoliert (Gerlach et al. 1985, Virology 151: 172–185) und an Acc 1 – Spe 1 geschnittenes, phosphatasebehandeltes pGEM 4 ligiert, um die Acc 1-Stelle zu verändern. Der entstandene Klon wurde mit Acc 1 linearisiert, phosphatasebehandelt, und es wurde ein 359 bp Taq 1-Fragment der sTobRV-cDNA inseriert. Die entstandenen Klone wurden auf das Vorhandensein einer zirkulär permutierten 520 bp sTobRV-cDNA-Sequenz gescreened, die die terminal redundanten Reste 277 bis 81 (pTTS) enthielt. Die sTobRV-Frequenz wird durch Promotoren für T7- und SP6-RNA-Polymerasen flankiert, und die in vitro-Transkription ergab RNAs mit (+)- oder (–)-Orientierung, die zwei Stellen für eine Selbstspaltung enthielten.
In vitro-Mutagenese:
Das Plasmid pTTS (50 μg) wurde mit BamH 1 linearisiert, mit S1-Nuclease behandelt und religiert, um eine einzelne BamH 1-Stelle zu entfernen. Die entstandene Konstruktion, pTTS-B, wurde mit 2 × 10^–4 Einheiten DNase 1 in 20 mM Tris-HCl pH 7,0, 15 mM MnCl₂ 10 Min. lang bei 37°C behandelt. Die entstandenen linearen DNAs wurden getrimmt und/oder unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase am Ende aufgefüllt und durch 0,7% LGT-Agarose-Gelelektrophorese und Extraktion gereinigt. Mit Kinase behandelte BamH 1-Linker-Sequenzen (CGGATCCG) wurden über Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart von 5% Polyethylenglycol an das linearisierte Plasmid ligiert. Anschließend wurden die Reaktionen mit BamH 1 verdaut, und die linearen Plasmid-DNAs wurden durch 0,7% LGT-Agarose-Gelelektrophorese erneut gereinigt (dies wurde als notwendig befunden, um letzte Spuren an zirkulärem Plasmid zusammen mit nichtligierten Linkern zu entfernen). Die Plasmide wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase rezirkularisiert und in E. coli DH-1 transformiert. Kolonien (größer als 1000) wurden von Agarplatten abgekratzt, in Flüssigkultur bis zur Sättigung wachsen gelassen, und es wurde eine Mischpopulation an Plasmid-DNAs hergestellt. Die sTobRV-cDNA-Mischinserts wurden durch Restriktionsenzymverdau an den flankierenden EcoR1- und Pst1-Stellen herausgeschnitten, durch 1% LGT-Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in EcoR1 – Pst1-geschnittenes, phosphatbehandeltes pGEM4 subkloniert. Die entstandenen Transformanten wurden wiederum vereinigt, in Flüssigkultur wachsen gelassen, und die Plasmid-DNA wurde präpariert. Die Plasmid-DNAs wurden mit BamH1 behandelt, um nur diejenigen Plasmide zu schneiden, die eine BamH1-Linker-Sequenz enthalten, und die linearen Formen wurden wiederum durch zweimalige 0,7% LGT-Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, mit T4-DNA-Ligase rezirkularisiert und in E. coli-DH-1 transformiert. Einzelne Transformanten wurden auf die ungefähre Position des insertierten BamH1-Linkers in der sTobRV-Sequenz durch Restriktionsenzymverdau gescreened, in M13 mp19 subkloniert und über die Didesoxynucleotid-Kettenabbruchstechnik sequenziert.
Es entstand eine Biobliothek aus sTobRV-Mutanten, und eine Nucleotidsequenz-Analyse zeigte, daß jede Mutante eine inserierte BamH1-Linkersequenz (CGGATCCG) zusammen mit flankierenden duplizierten oder deletierten sTobRV-Sequenzen enthielt. Die Mutanten wurden in vitro transkribiert und die RNAs auf ihre Fähigkeit zur Spaltung getestet. Aus diesen Versuchen wurden eine 52-Nucleotidsequenz identifiziert, die sowohl die Substrat- als auch die Spaltungsabschnitte der sTobRV-RNA enthielt. Diese 52-Nucleotidsequenz, dargestellt in der 1b, enthielt die Domäne der konservierten Sequenz, die zur Selbstspaltung anderer RNAs erforderlich ist (1a). Eine Mutante, bezeichnet mit D-51, enthielt eine BamH1-Linkersequenz aus acht Nukleotiden, insertiert zwischen dreⁱ duplizierte sTobRV-Nucleotide mit den Nummern 7 bis 9. Diese Mutante führte eine selbstkatalysierte RNA-Spaltung aus.
HaeIII-Fragmente mit 97 und 108 Basenpaaren, die die 52-Nucleotid-Schnittsequenz der Wildtyp- und D-51-RNAs enthielten (gezeigt in den 1b und 1c), wurden aus sequenzierten Plasmidklonen herausgeschnitten. Die Fragmente wurden in die Sma1-Stelle von pGEM4 ligiert und gescreened, um beide Orientierungen des Inserts zu erhalten. Die Plasmide wurden unter Verwendung von EcoR1 linearisiert, und die (+)- und (–)-Strang-RNAs von 159 und 170 Basen Länge wurden unter Verwendung von 200 Einheiten/ml T7-RNA-Polymerase in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 1000 Einheiten/ml RNasin, 500 μM ATP, CTP und GTP mit 200 μM [α³²P] UTP transkribiert. RNAs wurden durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamid-, 7 Molar Harnstoff, 25% Formamidgel aufgetrennt und autoradiographiert.
Wie 1d zeigt, wurde keine Spaltung der (–)-Strang-RNA-Transkripte beobachtet. Dies entsprach dem erwarteten Ergebnis, da der (–)-Strang keine selbstkatalysierte Schnittstelle enthielt. Mit den (+)-Strängen sowohl der Wildtyp- als auch der D-51-Sequenzen fand eine Spaltung statt, wobei die Spaltung der D-51-RNA etwas weniger effizient war als diejenige des Wildtyps (1d). Dieser Versuch zeigt, daß der einzelsträngige Loop-Abschnitt auf der rechten Seite der 52-Nucleotidsequenz, der bei der selbstkatalysierten Spaltung von RNA beteiligt ist, nicht essentiell ist.
Trennung der enzymatischen und der Substrat-Aktivitäten:
Unter Verwendung der in D-51 insertierten BamH1-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle wurden die flankierenden HaeIII-BamH1- und BamHI-HaeIII-Fragmente erhalten, und jedes Fragment wurde in ein zur in vitro-Transkription geeignetes E. coli-Plasmid subkloniert. Dies führte zur Eliminierung des mutierten einzelsträngigen Loops aus der Selbstspaltungsdomäne, wodurch der Abschnitt in zwei RNA-Segmente aufgespalten wird (2a). Das kleinere HaeIII-BamH1-Fragment enthielt die Nucleotide 321 bis 9, einschließlich der tatsächlichen Spaltungsstelle, und wurde als S-Fragment bezeichnet. Das die sTobRV-Nucleotide 7 bis 48 enthaltende BamH1-HaeIII-Fragment wurde als Ribozym oder Rz- Fragment bezeichnet. Die für die in vitro-Transkription verwendeten E. Coli-Plasmide waren pGEM3 und pGEM4 (Promega, Madison, WI, USA). Diese Expressionsplasmide enthalten:

(a) einen Replikationsursprung;
(b) ein selektierbares Arzneimittelresistenz (Amp^r)-Gen;
(c) eine multiple Klonierungsstelle, flankiert von RNA-Polymerase-Promotoren, die zur in vitro-Herstellung von Transkripten verwendbar sind.

Mit T7-DNA-Polymerase behandeltes, Kpn1-verdautes Rz-pGEM3 und Xba1-verdautes S-pGEM4 wurden unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase unter den gleichen Bedingungen transkribiert, wie sie oben beschrieben wurden.
Wie die 2 zeigt, zeigten sowohl die S- als auch die Rz-RNAs keinen signifikanten Abbau, wenn sie alleine (2b, Spuren 1 und 3) unter Bedingungen inkubiert wurden, die zur Selbstspaltung hochgeeignet sind (50°C, 20 mM MgCl₂, pH 8,0). Die markierte Rz-RNA erschien nahc der Inkubation mit der S-RNA ebenfalls unverändert (2b, Spuren 2 und 5). Wenn die S-RNA jedoch mit der Rz-RNA vermischt wurde, trat eine effiziente Spaltung der S-RNA auf (2b, Spuren 4 und 5), wobei zwei Fragmente entstanden. Die Produktgrößen waren mit der Spaltung der S-RNA (84 Basen) an der normalen Stelle zwischen den Nucleotiden #359 und #1 konsistent, um 5'- bzw. 3'-proximale Fragmente mit 67 bzw. 17 Nucleotiden zu ergeben. Dies zeigt, daß die S-RNA als ein Substrat für die ribonucleolytische Spaltung durch die Rz-RNA wirkte, die in katalytischer Weise wirkte.
Ein auf dem katalytischen Abschnitt der sTobRV-RNA basierendes Modell eines Ribozyms ist in der 3 gezeigt. Das Ribozym weist zwei Arme oder flankierende Sequenzen aus einzelsträngiger RNA auf, die bei C gezeigt sind, wobei sie mit komplementären Sequenzen auf einer Substrat-RNA, d.h. einer zu schneidenden RNA, hybridisieren. Jede bei C gezeigte flankierende Sequenz enthält 8 Ribonucleotide. Die Anzahl der im Abschnitt C enthaltenen Nucleotide ist unkritisch. Es muß jedoch eine ausreichende Anzahl an Nucleotiden vorliegen, so daß das Ribozym mit der Target-RNA hybridisieren kann. Es scheint, daß vier Nucleotide in jedem Abschnitt C die minimale Anzahl zur Hybridisierung sind.
Der katalytische Abschnitt B enthält Sequenzen, die in natürlich vorkommenden Spaltungsdomänen hochkonserviert sind (vgl. 1a). Aus einem Vergleich mit Spaltungsdomänen der bekannten Sequenzen ergibt sich, daß die Länge des Basenpaarstamms II unwichtig ist, was auch für das Vorhandensein eines damit verbundenen Loops an einem Ende hiervon gilt.
Die Schnittstelle in der Target-RNA ist bei A (in 3) mit GUC angegeben. Auf der Grundlage unserer Versuche (hier nicht gezeigt) und anderer von Koizumi (FEBS LETT 288; 228–230 (1988); und FEBS LETT 239; 285–288 (1988)) wirken die identifizierten Schnittstellen in natürlich vorkommenden RNRs, die Sequenzen GUA, GUC, CUC, AUC und UUC, auch als Schnittstellen in der RNA.
BEISPIEL 2
Darstellung der Konstruktion, Synthese und Aktivität von Ribozymen mit neuer und hochspezifischer Endoribonuclease-Aktivität:
Zur Veranschaulichung der Erfindung wurden drei Ribozyme konstruiert, die gegen das Transkript eines allgemein verwendeten Indikator-Gens gerichtet sind, das aus Bakterien stammt, nämlich gegen die Tn9 Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), das Bakterien, Pflanzen und Tieren eine Antibiotikaresistenz verleihen kann und das leicht nachweisbar ist. Diesen Ribozymen, die mit RzCAT-1 bis 3 bezeichnet werden, entsprechen mögliche GUC-Schnittstellen in CAT-RNA bei den Positionen 139–140, 494–495 bzw. 662–663. Die Sequenzen dieser Ribozyme sind in der 4 dargestellt. In allen Fällen betrug die Länge der flankierenden Sequenzen des Ribozyms, die mit der Target-CAT-RNA hybridisieren, 8 Nucleotide. Der katalytische Abschnitt wurde so gewählt, daß er zu dem von sTobV-RNA paßt, gezeigt in 3.
Das CAT-Gen wurde aus pCM4 erhalten und als ein BamH1-Fragment in pGEM-32 (von Promega, Madison, WI, USA) subkloniert. Dieses Plasmid wurde mit HindIII linearisiert, und CAT-Gen-Transkripte wurden unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase mit 220 μM [α-³²P]UTP erhalten. Ribozymsequenzen wurden als Oligodesoxynucleotide, Rz CAT-1, 2 bzw. 3, synthetisiert. Sie wurden kinasebehandelt, mit phosphatasebehandeltem, EcoR1-PstI-geschnittenem pGEM4 ligiert und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 vor der bakteriellen Transformation inkubiert. EcoR1-linearisierte Plasmide wurden mit T7-RNA-Polymerase transkribiert, um Ribozym-RNAs herzustellen. Ribozyme wurden mit CAT-Transkript in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl₂ bei 50°C 60 Min. lang inkubiert, und die Produkte wurden durch 5% Polyacrylamid-, 7M Harnstoff-, 25% Formamid-Gelelektrophorese vor der Autoradiographie aufgetrennt.
Wenn das 840-Nucleotid CAT-Transkript mit irgendeinem der drei Ribozyme inkubiert wurde, trat eine effiziente und hochsequenzspezifische Spaltung auf (5), wodurch 2 RNA-Fragmente in jeder Reaktion entstanden. Die Fragmentgrößen waren mit den vorausgesagten Schnittstellen konsistent (d.h. 139 bzw. 696, 494 bzw. 341, 662 bzw. 173 Basenfragmente waren die 5'- und 3'-Produkte aus der RzCAT-1 bis 3 katalysierten Spaltung). Die für diese ribozymkatalysierten Spaltungen erforderlichen Bedingungen glichen denjenigen Bedingungen, die für natürlich vorkommende Spaltungsreaktionen beobachtet wurden (Foster, A.C. und Symons, R.H., Cell 49: 211–220 (1987) und Foster, A.C. und Symons, R.H. Cell 50: 9–16 (1987)), wobei eine effizientere Spaltung bei erhöhtem pH, erhöhter Temperatur und zweiwertigen Kation-Konzentrationen erhalten wurde (Ergebnisse nicht gezeigt). Wenn sie im molaren Überschuß vorlagen, katalysierten die drei Ribozyme die fast vollständige Spaltung des CAT-RNA-Substrats nach 60 Minuten in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl₂ bei 50°C. Unter ähnlichen Bedingungen mit 0,1 μM Substrat und 3 μM Ribozymen betrug das T_1/2 des CAT-mRNA-Substrats 3,5, 3,5 bzw. 2,5 Min. in Gegenwart von RzCAT-1 bis 3. Die Ribozymsequenzen waren gegen das Komplementäre der Substrat-RNA (d.h. den (+)-Strang) inaktiv, und in der Form von Oligodesoxyribonucleotiden (Ergebnisse nicht gezeigt). Die 3'-terminalen Spaltungsfragmente aus jeder ribozymkatalysierten Reaktion wurden isoliert und 5'-³²P-kinasebehandelt (50 mM Tris/HCl, pH 9, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT mit 50 μCi γ-³²P-ATP und 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase für 30 Min. bei 37°C). Die effiziente Kinasebehandlung der Fragmente zeigte, daß sie 5'-terminale Hydroxylgruppen aufwiesen, ähnlich denjenigen, die bei den natürlich vorkommenden Spaltungsreaktionen entstanden.
Das terminale Nucleotid der durch die Spaltung der CAT-Sequenzen durch RzCAT-1 bis 3 hergestellten Fragmente wurden bestimmt. Kurz gesagt, wurden radioaktiv markierte Fragmente auf einem 5% Polyacrylamidgel gereinigt und mit einem gleichen Volumen von 500 Einheiten pro ml RNase T1, 25 Einheiten/ml RNase T2 und 0,125 mg/ml RNaseA in 50 mM Ammoniumacetat bei pH 4,5 120 Min. lang bei 37°C verdaut. Die Produkte wurden auf einem 20% Polyacrylamidgel, das 25 mM Natriumcitrat, pH 3,5 und 7 Molar Harnstoff enthielt, aufgetrennt. Die 5b zeigt, daß die Spaltung der CAT-Sequenzen durch RzCAT-1 bis 3 präzise vor den Nucleotiden A, U bzw. G stattfindet.
Die terminale Sequenz der CAT-Genfragmente wurde direkt unter Verwendung der partiellen Enzymverdautechnik bestimmt (Donis-Keller et al., Nucleic Acids Res. 4: 2527–2538 (1980)), und zwar unter Verwendung einer basenspezifischen partiellen ribonucleolytischen Spaltung. Die Sequenz der Fragmente bestätigte, daß die Spaltung an den erwarteten Stellen in der CAT-RNA stattfand (hier nicht gezeigt).
Enzymatische Katalyse:
Um zu zeigen, daß Ribozyme die Spaltung des CAT-mRNA-Substrats in katalytischer Weise bewirken, wurde jedes der Ribozyme mit einem molaren Überschuß an Substrat inkubiert, und zwar unter Bedingungen, die sowohl eine effiziente Spaltung als auch eine Produktdissoziation begünstigen sollten. Die 6 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs, wo nach 75 Min. bei 50°C, pH 8,0 in 20 mM MgCl₂, 10 pMole an RzCAT-1 die spezifische Spaltung von 163 pMolen eines verkürzten CRT-mRNA (173 Basen)-Substrats katalysiert hatten, um 5'- und 3'-Fragmente mit 139 bzw. 34 Basen zu ergeben. Im Durchschnitt nahm jedes Ribozym an mehr als zehn Spaltungsvorgängen teil. Nach 75 Min. bei 50°C wurde eine gewisse nichtspezifische Spaltung von RNA aufgrund der extremen Bedingungen festgestellt, wobei jedoch 70% der verbleibenden intakten RNAs (163 pMole) als das 139 Basenfragment akkumulierten. Ähnliche Ergebnisse wurden für RzCAT-2 und -3 erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt) dies zeigt, daß jedes Ribozym als ein RNA-Enzym wirkt.
BEISPIEL 3
Einfluß der Temperatur auf die Ribozymaktivität:
Der Einfluß der Reaktionstemperatur auf die in vitro-Geschwindigkeit der Ribozymaktivität wurde überprüft.
Es wurde ein Reaktions-Zeitablauf für die Ribozyme RzCAT-1 bis 3 an CAT-RNA-Substrat bei 37°C und 50°C durchgeführt.
In diesem Versuch wurden die Reaktionen für jedes Ribozym zweifach unter Verwendung der für die Ribozymspaltung in Beispiel 2 angegebenen Reaktionsbedingungen angesetzt. Eine Reaktion wurde bei 37°C inkubiert, die andere bei 50°C. Proben wurden im 90-Min.-Abstand entnommen, und das Ausmaß der Reaktionen wurde durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die 7 zeigte den Zeitverlauf der Reaktion für jedes der Ribozyme RzCAT-1 bis 3 bei 37°C und 50°C. Die Reaktionsgeschwindigkeit jedes Ribozyms erhöht sich mit zunehmender Reaktionstemperatur.
Die für eine 50% (t_1/2)-Spaltung von CAT-RNA erforderliche Zeit ist in der Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
Die Tabelle 1 zeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Ribozyme bei 37°C ungefähr 20mal langsamer ist als die Reaktionsgeschwindigkeit bei 50°C.
BEISPIEL 4
Einfluß unterschiedlicher Armlängen (oder flankierender Sequenzen) der Ribozyme auf die katalytische Aktivität des Ribozyms:
Die Arme oder flankierenden Sequenzen eines Ribozyms (Abschnitt (2) der Formel 1) hybridisieren das Ribozym an eine Target-RNA, wonach die Spaltung der RNA stattfindet. In diesem Versuch wurde der Einfluß auf die Spaltungsgeschwindigkeit einer Targetsequenz durch Veränderung des Komplementaritätsgrades und der sich daraus ergebenden Länge an Basenpaarung der Ribozymarme an die Targetsequenz untersucht.
Es wurden Ribozyme mit 4, 8 und 12 Basen-Komplementarität zur Target-Sequenz RzCAT-2 auf jedem Arm hergestellt (8a). Die Ribozyme wurden entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Ribozymaktivität wurde, wie oben beschrieben, durch Inkubieren der Ribozym-RNA mit CAT-RNA bestimmt.
Das Ribozym mit einer 4-Basen-Komplementarität auf jedem Arm schnitt die Substrat-RNA nicht. Das Ribozym mit der 8-Basen-Komplementarität auf jedem Arm schnitt das CAT-Substrat wie das Ribozym mit der 12-Basen-Komplementarität. Ribozyme mit 12 Basen-Komplementarität schnitten die Target-RNA effizienter, was durch die Reaktionsgeschwindigkeit in vitro beurteilt wurde, als Ribozyme mit einer geringeren Anzahl an Basen-Komplementaritäten. Wenn es auch notwendig erscheint, daß die Basen-Komplementarität mehr als 4 beträgt, erhöht eine Zunahme der Länge des Hybridisierungsabschnitts der Ribozyme ihre Reaktionsgeschwindigkeit.
In einem zweiten Versuch wurde die Reaktionseffizienz eines Ribozyms mit (a) Komplementarität zur gesamten Länge der CAT- Transkript-Target-RNA und (b) multiplen katalytischen Domänen untersucht.
Vier GUC-Target-Stellen in CRT-RNA-Sequenzen wurden ausgewählt. Katalytische Ribozym-Domänen gegen diese Stellen wurden in eine vollständige Antisense-(–)-Sequenz für das CAT-Transkript "insertiert", und die katalytische Aktivität wurde bestimmt.
Die vier ausgewählten Stellen entsprachen den drei durch RzCAT-1 bis 3 spezifizierten und oben beschriebenen, und einer weiteren Stelle, die wie folgt darstellbar ist: Neue CAT-Stelle
wobei sich "192" auf die Aminosäure 192 im CAT-Polypeptid bezieht und ein Pfeil die Spaltungsstelle angibt.
Katalytische Ribozymdomänen enthaltende Oligodesoxyribonucleotide, die jede dieser Spaltungsstellen umspannen, wurden für M13-Mutageneseversuche verwendet, um eine Sequenz herzustellen, die das gesamte Komplementäre der CAT-Sequenz enthält, in die jedoch die vier katalytischen Ribozymdomänen insertiert waren. Die M13-Mutagenese wurde durch Bindung der Ribozym-Insertionen enthaltenden Oligonucleotide an einzelsträngige, Uracil enthaltende M13-DNAs mit nachfolgender Synthese komplementärer, die Insertion enthaltenden DNAs durchgeführt. Die komplementären DNAs wurden nach dem Klonieren in einem geeigneten Escherichia coli-Stamm gewonnen (T.A. Kunkel 1985, Proc. Natl. Aced. Sci. USA 82: 488–492). Die entstandene doppelsträngige cDNA wurde in einen in vitro-Expressionsvektor kloniert, um Ribozym-RNA unter Verwendung des T7-Polymerase-Transkriptionssystems herzustellen. Die Ribozymaktivität wurde durch Inkubation von Ribozym-RNA mit CAT-Transkript mit nachfolgender Gelelektrophorese der Reaktionsmischung nach Glyoxal-Behandlung zur Denaturierung der Nucleinsäuren bestimmt.
An allen erwarteten Stellen auf dem CAT-Transkript fand eine autolytische Spaltung statt. Demnach können die flankierenden Sequenzen der Arme eines Ribozyms über die gesamte Länge des zu schneidenden RNA-Transkripts reichen.
Die 9 zeigt schematisch die Herstellung einer katalytischen Antisense-RNA, die alle vier Ribozyme enthält. Die katalytische Antisense-RNA enthält ungefähr 900 Basen.
Unter den oben genannten Reaktionsbedingungen bilden die Ribozym- und Targetsequenzen Komplexe mit hohem Molekulargewicht, wahrscheinlich durch extensive Basenpaarung. Es ist eine starke denaturierende Behandlung, beispielsweise eine Glyoxalbehandlung, notwendig, um die Reaktionsprodukte während der Elektrophorese aufzutrennen.
BEISPIEL 5
Targetsequenzen für die Ribozymspaltung:
Das GUA-Motiv in der mRNA wurde getestet, um zu sehen, ob ein Ribozym an dieser Sequenz eine Spaltung der RNA bewirken würde.
Eine spezielle Stelle in der CAT-mRNA, die das GUA-Motiv (10a) enthält, wurde ausgewählt, und es wurde eine geeignete Ribozymsequenz hergestellt und auf ihre Aktivität getestet. Das Ribozym enthielt Arme aus 8 Ribonucleotiden.
Synthetische Oligonucleotide, die dem Ribozym der 10 entsprachen, wurden gemäß Beispiel 2 hergestellt, und eine in einen in vitro-Expressionsvektor (pGEM4, vgl. oben) klonierte doppelsträngige cDNA wurde in E. coli überführt, um eine Ribozym-RNA unter Verwendung des T7-Polymerase-Transkriptionssystems herzustellen. Die Ribozymaktivität wurde durch Inkubation der Ribozym-RNA mit CAT-mRNA und nachfolgender Gelelektrophorese der Reaktionsmischung wie oben beschrieben bestimmt.
Das Ribozym bewirkte die Spaltung an der GUR-Targetstelle (hier nicht gezeigt). Demnach ist das Motiv GUR in der RNA ein Substrat für die erfindungsgemäßen Ribozyme. Dieses Ergebnis war nicht völlig unerwartet, da eine natürlich vorkommende Spaltungsstelle in der Satelliten-RNA des Lucerne Transient Streak-Virus die Erkennung einer GUA-Stelle erfordert.
In ähnlicher Weise wurde ein GUU-Motiv in der CAT-RNA-Targetsequenz mit einem geeigneten Ribozym (vgl. 10b) getestet, und die Spaltung wurde durchgeführt.
BEISPIEL 6
Ribozymspaltung viraler RNA:
Viroid-RNA, in Form von Citrus Exocortis-Viroid-RNA, wurde unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Ribozyms gespalten.
Zwei GUC-Targetstellen wurden in der Citrus Exocortis-Viroid (CEV)-RNA ausgewählt. Weiterhin wurde eine Stelle in der komplementären Strangsequenz ausgewählt. Es wurden gegen alle diese Stellen Ribozyme hergestellt und auf ihre Aktivität getestet. Die Ribozyme wurden mit CEV9x(+), CEV9x(–) und CEV25x(+) bezeichnet. Die 11 zeigt die drei Schnittstellen in der CEV-RNA für jedes dieser Ribozyme.
Die Ribozyme wurden entsprechend den oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Ribozym RzCEV25x(+) wird in der 12 gezeigt. Dieses Ribozym schneidet das GUC-Motiv beim Nucleotid 116 der CEV-RNA.
Die 12 (b) zeigt die Spaltung von CEV-RNA mit dem Ribozym RzCEV9x(+). Mit dem Ribozym RzCEV9x(–) wird keine Spaltung beobachtet.
Dieser Versuch zeigt, daß Ribozyme gegen Target-RNA-Sequenzen aus unterschiedlichen Quellen wirken. Dies konnte erwartet werden, da alle RNAs aus den grundlegenden Ribonucleotideinheiten Adenin, Guanin, Cytosin und Uracil aufgebaut sind, ohne Rücksicht darauf, ob sie tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs sind.
BEISPIEL 7
Beispiele für Ribozyme mit verschiedenen katalytischen Domänen
Ein gegen eine CAT-2-Stelle gerichtetes Ribozym wurde unter Verwendung der Sequenz der katalytischen Domäne aus der Satelliten-RNA des Subterranean Clover Mottle-Virus (SCMoV) hergestellt. Eine Komplementarität von 12 Basen der flankierenden Sequenz des Ribozymarms wurde in das Konstrukt des Ribozyms RzSCMoV eingebaut. Die Ribozyme RzCAT-2 und RzSCMoV sind in den 13a bzw. 13b gezeigt. Der Loop-Abschnitt von RzSCMoV enthält 5 Nucleotide mit der Sequenz AAAUC. Dies steht im Gegensatz mit dem Loop-Abschnitt von RzCAT-2, der 4 Nucleotide mit der Sequenz AGAG enthält. Zusätzlich enthält RzSCMoV ein C im katalytischen Abschnitt anstelle von U* in RzCAT-2. Die unterschiedlichen Sequenzen in RzSCMoV im Vergleich zu RzCAT-2 sind markiert.
RzSCMoV wurde gemäß Beispiel 2 hergestellt. RzSCMoV war aktiv und ergab erwartungsgemäß zwei Spaltungsprodukte.
In einem anderen Versuch wurde die Citrus Exocortis-Viroid (CEV)-Targetstelle am Nucleotid –336 in seiner komplementären RNA unter Verwendung eines Ribozyms (RzCEV2) mit der in der 14a angegebenen Sequenz geschnitten. Der mit dem Buchstaben "L" in der 14 bezeichnete Loop-Abschnitt umfaßt sechs Nucleotide mit der Sequenz 3'-CCTATA-5'. Dies unterscheidet sich vom Loop-Abschnitt von sTobRV, der vier Nucleotide mit der Sequenz 3'-AGAG-5' umfaßt. Dieses Ribozym schneidet Target-CEV-komplementäre RNA an der Position –336, wie dies im Elektrophoresediagramm der 14b gezeigt wird.
Dieser Versuch zeigt, daß die Anzahl an Nucleotiden und die Nucleotidsequenz des Loop-Abschnitts bei der Ribozymaktivität wichtig ist. In diesen Versuchen wurde das Ribozym gemäß den in der vorstehenden Beschreibung angegebenen Verfahren hergestellt.
In einem anderen Versuch wurde die Wirkung der Basenpaarung in der katalytischen Domäne (Stammabschnitt) auf die Ribozymaktivität untersucht.
Ein RzCAT-2 entsprechendes modifiziertes Ribozym, das vier zusätzliche Basenpaare enthielt, wurde hergestellt und getestet. In der 15a wird die Sequenz des Ribozyms RzCAT-2 an die Target-CAT-RNA hybridisiert gezeigt. In der 15b wird das Test-Ribozym gezeigt, wobei die zusätzlichen Basenpaare eingerahmt sind. Das Test-Ribozym wies eine mit RzCAT-2 vergleichbare Aktivität auf. Dies zeigt, daß der basengepaarte Abschnitt der katalytischen Domäne des Ribozyms eine unterschiedliche Länge aufweisen kann, ohne hierdurch die katalytische Aktivität zu beeinflussen.
Es wurde beobachtet (Ergebnisse hier nicht gezeigt), daß die stabile in vivo-Form von in transgenen Pflanzen exprimierten sTobRV-RNA-Transkripten primär zirkulär ist, wahrscheinlich aufgrund der Ligierung an die 5'- und 3'-Enden. Deshalb führt die Verwendung zweier autolytischer Spaltungsstellen, die eine interessierende Sequenz flankieren, in einem in vivo-RNA-Transkript wahrscheinlich zu einem zirkularisierten Produkt, das eine größere Stabilität aufweisen kann als lineare Transkripte. Diese Vorgehensweise scheint ein neues Verfahren zur in vivo-Stabilisierung von Ribozymsequenzen zu ergeben. Dieses Verfahren wird als Zirkularisierung bezeichnet.
BEISPIEL 8
In vivo-Aktivität von Ribozymen:
Die in vivo-Aktivität von Ribozymen in Pflanzenzellen wird in diesem Beispiel untersucht.
Versuchsprotokoll:
Anti-CAT (CAT = Chloramphenicol-Acetyltransferase) oder kombinierte Anti-CAT/Ribozym-Genkonstrukte (vgl. unten) enthaltende Plasmide wurden in Tabakprotoplasten in der gleichen Menge und im gleichen Anteil relativ zueinander eingeführt, gemeinsam mit einem anderen Plasmid, das eine funktionelle CAT-Genkonstruktion enthielt. Die CAT-Aktivitäten wurden bestimmt und mit dem Grundniveau der Genaktivität verglichen.
Materialien und Methoden:
(a) Elektroporationen und CAT-Assays.
Diese wurden durchgeführt wie in Llewellyn et al., J. Mol. Biol. (1987) 195: 115–123 beschrieben. Kurz gesagt wurden Protoplasten von Nicotiana plumbaginifolia Linie T5 aus einer Suspension zwei Tage nach der Subkultur hergestellt, suspendiert in 10 mM HEPES, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,2 M Mannitol und auf eine Dichte von 3 × 10⁶/ml eingestellt. Die Elektroporation wurde unter Verwendung eines einzigen 50 ms-Pulses bei 250 V durchgeführt. Die Protoplasten wurden 10fach verdünnt und kultiviert und 20 Std. lang bei 26°C im Dunklen gehalten. Sie wurden durch Ultraschall aufgebrochen, und die Extrakte wurden gewonnen. Die Extrakte wurden auf den Proteingehalt normalisiert und auf die CAT-Aktivität in vitro unter Verwendung von ¹⁴C-Chloramphenicol und Acetyl-CoA getestet. Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Ausmaß der Reaktionen wurde über die Produktion von radioaktiven Produktderivaten aus dem ¹⁴C-Chloramphenicol-Template berechnet.
(b) Genkonstrukte.
Genkonstrukte wurden in 0,1 ml Protoplastensuspensionen als Plasmid-DNAs eingeführt, die aus Bakterien durch Extraktion und zweimalige CsCl-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wurden. Diese wurden in 10 mM Tris/1 mM EDTA/pH = 7,5 zum Gebrauch resuspendiert.
Die aktive CAT-Genkonstruktion lag auf dem mit pCAT7+ bezeichneten Plasmid. Es stammte aus der Fusion einer CAT-Gensequenz (aus dem Plasmid pCM4, vgl. T.J. Close und R. Rodriguez, 1982, Gene 20: 305–316) in das Plasmid pJ35SN (stammt aus p35SN, W.L. Gerlach et al., 1987, Nature 328: 802–805), so daß die aktive Genkonstruktion wie folgt aussah:
35S bezeichnet den 355-CaMV (Blumenkohl-Mosaikvirus)-Promotor, NOS das Nopalin-Synthetase-Polyadenylierungssignal, T/C die Transkription.
Zusammen mit 0,2 μg pCAT7+ wurden verschiedene Genkonstrukte wie unten beschrieben im Überschuß zugegeben. Die Genkonstrukte waren in Plasmiden mit den nachfolgenden Bezeichnungen enthalten:
pJ35SN – Dieses Vektor-Plasmid, dessen Karte in der 16 gezeigt ist, enthält einen 35S-CaMV-Promotor und das Pflanzennopalin-Synthase 3'-Polyadenylierungssignal, das wie folgt darstellbar ist:
pCAT7- – Dieses Plasmid enthält die CAT-Gensequenz inseriert in pJ35SN, so daß bei Transkription die Antisense-CAT-RNA entsteht, die wie folgt darstellbar ist:
pCAT19- – Dieses Plasmid enthält das CRT-Gen mit vier katalytischen Ribozymdomänen darin (vgl. Beispiel 4 und 9), inseriert in pJ35SN, so daß bei Transkription die Antisense-CAT-RNA entsteht, die vier katalytische Ribozymdomänen enthält und wie folgt darstellbar ist:
Insertionen katalytischer Domänen
Ergebnisse:
Die nachfolgende Tabelle zeigt die relativen CAT-Aktivitäten in Zellen 20 Std. nach Elektroporation. Die Aktivität ist als Umwandlung des Chloramphenicol-Substrats in Prozent in einem 1-stündigen Test ausgedrückt. μg Plasmid, eingeführt durch Elektroporation
(für jede Behandlung sind "A" und "B" Doppelansätze)
Aus diesen Ergebnissen kann die nachfolgende Schlußfolgerung gezogen werden:

(a) Die Einführung der CAT-Genkonstruktion ergibt eine signifikante GAT-Aktivität – vgl. 2A, B mit 1A, B. Es besteht eine Variabilität zwischen den zwei Ansätzen. Aus den in den anderen Proben (vgl. "b" und "c" unten) abzusehenden Tendenzen ist es wahrscheinlich, daß 2A eine unnormal niedrige Aktivität zeigt.
(b) Gleichzeitige Einführung einer Antisense-Genkonstruktion ergibt eine Abnahme des Aktivitätsgrades – vgl. 3A, B und 4A, B mit 2B. Das Ausmaß der Abnahme steht in direkter Beziehung zur Menge des als Plasmid zugegebenen Antisense-Gens – vgl. 3A, B und 4A, B.
(c) Gleichzeitige Einführung der kombinierten Antisense/Ribozym-Genkonstruktion resultiert in einer Abnahme der Genaktivität – vgl. 5A, B und 6A, B mit 2B. Weiterhin ist die Abnahme ausgeprägter als bei den entsprechenden Mengen von Antisense-Genkonstrukten – vgl. 5A, B mit 3A, B und 6A, B mit 4A, B.

Die gemittelten Ergebnisse für vier in vivo-Versuche sind in der 17 angegeben. In dieser Fig. steht "Kontrolle" für die Behandlung 2. "Antisense" steht für die Behandlung 4. "Katalytisch" steht für die Behandlung 6 und "Background" für die Behandlung 1.
Das katalytische Ribozym hemmt die CAT-Aktivität um durchschnittlich 47%, verglichen mit durchschnittlich 34% für ein Antisense-Ribozym.
Die Einführung von ribozymtragenden Genen in Pflanzenzellen hemmt die Aktivität von Genen, gegen die sie gerichtet sind. Weiterhin ist die Hemmung größer als für entsprechende Antisense-RNA-Moleküle.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Ribozyme in tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Zellen gegen einen Bereich von Target-RNA-Molekülen aktiv sein werden.
Der Wirkungsmechanismus der Ribozyme in diesem Beispiel ist unklar. Beispielsweise kann das Antisense-Ribozym irreversibel mit einer Target-RNA hybridisieren und die Spaltung einer Phosphodiesterbindung an einer oder mehreren ausgewählten Targetstellen entlang der Target-RNA katalysieren. Alternativ hierzu können zelluläre Enzyme die Antisense-RNA von ihrer Targetsequenz lösen, so daß die Target-RNA in zwei oder mehr Fragmente gespalten wird.
BEISPIEL 9
In vivo-Aktivtät von Ribozymen in tierischen Zellen:
Die Aktivität von Ribozymen bei der Inaktivierung einer Target-RNA in Säugetierzellen wird in diesem Beispiel gezeigt.
Materialien und Methoden:
Die Ribozyme kodierenden aktiven Genkonstrukte wurden in die weit verbreitet erhältliche Afffennieren-Zellinie COS1 durch Elektroporation transfiziert. Bei dieser Methode wurden 3 × 10⁶/ml COS1-Zellen, suspendiert in einer gepufferten Saline mit 10% FKS (fötales Kälberserum), mit verschiedenen Genkonstrukten in Kontakt gebracht, und es wurde eine elektrische Ladung angelegt, um die Elektroporation der DNA in die Zellen zu bewirken. Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C 48 Stunden lang in Kulturmedium inkubiert, bevor auf die CAT- und Luciferase-Aktivität getestet wurde.
Die CAT-Genkonstrukte befanden sich in dem mit pTK CAT bezeichneten Plasmid (Miksicek et al., Cell 46: 283–290, 1986). Dieses Plasmid entstand durch die Einführung einer CAT-Gensequenz in das Plasmid pSV2, so daß es unter Kontrolle des Thymidinkinase-Promotors des Herpes-simplex-Virus steht.
Die für Ribozyme kodierenden Genkonstrukte waren auf dem Plasmid pSV232A (De Wet et al., Molecular and Cellular Biology 7: 725–737, 1987), das das Luciferase-Gen, fusioniert an den frühen Promotor von SV40, enthielt. Die vier Ribozyme kodierende DNA wurde in die XbaI-Stelle am 3'-Ende des Luciferase-Gens gemäß den Standardverfahren von Maniatis et al. ligiert (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1982).
Die nachfolgenden Konstrukte wurden unter Verwendung der von Maniatis et al. (a.a.O.) beschriebenen Standardtechniken hergestllt:
pFC58 – Dieser Plasmidvektor enthält DNA, die für das Ribozym RzCAT-1 kodiert, fusioniert an das 3'-Ende des Luciferase-Gens in einer nichtfunktionellen Orientierung.
Dies kann wie folgt dargestellt werden:
wobei 232A die pSV232A-Sequenzen bezeichnet, SV40 früh den frühen Promotor von SV40 und kleines T die DNA, die für die kleine T-Intervening-Sequenz von SV40 kodiert. Dieses Konstrukt führt zur Herstellung eines RNA-Moleküls, das für Luciferase und das Ribozym RzCAT-1 kodiert, wobei das zuletzt genannte in einer solchen Orientierung vorliegt, daß eine katalytische Aktivität nicht erwartbar ist.
pFC4 – Dieses Plasmid ist das gleiche wie pFC58, mit der Ausnahme, daß RzCAT-1 durch RzCAT-3 ersetzt wird.
pFC1-6 – Dieses Plasmid ist das gleiche wie pFC58, mit der Ausnahme, daß RzCAT-1 durch RzCAT-3 in der Sense-Orientierung (5'-3') ersetzt wird.
pFC20 – Dieses Plasmid ist das gleiche wie pFC1-6, mit der Ausnahme, daß RzCAT-3 durch RzCAT-2 mit flankierenden Sequenzen von acht Nucleotiden ersetzt wird.
pFC12 – Dieses Plasmid ist das gleiche wie pFC20, mit der Ausnahme, daß das Ribozym RzCAT-2 flankierende Sequenzen mit zwölf Nucleotiden enthält.
pFC50 – Dieses Plasmid enthält das CAT-Gen mit vier katalytischen Ribozym-Domänen daran (vgl. Beispiel 4 und 9) in der Sense-Orientierung (5'-3'), das bei Transkription ein inaktives Ribozym ergibt. Dieses Plasmid kann wie folgt dargestellt werden:
pFC54 – Dieses Plasmid ist das gleiche wie pFC50, mit der Ausnahme, daß das CAT-Gen und die Ribozymdomänen in der Antisense (3'-5')-aktiven Orientierung vorliegen.
pFC64 – Dieses Plasmid hat mit pFC50 den SV40-Promotor und die Polyadenylierungssignale gemeinsam und enthält das Wildtyp-CAT-Gen ohne inserierte Ribozymdomänen. Dieses Gen liegt in der Antisense-Orientierung vor und produziert deshalb kein CAT-Protein.
pFC65 – Dieses Plasmid ist das gleiche wie pFC64, mit der Ausnahme, daß das Wildtyp-CAT-Gen in der Sense (5'-3')-Orientierung vorliegt und damit das CAT-Protein produziert.
Assays:
Die Luciferase-Aktivität wurde entsprechend den Methoden von De Wet et al. (a.a.O.) getestet. Kurz gesagt wurden COS-Zellen 48 Std. nach Transfektion lysiert, und das Zell-Lysat mit Luciferin, dem Substrat der Luciferase, inkubiert, und die Lumineszenz unter Verwendung eines Szintillationszählers nachgewiesen.
Die CAT-Aktivität wurde ebenfalls unter Verwendung von COS-Zell-Lysaten (die Zell-Lysate wurden in zwei Anteile aufgeteilt, und jeder Anteil entweder auf Luciferase- oder CAT-Aktivität getestet) bestimmt, und zwar gemäß dem Verfahren von Sleigh, M.J., Anal. Biochem. 156: 251–256 (1986).
In den in vivo-Assays beeinflußten pFC58 und pFC4 die CAT-Aktivität in transfizierten Zellen nicht. Diese Aktivität wurde mit 100% CAT-Aktivität und 0% CAT-Suppression bezeichnet. Die CAT-Aktivität in mit anderen Plasmiden transfizierten Zellen wurde relativ zu pFC58 bestimmt. Der Prozentsatz an CAT-Suppression wurde bestimmt als
normalisiert auf die Luciferase-Produktion. CAT_Test = CAT-Assay-Ergebnis für Testkonstrukte. CAT_Kontrolle = CAT-Assay für Kontrollkonstrukte (pFC4 und pFC58).
Die Luciferase-Produktion ist eine interne Kontrolle für die Elektroporation und gibt ein Maß für die Ribozymproduktion in jeder einzelnen, mit Elektroporation behandelten Gewebekulturplatte.
Ergebnisse: Versuch (i) μg Plasmid in der Elektroporation/1,5 × 10⁶ Zellen
Alle Behandlungen wurden zweifach ausgeführt und ein Mittelwert angegeben.
Versuch (ii) μg Plasmid in der Elektroporation/1,5 × 10⁶ Zellen
Die Behandlungen 5 bis 10 wurden zweifach durchgeführt, und die Ergebnisse sind als Mittelwert angegeben.
Versuch (iii) μg Plasmid in der Elektroporation/1,5 × 10⁶ Zellen
Die Behandlungen wurden fünffach durchgeführt, und die Ergebnisse sind als Mittelwert angegeben.
Versuch (iv) μg Plasmid in der Elektroporation/1,5 × 10⁶ Zellen
Jede der Behandlungen 13 bis 1b wurden vierfach durchgeführt.
Das Sense-CAT-Konstrukt (Behandlung 16) zeigte eine hohe CAT-Aktivität an sich. Deshalb ist der Prozentsatz der Suppression hier nicht anwendbar (NA).
Es wurde ebenfalls eine Anzahl von Versuchen durchgeführt, bei der der TK-Promotor von pTKCAT durch den humanen Metallothionein-Promotor ersetzt wurde. Wenn dieses CAT-Konstrukt in COS1-Zellen mit für ein oder mehrere Ribozyme kodierenden Plasmiden co-transfiziert wurde, wurde eine bemerkenswerte Abnahme in der CAT-Aktivität beobachtet.
Die obigen Ergebnisse zeigen deutlich die in vivo-Inaktivierungsaktivität von Ribozymen in tierischen Zellen.
Während man annimmt, daß die Wirksamkeit der Ribozyme in vivo durch eine oder mehrere katalytische Abschnitte, die zur Spaltung einer Target-RNA in der Lage sind, bewirkt wird, kann das Vorhandensein derartiger Abschnitte in "Antisense"-RNA-Typ-Ribozymen nicht tatsächlich zur Spaltung in vivo führen, falls das gesamte RNA-Antisense-RNA-Molekül nicht auseinanderfällt. Unabhängig davon, ob das Molekül auseinanderfällt oder nicht, zeigen die vorstehenden Beispiele jedoch die Wirksamkeit des Ribozyms bei der Inaktivierung der Target-RNA. Demnach ist die Erfindung auf alle Ribozyme mit einem katalytischen, eine Spaltung bewirkenden Abschnitt und einem hybridisierenden Abschnitt anwendbar, und zwar unabhängig davon, ob die Spaltung tatsächlich in der Target-RNA auftritt. Dies heißt, daß der hybridisierende Abschnitt so groß sein kann, daß er das Zusammenbleiben der RNA/Ribozym-Kombination bewirkt und verhindert, daß die Target-RNA in einzelne Bestandteile aufspaltet, sogar obwohl der katalytische Abschnitt selbst zur Spaltung in der Lage ist.

Claims

Verbindung mit der Formel:
worin bedeuten: jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann; jeder Rest (X)_n-1 und (X)_n' ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen C-A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist; jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährlei sten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt; jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind; jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, liefert; jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl, die 1 entspricht, und (X)_b ein Oligoribonucleotid, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl steht, die 2 entspricht.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Summe von n + n' größer oder gleich 14 ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei jeder der Indices n und n' größer als 6 ist.
Verbindung mit der Formel: 3'-[-(Y)_r-Q-(Y)_s-]_z-5' worin Q für eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder für eine Verbindung mit der Formel A steht:
worin bedeuten: jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann; jeder Rest (X)_n und (X)_n' ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A- kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist; jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid. definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährleisten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt; jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind; jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind, liefert; a eine ganze Zahl, die eine Zahl von Ribonucleotiden definiert, wobei gilt, dass a 0 oder 1 sein kann, und dass wenn a 0 ist, der 5' von (X)_a angeordnete Rest A an den 3' von (X)_a angeordneten Rest G gebunden ist; jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl größer oder gleich 1; jede der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, liefert, oder die Abwesenheit irgendeiner derartigen chemischen Bindung; und (X)_b ein Oligoribonucleotid, das anwesend oder abwesend sein kann, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl größer oder gleich 2 steht, wenn (X)_b vorhanden ist; und wobei jeder Rest Y für ein Ribonucleotid steht, das gleich oder verschieden sein kann, jeder der Indices r und s für eine ganze Zahl steht, die größer oder gleich 0 sein kann, und z für eine ganze Zahl größer als 1 steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei die zu spaltende RNA-Targetsequenz aus einer viralen RNA-Sequenz besteht.
Zubereitung, umfassend die Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5 in Verbindung mit einem pharmazeutisch, veterinärmedizinisch oder landwirtschaftlich akzeptablen Träger.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, umfassend die folgenden Stufen: a) Ligieren einer der Verbindung entsprechenden Nucleotidsequenz in einen Transfervektor aus DNA, RNA oder einer Kombination hiervon; b) Transkribieren der Nucleotidsequenz der Stufe a) mit einer RNA-Polymerase, und c) Gewinnen der Verbindung.
Transfervektor aus RNA oder DNA oder einer Kombination hiervon mit einer Nucleotidsequenz, die bei Transkription die Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5 liefert.
Zubereitung, umfassend den Transfervektor nach Anspruch 8 in Verbindung mit einem pharmazeutisch, veterinärmedizinisch oder landwirtschaftlich akzeptablen Träger.
Prokaryontische oder eukaryontische Zelle mit einer Nucleotidsequenz, die bei Transkription die Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5 liefert oder diese Verbindung ist.
Eukaryontische Zelle nach Anspruch 10.
Pflanzen- oder Tierzelle nach Anspruch 11.
Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach Anspruch 12 umfasst.
Verfahren zur Inaktivierung einer Target-RNA in einer Zelle, die keine Zelle in einem Menschen oder in einem Tier ist, umfassend das In-Berührung-Bringen der Target-RNA in der Zelle mit der Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder mit einer Verbindung der Formel A:
worin bedeuten: jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann; jeder Rest (X)_n und (X)_n' ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A- kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist; jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährleisten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt; jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind; jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind, liefert; a eine ganze Zahl, die eine Zahl von Ribonucleotiden definiert, wobei gilt, dass a 0 oder 1 sein kann, und dass wenn a 0 ist, der 5' von (X)_a angeordnete Rest A an den 3' von (X)_a angeordneten Rest G gebunden ist; jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl größer oder gleich 1; jede der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, liefert, oder die Abwesenheit irgendeiner derartigen chemischen Bindung; und (X)_b ein Oligoribonucleotid, das anwesend oder abwesend sein kann, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl größer oder gleich 2 steht, wenn (X)_b vorhanden ist; wobei die Verbindung durch Basenpaarung mit der Sequenz der Target-RNA unter Bedingungen derart zu wechselwirken vermag, dass die Verbindung durch Basenpaarung mit der Target-RNR stabil wechselwirkt und die Target-RNA gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Target-RNA das Transkript eines für die Zelle endogenen Gens ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Target-RNA das Transkript eines für die Zelle exogenen Gens ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14, 15 oder 16, wobei die Zelle eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Zelle eine Pflanzen- oder Tierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Pflanzenzelle Teil einer Pflanze ist.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5 oder einer Verbindung der Formel A:
worin bedeuten: jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann; jeder Rest (X)_n und (X)_n ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A- kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist; jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährleisten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt; jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind; jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind, liefert; a eine ganze Zahl, die eine Zahl von Ribonucleotiden definiert, wobei gilt, dass a 0 oder 1 sein kann und, dass wenn a 0 ist, der 5' von (X)_a angeordnete Rest A an den 3' von (X)_a angeordneten Rest G gebunden ist; jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl größer oder gleich 1; jede der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, liefert, oder die Abwesenheit irgendeiner derartigen chemischen Bindung; und (X)_b ein Oligoribonucleotid, das anwesend oder abwesend sein kann, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl größer oder gleich 2 steht, wenn (X)_b vorhanden ist; oder des Transfervektors nach Anspruch 8 oder eines Transfervektors aus RNA oder DNA oder einer Kombination hiervon mit einer Nucleotidsequenz, die bei Transkription die Verbindung mit der Formel A liefert, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines mit einer Target-RNA in Verbindung stehenden Zustands bei Mensch oder Tier.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5 oder einer Verbindung mit der Formel A:
worin bedeuten: jeder Rest X ein Ribonucleotid, das gleich oder verschieden sein kann; jeder Rest (X)_n und (X)_n ein Oligoribonucleotid, das (a) mit einer zu spaltenden RNA-Targetsequenz zu hybridisieren vermag und (b) durch eine gegebene Sequenz definiert ist, die natürlicherweise nicht an die Sequenzen A-A-A-G-C- bzw. X-C-U-G-A- kovalent gebunden vorkommt, wobei eine derartige RNA-Targetsequenz nicht in der Verbindung vorhanden ist; jeder der Indices n und n' eine ganze Zahl, die die Zahl der Ribonucleotide in dem Oligonucleotid definiert, wobei gilt, dass die Summe von n + n' ausreicht, um zu gewährleisten, daß die Verbindung mit der RNA-Targetsequenz durch Basenpaarung stabil wechselwirkt; jeder * eine Basenpaarung zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind; jede durchgezogene Linie eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden; die auf beiden Seiten hiervon angeordnet sind, liefert; a. eine ganze Zahl, die eine Zahl von Ribonucleotiden definiert, wobei gilt, dass a 0 oder 1 sein kann, und dass wenn a 0 ist, der 5' von (X)_a angeordnete Rest A an den 3' von (X)_a angeordneten Rest G gebunden ist; jeder der Indices m und m' eine ganze Zahl größer oder gleich 1; jede der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder eine chemische Bindung, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonucleotiden, die auf beiden Seite hiervon angeordnet sind, liefert, oder die Abwesenheit irgendeiner derartigen chemischen Bindung; und (X)_b ein Oligoribonucleotid, das anwesend oder abwesend sein kann, wobei gilt, dass b für eine ganze Zahl größer oder gleich 2 steht, wenn (X)_b vorhanden ist; oder des Transfervektors nach Anspruch 8 oder eines Transfervektors aus RNA oder DNA oder einer Kombination hiervon mit einer Nucleotidsequenz, die bei Transkription die Verbindung mit der Formel A liefert, bei der Herstellung einer Zubereitung zur Inaktivierung einer Target-RNA in Pflanzen.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 5 oder eines Transfervektors, der bei Transkription eine derartige Verbindung liefert, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Viruserkrankung bei Mensch oder Tier.