DE3788082T2

DE3788082T2 - Automatisches Gerät zum Extrahieren von Nukleinsäuren.

Info

Publication number: DE3788082T2
Application number: DE19873788082
Authority: DE
Inventors: Guy Richard Cathcart; P Eric Mayrand; Eric S Nordman
Original assignee: Applied Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-04-08
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2007-04-09
Also published as: EP0245945A2; EP0245945B1; EP0245945A3; JPH0815438B2; JPS6322194A; DE3788082D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus Zellen und insbesondere auf eine Vorrichtung zum automatischen Durchführen einer derartigen Isolierung.
Es wird Bezug genommen auf die EP 0215533, die dem gleichen Anmelder gehört und welche sich auch auf einen automatischen Nukleinsäureextraktor bezieht. Der Inhalt dieser vorangehenden Anmeldung wird durch Bezugnahme in diese Anmeldung mit aufgenommen.
Eine der ersten Stufen bei der in-vitro-Handhabung von Nukleinsäuren bezieht sich auf deren Isolierung. Beispielsweise werden relativ reine Proben von Genom-DNA benötigt, um Überprüfungen hinsichtlich genetischer Krankheiten durchzuführen, und die Rekombinationstechnik erfordert sowohl die Isolierung der Vector-DNA als auch der zu klonenden DNA.
Als allgemeine Regel existiert DNA nicht als freies Molekül in einer Zelle, sondern existiert statt dessen als ein komplexer Verbund von DNA, RNA und Proteinen. Dies ist eine Folge der Rolle der DNA als Träger der genetischen Information der Zelle. Die DNA wird als Schablone für die Herstellung von Boten-RNA verwendet, welche durch das Ribosom in Protein umgesetzt wird. Proteine, die direkt im Verfahren der Genexpression eine Rolle spielen, beispielsweise RNA-Polymerase und regelnde Proteine, reagieren mit DNA in vivo, um Nukleo-Proteinkomplexe zu bilden. DNA Polymerase, DNA Ligase, verschiedene nicht gewundene und übergewendelte Enzyme, Rekombinations- und Reparaturenzyme, und solche Proteine, die mit der Einleitung oder Durchführung der DNA-Replikation in Zusammenhang stehen, stehen auch mit DNA in vivo in Wechselwirkung und machen demzufolge die Trennung von reiner DNA kompliziert. Wegen dieses komplexen Verbundes der DNA mit diesen anderen Proteinen und Nukleinsäuren kann der Reinigungsvorgang (Isolierung), um DNA zu erhalten allgemein als ein dreistufiges Verfahren aufgefaßt werden:
(1) Freigabe der löslichen hochmolekulargewichtigen DNA durch die zerstörten Zellwände und Membrane; (2) Dissoziieren der DNA-Proteinkomplexe durch Proteindenaturation oder -proteolyse; und (3) Trennen der DNA von anderen Makromolekülen.
Innerhalb dieses Verfahrens wird die DNA bakteriellen Ursprungs (Prokaryontische DNA) typischerweise durch unterschiedliche Verfahren gereinigt, was davon abhängt, ob die DNA als chromosomale oder extrachromosomale DNA, z. B. Plasmide oder Bakteriophagen vorliegt. Bei der Reinigung chromosomaler DNA wird die Bakterienzellwand im allgemeinen durch Gefrier-Tauvorgänge oder durch die Behandlung mit dem Enzym Lysozym und dem Geliermittel Ethylendiamin- Tetraessigsäure Säure (EDTA) geschwächt. Die Zellauflösung wird durch die Hinzufügung eines Detergenz, beispielsweise Natriumdodekylsulfat (SDS) in einer Puffersalzlösung herbeigeführt. Der Lysis folgend wird die Lösung mit pankreatischer Ribonuklease behandelt, um RNA und Protease zu hydrolysieren, um die Proteine zu degradieren. Verbleibende Proteine und Oligopeptide werden mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Phenol oder einer Mischung aus gleichen Teilen Phenol und Chloroform extrahiert. Der größte Teil des Proteins wird denaturiert und tritt in die organische Phase ein oder fällt an der Zwischenfläche der organischen und der wäßrigen Phasen aus, wobei diese Phasentrennung vermittels einer Zentrifuge herbeigeführt wird. Die klare, viskose wäßrige Phase, die DNA enthält, wird dann entfernt. Durch die Hinzufügung von Alkohol fällt die DNA aus der wäßrigen Phase als ein weißes faseriges Material aus und kann auf einen Glasstab gewickelt werden. Das Ausfällen aus dem Alkohol dient dazu, die hochmolekulargewichtige DNA zu konzentrieren, während die kleinen Oligonukleotide von DNA und RNA, des Detergenz und das bei der Entnahme der Proteine verwendete organische Lösungsmittel entfernt werden. Das Restdetergenz und die Salze können durch Dialyse der erneut in Suspension gebrachten DNA-Lösung gegenüber dem zweckmäßigen Puffer entfernt werden. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, die DNA durch Zentrifugieren unter einem isopyknischen Cäsiumchloridgradienten oder durch Hydroxylapatit- Chromatgraphie zu reinigen. In dem oben genannten Verfahren für chromosomale DNA erfordern typische Verfahrensabläufe wenigstens zwei Tage für die DNA-Extraktion und den Reinigungsvorgang. (Vergl. Recombinant Techniques von Raymond L. Rodrigues und Robert C. Tact, 1983, S. 162)
Während der Reinigung der extrachromosomalen Elemente der prokaryontischen DNA unter Einschluß der Plasmide und der Bakteriophagen, ist es erwünscht, den Anteil der chromosomalen DNA, der die Aufbereitung verunreinigt, auf ein Minimum herabzusetzen. Im Hinblick auf die Bakteriophagen wird dies oft dadurch durchgeführt, daß zuerst die Phagenpartikel von den infizierten Bakterien gereinigt werden, dann die gereinigten Phagenpartikel mit Protease und/oder Phenol behandelt werden, um die bakteriophage DNA freizugeben. Die weitere Reinigung der DNA wird durch ähnliche Maßnahmen durchgeführt, wie sie für die chromosomale DNA beschrieben worden sind. Wegen ihrer Größe können jedoch die ausgefällten Bakteriophagen und die Plasmid-DNA nicht auf einem Glasstab aufgewickelt werden und daher werden diese im allgemeinen durch Zentrifugieren gewonnen. Wiederum sind drei Tage für den gesamten Isolierungs- und Reinigungsvorgang nicht atypisch.
Für eukaryontische Zellen wird die Isolierung und Reinigung der gesamten zellularen DNA oft dadurch durchgeführt, daß eine Modifikation des Detergenzauflösungs-Verfahrens durchgeführt wird, das oben im Zusammenhang mit Bakterien beschrieben worden ist. Der Hauptunterschied ist, daß die typische Zellauflösung und der Aufschluß der zellularen Proteine unter Verwendung von Proteinase K bei Anwesentheit des Detergenz durchgeführt werden. (Vergl. M. Gross-Bellard, P. Oudet und P Chambon, Eur. J. Biochem., 36 (1973), S. 32- 38; N. Blin und D. W. Stafford, Nuc. Acid. Res., 3 (1976), S. 230-2308; und D. J. Law, P.M. Frossard und D. L. Rucknagel, Gene 28 (1984), S. 153-158). Die Proteinase K wird dann durch Extraktion des Lysats mit Phenol oder einer Phenol/Chloroform-Mischung entfernt. Im Mischverfahren und auch für die Extraktion der bakteriellen DNA bilden typischerweise Lysat/Phenol oder Lysat/Phenol-Chloroform eine Emulsion, deren wäßrige und organische Phasen durch Zentrifugieren voneinander getrennt werden. Die obere oder wäßrige Phase, die die DNA enthält, wird abgegossen oder unter Einsatz einer Pipette entfernt, und dieses im wesentlichen proteinfreie Lysat wird dialysiert, um niedermolekulargewichtige zelluläre Verunreinigungen und Restphenol zu entfernen.
Bei den oben genannten Verfahren ist ein hauptsächlicher Begrenzungsfaktor der Extraktion, welcher in kritischer Weise die Möglichkeit zur Automatisierung des Verfahrens begrenzt, die Notwendigkeit eine Zentrifuge einzusetzen, um die wäßrigen und die organische Phase während der Phenolextraktion voneinander zu trennen. Oft sind mehrere Extraktionen erforderlich, um die gewünschte Reinheit zu erhalten, wobei jede von ihnen die Zentrifugation erfordert. Im wesentlichen als Folge dieser verschiedenen Zentrifugiervorgänge wird das Verfahren von Hand durchgeführt und ist demzufolge teuer. Diese Konstellationen macht auch das Automatisieren des Extraktionsvorganges schwierig und teuer.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine automatische Vorrichtung vorgesehen, durch welche ein neues Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Nukleinsäuren aus Zellen geschaffen wird, ohne eine Zentrifuge zu verwenden.
Die Apparatur weist eine Vorrichtung zum Extrahieren von Nukleinsäure auf, die ihrerseits aufweist:
eine Reaktionsgefäßeinrichtung zum Aufnehmen einer zu extrahierenden Probe, wobei es sich bei dem Reaktionsgefäß um eine Durchflußeinrichtung handelt, welche ein Rohr aufweist mit einer Öffnung an dem einen Ende zur Aufnahme der Probe, nachfolgend als oberes Ende bezeichnet, und mit einer Öffnung an dem anderen Ende, nachfolgend als unteres Ende bezeichnet;
eine Schwenkeinrichtung, um die Reaktionsgefäßeinrichtung, die Flüssigkeitsabgabeeinrichtung, die Abfallsammelleitung und die Heizeinrichtung zu befestigen und zu verschwenken und um eine horizonte Achse zu drehen;
eine Flüssigkeitsabgabeeinrichtung zur gesteuerten Abgabe von Proteinase K, einem Lysis-Puffer und einem auf Phenol basierenden Lösemittelsystem für die Reaktionsgefäßeinrichtung;
eine Abfallsammelleitung zum Ablassen von Flüssigkeiten oder Fluiden aus der Reaktionsgefäßeinrichtung durch das andere Ende; und
eine Heizeinrichtung zur Erhitzung der Reaktionsgefäßeinrichtung.
Weiterhin umfaßt das Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäure unter Verwendung der vorgenannten Apparatur:
Verschwenken der Reaktionsgefäßeinrichtung in eine Position, in welcher das obere Ende des Reaktionsgefäßes zur Aufnahme der Probe tiefer als das andere Ende liegt;
Belüften des anderen Endes zur Abfallsammelleitung hin;
Hinzufügen eines Lysis-Puffers und Proteinase K;
Verschwenken der Reaktionsgefäßeinrichtung in eine Position, in welcher das obere Ende der zur Aufnahme der Probe höher als das andere Ende liegt;
Hinzufügen der Probe zur Reaktionsgefäßeinrichtung;
Schwingenlassen der Reaktionsgefäßeinrichtung, um die Verarbeitung der Probe zu fördern, um ein Lysat zu bilden; Verschwenken der Reaktionsgefäßeinrichtung in eine Position, in welcher das andere Ende höher als das obere Ende liegt; Belüften des anderen Endes zur Abfallsammeleinrichtung hin; Hinzufügen eines auf Phenol basierenden Lösemittelsystems zu der Reaktionsgefäßeinrichtung;
Mischen des Lysats mit dem Lösungsmittel, um eine Emulsion extrahierter Aminosäuren und Proteine zu erzeugen;
Erhitzen der Reaktionsgefäßeinrichtung, um die Separation der Nukleinsäurephase der Emulsion in eine wäßrige Nukleinsäure enthaltende Phase und eine organische Phase herbeizuführen;
Abziehen der organischen Phase;
Konzentrieren der die wäßrige Nukleinsäure enthaltenden Phase; und
Auffangen des konzentrierten Nukleinsäureanteils.
Das Erhitzen der Emulsion und die wahlweise Verwendung eines Lysispuffers mit hoher Salzkonzentration und die Erhöhung des Oberflächenbereichs der Emulsion resultiert in einer Phasentrennung innerhalb von 2-8 Minuten und beseitigt auf dieser Art und Weise die Notwendigkeit des Einsatzes einer Zentrifuge.
Ein Computersystem kann verwendet werden, um das Heizsystem, die Schwenkeinrichtung und das Abgabesystem zu steuern, um den Fluß der Reagenzien in das Reaktionsgefäß zeitlich zu steuern, um das Volumen einzustellen, die Temperatur in dem Reaktionsgefäß aufzuzeichnen und den Fluß der organischen Phase aus dem Reaktionsgefäß heraus festzuhalten. Der Computer dient auch als Hauptsteuerungseinrichtung, um das Mischen der Schwenkeinrichtung und die Wartezeit während der Phasentrennung zeitlich zu steuern und arbeitet nach einem bevorzugten Instruktionssatz, der auf dem oben genannten Verfahren basiert.
Das Reaktionsgefäß und die Dialysevorrichtung werden unabhängig voneinander betrieben, jedoch ist das Dialysesystem so ausgestaltet, daß es mit dem Reaktionsgefäß zum Zwecke eines leichteren Transports des Materials von einem zum anderen Gefäß angepaßt ist. Außerdem ist die Vorrichtung speziell für die normale Ethanolausfällung der Nukleinsäuren in dem Reaktionsgefäß ausgebildet.
Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung wird nun beispielsweise unter Bezugnahme auf die anhängenden Zeichnungen beschrieben, in welchen
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Vorrichtung gemäß der Erfindung zeigt,
Fig. 2 eine Querschnittsansicht durch das Reaktionsgefäß und deren Abdichtung zeigt,
Fig. 3 drei unterschiedliche Formen von Reaktionsgefäßen zeigt,
Fig. 4 eine Seitenansicht der Schwenkeinrichtung zeigt,
Fig. 5A eine auseinandergezogene Darstellung der Dialysekartusche zeigt,
Fig. 5B die vollständige Kartusche nach Fig. 5 zeigt,
Fig. 6 ein Verfahren zeigt, welches verwendet wird, um die Dialysekartusche der Fig. 5 B zu füllen,
Fig. 7 eine Vorderansicht der Dialysekartuschen zeigt, die an der Schwenkeinrichtung befestigt sind, und
Fig. 8 eine Ausfällungssammeleinrichtung zeigt.

Definitionen

Für den Zweck der Beschreibungen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Definitionen zugrunde gelegt:
Eine "Emulsion" ist eine Mischung aus zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten, wobei die eine in der anderen in Suspension gehalten wird. Im Zusammenhang mit der Extraktion von Nukleinsäuren aus Zellen wird nach der Zellauflösung und der Mischung des Lysats mit einem auf Phenol basierenden Lösungsmittelsystems, eine Emulsion gebildet, wobei die Hauptflüssigkeiten eine wäßrige Phase, die die Nukleinsäuren enthält, und eine organische Phase sind, die das Phenol, denaturierte Proteine, Lipide und andere Zellbestandteile enthält. Zusätzlich zu den Nukleinsäuren enthält die wäßrige Phase auch die typischen Verunreinigungen, welche in vielen Fällen entfernt werden müssen, bevor in-vitro-Handhabungsvorgänge durchgeführt werden können. Diese Verunreinigungen umfassen Spurenanteile des auf Phenol basierenden Lösemittelsystems und viele nieder-molekulare Zellbestandteile, beispielsweise Carbohydrate, Aminosäuren und kleinere Nukleinsäuren, beispielsweise als Nukleoside und Nukleotide (die für gewöhnlich als Zellsaft bezeichnet werden).
"Dialyse" ist ein Trennungsvorgang, der von dem unterschiedlichen Transport gelöster Teile unterschiedlicher Größe durch eine poröse Barriere hindurch abhängt, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt, wobei die antreibende Kraft lediglich ein Konzentrationsgefälle ist. Bei der Extraktion von Nukleinsäuren wird die Dialyse oft eingesetzt, um die Verunreinigungen in der wäßrigen Phase der Emulsion zu beseitigen. "Restriktion" ist das wahlweise endonukleitide Abspalten von DNA an einer einzigen bestimmten Basissequenzstelle. Für gewöhnlich wird die Restriktabilität als ein aussagekräftiger Test für die Reinheit der DNA angesehen. Die Vorrichtung ist so ausgestaltet, daß sie zu einer Dialysekassette paßt, die nachfolgend als Dialysette (TM)-Kartusche bezeichnet wird, so daß nach der Extraktion die Dialyse unabhängig durchgeführt werden kann, wenn dies gewünscht wird, beispielsweise bei einer herabgesetzten Temperatur. Sie ist außerdem zur Verwendung an Verfahren des Normal- Ethanolausfällens von Nukleinsäuren angepaßt.
Die Vorrichtung weist eine Hochdruckquelle 701 auf, die tpyischerweise mit einem Druck von 0,7 N/cm² (ungefähr 10 psi) arbeitet, eine Niederdruckquelle 703, die üblicherweise mit einem Druck von 0,01N/cm² (ungefähr 1,5 psi arbeitet), ein Gasverteilungssystem 704 für die wäßrigen Reagenzien und ein Gasverteilungssystem 705 für die organischen Reagenzien auf. Eine typische Auswahl von wäßrigen Reagenzien ist die folgende: Das Gefäß R1 enthält Proteinase K; das Gefäß R2 enthält Lysozym; das Gefäß R3 enthält den Lysispuffer, beispielsweise 4M Urea, 0,2 NaCl, 100 mM Tris- HCL pH 8.0, 0,5% n-Lauroyolsarcosin, 10mM CDTA; das Gefäß R4 enthält 3M Natriumacetat pH = 5,5; das Gefäß R5 ist ein zusätzliches Gefäß, das verwendet werden kann, wenn dies erwünscht ist, das Gefäß R6 enthält 70%iges Ethanol und das Gefäß R7 enthält Wasser. Die organischen Reagenzien sind die folgenden: Das Gefäß R8 enthält Ethanol; das Gefäß R9 enthält Phenol/Chloroform in einem Verhältnis 50 : 50 und das Gefäß R10 enthält Chloroform. Ein elektrisch betätigter Ventilblock 723 wird verwendet, um den Strom der Reagenzien aus den verschiedenen Gefäßen R1-R10 heraus zu steuern, wobei die Bemessung auf der Zeit und dem Druck, wie vorangehend beschrieben, basiert. Ein Einlaß 710 im Ventilblock 723 ist mit einem Ventilblock 725 verbunden, welcher den Strom der verschiedenen Reagenzien zu acht Reaktionsgefäßen 741-748 leitet. Ein Striperhitzer 749 ist an jedem Gefäß angeschlossen, um die gewünschte Temperaturkontrolle während der Extraktion sicher zu stellen.
Der Ventilblock 725 und die Reaktionsgefäße 741-748 sind auch mit einem Abfalleitungssystem 726 verbunden. Die Reaktionsgefäße 741-748, der Abfalleitung 726, der Striperhitzer 749 und der Ventilblock 725 sind alle auf einer Schwenkeinrichtung befestigt und werden gleichzeitig um eine Achse 727 durch einen (nicht gezeigten) Motor in Schwingung gesetzt. Die Schwingung um die Achse 727 während des Extraktionsvorganges findet sehr langsam statt, etwa eine Schwingung pro Sekunde, typischerweise über einen Winkel von 500 bis 600. Die Vorrichtung wird auch so in Schwingung gesetzt, daß die Reaktionsgefäße sich in einer vollständigen horizontalen Lage während der Phasenseparation befinden.
Das Material in den Reaktionsgefäßen kann unter dem Einfluß der Schwerkraftströmung entfernt werden, da die Gefäße als Durchflußgefäße ausgebildet sind, oder kann mit Hilfe von Druck aus dem Bodenbereich herausgedrückt werden, wenn dies so gewünscht wird. Außerdem ist der Boden der Reaktionsgefäße 741 bis 748 mit Leitfähigkeitszellen 751-758 ausgestattet, und zwar eine Zelle pro Gefäß, um festzustellen, wann die organische Phase abgeführt worden ist. Das Ausströmen aus den Reaktionsgefäßen wird durch Angarventile 761-768 gesteuert.
Fig. 2 zeigt eine abgeschnittene Seitenansicht eines Teiles der Vorrichtung, um die Reaktionsgefäße an der Schwingvorrichtung zu haltern. Eine Kappe 801 hält eine federvorbelastete Abdichtung 805 fest gegen den oberen Teil des Reaktionsgefäßes 748. Am Boden dichtet ein Durchflußverbindungsteil 807 üblicherweise aus Polyethylen, das Reaktionsgefäß mit einem vorstehenden Fitting 808 vom Luer-Typ ab. Der Durchlaufverbindungsteil ist abnehmbar, um das Auswaschen des Reaktionsgefäßes zu erleichtern. In diesem Fall ruht die Lippe 749 des Reaktionsgefäßes 748 auf einem O-Ring 809, so daß der gesamte Innenraum des Reaktionsgefäßes gereinigt werden kann und kein Totraum vorhanden ist, welcher zu Verunreinigungen beitragen könnte.
Ein tonnenförmiger Teil 811, welcher in einem Gehäuse 823 bewegbar ist, hält den Ablaufverbindungsteil 807 an Ort und Stelle. Die Leitfähigkeitszelle 758 ist üblicherweise wegen der maximalen Ansprechempfindlichkeit mit Gold überzogen, um Korrosionsbeständigkeit zu erhalten. Die beiden Elektroden der Zelle sind durch einen Teflonabstandsteil 815 voneinander getrennt. Ein weiterer Teflonabstandsteil 817 hält die Zelle an Ort und Stelle, und zwar gegen einen Haltering 819, welcher durch eine Feder 821 vorgespannt ist, um auf diese Art und Weise die gesamte Anordnung auf das Reaktionsgefäß 748 aufzudrücken. Das Gehäuse 823 ist auch an einem Montageteil 825 über einen Zapfen 824 verschiebbar gehaltert, welcher in dem Montageteil 825 nach oben und nach unten verschiebbar ist, um eine gute Abdichtung des Ablaufverbindungsteils mit dem Reaktionsgefäß zu bewerkstelligen.
In Fig. 3 sind drei Beispiele von Reaktionsgefäßen gezeigt, die zur Verwendung mit dieser zweiten Ausführungsform geeignet sind. Das Gefäß 901 ist ein 14 ml-Gefäß, welches aus Glas besteht und eine Länge von ungefähr 15 cm (6 inches), einen maximalen Innen-Durchmesser D901 von ungefähr 1,5 cm (0,6 inch) und ein Längenverhältnis von 10 : 1 hat. Der obere Teil 905 des Gefäßes 901 ist rechtwinklig abgeschnitten, damit er fest an die federbelastete Dichtung 805 angepreßt werden kann, ohne irgendeinen toten Raum zu bilden, in dem sich Reste von DNA sammeln könnten. Da die zu verarbeitenden Materialien durch den oberen Teil 905 eingeführt werden, ist der innere Durchmesser D905 des oberen Teils relativ groß, nämlich ungefähr 6,4 mm (0,25 inch). Am Boden des Gefäßes 901 ist das Gefäß mit einem nach unten gehenden Hals mit einem inneren Durchmesser D907 von ungefähr 4 mm (0,156 inch) ausgebildet und ist innen auf einen Winkel von 1,7º geschliffen, um einen aufnehmenden Fittingteil 907 vom Luer-Typ zu schaffen. An dem untersten Boden des Gefäßes ist eine Lippe 909 vorgesehen, um eine Dichtung mit einem O-Ring 809 während des Reinigungsvorganges sicher zu stellen. Das Reaktionsgefäß 902 ist ein 7 ml-Gefäß mit einer Gesamtlänge von ungefähr 114 mm (4,5 inches) und einem maximalen inneren Durchmesser von ungefähr 11,4 mm (0,45 inches), um ein Längenverhältnis von ungefähr 10 : 1 zu schaffen. Das Gefäß 902 ist mit einem aufnehmenden Fittingsteil von Luer-Typ ausgebildet, und am Boden ist wie beim Gefäß 901 eine Lippe vorgesehen. Entsprechend ist auch der obere Teil rechtwinklig abgeschnitten und hat die gleiche Größe wie der obere Teil des Gefäßes 901, damit er an der Dichtung 805 anliegen kann. Das Reaktionsgefäß 903 ist ein 3,5 ml-Gefäß mit einer Länge von ungefähr 91,4 mm (3,6 inches), weist einen maximalen inneren Durchmesser von ungefähr 9 mm (0,36 inch auf) und hat wiederum ein Längenverhältnis von 10 : 1. Der obere und der untere Teil des Gefäßes passen zu denjenigen der Gefäße 901 und 902. Das Längenverhältnis von 10 : 1 für jedes dieser Gefäße dient dazu, ein praktisches Verhältnis des Querschnittsbereiches einer Flüssigkeit in dem Gefäß in der aufgerichteten Lage in bezug auf den Bereich der Flüssigkeit in dem Gefäß zu schaffen, wenn dieses sich in horizontaler Erstreckung befindet, und dient demgemäß der Optimierung der Phasenseparation. Sogar größere Längenverhältnisse sind für diese Phasenseparation erwünscht, jedoch sind Längenverhältnisse, welche wesentlich größer als 15 : 1 sind, für andere Verfahrensstufen nicht praktisch, beispielsweise wenn die Reagenzien in dem Gefäß gemischt werden sollen. Auch geringere Längenverhältnisse von 10 : 1 können verwendet werden, jedoch wird durch Längenverhältnisse kleiner als 6,5 : 1 die Phasenseparation nicht signifikant erhöht.
Fig. 4 zeigt eine Seitenansicht der Schwenkeinrichtung 1001 in ihrer normalen aufrechten Lage. Die Schwenkvorrichtung trägt eine Art Krippe 1002, an welcher die Reaktionsgefäße befestigt werden, üblicherweise durch wärmeaushärtendes Epoxydharz. Die Krippe hält außerdem den Striperhitzer 749 mit den Gefäßen in Berührungslage. Der Befestigungsteil 825 ist an der Schwenkeinrichtung 1001 verschiebbar befestigt und hält den Zapfen 824 (nicht gezeigt) und das Gehäuse 823 so, daß Reaktionsgefäße mit unterschiedlicher Länge an Ort und Stelle gehaltert werden können. Die Kappe 801 wird an Ort und Stelle mit Hilfe eines Riegelteils 1005 gehaltert, welcher an der Schwenkeinrichtung 1001 befestigt ist und welcher an der Kappe nach unten hin in Klemmeinrichtung angeordnet ist und diese an Ort und Stelle festlegt, um eine feste Abdichtung zwischen der federvorbelasteten Dichtung 805 (nicht gezeigt) und dem Reaktionsgefäß 748 zu schaffen. Der Durchlaufverbindungsteil 807 wird an Ort und Stelle fest gehaltert, und zwar gegen das Reaktionsgefäß mittels eines Hebelbetätigungsteiles 1007, welcher das Gehäuse 823 an einer Seite des Befestigungsteiles 825 nach oben und nach unten bewegt, wie dies vorangehend beschrieben worden ist. Das Verfahren gemäß der Erfindung bezieht sich auf die Schwenkeinrichtung 1001, die umgekehrt wird, auf das Umkehren der Reaktionsgefäße 741-748, wobei die Gefäße mit der Abfalleitung 726 nacheinander verbunden werden, um Querverunreinigungen von Gefäß zu Gefäß zu vermeiden, und in entsprechender Weise auf alle weiteren Vorgänge mit Ausnahme des Reinigungszkyklus, wie dies nachfolgend beschrieben werden wird. Der Lysatpuffer und die Proteinase K werden dann über Ventilblöcke 723 und 725 zu der gewünschten Anzahl der Reaktionsgefäße gegeben. Die Gefäße werden dann bei ungefähr 60ºC und für 5 bis 10 Min. vorgebrütet, um irgendwelche Restnukleaseaktivitäten zu entfernen, die in der Proteinase K vorhanden sein können, wobei die Gefäße leicht unter Schwingung gesetzt werden. (Um den Rest der Diskussion zu vereinfachen, wird das Verfahren unter Bezugnahme auf lediglich eines der Reaktionsgefäße, nämlich das Gefäß 748 beschrieben) . Ein Lysatpuffer mit einer hohen Salzkonzentration kann eingesetzt werden, wobei das Salz die Ionenstärke erhöht. Ein bevorzugter Lysatpuffer enthält 4M Urea; 0,5M NaCl; 0,5% SDS; 50mM-Tris-HCl und 10mM EDTA mit einem pH-Wert von 8,0. Eine 8M Urea-Konzentration entspricht ungefähr der Sättigung und stellt so die obere Grenze dar. Niedrigere Urea-Konzentrationen können verwenden werden und eine 4M-Konzentration wird hinsichtlich des Wirkungsgrades als beste Konzentration bevorzugt. Ein unterer Grenzwert scheint bei ungefähr 2M Urea zu liegen. Auch können andere chaotropische Reagenzien, beispielsweise Guanadinhydrochlorid, als Ersatz für Urea verwendet werden. Die Konzentration des Detergenz SDS kann auch verändert werden, üblicherweise von 0,5% bis so viel wie 2,5%, jedoch erscheint eine Konzentration von ungefähr 0,5% für die meisten Typen von Säugetierzellen mehr als hinreichend. Andere Detergenzien, beispielsweise Triton X-100 (TM), Nonedit (TM) und Lauroyolsarcosin, können auch verwendet werden. In entsprechender Weise kann die hohe Salzkonzentration von 0,1M, welche die Phasenseparation bemerkenswert verlangsamt, bis zu einem Wert so hoch wie 2M variiert werden, was nicht merklich die Phasenseparationsrate über diejenige hinaus erhöht, die bei der bevorzugten 0,5M NaCl-Lösung erhalten wird. Andere Salze, beispielsweise KCl, können auch verwendet werden, wobei die Konzentration von der Ionenstärke des verwendeten Salzes abhängt. Ein anderes Geliermittel als EDTA kann auch verwendet werden, beispielsweise 8-Hydroxyquinolin, und in einigen Fällen kann das Geliermittel weggelassen werden. Die Tris-HCl dient als Puffer.
Die Schwenkeinrichtung wird dann in ihre normale aufrechte Lage zurückgebracht und die Kappe 801 wird durch Anheben des Riegels 1005 entfernt. Eine Nukleinsäureprobe wird dann dem Reaktionsgefäß von oben her zugegeben und der Riegelteil 1005 wird durch festes Anpressen der Kappe 801 auf das Reaktionsgefäß geschlossen. Die Schwenkeinrichtung wird dann in eine Nennstellung von 90º in bezug auf die normale aufrechte Lage bewegt und das Reaktionsgefäß wird um die horizontale Lage hin und her in Schwingung versetzt, während es auf 60ºC erhitzt wird, um die Probe zu verarbeiten. Nachdem die Verarbeitung vervollständigt worden ist (0,5 bis 3h) wird die Schwenkeinrichtung mit dem oberen Teil nach unten gedreht und das Reaktionsgefäß wird zum Abfall hin entleert. Das Phenol/Chloroformlösungsmittel wird dann in das Reaktionsgefäß mit dem Lysat über die Ventilblöcke 723 und 725 zugeführt und das Lysat und das Lösemittel werden leicht gemischt, indem es um eine horizontale Lage für ungefähr 15 Minuten hin und her geschwenkt wird, um verunreinigtes Protein von den Nukleinsäuren zu extrahieren.
Vorzugsweise enthält das auf Phenol basierende Lösemittelsystem Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol im Verhältnis von 50 : 48 : 2, wobei das Phenol zur Denaturierung und Extraktion der Proteine, das Chloroform zur Erhöhung der Hydrophobizität dient und um sicherzustellen, daß die DNA in wäßriger Phase verbleibt, und der Isoamylalkohol primär als ein Antisurfaktant (Antischäummittel) dient. Veränderungen dieses organischen Lösemittelsystems können eingesetzt werden, beispielsweise durch Ersetzen des Phenol/Chloroform/ Isoamyl-Alkoholsystems durch ein phenolgesättigtes System mit Tris-HCl-Puffer mit einen pH- Wert von 8,0, oder indem das Chloroform durch Methylenchlorid ersetzt wird, jedoch wird das Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkoholsystem wegen seiner Wirksamkeit beim Herbeiführen der gewünschten Phasenseparation bevorzugt und weil die DNA in der Zwischenfläche zwischen der organischen und der wäßrigen Phase nicht verlorengeht, was mit dem System passieren kann, welches Phenol einsetzt, das mit dem Puffer gesättigt ist. In entsprechender Weise können die präzisen volumetrischen Verhältnisse (z. B. 50 : 48 : 2) dieses bevorzugten phenolbasierenden Lösemittelsystems verändert werden, jedoch ermöglicht eine zu niedrige Konzentration des Chloroforms der DNA häufig, in die organische Phase einzutreten, anstatt in der wäßrigen Phase zu verbleiben. Als allgemeine Regel scheint ein Verhältnis von Phenol zu Chloroform von ungefähr 1 : 1 das optimale Verhalten zu erbringen. In entsprechender Weise kann eine zu niedrige Konzentration des oberflächenwirksamen Mittels zum Schäumen führen, was wiederum zu Verklebungen in den Leitungen führt.
Wenn der Extraktionsvorgang vervollständigt worden ist, wird die Schwenkeinrichtung angehalten und das Reaktionsgefäß wird in einer horizontalen Lage während einer Zeitspanne von 5 Minuten gehalten, während der das Gefäß erhitzt wird, um die Phasenseparation zu bewerkstelligen.
Das Gefäß wird vorzugsweise auf einer Temperatur zwischen 35ºC und 55ºC und bevorzugter Weise zwischen 45ºC und 55ºC erhitzt, wobei am meistens eine Temperatur von ungefähr 55ºC bevorzugt wird, wobei diese letztgenannte Temperatur nahe dem Siedepunkt des Chloroforms liegt. Eine Erhöhung des Oberflächenbereichs wird üblicherweise durch Positionieren des Reaktionsgefäßes bewerkstelligt, welches die Emulsion an seinen Seiten enthält, wodurch sich der Querschnittsbereich der Zwischenfläche zwischen dem Lysat und der organischen Phase erhöht und die Tiefe der beiden Phasen verringert wird. Die Kombination der hohen Konzentration an Salz, der großen Oberfläche und des Verfahrens zum Aufheizen während dieser Stufe bewirkt, daß die Emulsion sich in ein Zweiphasensystem innerhalb von 2 bis 8 Minuten trennt, wobei die Notwendigkeit zum Zentrifugieren vollständig beseitigt wird.
Wenn die Phasenseparation stattgefunden hat, wird die Schwenkeinrichtung 1001 in eine solche Position verschwenkt, daß der Boden des Reaktionsgefäßes sich um 10º oberhalb der Horizontalen befindet und das Angarventil 768 wird mit der Ablaufleitung 726 verbunden, um Druck freizugeben, der sich durch die Erhitzung aufgebaut hat. Das Angarventil 768 wird dann geschlossen, das Gefäß wird in die aufrechte Lage bewegt und die untere Phenolphase wird zur Abfalleitung 726 hinabgezogen. Die Leitfähigkeitszelle 758 wird eingesetzt, um den Phasenwechsel festzustellen, um das Ablaufenlassen des Materials aus dem Reaktionsgefäß zu beenden. Der obige Extraktionsvorgang wird dann wie vorangehend beschrieben wiederholt, bis die obere Phase proteinfrei ist. Üblicherweise ist lediglich eine weitere Extraktion für die Trennung der Nukleinsäuren von den Lymphozyten erforderlich, während für einige andere Zelltypen, beispielsweise Leberzellen, sogar drei zusätzliche Extraktionsvorgänge erforderlich sind. Üblicherweise wird die endgültige Extraktion allein mit Chloroform durchgeführt, welches den größten Teil des verbliebenen Phenols entfernt, anstatt daß mit der Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkoholmischung gearbeitet wird. Die Zeit für diese nachfolgende Extraktion liegt üblicherweise im Bereich von 10 bis 15 Minuten. Die nachfolgende Phasenseparation tritt jedoch typischerweise in kürzeren Zeiten innerhalb von 2 bis 3 Minuten auf.
Wenn der oben geschilderte Extraktionsvorgang vervollständigt worden ist, steht eines von zwei Verfahren zur Konzentration der wäßrigen Phase, die die Nukleinsäuren enthält, zur Verfügung, und zwar entweder die Dialyse oder die Ethanolausfällung.
Wahlweise kann die wäßrige Phase entweder mit RNase oder DNase bearbeitet werden, und die Extraktion kann wiederholt werden, um entweder DNA oder RNA in der wäßrigen Phase zurück zulassen.
Die gereinigte Probe kann dann aufgefangen werden.
Fig. 5A ist eine Konstruktionszeichnung einer Dialysette- (TM) Kartusche 1100, welche speziell so ausgestaltet ist, daß sie zu dem aufnehmenden Fitting-Teil vom Luer-Typ am Boden der Reaktionsgefäße paßt. Die Kartusche besteht aus zwei Rahmenhälften 1113 und 1115, zwischen welchen in Sandwichweise zwei Dialysemembrane 1117 und 1119 und ein Satz von Dichtungen 1121, 1122, 1123 und 1124 angeordnet sind, wobei die Dichtungen in Sandwichweise zwischen den Dialysemembranen angeordnet sind. Jede Rahmenhälfte weist eine Reihe von erhabenen Fenstern 1131-1134 auf, welche, wenn die Rahmenhälften aneinander befestigt sind, die Dialysemembrane und die Dichtungen fest an Ort und Stelle haltern, indem sie vier Reservoire bilden, die durch den Zwischenraum zwischen den Membranen festgelegt sind, welche durch die Dichtungen 1121-1124 geschaffen sind.
Fig. 5B zeigt einen vervollständigten Aufbau mit den vier Reservoiren 1141-1144. Um die Reservoire zu füllen, sind die Dichtungen mit Einfüllrohren ausgebildet, welche vorstehende Fitting-Teile 1151-1154 vom Luer-Typ an ihrem oberen Teil aufweisen. Außerdem ist jedes Einfüllrohr in genau gleichem Abstand angeordnet, der dem der Reaktionsgefäße entspricht, so daß sie zu diesen passen.
Die Fig. 6A-6B erläutern das zur Befestigung und Befüllung der Dialysette-Kartuschen eingesetzte Verfahren. Zuerst wird die Dialysette-Kartusche in eine halb aufrechte Lage verschwenkt, wie diese in Fig. 6A gezeigt ist. Die Reaktionsgefäße werden dann geöffnet und wie in Fig. 6B gezeigt, werden die Gefäße von der Schwenkvorrichtung 1001 etwas wegverschwenkt, wie dies in Fig. 6C gezeigt ist, um die Kartusche zu befestigen. Die Dialysekartusche 1113 wird dann, wie in Fig. 6D gezeigt, befestigt und an Ort und Stelle, wie in Fig. 6E gezeigt, mittels des Hebelbetätigungsteiles 1007 festgeklemmt, und so wird auch mit den anderen entsprechenden Hebelbetätigungsteilen für die anderen Reaktionsgefäße vorgegangen. Die Schwenkeinrichtung wird dann in die in Fig. 6F gezeigte Lage zurückgeschwenkt, um auf diese Art und Weise die Reservoire der Dialysettekartuschen zu befüllen.
Fig. 7 zeigt eine Vorderansicht der Schwenkvorrichtung mit den an den Reaktionsgefäßen 741-748 befestigten Dialysette- Kartuschen 1100 und 1101. Wenn die Dialysette-Kartuschen befüllt worden sind, werden sie entfernt, verschlossen und die Standarddialysevorgänge werden durchgeführt, um die extrahierten Nukleinsäuren zu konzentrieren und zu reinigen. Für eine detaillierte Beschreibung der Dialysette-Kartusche wird auf die anhängige Anmeldung unter der Bezeichnung "Dialysette (TM) Dialysis Cartridge" vom 10. April 1986 von G. Richard Cathcart, et al. verwiesen.
Der andere Ansatz, um die Nukleinsäuren zu konzentrieren, d. h. die Ethanolausfällung, wird auch durch den Aufbau der Vorrichtung vorteilhaft zur Geltung gebracht. Um die Nukleinsäuren in dem Gefäß 748 durch Standardethanolausfällung zu konzentrieren, wird eine Volumenmenge an Natriumacetat dem Reaktionsgefäß aus dem Reaktionsgefäß R4 zugegeben, welches gleich dem 0,1-fachen des Volumens des verbleibenden Lysats ist. Dann werden zwei Volumenmengen von hochreinem Ethanol aus dem Reagensgefäß R8 zugegeben und das Gefäß wird leicht in Schwingung versetzt, um die Nukleinsäuren niederzuschlagen. Die beiden Volumenmengen von Ethanol entsprechen dem Doppelten des Volumens des Lysats und des Natriumacetats zusammengenommen.
Um die niedergeschlagenen Nukleinsäuren zu sammeln, ist eine spezielle Sammeleinrichtung bekannt, die nachfolgend als Precipitette (TM)-Sammeleinheit 1400 verwendet wird. Fig. 8 zeigt eine Querschnittsansicht der Sammeleinheit 1400. Die Einheit besteht aus einem kreisförmigen Oberteil 1401, welcher ein nach oben stehendes Element aufweist, das an seinem obersten Ende die Form eines vorstehenden Fitting- Teils vom Luer-Typ hat, so daß es zu dem Boden eines Reaktionsgefäßes paßt. Ein kreisförmiges Rohr 1403 läuft durch den oberen Teil 1401 hindurch und hat eine glatte angeschrägte Oberfläche 1405, um das Ansammeln von Nukleinsäuren an der Oberfläche der Einheit zu verhindern. Der obere Teil 1401 weist einen Schnappring 1409 auf, der in eine kreisförmige Ausnehmung 1403 einschnappt, die in einem Bodenteil 1415 ausgebildet ist, um den oberen Teil 1401 und den unteren Teil 1415 zusammenzuhalten. In Sandwichanordnung zwischen dem oberen und dem unteren Teil befindet sich ein Stützsieb 1407, welches dazu dient, ein Filter 1402 auf sich zu haltern. Ein kreisförmiger Vorsprung 1418 drückt das Filter 1402 gegen das Gitter 1417 und hält sowohl das Filter als auch das Sieb an Ort und Stelle in der Einheit. Ein Bodenteil 1419 ist vorgesehen, welcher direkt in einen tonnenförmigen Teil 811 paßt, wo für gewöhnlich der Durchlaufverbindungsteil 807 befestigt ist. Auch der Bodenteil 819 ist mit einem Rohr 1420 ausgebildet, damit die Einheit mit der Abfallsammeleinrichtung verbunden werden kann. Ein Volumen 1421 zwischen dem Boden des oberen Teils 1401 und dem Gitter ist vorgesehen, um die ausgefällten Nukleinsäuren zu sammeln.
Um die Precipitette (TM)-Sammeleinheit 1400 zu verwenden, wenn die Ethanolausfällung durchgeführt worden ist, wird die Schwenkeinrichtung mit dem oberen Teil nach unten verschwenkt. Der Durchlaufverbindungsteil wird entfernt und die Precipitette-Sammeleinheiten werden an ihren vorgesehen Plätzen installiert. Die Schwenkeinrichtung wird dann rasch in ihre normale aufgerichtete Lage verschwenkt, während zur gleichen Zeit, während dieses nach oben gerichteten Hubes, Luft und Ethanol pulsartig eingegeben werden, um die Niederschläge von den Seiten des Reaktionsgefäßes und in die Precipitette-Sammeleinheiten zu spülen. Das Pulsieren von Luft und Ethanol wird in abwechselnden Zyklen durchgeführt, für Luft typischerweise über eine Zeitspanne von ungefähr 600ms und für Ethanol über ungefähr 300ms, wenngleich diese Zeiten in Abhängigkeit von der Größe des Reaktionsgefäßes, das gereinigt werden soll, verändert werden können. Wenn die Ausfällung aus den Reaktionsgefäßen ausgespült worden ist, wird sie in Filtern 1402 in den Sammeleinheiten aufgefangen.
Falls erwünscht, können die Ausfällungen weiterhin ausgewaschen werden, indem die Reaktionsgefäße mit Ethanol gefüllt werden und diese durch die Sammeleinheiten zur Abfalleitung hin entleert werden. Der Niederschlag kann dann gesammelt werden, indem die Filter den Sammeleinheiten entnommen werden.
Nach der Dialyse oder dem Ausfällen folgend müssen die Reaktionsgefäße peinlichst genau gereinigt werden, bevor sie erneut eingesetzt werden können, da ein Rest, der von einer DNA verblieben ist, ein nachfolgendes Extraktat verunreinigen würde und in zukünftigen Klonierexperimenten immer wieder repliziert werden könnte. Um diese Reinigung durchzuführen, wird ein Reinigungszyklus installiert, wobei jedes Gefäß unabhängig von den anderen gereinigt wird, um Querverunreinigungen zu vermeiden. Der Ablauf ist der folgende. Zuerst wird jedes Gefäß durch zusätzliches Wasser gespült, welches in dem Gefäß auf ungefähr 60ºC erhitzt wird. Jedes Gefäß wird stark gerüttelt und Heißwasser wird nacheinander zur Abfallsammelleitung geblasen. Sodann wird 6-normale Nitrosäure jedem Gefäß hinzugeführt und auf ungefähr 600 erhitzt, wobei währenddessen stark geschüttelt wird. Sodann wird die Nitrosäure nacheinander zum Abwassersammelgefäß geblasen. Jedes Gefäß wird dann mit Wasser gespült, welches auf 600 erhitzt wird, heftig gerüttelt und sodann wird das Wasser - wiederum ein Gefäß nach dem anderen - zur Abwasserleitung hin geblasen, eine 50/50 Mischung des Lysatpuffers mit Wasser wird jedem Gefäß zugegeben, um die Nitrosäure zu neutralisieren, die auf 600 erhitzt worden ist, und die Gefäße werden gerüttelt und wie vorangehend zur Abfallsammelleitung hin entleert. Dann wird jedes Gefäß zweimal mit Wasser gespült, und zwar genauso wie bei der ersten Wasserspülung. Jeder der oben geschilderten Zyklen erfordert ungefähr drei Minuten. Nach dem Reinigungsvorgang stehen die Reaktionsgefäße wieder zur Verfügung.
Um es auf den kleinsten gemeinsamen Nenner zu bringen, ist die Software-Steuerung der Extraktionsvorrichtung eine Angelegenheit der Öffnung und des Schließens von Ventilen und des Ein- und Ausschaltens von Schaltern zum richtigen Zeitpunkt, um die gewünschten Ströme der verschiedenen Materialien aus einem Gefäß in ein anderes herbeizuführen und um die gewünschten Vorgänge durchzuführen. Die Tatsache, daß das Verfahren gemäß der Erfindung eine Aufeinanderfolge von Stufen ist, macht dieses Verfahren von sich aus einer Software-Steuerung zugänglich.

Beispiele

Vorbereitung von DNA aus menschlichen Lymphozyten.
Lymphozyten werden zuerst aus einer Einheit aus Vollblut ausgewaschen und dann erneut in Suspension in einer 4ml ausgeglichenen Salzlösung suspendiert (Die im Gleichgewicht befindliche Salzlösung wird aus einem Volumenteil Lösung A und 9 Volumenteilen der Lösung B hergestellt, wobei Lösung A 0,1% Glukose, 5·10&supmin;¹&sup0;M CaCl&sub2;, 9,8·10&supmin;&sup4;M MgCl&sub2;, 5,4·10&supmin;³, KCl, 0,145M Tris-HCl pH=7,6, und Lösung B 0,14M NaCl ist.) Sodann wird 0,35ml der oben genannten Lymphozyten-Suspension mit 4ml Lysatpuffer gemischt (1M NaCl, 1% SDS, 8M Urea, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0), und 1 mg von Proteinnase K in 0,65 ml Lysatpuffer gemischt, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu erhalten. Die Verarbeitung wird in einem konischen Rohr (Extraktionsgefäß 11) durchgeführt, wie vorangehend beschrieben, und zwar bei 5500 für über 3 Stunden. Ungefähr 5 ml von Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol in einem Verhältnis von 50 : 48 : 2 wird in das Rohr zugegeben, und die beiden Phasen werden gemäß dem Protokoll 20 Minuten gemischt. Das Extraktionsgefäß wird dann in die horizontale Lage für 10 Minuten bei 55ºC gedreht, um zu ermöglichen, daß sich die Phasen trennen. Das Extraktionsgefäß wird dann langsam in die vertikale Lage über eine Zeitspanne von ungefähr 10 Sekunden zurückverschwenkt, und die untere organische Lage wird zur Abfalleitung abgegeben. Eine zweite Extraktion wird mit der Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkoholmischung und eine dritte Extraktion wird unter Verwendung von 5 ml Chloroform durchgeführt. Das Chloroform wird zur Abfalleitung gegeben und die wäßrige DNA enthaltene Schicht wird mit Hilfe von Druck in einen Dialysebehälter, beispielsweise einem Dialysebehälter 311 übertragen. Diese wäßrige Lösung wird dann unter Druck gemäß dem Protokoll dialysiert, bis A270 sich unterhalb 0,01 befindet. Die endgültige DNA-Lösung wird dann aus dem Behälter herausgenommen und aufgefangen.
Nach diesem Verfahren ergibt sich ungefähr 1 ml DNA-Lösung, die ungefähr 250 Mikrogramm an DNA enthält. Die resultierende Lösung hat ein Absorptionsverhältnis A230:A260 von 0,52 und ein Absorptionsverhältnis A260:A280 von 1,9, was eine hohe Reinheit belegt. (Für absolut reines DNA beträgt das Absorptionsverhältnis A230:A260 0,5±0,05 und A260:A280 1,9±0,1.) Die Analyse der Probe unter Verwendung von 0,8% Agarose-Gel und einem Standardethidiumbormid- Staining-Verfahren zeigt ein einzelnes Band mit einer Größe größer als 50kbasis Paare, (das heißt größer als 3,5·10&sup7; Daltons). Außerdem ist, was sehr bedeutsam ist, die Verarbeitung mit dem Enzym Eco R1 positiv, was anzeigt, daß die DNA restriktabel ist und demzufolge ist die Restriktabilität daher ein sehr aussagekräftiger Test für die Reinheit der DNA.
Abänderungen des obigen Beispiels belegen die Bedeutung der Erhitzung und der Erhöhung des Oberflächenbereiches, um die Phasenseparationsstufe durchzuführen. Für menschliche Lymphozyten beispielsweise erfordert die Phasenseparation üblicherweise über 60 Minuten, falls das Extraktionsgefäß nicht erhitzt wird, sondern auf Raumtemperatur gehalten wird und das Extraktionsgefäß nicht in die horizontale Lage verschwenkt wird. Falls statt dessen das Extraktionsgefäß auf 55ºC erhitzt, jedoch nicht in die horizontale Lage verschwenkt wird, erfordert die Phasenseparation über 4 Minuten. Bei einer Erhitzung auf 55ºC und Drehung des Extraktionsgefäßes in die horizontale Lage erfordert die Phasenseparation üblicherweise lediglich ungefähr 2,5 Minuten. In jeder dieser Variationen erhöht der hohe Salzgehalt jedoch die Geschwindigkeit der Phasenseparation um ungefähr den Faktor 2.
Wenngleich eine bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung und des Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben worden ist, ist es dennoch für Fachleute klar, daß viele Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne von der Erfindung in ihren weitesten Aspekten abzuweichen. Beispielsweise ist es offensichtlich, daß das Extraktionsgefäß nicht in eine horizontale Lage gedreht werden muß, um die Phasenseparation zu beschleunigen, obgleich dies einen Haupteinfluß ausübt. In entsprechender Weise kann die Phasenseparation bei einer Temperatur unterhalb des bevorzugten Bereiches von 45ºC bis 55ºC durchgeführt werden, jedoch findet sie dann bei einer niedrigen Geschwindigkeit statt, und zwar je weiter sie unterhalb dieses Bereiches liegt, desto niedriger ist diese Geschwindigkeit. Im Hinblick auf die Vorrichtung ist offensichtlich, daß automatische Vorrichtungen gemäß der Erfindung entweder mit mehr oder mit weniger Extraktionsgefäßen, Reaktionsgefäßen und Dialysebehältern aufgebaut sein können. Einige Ventile können auch zweckmäßigerweise an unterschiedlichen Stellen in der Vorrichtung angebracht werden, beispielsweise kann der Ventilblock 52 oberhalb der Leitfähigkeitsmeßeinrichtung 55 angeordnet werden. Jedoch führt dies zu gewissen Verlusten der wäßrigen Phase, wenn die Strömung angehalten wird. Zusätzlich ist die spezielle Zahl der Modellnummern für die verschiedenen Stücke der Vorrichtung, die in einem automatischen Extraktionssystem eingeschlossen sind, im Hinblick auf das spezielle Modell nicht restriktiv zu sehen, welches verwendet werden kann, da diese Zahlen lediglich beispielshalber angegeben worden sind.

Claims

1. Vorrichtung zum Extrahieren von Nukleinsäuren, aufweisend:

eine Reaktionsgefäßeinrichtung (741-748) zum Aufnehmen einer zu extrahierenden Probe, wobei es sich bei dem Reaktionsgefäß um eine Durchflußeinrichtung handelt, welche ein Rohr aufweist mit einer Öffnung an dem einen Ende zur Aufnahme der Probe, nachfolgend als oberes Ende bezeichnet, und einer Öffnung an dem anderen Ende, nachfolgend als unteres Ende bezeichnet;

eine Schwenkeinrichtung (1001), um die Reaktionsgefäßeinrichtung (741-748), die Flüssigkeitsabgabeeinrichtung (723, 725), die Abfallsammelleitung (726) und die Heizeinrichtung (749) zu befestigen und zu verschwenken und um eine horizonte Achse zu drehen;

eine Flüssigkeitsabgabeeinrichtung (723, 725) zur gesteuerten Abgabe von Proteinase K, einem Lysis-Puffer und einem auf Phenol basierenden Lösemittelsystem für die Reaktionsgefäßeinrichtung;

eine Abfallsammelleitung (726) zum Ablassen von Flüssigkeiten oder Fluiden aus der Reaktionsgefäßeinrichtung durch das andere Ende; und

eine Heizeinrichtung (749) zur Erhitzung der Reaktionsgefäßeinrichtung.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher das andere Ende der Reaktionsgefäßeinrichtung (741-748) eine Luer-Typ- Armatur aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, weiterhin aufweisend eine Dialysekartuscheneinrichtung (1100, 1101, 1113) mit einer Luer-Typ-Armatur zur Verbindung mit den und Anpassung an die Luer-Typ-Armaturen der Reaktionsgefäßeinrichtung (741- 748) und zum Aufnehmen extrahierter Nukleinsäure aus der Reaktionsgefäßeinrichtung zur Dialyse.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, weiterhin aufweisend eine Niederschlagsammeleinrichtung (1400) zum Aufsammeln der in der Reaktionsgefäßeinrichtung (741-748) abgesetzten Nukleinsäuren, wobei die Niederschlagsammeleinrichtung (1400) eine Luer-Typ-Armatur zur Anpassung an die Luer-Typ-Armatur der Reaktionsgefäßeinrichtung (741-748) aufweist.

5. Vorrichtung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin aufweisend ein Computersystem zur Steuerung der Heizeinrichtung, der Schwenkeinrichtung, der Flüssigkeitsabgabeeinrichtung und der Abfallsammelleitung zur Steuerung des Flusses der Reagentien in die Reaktionsgefäßeinrichtung hinein, zur Überwachung der Temperatur in der Reaktionsgefäßeinrichtung und zum Festhalten der Strömung der Flüssigkeiten aus der Reaktionsgefäßeinrichtung heraus.

6. Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus einer Probe unter Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verfahren aufweist;

Verschwenken der Reaktionsgefäßeinrichtung in eine Position, in welcher das obere Ende des Reaktionsgefäßes zur Aufnahme der Probe tiefer als das andere Ende liegt;

Belüften des anderen Endes zur Abfallsammelleitung hin;

Hinzufügen eines Lysis-Puffers und Proteinase K;

Verschwenken der Reaktionsgefäßeinrichtung in eine Position, in welcher das obere Ende der zur Aufnahme der Probe höher als das andere Ende liegt;

Hinzufügen der Probe zur Reaktionsgefäßeinrichtung;

Schwingenlassen der Reaktionsgefäßeinrichtung, um die Verarbeitung der Probe zu fördern, um ein Lysat zu bilden;

Verschwenken der Reaktionsgefäßeinrichtung in eine Position, in welcher das andere Ende höher als das obere Ende liegt;

Belüften des anderen Endes zur Abfallsammeleinrichtung hin;

Hinzufügen eines auf Phenol basierenden Lösemittelsystems zu der Reaktionsgefäßeinrichtung;

Mischen des Lysats mit dem Lösungsmittel, um eine Emulsion extrahierter Aminosäuren und Proteine zu erzeugen;

Erhitzen der Reaktionsgefäßeinrichtung, um die Separation der Nukleinsäurephase der Emulsion in eine wäßrige Nukleinsäure enthaltende Phase und eine organische Phase herbeizuführen;

Abziehen der organischen Phase;

Konzentrieren der die wäßrige Nukleinsäure enthaltenden Phase; und

Auffangen des konzentrierten Nukleinsäureanteils.