DE3752148T2 - Echtzeitabtastvorrichtung in einem Elektrophoreseapparat zur DNS-Sequenzbestimmung - Google Patents

Description

• Diese Erfindung bezieht sich auf einen Apparat zur Fluoreszenzerfassung in Elektrophoresesystemen, und insbesondere auf einen solchen Apparat zur automatischen Sequenzbestimmung von Nucleinsäuren.
• Die strukturelle Analyse der DNA spielt in der modernen Molekularbiologie eine immer wichtigere Rolle. Ca. 4 x 106 Basen der DNA wurden seit der Einführung des Enzymoder Dideoxyverfahrens der von Sanger und seinen Kollegen (Sanger, et al., Proc. Natn. Acad. Sci., USA 74,5463-5467 (1977), A.J.H. Smith, Meth. Enzymol. 65,560-580 (1980)) entwickelten schnellen Sequenzbestimmung und dem von Maxam und Gilbert entwickelten chemischen Verfahren (S.M. Maxam und W. Gilbert, Meth. Enzymol. 65,499-559 (1980)) sequenziert. Üblicherweise werden vier separate Reaktionen auf jedem einzelnen zu analysierenden DNA-Segment durchgeführt. Beim Enzymverfahren erzeugen diese Reaktionen DNA-Fragmente, die entweder auf Adenosin (A), Cytosin (C), Guanosin (G) oder Thymidin (T) enden. Beim chemischen Verfahren werden üblicherweise Fragmente erzeugt, die auf G, G+A, C+T oder C enden. In beiden Fällen werden die vier Sätze von Reaktionsprodukten in benachbarten Spuren aus einem hochauflösenden Polyacrylamidgel elektrophoresiert. Ein autoradiographisches Bild des Gels wird erzeugt, und das Autoradiogramm wird untersucht, um die relativen Längen der bei jeder der vier Reaktionen erzeugten DNA-Fragmente zu bestimmen. Die DNA-Sequenz wird direkt aus dieser Information gefolgert.
• Beide Techniken sind sehr effektiv, aber auch sehr arbeitsintensiv, relativ teuer und umfassen die Verwendung von Radioisotopen; Werte von ca. 3.000 bis 10.000 sequenzierter Basen pro Person und Jahr mit Kosten von einem bis fünf Dollar pro Base sind repräsentativ. Aus diesen Gründen, und da noch viel DNA sequenziert werden muß (allein im menschlichen Genom gibt es 3 x 10&sup9; Basen), wurde in letzter Zeit viel unternommen, um ein automatisiertes und nicht-isotopes Verfahren der DNA- Sequenzanalyse zu entwickeln.
• Einer der erfolgreicheren Versuche wurde von Lloyd Smith und Kollegen im Labor von Leroy Hood am California Institute of Technology durchgeführt (s. Bio/Technology, Bd. 3, Mai 1985). Bei diesem Ansatz werden vier fluoreszierende Farbstoffe mit unterschiedlich gefärbten Marken anstelle der radioaktiven Markierungen verwendet. Jede Farbe entspricht einem anderen Nucleosid, so daß bei der elektrophoretischen Co-Separation der Proben, die während der Sequenzbestimmung erzeugte "Leiter" aus DNA-Fragmenten in fluoreszierende mehrfarbige Sprossen getrennt wird, wobei jede Farbe einer der Basen A, G, C oder T entspricht. Da die Länge der Säule von einem Fluoreszenzsensor abgetastet wird, entspricht die Reihenfolge der gefärbten Banden der spezifischen Gensequenz. Die spezifischen von Smith, et al., ausgewählten Fluorophoren waren Fluoresceinisothiocyanat (FITC) mit einer Emissionsspitze bei 520 nm, 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1-diazol (NBD-Chlorid), das bei 550 nm emittiert, Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TMRITC), das bei 580 nm emittiert, sowie Texas Red, das bei 610 nm emittiert. Diese Emissionsspitzen führen dazu, daß die Farbstoffe grün, gelbgrün, orangerot bzw. rot aussehen.
• Das spezifische von Smith, et al., verwendete Verfahren war eine Adaptation des Dideoxy(Enzym)verfahrens von Sanger, das allgemein ein Klonen des Gens von Interesse in dem einzelsträngigen DNA-Phagen M13 umfaßt. Eine der Phasensequenz neben dem geklonten Gen komplementäre Primersequenz wird verwendet, um eine DNA-Synthese zu initiieren, die einen Teil des Gens kopiert. In dem von der Cal Tech-Gruppe erdachten Schema wird ein einzelnes Molekül einer Fluoreszenzmarkierung mit jedem Primer verbunden. Die geklonten Gene und Primer werden dann in vier separate DNA-Synthesereaktionsmischungen gegeben, die jeweils alls vier Nudeoside enthalten. Eine kleine Menge einer Dideoxyform eines Nucleosids, ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP, wird jeder Charge zugegeben. Wenn ein Dideoxytriphosphat zufällig ein konventionelles Nucleosid ersetzt und in den sich entwickelnden DNA-Strang in der Synthesereaktion eingebaut wird, hört die naszie rende DNA-Kopie sofort auf zu wachsen. Folglich enden alle Stränge in der Charge mit ddATP an einer Stelle, wo Adenosin in der Sequenz auftaucht. Stellenspezifische Abbrüche an den C-, G- und T-Positionen treten ebenso in den anderen drei Reaktionschargen auf.
• Um die vier Basen zu unterscheiden, wird in jeder Reaktionsmischung eine andere Fluoreszenzmarkierung verwendet. Um dies zu erreichen, werden alle DNA-Kopien, die auf A enden, mit dem grünem FITC markiert; die auf C enden, werden mit dem gelbgrünen NBD-Chlorid markiert, die auf G enden, werden mit der orangeroten TMRITC- Marke markiert, und Kopien, die auf T enden, werden mit Texas Red markiert.
• EP 0214713 beschreibt einen Apparat, der ein zweidimensionales Charge Coupled Device (CCD) verwendet, um die Strahlung von einem ein- oder zweidimensionalen Punktfeld, das durch eine elektrophoretische Separation von Proben entsteht, zu messen.
• DE 3620235 beschreibt ein elektrophoretisches System zur Bestimmung der Größe radioaktiv markierter biologischer Moleküle. Das System weist eine Zelle auf, die zur elektrophoretischen Separation mit einer Spannungsquelle verbunden ist; einen Detektor zur Erfassung der Strahlung von den elektrophoretischen Spuren und zur Erzeugung eines elektrischen Ausgangssignals; an den Detektor gekoppelte Impulsverarbeitungsmittel zur Bestimmung der Impulsgeschwindigkeit jeder Spur; sowie einen Rechner, um die Impulsgeschwindigkeit als Funktion der Zeit von diesen Spuren mit einer im Rechnerspeicher gespeicherten zeitlichen Funktion in Beziehung zu setzen, um das Ergebnis mit vorbestimmten Werten zu vergleichen.
• In dem automatisierten System von Cal Tech werden ahquote Teile von allen vier Reaktionsmischungen durch ein einziges Polyacrylamidgel, das die verschieden langen Fragmente nach Größe sortiert, elektrophoresiert.
• Am Boden des Elektrophoresegels befindet sich ein Argonionenlaser, der nacheinander jedes Band beleuchtet, während es durch das Gel migriert. Wenn sie durch Laserlicht angeregt werden, emittieren die Fluorophoren bei ihrer charakteristischen Wellenlänge, und die Emis sionen werden von einem Sensor erfaßt und identifiziert. Die Sequenz der Emissionsfarben wird vom Gerät in eine Nucleotidsequenz umgekehrt.
• Obwohl die Cal Tech-Gruppe in der Lage war, den Sequenzbestimmungsvorgang zu automatisieren, indem sie die vorher erforderlichen vier Spuren auf eine Spur reduzierten, und Probleme mit Mobilitätsdifferenzen zwischen Basen im wesentlichen ausgeschaltet haben, müssen wichtige Probleme immer noch gelöst werden. Erstens ist die Empfindlichkeit der Detektionssystemausgestaltung nicht optimal. Zweitens, was noch wichtiger ist, kann der Apparat nur jeweils eine Säule gleichzeitig bearbeiten, während bei der Verwendung von Autoradiogrammen viele Spuren auf einem Plattengel gleichzeitig sequenziert werden können.
• Benötigt wird ein Fluoreszenzerfassungsapparat mit hohem Durchsatz und Echtzeit, der Nucleinsäuresequenzbestimmung auf vielen Spuren eines Gels gleichzeitig durchführen kann. Außerdem sollte der Apparat eine hohe Empfindlichkeit besitzen, das Erfassungssystem sollte jedoch keine häufige Überwachung durch geschultes Personal erfordern.
• Es wird ein automatisierter Echtzeitapparat zur Nucleinsäuresequenzbestimmung, der hohe Geschwindigkeit und definitive Sequenzbestimmung auf vielen Proben gleichzeitig bietet, vorgesehen. Der Apparat ermöglicht die gleichzeitige Sequenzbestimmung von mehr als einem Klon, wodurch die für die Sequenzbestimmung längerer Fragmente erforderliche Zeit stark verkürzt wird und die Sequenzbestimmungskosten entsprechend gesenkt werden. Außerdem ist das Erfassungssystem im Kern des Apparats so ausgelegt, daß keine teuren Ausrichtungsvorgänge erforderlich sind und die ständige Überwachung durch geschultes Fachpersonal nicht mehr erforderlich ist.
• Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung einen Apparat zur Erfassung elektromagnetischer Strahlung von einer Mehrzahl elektrophoretischer Spuren vor, die im wesentlichen parallel sind und in einem im wesentlichen planaren Feld angeordnet sind, wie in Anspruch 1 definiert.
• Außerdem umfaßt das Verfahren der Erfassung elektromagnetischer Strahlung von einer Mehrzahl von elektrophoretischen Spuren eines Elektrophoreseapparats die in Anspruch 5 definierten Schritte.
• Im weitesten Sinne und in Übereinstimmung mit bevorzugten Ausführungen der Erfindung wird ein Apparat zur Erfassung elektromagnetischer Strahlung von einer Mehrzahl von Spuren in einem Elektrophoresesystem vorgesehen, worin die Mehrzahl von Spuren in einem planaren Feld angeordnet ist. Das Gerät umfaßt ein optisches System zur Erfassung der Strahlung bei einer Mehrzahl von Wellenlängen, die von der Mehrzahl von Spuren ausgeht. Um diese Funktion auszuführen, besteht das optische System aus einem Sammelelement zum Fokussieren der Strahlung, einem Filter zur selektiven übertragung der Mehrzahl von Wellenlängen, die vom Sammelelement empfangen werden, sowie einem Erfassungssystem zum Messen der Intensität der vom Filtermittel empfangenen Strahlung. Der Apparat hat auch einen umsetzbaren Ständer, auf dem das optische System aufgestellt werden kann und auf dem das optische System in einer Richtung parallel zum planaren Feld elektrophoretischer Spuren bewegt werden kann, um das Sammelelement so zu bewegen, daß es Strahlung von jeweils einer Spur empfängt. Das Gerät umfaßt auch ein Rechnersystem zur Steuerung des Filters und des Ständers. Das Rechnersystem empfängt auch Intensitätsdaten vom Detektor und setzt die Intensitätsdaten mit der ensprechenden Spur und der entsprechenden Wellenlänge, die vom Filter in Echtzeit übertragen wird, in Beziehung.
• Um das Gerät für die Sequenzbestimmung von Nucleinsäuren zu verwenden, werden die Nucleinsäuren entsprechend dem Enzymverfahren vorbereitet und wie bei Smith, et al., markiert. Die Nucleinsäuren werden dann im Apparat elektrophoresiert, und der Rechner wird verwendet, um die Intensitätsdaten nach Zeit- und Wellenlängeninformationen für jede Spur zu sortieren, wobei eine Sequenz für jede Spur herauskommt.
• Fig. 1 stellt einen erfindungsgemäßen Elektrophoreseapparat und Einsatz dar.
• Fig. 2A zeigt eine schematische Darstellung der Erfindung in einem horizontalen Schnitt durch das optische System.
• Fig. 2B ist eine schematische Darstellung der Erfindung in einem vertikalen Schnitt durch das optische System.
• Fig. 3A und 3B veranschaulichen die Herstellung von Vertiefungen im Elektrophoreseapparat.
• Fig. 4A stellt ein erfindungsgemäßes Einstellfernrohr dar.
• Fig. 4B und 4C zeigen Details von im Einstellfernrohr verwendeten Linsen.
• Fig. 5A stellt erfindungsgemäß eine Sammellinse und Fabry-Linsengruppe dar.
• Fig. 5B, 5C und 5D zeigen Details der in Fig. 5A dargestellten Linsen.
• Fig. 6 ist eine Tabelle, die detaillierte Abmessungen für die Linsen und das optische System zeigt.
• Fig. 7A-7D stellen die mechanische Konfiguration des optischen Systems in vier Ansichten dar.
• Fig. 7E ist eine Tabelle der Abmessungen für die in Fig. 7A-7D gezeigte mechanische Konfiguration.
• Fig. 8 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Rechnersystems.
• Fig. 9 ist ein Flußdiagramm, das die Rechnerlogik veranschaulicht, um aus den Elektrophorese- und Zeitdaten eine Nucleinsäuresequenz zu erhalten.
• Fig. 10A-10D sind graphische Darstellungen von mit dem erfindungsgemäßen Apparat für jede von vier Wellenlängen aufgenommenen Intensitätsdaten.
• Fig. 11 ist eine überlagerung der graphischen Darstellungen aus Fig. 10A-10D.
• In Fig. 1, 2A und 2B ist eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführung der Erfindung gezeigt, die aus einem Elektrophoreseapparat 100 mit einem Polyacrylamidplattengel 104, einem Laser 300 als Quelle intensiver elektromagnetischer Strahlung sowie einem optischen Erfassungssystem 200 besteht, welches das Laserlicht auf das Plattengel richtet und die Fluoreszenz von an den im Gel elektrophoresierten Materialien befestigten Farbstoffen erfaßt. Während des Betriebs sind der Elektrophoreseapparat 100, der Laser 300 und das optische Erfassungssystem in einer lichtundurchlässigen Umgebung, z.B. einem Kasten (nicht abgebildet), eingeschlossen.
• Der Elektrophoreseapparat 100 hat eine transparente Frontverkleidung 106 und eine transparente Rückverkleidung 105, zwischen denen sich Gel 104 befindet. Ebenfalls enthalten ist eine untere Pufferkammer 101 und eine obere Pufferkammer 109, die so ausgelegt sind, daß sie einen Kontakt zwischen dem Gel 104 und den in den beiden Kammern enthaltenen Pufferlösungen herstellen. Die Pufferkammern und die Platten 105 und 106 werden durch einen Rahmen 107 mit Bügeln 113 und 115 in einer festen Beziehung zueinander festgehalten. Der Elektrophoreseapparat umfaßt auch einen Strahlenauffänger 111, um zu verhindern, daß das direkte Licht vom Laser 300 einen Pfad über den Elektrophoreseapparat hinaus durchläuft. Zusätzlich umfaßt jede Pufferkammer einen Bananenstecker (112 und 114), um eine Spannungsquelle durch das Gel anzuschließen (üblicherweise 1.000-1.500 V). In einer bevorzugten Ausführung besteht das Gel 104 aus 8 Gew.-% Acrylamidmonomer und wird nach bekannten Techniken hergestellt (s. Maniatis, et al., Molecular Cloning, S. 478). Um zu sequenzierende Proben in den Elektrophoreseapparat einzuführen, wird eine Reihe von Vertiefungen wie 91 bis 97 oben auf dem Gel erzeugt, wie in Fig. 3A und 3B schematisch dargestellt. Zuerst werden Abstandshalter 98 und 99 auf der Platte 106 angeordnet, um die gewünschte Dicke des Gels 104 zu definieren, und die Platte 105 wird an der Platte 106 befestigt, wodurch zwischen ihnen ein Hohlraum erzeugt wird. Übliche Materialien für die Abstandshalter 98 und 99 sind Streifen aus Nylon oder Delrin . Das Gel wird dann in den Hohlraum gegossen, der Kamm wird daraufgesetzt und das Gel härtet aus. Der Kamm 102 wird dann abgenommen, wobei die Reihe von Vertiefungen auf dem Gel verbleibt. Proben können dann direkt in die Vertiefungen eingespritzt werden. Da die Proben durch die Wände der Vertiefungen ausreichend getrennt werden und da der Diffusionskoeffizient im Gel sehr niedrig ist, erscheinen während der Elektrophorese genau definierte Spuren wie die Spuren 110 und 108 in Fig. 2A, eine Spur für jede Vertiefung. Obwohl nur sieben Spuren gezeigt sind, werden im bevorzugten Modus üblicherweise 16 für ein 25 cm breites Gel verwendet. Die Tiefe und Breite der Vertiefungen liegen üblicherweise beide im Bereich von 0,5 cm bis 1 cm, und die Abstandshalter 98 und 99 sind üblicherweise ca. 1 cm breit. Die Geldicke liegt üblicherweise im Bereich von 0,5 mm bis 1,0 mm, und die bevorzugte Höhe des Gels beträgt 40 cm. Die Platten 105 und 106 sind üblicherweise 3,0 mm bis 510 mm dick und bestehen aus einem durchsichtigen, nicht-fluoreszierenden Material, wie Pyrex-Borosilikatglas. Ein besonders geeignetes Material ist ein in der Technik unter dem Markennamen TEMPAX bekanntes Schott-Glas, das eine geringe Fluoreszenz hat, einen Brechungsindex ähnlich wie das Gel (n 1,47) hat und hohe Temperaturen und plötzliche Temperaturveränderungen aushalten kann. (TEMPAX wird von Schott Optical Company hergestellt.) Oben in der Platte 106 befindet sich eine Aussparung 90, damit die Pufferlösung in der Pufferkammer 109 während der Elektrophorese mit dem Gel in Verbindung steht. In einem anderen bevorzugten Modus werden die oberen 2 bis 4 cm des Gels unmittelbar unter dem Kamm mit 5 Gew.-% Acrylamidmonomer begossen, wobei das Gleichgewicht des Geis bei 8% Acrylamidmonomer liegt. Diese Kombination von Konzentrationen scheint die Geschwindigkeit und Menge von Probenmaterialien, die anfangs in das Gel eintreten, zu verbessern. Ein weiterer Ansatz ist das Mischen von Agarose mit dem Acrylamidgel in den oberen 2 bis 4 cm.
• Wie in Fig. 1 veranschaulicht, ist der Elektrophore seapparat so ausgelegt, daß er auf ein Bord 117 eines Gehäuses 370 paßt. Das Bord ist so konf iguriert, daß es in das Gehäuse 370 geschoben werden kann, wodurch es die Platte 106 mit einer Wärmeübertragungsplatte 119 in Kontakt bringt, um die während des Elektrophoresevor gangs erzeugte Wärme auszugleichen und abzuleiten. Ein Schlitz 123 in der Platte 119 läßt Licht durch die Platte 119, um die Fluoreszenz der verschiedenen Farbstoffe hervorzurufen und um die Erfassung dieser Fluoreszenz zu ermöglichen. Das Gehäuse 370 umfaßt eine Bodenplatte 241, die sich über dem Bord 117 befindet, so daß die Pufferkammer 101 daruntergeschoben werden kann. Die strukturelle Einheit des Gehäuses wird durch ein Füllstück 121 vorgesehen, das um den Umfang des Elektrophoreseapparats 100 paßt, wenn er sich auf dem Bord befindet.
• Das optische Erfassungssystem 200 ist an einer Platte 239 befestigt, die auf einem umsetzbaren Ständer 231 läuft, der über eine Führungsschiene 233 an der Bodenplatte 241 befestigt ist. Der Ständer wird durch eine Schraube 252, die von einem Gleichstrornmotor 237 angetrieben wird, horizontal vor- und zurückversetzt, und die Position des Ständers wird von einem Wellenencodierer 238 überwacht. Optische Sensoren 242 und 244 (nicht abgebildet) werden verwendet, um das Laufende des Ständers zu überwachen. Es können zwar mehrere unterschiedliche umsetzbare Ständer verwendet werden, ein besonders zweckmäßiger aufgrund seiner Größe und Leichtlaufeigenschaften ist jedoch die Laufbahngruppe, Teile-Nr. RSR 5WUU, erhältlich bei THK, Co. Ltd., Elk Grove Viilage, Illinois.
• Wie oben angegeben, ist die Quelle elektromagnetischer Strahlung zur Herbeiführung von Fluoreszenz der Laser 300. In der bevorzugten Ausführung wird ein Argonionenlaser verwendet, der in einem Modus betrieben wird, der zwei Leitungen vorsieht, eine bei 488,0 nm und eine bei 514,5 nm, wobei beide Leitungen ungefähr dieselbe Stär ke haben, ca. 7 mW für jede Leitung, und eine Gesamtstärke von 20 mW. Anders als das optische Erfassungssystern 200 wird der Laser 300 fixiert. Vom Laser abgegebenes Licht 250 trifft zuerst auf einen Spiegel 253 im Winkel von 450, dann auf einen Spiegel 251 im Winkel von 450, so daß es wieder parallel zur Umsetzrichtung des optischen Erfassungssystem wird. Dadurch beeinflußt die Bewegung des optischen Erfassungssysterns nicht den Einfaliwinkel des Lichts auf das optische Erfassungssystem.
• Das optische Erfassungssystem 200 besteht aus einem Einstellfernrohr 260 mit Linsen 257 und 259, um die Größe des einfallenden Strahls zu verkleinern und das Licht auf die Geispuren zu fokussieren. Der Pfad des Lichts vom Einstellfernrohr wird durch einen Polarisationswinkeispiegel 255 durch ein Fenster 125 zum Gel abgelenkt, wobei das Fenster und der Spiegel relativ zum Ständer 231 fixiert sind. Der Einfaliwinkel am Spiegel 255 wurde als der Polarisationswinkel gewählt, um die Streuung von polarisiertem Laserlicht, das mit der Fluoreszenzerfassung interferiert, zu minirnieren. Auf die einzelnen Spuren wird zugegriffen, indem der Ständer entlang der Führungsschiene 233 vor- und zurückbewegt wird. Wenn Licht vom Laser 300 auf einen Farbstoff in einer Spur trifft, fluoresziert der Farbstoff wie für Spur 108 angezeigt. Eine Sammellinse 221 sammelt einen Teil des fluoreszierenden Lichts und richtet es auf ein Filterrad 223, das aus vier Farbfiltern besteht, die als Quadranten des Rads angeordnet sind. Während sich das Filterrad dreht, übertragen die Durchlässigkeitsbereiche der Filter selektiv bestimmte Wellenlängen des fluoreszierenden Lichts, jeweils eine, auf eine Fabry-Linsengruppe 226, die aus den Linsen 225 und 227 besteht.
• Die Fabry-Gruppe befindet sich im Brennpunkt der Sarnmellinse 221 und ist so konfiguriert, daß sie die Sammellinse auf dem aktiven Bereich einer mit der Breitseite dem Betrachter zugekehrten Fotozelle 229, wie einer R928 von Hamamatsu, abbildet anstatt die Spuren selbst abzubilden. Allgemein variiert das Ausgangssignal der Photokathode mit dem Ort des Lichtsignals auf dem aktiven Bereich. Durch das Abbilden der Sammellinse anstelle der Spuren ist der Ort des Lichts auf der Fotozelle sogar dann stabil, wenn der Ort der Beleuchtung auf dem Gel verändert wird. Daher sind keine unechten Variationen im Ausgangssignal der Fotozelle zu sehen, wenn der Beleuchtungsort auf dem Gel aus irgendeinem Grund, z.B. ungenauer Ausrichtung, verändert werden sollte. Ein anderer Grund für die Verwendung eines Linsenpaars für die Fabry-Gruppe ist es, das System für Abbildungsfehlerkomponenten, die durch Ausrichtungsfehler entstehen, noch unempfindlicher zu machen. Um die Sammellinse in einem angemessenen Abstand auf die Fotozelle zu fokussieren, muß die Fabry-Gruppe relativ stark sein. Die Verwendung einer einzigen Linse, um große Stärkeergebnisse bei der Feldkrümmung und geometrischen Verzerrung zu erzielen, kann dazu führen, wenn keine Korrektur erfolgt, daß das Bild auf der aktiven Oberfläche aus dem Brennpunkt hinaus- und hineingeht, wenn der Beleuchtungsbereich während eines Messungsdurchlaufs seitlich variiert, z.B. wenn er nicht richtig ausgerichtet ist oder wenn die Gelplatte Unebenheiten aufweist. Daher wird eine Doppellinsengruppe verwendet, wobei die Fabry-Linse 227 nicht sphärisch ist, so daß Feldkrümmung und geometrische Verzerrung zusammen ausgeschaltet werden. Daher ist das Bild auf der Fotozelle selbst bei falscher Ausrichtung oder Unebenheiten sehr stabil und verändert seine Größe nicht.
• Die jeweils im System verwendeten Farbf ilter variieren mit der Auswahl der Farbstoffe. Im bevorzugten Modus wird jeder Farbstoff aus einem separaten von vier Farbstoffsätzen ausgewählt. Für diese Farbstoffe haben die ausgewählten Filter nominale Mitteiwellenlängen von 540 nm, 560 nm, 580 nm und 610 nm, alle mit einem Durchlässigkeitsbereich von 10 nrn (wie am 50%igen Übertragungspunkt gemessen). Solche Filter sind beispielsweise bei OMEGA Optical, Battlesborough, VT, erhältlich.
• Die vier Farbstoffsätze sind folgende: Satz 1 besteht aus Fluorescein, monoderivatisiert mit einer Verbindungsfunktionalität auf der 5. oder 6. Kohlenstoffposition (gemäß Color Index-Numerierungssystem). Veranschaulichende Besipiele für Elemente aus Satz I sind Fluorescein-5-isothiocyanat, Fluorescein-6-isothiocyanat (wobei die -5- und -6-Formen gemeinsam als FITC bezeichnet werden), Fluorescein-5-succinimidylcarboxylat, Fluorescein-6-succinimidylcarboxylat, Fluorescein- 5-iodacetamid, Fluorescein-6-iodacetamid, Fluorescein- 5-maleimid sowie Fluorescein-6-maleimid. Diese Beispiele für Elemente aus Satz 1 sind im Handel erhältlich, z.B. bei Molecular Probes, Inc. (Junction City, OR), oder können nach Standardtechniken synthetisiert werden.
• Satz II besteht aus 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlorofluorescein, monoderivatisiert mit einer Verbindungsfunktionalität an der 5. oder 6. Kohlenstoffposition (wobei die Kohlenstoffe nach dem Color Index Numerierungssystem identifiziert werden). Elemente aus Satz II können durch Standardmodifikationen von 2,7-Dimethoxy-4,5-dichloro-9-(2',4'-dicarboxyphenyl)-6- hydroxy-3H-xanthen-3-on und 2,7-Dimethoxy-4,5-dichloro-9-(2',5'-dicarboxyphenyl)-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on (IUPAC-Bezeichnung) erhalten werden, wie im US-Patent 4,318,846 beschrieben. Beispielsweise können die 4r und 5'-Carboxylgruppen dieser Verbindungen mit Nr hydroxysuccinimid unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid kondensiert werden, um eine aminselektive Verbindungsfunktionalität zu bilden, z.B. wie durch die Beispiele 6 und 8 des oben zitierten Patents (Sp. 28-29) veranschaulicht. Kasai et al., Anal. Chem. Bd. 47, S. 34-37 (1975), beschreibt die Basistechniken für solche Kondensationen. Beispiele für Elemente von Farbstoffen aus Satz II sind 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlorofluorescein-5-succinimidylcarboxylat und 2' ,7'- Dimethoxy-4',5'-dichlorofluorescein-6-succinirndiylcarboxylat (wobei die -5- und -6-Formen gemeinsam als DDFCS bezeichnet werden).
• Satz III besteht aus Tetramethylrhodamin, monoderivatisiert mit einer Verbindungsfunktionalität an der 5. oder 6. Kohlenstoffposition. Veranschaulichende Beispiele für Elemente aus Satz III umfassen Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat, Tetramethylrhodamin-6- isothiocyanat (wobei die -5- und -6-Formen gemeinsam als TMRITC bezeichnet werden), Tetramethylrhodamin-5- iodacetamid, Tetramethylrhodamin-6-iodacetamid, Tetramethylrhodamin-5-succinimidylcarboxylat, Tetramethylrhodamin-6-succinimidylcarboxylat, Tetramethylrhodamin- 5-maleimid sowie Tetramethylrhodamin-6-maleimid. Diese exemplarischen Farbstoffe sind im Handel erhältlich, z.B. bei Molecular Probes, Inc., oder können nach Standardtechniken synthetisiert werden.
• Satz IV besteht aus Rhodamin-X-Derivaten, bei denen ein disubstituiertes Phenyl am Sauerstoffheterozyklus des Moleküls befestigt ist, wobei einer der Substituenten eine am 4'- oder 5'-Kohlenstoff (IUPAC-Numerierung) des Phenyls befestigte Verbindungsfunktionalität ist, und der andere eine am 2'-Kohlenstoff befestigte saure anionische Gruppe ist. Veranschaulichende Beispiele für Elemente aus Satz IV sind Texas Red (Handelsname von Molecular Probes, Inc.), Rhodamin X-5-Isothiocyanat, Rhodamin x-6-Isothiocyanat, Rhodamin X-5-Iodacetamid, Rhodamin X-6-Iodacetamid, Rhodamin x-5-Succinimidylcarboxylat, Rhodarnin X-6-Succinimidylcarboxylat, Rhodamin X-5-Maleimid sowie Rhodamin X-6-Maleimid. Die meisten dieser exemplarischen Farbstoffe sind im Handel erhältlich, z.B. bei Molecular Probes, Inc., oder können nach Standardtechniken synthetisiert werden. Texas Red kann beispielsweise gemäß dem in Titus et al., "Texas Red, a Hydrophilic, Red-Emitting Fluorophore for Use with Fluorescein in Dual Parameter Flow Microfluorometric and Fluorescence Microscopic Studies," J. Immunological. Methods, Bd. 50, S. 193-204 (1982), beschriebenen Verfahren synthetisiert werden.
• Die Details der optischen Baugruppen, aus denen das optische Erfassungssystem besteht, sind in Fig. 4A bis 4C und Fig. 5A bis 5C angegeben, welche die Positionen der verschiedenen Linsenelemente zueinander und die Spezifikationen für die Linsen zeigen. Die Linsenabmessungen sind in einer Tabelle in Fig. 6 angegeben.
• In Fig. 7A bis 7D sind die mechanischen Details des optischen Erfassungssystems 200 gezeigt. Ein Gehäuse 701 hält das Einstellfernrohr 260 und den Polarisationswinkelspiegel 255 fest und enthält die Sammellinse 221 und den Schlitz 125. Licht aus der Sammellinse wird durch ein Rohr 703 auf das Filterrad 223 gerichtet, das sich in einem Radgehäuse 705 befindet. Die Fabry-Gruppe 226 befindet sich in einem Gehäuse 707 neben der Fotozelle 229. Eine Stromquelle 709 für die Fotozelle befindet sich an einem Ende der Zelle, und eine Platine 711 sorgt für die elektronischen Steuerungen für die Fotozelle und das Filterrad. Ein Schrittmotor 713 wird verwendet, um das Filterrad über einen Antriebsriemen 716, der über die Riemenscheiben 715 und 717 mitgenommen wird, anzutreiben, wobei die Riemenscheibe 715 verwendet wird, um die Welle 714 anzutreiben, die mit dem Filterrad verbunden ist. Ein Schaltrad 719 wird verwen det, um die Filterradposition über einen optischen Codierer 721 zu codieren. Fig. 7E zeigt eine Tabelle, welche die relevanten mechanischen Abmessungen des optischen Erfassungssystems 200 angibt.
• In Fig. 8 ist eine schematische Darstellung eines Rechnersystems 400 zur Steuerung des Betriebs des optischen Erfassungssysterns und zur Durchführung der erforderlichen Datenanalyse gezeigt. Das System 400 umfaßt einen Zentralrechner 801, wie einen IBM PC, der mit einem Prozeßrechner 802, wie dem Microcornputer auf Z80-Basis, verwendet von Applied Biosysterns, Foster City, CA, in ihrem 381 DNA Synthesizer, verbunden ist. Der Prozeßrechner 802 ist zur Kommunikation mit den Elementen des optischen Systems, die eine Überwachung oder Steuerung erfordern, mit einer Schnittstelle 803 verbunden. Diese Elemente umfassen den Schrittmotor 713, den Codierer 721 für das Filterrad, den Ausgang der Fotozelle 229, den Antriebsmotor 237 für den Ständer 231, den Wellencodierer 238 sowie die Begrenzungsschalter 242 und 244 für den Ständer 231. Die Analyse von während des Sequenziervorgangs erhaltenen Intensitätsdaten wird vom Zentralrechner 801 durchgeführt.
• Zuerst werden zu sequenzierende Proben gemäß dem oben unter Hintergrund der Erfindung beschriebenen Enzymverfahren von Sanger vorbereitet. Die Pufferkammern werden mit einem geeigneten Puffer gefüllt, und der Elektrophoreseapparat wird auf das verschiebliche Bord 117 gestellt. Das Gel wird dann ca. eine halbe Stunde vorelektrophoresiert, um fluoreszierende Verunreinigungen zu entfernen. Die Proben werden dann in die Vertiefungen oben auf dem Gel eingespritzt, und eine Hochspannung wird zwischen den Pufferkammern angelegt, um den Elektrophoreseprozeß zu starten.
• Um den Erfassungsteil des Vorgangs zu starten, wird der Laser eingeschaltet, und der Rechner 801 stellt das Filterrad auf einen ersten Filter ein und veranlaßt den Ständer 231, das optische Erfassungssystern entlang der 16 vertikalen Spuren des Gels 104 zu bewegen. Jede Spur entspricht einer separaten Sequenzbestimmung mit allen vier Farbstoffen, genauso wie die von Lloyd Srnith, et al., verwendete einzelne Säule. Der Ständer wird in ca. 1 Sekunde über das Gel geführt, und 192 Lichtintensitätsmessungen werden während der Abtastung durchgeführt. Jede Messung der Lichtintensität ist ein Durchschnitt, der über einen Abstand von ca. 0,8 mm und über eine Zeit von 0,005 Sekunden vorgenommen wird; diese Messungen werden im folgenden als Kanäle bezeichnet. Am Ende der ersten Abtastung veranlaßt der Rechner einen zweiten Filter, in Position (ca. 0,5 Sekunden) im Pfad des erfaßten Lichts gedreht zu werden. Die Richtung des Ständers 231 wird dann umgekehrt und das optische Erfassungssystem 200 fährt mit der Erfassung in dieser Urnkehrabtastung fort, wobei es erneut 192 Kanäle mißt. Dieser Vorgang wird dann für den dritten und vierten Filter wiederholt.
• In der bevorzugten Ausführung ist jede Spur im Gel ca. 4 mm breit, wobei jede Spur ca. 4 mm voneinander entfernt ist, wie durch die Ausgestaltung des Kamms bei der Vorbereitung des Gels bestimmt wird. Durch diese Ausgestaltung umfaßt jede Spur 5 Kanäle. Um das Verhältnis von Signal zu Störung zu erhöhen, werden mit den Kanälen, die einer bestimmten Spur entsprechen, assozuerte Intensitätsdaten addiert. Die vier Durchlässe hinter einer bestimmten Spur liefern dann vier Farbdaten für diese Spur zu dieser Zeit. Pro Zeitraum von 6 Sekunden (4 Filter x (1 sedabtastung + 0,5 sec/Filteränderung) wird ein Vierfarben-Bezugspunkt für jede Spur aufgezeichnet. Diese Vierfarbdaten können dann durch eine Mehrkomponentenanalyse analysiert werden, um die gewünschte Sequenzinformation wie weiter unten beschrieben zu liefern. Ein Flußdiagramm, das obiges Verfahren veranschaulicht, ist in Fig. 9 gezeigt.
• Verglichen mit der Geschwindigkeit, mit der sich die Proben-DNA auf einer Spur entlangbewegt, ist die Zeit von sechs Sekunden, die erforderlich ist, um die Vierfarbdaten zu erhalten, fast Null. Tatsächlich wird ein Ernissionsspektrurn mit vier Wellenlängen für jede Zeiteinheit während der Elektrophorese in einem festen Abstand unterhalb des Geis gemessen. Durch Mehrkornponentenanalyse ergeben die Daten für diese vier Wellenlängen Informationen über die vier relativen Konzentratio nen der farbstoffrnarkierten DNA-Stücke, die sich auf einer Spur entlangbewegen. Spitzenkonzentrationen einer bestimmten Farbstoffmarkierung entsprechen dann einer bestimmten Base in der DNA-Sequenz. Die vier graphischen Darstellungen der Konzentration über die Zeit werden überlagert und die Spitzen bestimmt, wobei die übereinstimmung der Spitzen mit den DNA-Basen die Sequenz ergibt.
• Analytisch führt die Mehrkornponentenanalyse zum Lösen von vier Gleichungen mit vier Unbekannten. Die allgemeine Formel für die Analyse lautet:
• wobei Aij die Standardfluoreszenz von Farbstoff j bei Filterwellenlänge i ist, Cj die Konzentration von Farbstoff j, und Fi die von Filter i gemessene Fluoreszenzintensität. Durch Auflösen der obigen Gleichungen ergibt sich ein einzigartiger Satz von Konzentrationen zu jedem Zeitpunkt. Für die vollständig automatisierte Analyse können Standardstörungsunterdrückung und Spitzensuchalgorithmen verwendet werden, um die Sequenz abzurufen, oder eine ausgebildete Person kann überprüfen, ob der Satz von Konzentrationen zu einer Sequenz führt. Für die Zweckmäßigkeit werden während des Vorgangs die vier Konzentrationskornponenten gleichzeitig auf einem Farbmonitor des Rechnersystems 801 graphisch dargestellt, während das Gel bei der Elektrophorese abgetastet wird.
• Die Standard-Fluoreszenzkoeffizienten Cij von jeweils einem Farbstoff werden durch Messen der Fluoreszenz bei jedem Filter bestimmt, wenn eine bekannte Einheitenkon zentration von jedem Farbstoff im Gel vorhanden ist. Für solche Messungen kann man ein einzelnes Band von farbstoffmarkiertem Primer verwenden. Allgemein sind diese Koeffizienten eine Funktion der Laserwellenlänge und -intensität, der Geleigenschaften, des optischen Filters sowie des Ansprechens der Fotozelle.
• Fig. 10 und 11 veranschaulichen des Ergebnis einer mit der Erfindung durchgeführten DNA-Sequenzbestimmung auf den Basen 120 bis 190 des Klonvektors mp8 des Bakteriophagen M13 unter Verwendung von DNA-Polymerase, Klenow- Fragment. Die gezeigten Ergebnisse entsprechen einer der 16 Spuren, wobei die anderen Spuren dieselbe Art von Informationen für die jeweiligen dort sequenzierten Proben liefern. Die spezifischen Farbstoffe, die diesem Durchgang entsprechen, sind Fluorescein-5-isothiocyanat; 2',7'-Dimethoxy-4'-5'-dichlorofluorescein; Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat sowie Texas Red. Fig. 10 zeigt die relativen Intensitäten, die während der Sequenzbestimmung für jede Base aufgezeichnet wurden, als Funktion der Zeit. Fig. 11 zeigt die vier unterschiedlichen Intensitäten graphisch übereinander dargestellt, wodurch die Sequenz leichter abrufbar wird, da die Beziehung zwischen den Spitzen deutlicher wird. Diese Beziehung ist sogar noch deutlicher, wenn ein Farbmonitor mit dem Rechner 801 verwendet wird, so daß die Intensität für jede Base in einer anderen Farbe graphisch dargestellt wird, eine auf der anderen. Wie angegeben, ist der abgerufene Wert in den meisten Fällen eindeutig. Es treten jedoch gewisse niedrige Signaispitzen auf, siehe beispielsweise Basen 174 und 181. In einer unbekannten Probe könnten solche Basen in der Sequenz übersehen werden. Wie jedoch sogar bei der radiographischen Sequenzbestimmung üblich ist, führen Fachleute oft mehr als einen Sequenzbestimmungsdurchgang durch, üblicherweise mit anderen Sequenzbestirnrnungsenzymen, um durch die jeweils ausgewählte Chemie verursachte zweideutige abgerufene Basenwerte auszuschalten. Es ist Fachleuten beispielsweise bekannt, daß die Cytosinse quenz große Variationen in der Amplitude aufweist. Daher führt man üblicherweise auch einen Sequenzbestimmungsdurchgang auf dem komplementären Strang durch, um die Ergebnisse des Cytosinabrufs zu überprüfen. Ein weiterer Ansatz ist die Verwendung eines komplett anderen Enzyms, z.B. Revertase.
• Daher können das erfindungsgemäße automatisierte Verfahren und der Apparat verwendet werden, um definitive Hochgeschwindigkeitssequenzbestimrnungsanalysen von vielen Proben gleichzeitig zu liefern. Dadurch kann mehr als ein Klon gleichzeitig sequenziert werden, wodurch die erforderliche Zeit für die Sequenzbestimmung größerer Fragmente stark verkürzt wird und die Kosten entsprechend gesenkt werden. Zusätzlich ist durch die Ausgestaltung wenig oder gar keine weitere Ausrichtung durch geschultes Personal am Ende des Vorgangs erforderlich, wenn das System einmal aufgebaut ist. Außerdem hat das Echtzeit-Sequenzbestirnmungsverfahren im Vergleich mit dem radiographischen Verfahren viele andere Vorteile. Erstens wird die Sequenzbestirnrnung mit allen vier Basen in einer Spur durchgeführt, anstatt in vier separaten Spuren, wodurch Probleme mit der Mobilitätsvariation zwischen Spuren vermieden werden. Zweitens sind keine radioaktiven Materialien erforderlich, und die verwendeten Materialien sind wesentlich länger lagerungsfähig als radioaktive Materialien. Drittens, da das System ein Echtzeitsystem ist, kann der Durchgang in der Mitte angehalten und wiederholt werden, anstatt warten zu müssen, daß die gesamte radiographische Sequenzbestirnmung abgeschlossen ist, nur um festzustellen, daß der Durchgang fehlerhaft war.
• Verschiedene Modifikationen des obigen Apparats und Verfahrens können durchgeführt werden. Beispielsweise könnte man statt eines Plattengels eine Reihe unabhängiger Säulen verwenden, die in einem linearen Feld als Elektrophoresespuren angeordnet sind. Auch könnten Gels mit unterschiedlichen prozentualen Anteilen für die gesamte Platte verwendet werden, oder Gels mit unterschiedlichen prozentualen Anteilen könnten in benachbarten Spuren der Platte verwendet werden, um Fragmente von unterschiedlicher Größe zu separieren, ähnlich wie bei den in der Proteinelektrophorese verwendeten Stapelgelen. Außerdem könnten unterschiedliche Ständer und Antriebssysterne, ebenso wie unterschiedliche Quellen elektromagnetischer Strahlung verwendet werden.

Claims (7)

1. Ein Apparat zum Erfassen elektromagnetischer Strahlung aus einer Mehrzahl elektrophoretischer Spuren (108, 110), die parallel und in einem planaren Feld angeordnet sind, wobei der Apparat folgendes aufweist:

ein optisches Mittel (200) zum Erfassen von Strah lung bei einer Mehrzahl von Wellenlängen, die von der Mehrzahl von Spuren ausgehen, wobei das optische Mittel folgendes umfaßt:

Sammelmittel (221, 226) zum Sammeln und Fokus sieren der Strahlung aus einem lokalisierten Bereich jeder Spur von jeweils einer Spur,

ein Filtermittel (223) zum Empfangen der Strahlung vom Sammelmittel und zum selektiven übertragen der Mehrzahl von Strahlungswellenlängen, sowie

einen Detektor (229) zum Messen der Intensität von vom Filtermittel empfangener Strahlung und zum Erzeugen eines Ausgangssignals als Reaktion auf die Strahlung;

einen Ständer (231) zum Befestigen des optischen Mittels, das in einer zum planaren Feld elektrophoretischer Spuren parallelen Richtung sowie quer zu den Spuren umgesetzt werden kann, der das Feld in einem festen Abstand entlang jeder Spur abtastet; sowie

ein Rechnermittel (400) zum Steuern des Filtermittels und der Bedienung des Ständers, um bei jedem Abtastvorgang während der Elektrophorese das Umsetzen des Ständers über die Spuren zu ermöglichen, um Intensitätsdaten vom Detektor zu empfangen und um die Intensitätsdaten mit entsprechenden elektrophoretischen Spuren und entsprechenden, vom Filtermittel übertragenen Wellenlängen in Beziehung zu setzen.

2. Ein Apparat nach Anspruch 1, worin das optische Mittel (200) zum Erfassen elektromagnetischer Strahlung im wesentlichen unempfindlich für geringe Fehlausrichtungen der elektrophoretischen Spuren ist, wobei das Sammelmittel folgendes aufweist:

eine Sammellinse (221) zum Sammeln elektromagnetischer Strahlung aus dem Feld elektrophoretischer Spuren; sowie

eine Linse (226) zum Abbilden des Sarnrnelelements auf dem Detektor.

3. Ein Apparat nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin auf weisend

Mittel (251, 253, 255, 260), um Licht aus einer Lichtquelle der Reihe nach auf jede Spur zu lenken.

4. Ein Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Ständer in eine Richtung umgesetzt werden kann, die im wesentlichen senkrecht zu den elektrophoretischen Spuren ist, und worin das Rechnermittel ein Mittel zum Auswählen eines geeigneten Filters zwischen aufeinanderfolgenden Abtastvorgängen umfaßt.

5. Ein Verfahren zum Erfassen von Fluoreszenz aus einer Mehrzahl elektrophoretischer Spuren unter Verwendung des Apparats nach Anspruch 1, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Beleuchten von Molekülen während der elektrophore tischen Separation mit elektromagnetischer Strahlung, wobei die Moleküle mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind;

Sammeln der Fluoreszenzausgabe der elektrophoreti schen Spuren durch wiederholtes Bewegen des optischen Mittels des Apparats nach Anspruch 1 über die elektrophoretischen Spuren während der elektrophoretischen Separation;

Fokussieren des fluoreszierenden Lichts auf den Detektor, so daß ein Intensitätsprofil entsteht, während das optische Mittel über die elektrophoretischen Spuren bewegt wird; sowie

Sortieren des Intensitätsprofils nach Zeit, um eine nach Zeit geordnete Sequenz von Farbstoffen, die jede elektrophoretische Spur kreuzen, zu identifizieren.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, worin der Ständer mit einer Geschwindigkeit von ca. 160 Millimeter pro Sekunde abtastet, jeder einzelne Datenintensitätswert über ein Intervall von ca. 0,005 Sekunden gesammelt wird, die Wellenlänge von an den Detektor übertragenem Licht zwischen jedem Abtastvorgang innerhalb eines Intervalls von ca. 0,5 Sekunden verändert wird und jeder Abtastvorgang in ca. 1,5 Sekunden abgeschlossen ist.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin die Moleküle DNS-Fragmente sind.