JP4891363B2 - 蛍光検出方法及び蛍光検出装置 - Google Patents
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Description
例えば、図10(a)に示すように複数種類における試料の蛍光強度が弁別困難な場合がありうるので、図10(b)に示すように、試料ごとに異なる検出波長を選択する方法を示したものである。これらの詳細については実施例3で説明する。
(実施例1)
本実施例は、分析試料の濃度検出に関するものである。本発明の実施例として、600nmに最適な励起波長を持つ蛍光体を標識した核酸を定量的に検出する場合を例に、以下図面を用いて具体的に説明するが、本発明は蛍光体からの蛍光発光を複数同時に検出し、検出範囲内の蛍光強度を検出結果とすればよく、以下の具体例に限定されるものではない。
1.試料の準備
600nmに励起波長を持つ蛍光体を標識した濃度不明の検査試料A、検査試料Bと当該蛍光体を標識した濃度20ng/μlの標準試料Cを用意した。そして、検査試料Aと標準試料Cを等量混ぜて測定試料ACを作成し、検査試料Bおよび標準試料Cを等量混ぜた測定試料BCを作成した。また、600nmに励起波長を持つ当該蛍光体の蛍光発光スペクトルを図5に示した。図5より、CCD検出器において検出される波長を600nm、610nm、650nm、700nmの4波長に設定し、以下の実験を行った。
2.蛍光の複数波長同時検出
測定試料ACと測定試料BCに対して電気泳動を行い、試料を分離しながら、励起光を照射し、CCDの検出器を用いて600nm、610nm、650nm、700nmの4波長における蛍光強度を同時に測定し、測定試料ACに対しては図6に示す各波長における蛍光強度の経時変化を得、測定試料BCに対しては図7に示す各波長における蛍光強度の経時変化を得た。
3.検出データの選択
測定試料AC(図6)における複数の蛍光強度は、図7に示されるように600nmおよび610nmで検出された試料Aにおけるピーク(以下、本文内において、時間軸に従って得られた蛍光強度に対して、X軸に時間、Y軸に蛍光強度をプロットした時の検査試料の存在を意味する波形をピークと定義する。)の上端が水平となっており、検出範囲を越えていたため、650nmで取得された蛍光強度を選択した。一方、測定試料BC(図7)は最適な検出波長である600nmでも検出範囲を越えなかったため、600nmで取得された蛍光強度を選択し、選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度と標準試料Cの濃度から換算して測定試料AC中の検査試料Aと測定試料BC中の検査試料Bの濃度を数1の方法を用いて算出した結果を表1に示す。
(実施例2)
本実施例は、分析試料の濃度検出に関するものである。本発明の実施例として、600nmに最適な励起波長を持つ蛍光体を標識した核酸を定量的に検出する場合を例に、以下図面を用いて具体的に説明するが、本発明は蛍光体からの蛍光発光を複数同時に検出し、検出範囲内の蛍光強度を検出結果とすればよく、以下の具体例に限定されるものではない。
1.試料の準備
600nmに励起波長を持つ蛍光体を標識した濃度不明の異なる検査試料A、検査試料Bと当該蛍光体を標識した濃度30ng/μlの標準試料Cを用意した。そして、検査試料Aと試料Bと標準試料Cを等量混ぜて測定試料ABCを作成した。また、600nmに励起波長を持つ当該蛍光体の蛍光発光スペクトルを図5に示した。図5より、CCD検出器において検出される波長を600nm、610nm、650nm、700nmの4波長に設定し、以下の実験を行った。
2.蛍光の複数波長同時検出
測定試料ABCに対して電気泳動を行い、試料を分離しながら、励起光を照射し、CCDの検出器を用いて600nm、610nm、650nm、700nmの4波長における蛍光強度を同時に測定し、図8に示す各波長における蛍光強度の経時変化を得た。
3.検出データの選択
測定試料ABCの測定により得られた複数の蛍光強度は、図8(a)に示されるように600nmおよび610nmで検出された検査試料Aのピークの上端が水平となっており、検出範囲を越えていたため、試料A、B、Cにおいて650nmで取得された蛍光強度を選択し、選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度を検出した。そして、標準試料Cの濃度から換算して検査試料Aと検査試料Bの濃度を式1の方法を用いて算出した結果を表2に示す。
(実施例3)
図2に示す方法において、複数の蛍光体検出法の具体例を、異なる3種類の蛍光体を標識した濃度未知の異なる核酸を定量的に検出する場合を例にとり説明する。
1.試料の準備
それぞれ異なる蛍光体を標識した濃度が未知の検査試料A、B、Cと、濃度40ng/μlの標準試料Dをそれぞれ等量混ぜ、測定試料ABCDを調整した。試料A、B、C、Dに標識された蛍光体は、図9に示すように500、550、600、520に最適波長を持つ。図9より、CCD検出器において検出される波長を500nm、520nm、550nm、600nm、650nm、700nmの6波長に設定し、以下の実験を行った。
2.蛍光の複数波長同時検出
測定試料ABCDに対して電気泳動を行い、試料を分離しながら、励起光を照射し、励起された蛍光を500、520、550、600、650、700(nm)の6波長における蛍光強度を同時に測定した。この結果、図10(a)に示すように、検査試料Aのピークにおいては、波長500nm、520nmで検出範囲を逸脱し、550nmで蛍光強度が最大となる検出範囲内のピークが得られた。検査試料Bのピークにおいては、検出した全ての波長において検出範囲内でピークを検出でき、波長550nmで最大蛍光強度となるピークを得た。検査試料Cにおいては、波長600nmで検出範囲を逸脱し、650nmで蛍光強度が最大となる検出範囲内のピークが得られた。標準試料Dにおいては、検出した全ての波長において検出範囲内でピークを検出でき、波長520nmで最大蛍光強度となるピークを得た。
3.検出データの選択
測定試料ABCDの測定により得られた複数の蛍光強度は、図10(a)に示されるように500nmおよび520nmの蛍光強度において、検査試料Aのピークの上端が水平となり検出範囲を越え、600nmの蛍光強度において、検査試料Cのピークの上端が水平となり検出範囲を越えていた。
Claims (7)
- 蛍光体を有する複数種の検査試料及び蛍光体を有する濃度既知の標準試料を分離しながらこれらの試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する方法であって、
該蛍光発光を発光領域の波長帯を含む複数の波長で同時に検出し、
該複数の波長の中から検出範囲内で検出された複数の波長を検査試料毎に選択し、
選択された全ての波長を標準試料に対して選択し、
それぞれの試料に対して選択された波長の蛍光強度を検出結果として時間軸と関連づけて出力し、
各検査試料の蛍光強度と標準試料の蛍光強度との比率を算出することを特徴とする蛍光検出方法。 - 検出結果が検出範囲外にある蛍光波長を含む場合は、その蛍光波長を除いて、その他の蛍光波長を選択して、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することを特徴とする請求項1記載の蛍光検出方法。
- 選択する波長は、検出範囲内にある最大の波長である請求項1記載の蛍光検出方法。
- 選択する波長は、検出範囲内にある任意の波長である請求項1記載の蛍光検出方法。
- 検出結果に検出範囲外にある蛍光波長が含まれている場合は、その蛍光波長を除いて、その他の蛍光波長を採用して、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の蛍光検出方法。
- それぞれの蛍光体について選択した蛍光波長が異なることを特徴とする請求項5記載の蛍光検出方法。
- 蛍光体を有する複数種の検査試料及び蛍光体を有する濃度既知の標準試料を分離しながらこれらの試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する装置であって、
該蛍光発光を複数の波長で同時に検出できる検出器を備え、該試料の蛍光発光が大きく、該蛍光体に最適な波長で検出範囲を越える場合は、最適な波長以外から得られた蛍光強度が検出範囲に収まる波長を選択し、選択された全ての波長を標準試料に対して選択し、
それぞれの試料に対して選択された波長の蛍光強度を検出結果として時間軸と関連付けて出力し、各検査試料の蛍光強度と標準試料との蛍光強度との比率を算出することを特徴とする蛍光検出装置。
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