DE4002981C2 - Humane, Epididymis-spezifische Polypeptide und deren Verwendung zur Therapie und Diagnose männlicher Infertilität - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue, humane, Epididymis-spezifische Polypeptide und deren Verwendung als Arzneimittel zur Diagnose und Behandlung der männlichen Infertilität.

Derzeit sind ca. 15% aller Paare in der Bundesrepublik Deutsch­ land ungewollt kinderlos und ihr Anteil nimmt ständig zu. Die Ursachen für die Unfruchtbarkeit liegen zu gleichen Teilen bei Mann und Frau. Während jedoch die Ursachen bei der Frau weit­ gehend diagnostizierbar sind, können beim Mann nur in ca. 30% der Fälle organische Ursachen festgestellt werden. Etwa ein Drittel der verbleibenden 70% lassen sich auf Oligospermie unbekannten Ursprungs zurückführen, während bei den restlichen Fällen nach dem bisherigen Wissensstand keine organisch-biochemisch manifes­ tierbaren Ursachen vorliegen.

Bei der Reifung der Spermien nimmt der Epididymis (Nebenhoden) eine Schlüsselrolle ein. Er besteht beim Menschen aus einem einzigen 5 m langen Kanal, der sehr stark mäanderartig auf­ gewunden ist. Die im Hoden gebildeten, noch unreifen Spermien werden zum Epididymis transportiert und während einer 2 bis 3 Tage dauernden Passage einem Reifungsprozeß unterzogen, im Verlaufe dessen sie u. a. ihre Beweglichkeit erlangen.

Es ist demgemäß davon auszugehen, daß männliche Unfruchtbarkeit in zahlreichen Fällen auf Störungen der im Epididymis ablaufenden Reifungsprozesse beruht.

Obwohl die anatomische Feinstruktur des humanen Epididymis makroskopisch, mikroskopisch und elektronenmikroskopisch sehr gut beschrieben ist (vgl. A.F. Holstein: Morphologische Studien am Nebenhoden des Menschen, zwanglose Abhandlungen aus dem Gebiet der normalen und pathologischen Anatomie, 20, 1-91 (1969)), sind dessen Proteinprodukte mit wenigen Ausnahmen (vgl. beispielsweise Tezon et al., Immunochemical localization of secretory antigens in the human epididymis and their association with spermatozon, Biology of Reproduktion, 32, 591-597 (1985)) nur wenig erforscht. Fast alle Kenntnisse über dieses Organ stammen aus Arbeiten an Ratten, Mäusen, Hamstern, Ebern, Bullen oder gelegentlich Affen, wobei die Tier-spezifischen Unterschiede bekanntermaßen groß sind.

Die an verschiedenen Tierarten gewonnenen Ergebnisse zur Spermienreifung beim Durchtritt durch den Epididymis lassen sich wie folgt zusammenfassen (vgl. T.G. Cooper: The Epididymis, Sperm Maturation and Fertilisation, Springer Verlag, Berlin, (1986)):

• (a) Begeißelung und Hyperaktivierung der Spermien.
• (b) Kapazitation, d. h. die Bereitschaft die Akrosomenreaktion durchzuführen, wobei durch Dekapazitationsfaktoren, bei denen es sich vermutlich um epididymale Polypeptide handelt, eine regelnde Rolle spielen.
• (c) Veränderung der Oberflächenantigene der Spermien, um die Bindung zwischen Spermien und Eizelle zu begünstigen.
• (d) Veränderung der Spermienmembran, um die Fusion mit dem Ei zu ermöglichen.

Das diese Prozesse auslösende Stoffwechselgeschehen im Epididymis ist selbst bei den untersuchten Tieren weitgehend ungeklärt. Es konnte jedoch anhand von Gelelektrophoresen gezeigt werden, daß im Epididymis einige Polypeptide zu der aus der Rete Testis stammenden Seminalflüssigkeit hinzukommen. Unter diesen sind bei der Ratte die Polypeptide (a) bis (e) von Cooper (a.a.O., Tabelle 20), in denen das sogenannte "acidic epididymal glycopro­ tein (AEG)" (Lea et al., (1978)) bzw. die Polypeptide B bis E von Brooks und Mitarbeiter (D.E. Brooks und J. Higgins, Characteriza­ tion and androgen-dependence of proteins associated with lunimal fluid and spermatozoa in the rat epididymis, Journal of Reproduc­ tion and Fertility, 59, 363-375, (1980)) enthalten sind. Die Ergebnisse dieser Modelle weisen daraufhin, daß die Polypeptide unter Androgeneinfluß stehen.

Die aus Tierversuchen gewonnenen Ergebnisse lassen sich jedoch aufgrund der hohen Gewebe- und Spezies-Spezifität nicht auf den Menschen übertragen. Beispielsweise wurden die bei der Ratte wesentlichen epididymalen Polypeptide oder die sie kodierenden mRNA′s in keinem anderen Gewebe und, abgesehen von der Maus, in keiner anderen Spezies gefunden (D.E. Brooks et al., Europ. J. Biochem., 161, 13-18 (1986); J. Biolog. Chem., 261, 4956-4961, (1986)).

Es konnte aber gezeigt werden, daß beim Menschen nach Vasektomie oder Epididymovasostomie einige Proteine aus dem Ejakulat verschwinden (Wong et al., 1982) und es ist davon auszugehen, daß bisher unbekannte sekretorische Polypeptide des Epididymis auch beim Menschen eine Schlüsselrolle bei der Spermienreifung einnehmen. Störungen des Stoffwechsels dieser Proteine sind mit großer Wahrscheinlichkeit für einen Teil der Fälle männlicher Unfruchtbarkeit verantwortlich.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Mittel zu schaffen, mit deren Hilfe männliche Infertilität - soweit sie auf Störungen des Proteinstoffwechsels im Epididymis beruht - diagnostiziert und gegebenenfalls therapiert werden kann.

Zur Lösung der Aufgabe werden die erfindungsgemäßen Epididymis- spezifischen Polypeptide humanen Ursprungs sowie Fragmente derselben und allelische Varianten mit gleicher Immunogenität vorgeschlagen.

Die Isolierung und Identifikation Epididymis-spezifischer Polypeptide nach konventionellen Verfahren ist wegen der geringen Mengen des zur Verfügung stehenden Gewebes nicht möglich.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr gelungen, spezifische Sekretproteine des menschlichen Nebenhodens nach­ zuweisen, zu charakterisieren und auf der Basis rekombinanter DNA-Technologie herzustellen.

Erfindungsgemäß wurde zunächst eine cDNA-Bibliothek aus epididy­ maler mRNA in Lambda gt11 (Clontech, California) erstellt, sodann wurden die Epididymis-spezifischen Rekombinanten in einer komplexen Folge von differentiellen Hybridisierungsschritten selektiert (vgl. Fig. 1) und anschließend in dem bakteriellen Plasmid pSB (Stratagene, California, USA) subkloniert und charakterisiert.

Das differentielle Screening zielte darauf ab, Klone von mRNA′s zu isolieren, welche in Epididymis-Gewebe nicht aber im Gewebe anderer und funktionsverwandter Organe vorhanden sind oder dort nur in wesentlich reduzierter Kopienzahl auftreten. Bei dem erfindungsgemäß eingesetzten Verfahren diente im ersten Schritt menschliches Hodengewebe als Vergleichsmaterial. Da einige der als Ausgangsmaterial verwendeten Gewebeproben von orchiektomier­ ten Männern stammten, die mit verschiedenen Medikamenten behandelt worden waren, mußte zunächst überprüft werden, ob und in welchem Umfang die Medikamentation Einfluß auf das jeweilige Polypeptidmuster ausübt. Es konnte jedoch an 7 Patienten unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Medikamentation gezeigt werden (vgl. Beispiel 2 und Fig. 2a bis d), daß die Muster durch vorherige Verabreichung von Medikamenten nur unwesentlich beeinflußt werden und daß auch die individuellen Abweichungen gering sind.

Wie in Fig. 1 schematisch dargestellt ist, erfolgte das Screening erfindungsgemäß in einer primären und einer sekundären Stufe, wobei in der primären Stufe durch Kreuzhybridisieren mit Testis-mRNA potentiell Epididymus-spezifische Klone isoliert wurden und diese in der sekundären Stufe durch Kreuzhybridisieren mit mRNA aus Gehirn und Leber weiter selektioniert wurden (vgl. Beispiel 4 und Fig. 3 und 4).

Durch nachfolgende Nothern-Blot-Analyse gegen Gesamt-mRNA aus Hoden und menschlicher Decidua konnte die Zahl der in Betracht kommenden Klone weiter eingeengt werden und diese schließlich vier unabhängigen cDNA-Familien zugeordnet werden (vgl. HE 1 bis HE 4, Beispiel 4 und Fig. 5 und 6).

Die erfindungsgemäß gewonnenen Ergebnisse zeigen, daß die diesen vier Klonen zugrunde liegenden mRNA′s gar nicht oder nur sehr schwach in anderen menschlichen Geweben synthetisiert werden (vgl. Fig. 7); es handelt sich demgemäß um Epididymis-spezi­ fische Moleküle, die zugleich Spezies-spezifisch sind (vgl. Fig. 8).

Nur beim Hund zeigten sich Übereinstimmungen mit HE 1 und HE 4; letzterer ist auch beim Rind vorhanden.

Die Sequenzen der erfindungsgemäßen cDNA-Klone HE 1 bis HE 4 wurden wie in Beispiel 7 angegeben analysiert. Die Ergebnisse sind in den Fig. 9 bis 12 wiedergegeben. Die gefundenen Sequenzen wurden auf Homologie zu den in der NIH-Genbank database gespei­ cherten Gensequenzen untersucht. Dabei zeigte es sich, daß es sich um bisher unbekannte Gene handelt.

Das Vorhandensein gentativer Signalpeptidsequenzen in HE 1, HE 2 und HE 4 zeigt, daß es sich um Gene handelt, welche für Sekret­ polypeptide kodieren.

Die cDNA-Klone HE 1 bis HE 4 können nach herkömmlichen Verfahren Vektoren oder Plasmide in pro- oder eukaryontische Wirtszellen transferiert und dort exprimiert werden. Das gleiche gilt für Fragmente und syngene Sequenzen, soweit sie für Polypeptide mit gleicher Immunogenität kodieren. Bei den so gewonnenen Produkten handelt es sich um Sekretproteine, die wesentlich an der Spermienaktivierung beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen einschließlich ihrer komplementären Sequenzen, ihre Expressionsprodukte sowie auf deren Basis hergestellte Antikörper bieten erstmals die Möglichkeit, Störungen im Protein­ stoffwechsel des Epididymis zu diagnostizieren und gegebenenfalls zu therapieren.

So können beispielsweise die cDNA-Sequenzen oder deren komple­ mentären Sequenzen mit Markern versehen und zur in situ Hybridi­ sierung bei der Gewebediagnostik verwendet werden.

Die auf der Basis der Sequenzen in prokaryontischen oder euka­ ryontischen Wirtszellen exprimierten Polypeptide sowie deren allelische Varianten mit gleicher Immunogenität oder Fragmente können ferner in markierter oder unmarkierter Form als Antigene zur Identifizierung von Autoantikörpern in den Seren infertiler Männer dienen. Diese Möglichkeit ist von besonderer Bedeutung, da vermutet wird, daß die Infertilität in einigen Fällen auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen wesentliche Komponenten des Fortpflanzungssystems zurückzuführen ist. Die bisher zur Verfügung stehenden Testmethoden messen jedoch nur Antikörper, die gegen einige Sperm-Oberflächen-Antigene gerichtet sind, wobei ein ausreichend hoher Titer der Antikörper vorhanden sein muß, um die Sperm-Agglutination erfolgen zu lassen. Es wird jedoch angenommen, daß Antikörper in weitaus niedrigeren Titern vorhanden sein und Infertilität verursachen können. Diese könnten mit den erfindungsgemäß hergestellten reinen Polypeptiden als Antigene erfaßt werden.

Ferner können die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Fragmente derselben mit gleicher biologischer Wirksamkeit für die in vitro Behandlung von Spermien infertiler Männer zum Einsatz kommen.

Schließlich können mit Hilfe der erfindungsgemäßen hochreinen Polypeptide auf bekannte Weise polyklonale und monoklonale Antikörper zur Verwendung in immunologischen Nachweisverfahren hergestellt werden. Derartige Antikörper lassen sich auf der Basis der vollständigen Polypeptide sowie auf der Basis von Fragmenten und allelischen Varianten derselben herstellen, soweit diese die gleiche Immunogenität besitzen.

Die Antikörper können in immunologischen Testverfahren eingesetzt werden, um bei Infertilität das Vorhandensein der relevanten Proteine zu überprüfen.

Sie können ferner zur Isolierung der entsprechenden Polypeptide aus Körperflüssigkeiten beispielsweise mittels Säulenchromatogra­ phie dienen. Die Erfindung umfaßt demgemäß auch derartige aus natürlichen Quellen isolierte Polypeptide.

Schließlich kommen Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide als Impfstoffe zur Infertilisation in Betracht. Aufgrund der Homologie der Klone HE 1 und HE 4 mit dem Hund wird erfindungsgemäß ein wertvolles Mittel zum Sterilisieren von Hunden geschaffen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen im einzelnen erläutert.

Beispiel 1 RNA-Präparation

Gesamt-RNA wurde nach dem Verfahren von J.M. Chirgwin et al., Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease, Biochemistry, 18, 5294, (1979), aus den gefrorenen Geweben menschlicher Hoden (Testis) und Nebenhoden (Epididymis), die Männern mit Prostatakarzinom im Alter von 58 und 74 Jahren durch Orchiektomie entnommen worden waren, unter Einsatz von Guanidin-Isothiocyanat extrahiert und anschließend durch Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation gereinigt. Durch Verwendung einer Oligo(dT)-Cellulosesäule konnte Po­ ly(A) ⁺RNA affinitätschromatographisch angereichert werden, wie von H. Aviv & P. Leder, Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid­ cellulose, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1408-1412, (1972), beschrieben. Die RNA-Proben wurden mit Ethanol gefällt und nach Resuspendieren in sterilem Wasser in einer Konzentration von 1 µg/µl bei -80°C aufbewahrt.

Beispiel 2 In vitro-Translation und Charakterisierung der Produkte durch zweidimensionale Gelelektrophorese

0,5 bis 1 µg der Poly(A) ⁺RNA von Nebenhoden und Hoden aus Beispiel 1 wurden jeweils in einem zellfreien System eines Retikulozyten-Lysats aus Kaninchen (New England Nuclear (NEN), Dreieich, BRD) in vitro-translatiert. Die Synthese wurde in Gegenwart von (³⁵S)-Methionin spezifische Aktivität <1000 Ci/mmol) durchgeführt. Die resultierenden Proteinprodukte wurden anschließend in einem zweidimensionalen Gel elektrophoretisch aufgetrennt (vgl. P.H. O′Farrel, High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J.Biol. Chem., 250, 4007-4021 (1975)). Für die erste Dimension wurde jeweils eine Menge von 350 000 cpm der mit (³⁵S)-Methionin märkierten Translationsan­ sätze auf das Gel aufgetragen und bei einer angelegten Spannung von 10 000 V.h isoelektrisch fokussiert. Der pH-Gradient lag zwischen 4,0 und 7,5. Die Auftrennung der Polypeptide nach ihrem Molekulargewicht wurde in der zweiten Dimension innerhalb eines linearen Gradienten von 7,5-15% Acrylamid durchgeführt (vgl. D.M. Neville & H. Glossmann, Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein subunits by discontinous gel electrophoresis in dodecylsulfate, Meth. Enzym., 32, 92-102, (1974)). Zur Abschätzung der Molekulargewichte wurde in der zweiten Dimension ein mit ¹⁴C-märkierter Protein-Marker (Amer­ sham, GB) aufgetragen. Anschließend wurde das Gel mit Hilfe des autoradiographischen Films Kodak X-AR5 fluorographiert (vgl. W.M. Bonner & R.A. Laskey, A film detection method for Tritium­ labelled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels, Eu­ rop. J. Biochem., 46, 83-88, (1974)). Die Expositionszeit betrug 8 Tage. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 wiedergegeben.

Diese zeigt das Muster der zellfrei synthetisierten Translations­ produkte, die sich von Nebenhoden- bzw. Hoden-spezifischer Poly(A) ⁺RNA ableiten.

Insbesondere zeigt

Fig. 2a Nebenhodengewebe eines 74 Jahre alten, mit Cyproteronacetat behandelten Orchiektomie-Patienten

Fig. 2b Nebenhodengewebe eines 58 Jahre alten, nicht mit Medikamenten behandelten Orchiektomie-Patienten,

Fig. 2c Hodengewebe desselben, nicht mit Medikamenten behandelten Patienten (siehe Fig. 2b).

Nebenhoden-spezifische Translationsprodukte, deren korrespondie­ rende Banden in Fig. 2c (Translationsprodukte von mRNA aus Hoden) nicht auftauchen, sind durch kleine Pfeile gekennzeichnet (siehe Fig. 2b).

Eine Veränderung der Expression im Nebenhodengewebe durch vorherige Behandlung mit Antiandrogenen zeigt ein Vergleich der Fig. 2a und 2b. Banden, die in Fig. 2a gegenüber Fig. 2b re­ duziert sind, wurden durch große Pfeile markiert. Die Molekular­ gewichte des Proteinmarkers sind in Kilodalton angegeben. Actin(A)- und Tubulin(T)-ähnliche Produkte sind jeweils gekenn­ zeichnet.

Beispiel 3 Erstellung der cDNA-Gesamtbibliothek und Auswahl potentiell spezifischer Klone

Die Kultivierung, Handhabung und Erhaltung von Bakterien und Bakteriophagen sowie der Einsatz DNA-rekombinierender Techniken erfolgte nach den Angaben von T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982).

• a) Für die Erstellung der cDNA-Bibliothek wurde Poly(A) ⁺RNA aus dem Nebenhoden-Gewebe eines nicht medikamentös behandelten Patienten eingesetzt (bezüglich Muster der in vitro-Transla­ tionsprodukte, vgl. Fig. 2b). 20 µg von Poly(A) ⁺RNA gemäß Beispiel 1 wurden unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer revers transkribiert (vgl. U. Gubler & B.J. Hoffmann, A simple and very efficient method for generating cDNA libraries, Gene, 15, 263-269, (1983)).
  Die doppelsträngigen cDNA-Konstrukte wurden auf beiden Seiten mit EcoRI-Linkern ligiert und anschließend in die EcoRI Klonierungsstelle des Bakteriophagen Lambda gt11 (Clontech California) eingeführt.
  Bakterien des E. coli-Stammes Y 1090 wurden bis zur log­ arhythmischen Phase angezogen, in Weich-Agarose überführt und zusammen mit der nicht amplifizierten Lambda-Bibliothek in einer Phagendichte von 500 bis 1000 pfu pro Petrischale (15 cm) ausplattiert und 8 Stunden lang bei 42°C inkubiert.
  Für das differentielle Screening wurden die Plaques einer jeden Schale nachfolgend auf zwei Nitrocellulose-Filter (Schleicher & Schüll, Darmstadt, BRD, BA85) Replika-plat­ tiert, wobei die Inkubationszeit für das erste Filter 1 Minute, für das zweite Filter 2 Minuten betrug.
  In dieser Weise wurden Replika-Filter von insgesamt 20 Pet­ rischalen hergestellt und anschließend mit jeweils zwei einzelsträngigen, radioaktiv markierten cDNA-Sonden (vgl. b) unten) (positiv/negativ) hybridisiert.
• b) Die Sonden aus Poly(A) ⁺RNA von Nebenhoden (liefert positive Sonde) und aus Poly(A) ⁺RNA von Hoden (liefert negative Sonde) wurden unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer wie folgt hergestellt:
  Beide RNA-Spezies entstammten den entsprechenden Geweben eines Patienten, der keiner medikamentösen Vorbehandlung ausgesetzt worden war. Jeweils 1 µg der Poly(A) ⁺RNA gemäß Beispiel 1 wurde 5 Minuten lang bei 65°C in einem Volumen von 2 µl denaturiert. Nach schnellem Abkühlen der Ansätze auf Eis wurden jeweils folgende Bestandteile nacheinander zugegeben:
  • - 2 µl Oligo(dT) (100 µg/ml)
  • - 1 µl dNTP-Mix (dATP, dGTP, dTTP jeweils 2 mM)
  • - 1 µl 40 mM Natriumpyrophosphat
  • - 1 µl RNasin (Amersham; GB)
  • - 2 µl 10× Reverse Transkriptase-Puffer (500 mM Tris.-Cl (pH 8,5), 500 mM KCl, 100 mM MgCl₂, 100 µg/ml BSA, 10 mM EDTA, 10 mM Dithio­ treitol)
  • - 20 Einheiten AMV reverse Transkriptase (Boehringer Mannheim, BRD)
  • - 10 µl (α-³²P)-dCTP (NEN, 10 µ Ci/µl; S.A. < 3000 Ci/mmol).

Die Reaktionsansätze wurden 15 Minuten lang bei 42°C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl "Chasemix" (enthaltend alle vier dNTP′s in einer Konzentration von jeweils 10 mM) wurde die Inkubation für weitere 20 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von jeweils 1 µl 0,5 M EDTA abgestoppt und die Produkte ohne weitere Reinigung mit Ethanol gefällt. Die mit einer spezifischen Aktivität von < 10⁸ cpm/mg markierten Sonden wurden mit den oben genannten Replika-Filtern parallel hybridisiert. Die Hybridisie­ rung wurde in 5× Denhardt′s-Lösung, 4× SET (200 mM Tris (pH 8,0), 20 mM EDTA, 0,6 M Nacl), 0,1% Natriumpyrophosphat und 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 72 Stunden lang bei 65°C und einer Konzentration der Radioaktivität von 5 × 10⁶ cpm/ml durchgeführt. Die Filter wurden anschließend in 0,1% SDS, 2× SSC (300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natrium₃-Citrat) bei einer Temperatur von 65°C gewaschen.

Fig. 3 zeigt die Autoradiogramme zweier Replika-Filter von einer der Petrischalen, welche mit epididymalen (a) bzw. testikularen (b) cDNA-Sonden hybridisiert wurden. Die Entwicklung der Autoradiogramme erfolgte nach einer Expositionszeit von 16 Stunden unter Verwendung einer Verstärker-Folie. Die Filter repräsentieren etwa 500 unabhängige Klone der im System Lambda gt 11 erstellten cDNA-Gesamtbibliothek aus Nebenhodengewebe. Die positiven, Epididymis-spezifischen Hybridisierungssignale sind mit Pfeilen markiert (vgl. Fig. 3a).

Mit Hilfe dieses Primär-Screening-Verfahrens (vgl. Fig. 1a) konnten etwa 10 000 unabhängige cDNA-Klone analysiert werden. Dabei konnten 265 Rekombinanten identifiziert werden, deren Signale nach Hybridisierung mit der epididymalen cDNA-Sonde im Vergleich zu der aus Hodengewebe hergestellten sehr viel stärker waren. Bezogen auf den durch Screening analysierten Teil der Phagen-Bibliothek entspricht die Anzahl positiver cDNA-Klone einem Anteil von 2,5%.

Positive cDNA-Klone wurden isoliert und für ein Sekundär- Screening in 6 Gruppen mit bis zu 50 Klonen aufgeteilt.

Das oben beschriebene Verfahren wurde mit der Abweichung wiederholt, daß von jeder der 6 Petrischalen 3 Replika-Filter angefertigt wurden. Zur Herstellung der negativen cDNA-Sonden wurde hier Poly(A) ⁺RNA aus menschlichem Gehirn bzw. aus mensch­ ischer Leber (Clontech California, USA) verwendet.

Die Anzahl positiver Rekombinanten wurde nach Analyse dieses sekundären Screening-Verfahrens (vgl. Fig. 1b) auf 59 Klone reduziert (vgl. Fig. 4).

Die Isolierung positiver Klone erfolgte ohne weitere Reinigung der Plaques. Die gereinigte Lambda-DNA wurde mit EcoRI geschnit­ ten und die Inserts durch Biotrap-Elution (Schleicher & Schüll) isoliert. Die EcoRI-Inserts wurden in den bakteriellen Plasmid-Vektor pBS (Stratagene, California, USA) subkloniert und durch das CaCl₂-Transformationsverfahren in die Bakterienzellen des E.coli-Stammes XL1 Blue (Stratagene, California) eingeführt (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982)).

Beispiel 4 Herstellung von Northern-Blots zur Analyse der gewebespezifischen Genexpression und Einteilung der Epididymis-spezifischen cDNA-Klone in Familien mit verwandten Sequenzen

20 µg Gesamt-RNA aus menschlicher Epididymis (E) von einem mit Cyproteronacetat behandelten Patienten sowie die gleiche Menge Gesamt-RNA aus menschlichem Hoden (T) und menschlicher Decidua (D) wurden in einem horizontalen 1,3%-igen Formaldehyd-Agarosegel 16 Stunden lang bei einer konstanten Spannung von 25 Volt elektrophoretisch aufgetrennt (vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982) (Fig. 3)). Zur Größenbestim­ mung der RNA′s wurde das Gel zusätzlich mit einer RNA-Leiter (0,24-9,5 kB) beladen. Die RNA wurde anschließend durch Kapillar- Blotting in Gegenwart von 20 × SSC auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) übertragen. Die Blots wurden nachfolgend mit radioak­ tiven, potentiell Epididymis-spezifischen cDNA-Sonden sukzessive hybridisiert. Die Sonden wurden durch EcoRI-Restriktion der im Plasmid pBS subklonierten Lambda gt11-DNA sowie anschließender Biotrap-Elution isoliert und wiesen nach radioaktiver Markierung eine spezifische Radioaktivität von < 10⁹ cpm/µg auf (vgl. A.P. Feinberg und B. Vogelstein, A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity, Analytical Biochemistry, 132, 6-13, (1983)). Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei einer Radioaktivitätskonzentration von 1-2 × 10⁶ cpm/ml. Nachfolgend wurden die Filter schrittweise unter steigender Stringenz gewaschen, beginnend mit 2 × SSC bei Raumtemperatur bis zu 0,1 x SSC bei einer Temperatur von 65°C. Zur Dehybridisierung wurden die Filter 15 Minuten bei 65°C in Gegenwart von 2 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA und 0,1% SDS inkubiert. Die getrockneten Filter wurden auf das Vorhandensein von Sondenmaterial autoradiographisch untersucht, bevor sie im Falle ausbleibender Signale für eine wiederholte Hybridisierung mit einer weiteren Sonde verwendet wurden.

In Fig. 5 sind Beispiele für die Autoradiogramme der Northern-Blot-Analysen potentiell positiver cDNA-Klone dargestellt. Die Expositionszeit betrug 20 Stunden. Anhand der unterschiedlichen Hybridisierungsmuster wurden die Klone hinsichtlich ihrer Gewebespezifität qualitativ bewertet.

• a) Positiver cDNA-Klon, angezeigt durch Epididymis-spezifische Hybridisierung.
• b) Positives, aber nicht Epididymis-spezifisches Hybridisie­ rungsmuster.
• c) Positiver cDNA-Klon (*), der auch mit rRNA hybridisiert.
• d) cDNA-Klon ohne Gewebe-spezifische Expression.

Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte eine Anzahl von 36 epididyma­ len cDNA-Klonen identifiziert werden. Das spezifische Hybridisie­ rungssignal eines jeden Klon-Inserts mit epididymaler RNA war um mindestens eine Größenordnung stärker als solche mit RNA aus Hoden oder Dezidua (vgl. Fig. 5a).

Durch die Ergebnisse aus Kreuz-Hybridisierungen mit der ursprüng­ lichen Phagenbibliothek konnten die 36 Epididymis-spezifischen cDNA-Klone vier unabhängigen Familien (HE 1, HE 2, HE 3 und HE 4) zugeordnet werden, die jeweils einen Satz zueinander verwandter Klone umfassen (vgl. Fig. 6 für HE 2 und HE 4). Dabei konnte gezeigt werden, daß sich die vier cDNA-Klon-Familien von vier unterschiedlichen, relativ kurzen mRNA-Molekülen ableiten. Ihre ungefähren Längen sowie die anhand der Korrelation von Hybridi­ sierungssignalen mit der Phagenbibliothek ausgezählten Häufig­ keiten in bezug auf das Vorkommen einer jeden cDNA-Familiense­ quenz von HE1 bis HE4 sind in der Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Häufigkeit des Auftretens humaner Epididymis- spezifischer cDNA′s und ungefähre Länge der mit ihnen korrespondierenden mRNA′s

Beispiel 5 Kontrolle der Gewebespezifität der Klone HE 1 - HE 4

Jeweils 8 µg Gesamt-RNA aus Epididymis (E), Decidua (D), Hoden (T), Prostata (P), Niere (K), Hypophyse (Pi) und aus Lympho­ blastoiden IM9-Zellen (I) wurden gemäß Beispiel 4 aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Als Sonden wurden (³²P)-markierte cDNA-Inserts aus HE 1(a), HE 2(b), HE 3(c) und HE 4(d) eingesetzt und mit Northern-Blots gemäß Beispiel 4 hybridisiert.

Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Es zeigt sich, daß jeder der vier cDNA-Klone nur mit der epididymalen RNA ein eindeutiges Hybridisierungssignal liefert.

Beispiel 6 Kreuz-Hybridisierungen zur Analyse der Spezies-spezifischen Genexpression

Jeweils 20 µg epididymale Gesamt-RNA aus Mensch (H), Rind (B), Ratte (R), Maus (M), Katze (C) und Hund (D) wurden gemäß Bei­ spiel 4 auf getrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Als Sonden wurden (³²P)-markierte cDNA-Inserts aus HE 1 (a), HE 2 (b), HE 3 (c) und HE 4 (d) eingesetzt und mit Northern-Blots gemäß Beispiel 4 hybridisiert, wobei jeweils der Vertreter mit der größten Kettenlänge eingesetzt wurde. In Fig. 8 sind die nach einer Expositionszeit von 8 Stunden entwickelten Autoradiogramme der Northern-Blot-Analyse dargestellt.

Die cDNA-Inserts aus den Klonen HE 2 und HE 3 zeigten keine Kreuz-Hybridisierung mit den tierischen RNA′ s (vgl. Fig. 5b, c), während das Insert aus dem Klon HE 1 ein starkes Signal mit der epididymalen Hunde-RNA aufweist (vgl. Fig. 8a). Da sich das Signal auch nach Waschen unter stringenten Bedingungen nicht reduzierte, liegt hier eine hohe Sequenzhomologie vor. Bei dem Insert des Klons HE 4 wurde ein starkes Signal mit epididymaler Rinder- und Hunde-RNA und ein schwaches Signal mit der Katzen-RNA beobachtet (vgl. Fig. 8d). Keine der menschlichen Sequenzen hybridisierte mit epididymaler RNA aus der Ratte und der Maus.

Beispiel 7 Bestimmung der Basensequenzen der Epididymis-spezifischen cDNA-Klone HE 1 bis HE 4

Die Basensequenz des jeweils längsten cDNA-Klons aus den Familien HE 1 bis HE 4 gemäß den Beispielen 4, 5 und 6 wurde mit Hilfe der Dideoxy-Methode nach Sanger, F. und Coulson, A.R. "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase" J. Mol. Biol. 94, 441 (1975) ermittelt. Zu diesem Zweck wurden pBS-Subklone gemäß Beispiel 3 hergestellt und unter alkalischen Bedingungen in Einzelstrang-DNA′s überführt.

Die Ergebnisse für die jeweiligen Klone sind in den Fig. 9 bis 12 dargestellt.

Claims (15)

1. Humane, Epididymis-spezifische Polypeptide, kodiert von einer der in den Fig. 9 bis 12 angegebenen DNA-Sequenzen, sowie allelische Varianten oder Fragmente dieser Polypeptide mit gleicher Immunogenität, wobei die Fig. 9 bis 12 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Humane, Epididymis-spezifische Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in den Fig. 9 und 12 angegebenen Aminosäure-Sequenzen aufweisen sowie allelische Variationen oder Fragmente dieser Sequenzen mit gleicher Immunogenität, wobei die Fig. 9 und 12 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

3. Verwendung der Polypeptide nach den Ansprüchen 1 und 2 zur diagnostischen oder therapeutischen Behandlung männlicher Infertilität.

4. DNA-Moleküle, dadurch gekennzeichnet, daß sie

• a) die in den Fig. 9 bis 12 angegebenen Nukleotidsequen­ zen oder syngene Sequenzen oder Fragmente derselben, soweit diese für Polypeptide mit gleicher Immunogenität kodieren, aufweisen, oder
• b) Nukleotidsequenzen aufweisen, welche mit den in den Fig. 9 bis 12 angegebenen Nukleotidsequenzen oder Fragmenten derselben, soweit diese für Polypeptide mit gleicher Immunogentiät kodieren, hybridisieren, oder
• c) Nukleotidsequenzen aufweisen, welche mit Ausnahme der durch die Degeneration des genetischen Kode verursachten Abweichungen, mit den unter a) und b) genannten Sequenzen hybridisieren,

wobei die Fig. 9 bis 12 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

5. cDNA-Moleküle nach Anspruch 4.

6. DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie mit einem Marker versehen sind.

7. Verwendung der Sequenzen nach den Ansprüchen 4 bis 6 zur diagnostischen Behandlung männlicher Infertilität.

8. Vektor oder Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 4 bis 6 enthalten.

9. Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor oder Plasmid nach Anspruch 8 transformiert ist.

10. Verfahren zur Herstellung humaner, Epididymis-spezifischer Polypeptide oder von Fragmenten derselben mit gleicher Im­ munogenität, dadurch gekennzeichnet, daß man prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die mit einer der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert sind, unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression der DNA-Sequenz erlauben und gegebenenfalls anschließend das Expressionsprodukt aus dem Kulturansatz gewinnt.

11. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage sind, eine Immunreaktion mit einem der Polypeptide nach den Ansprüchen 1 oder 2 einzugehen.

12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonale Antikörper sind.

13. Antikörper nach den Ansprüchen 11 und 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie mit einem synthetischen Polypeptid der in den Fig. 9 und 12 angegebenen Sequenzen oder Fragmenten derselben mit gleicher Immunogenität reagieren, wobei die Fig. 9 und 12 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

14. Verwendung der Antikörper nach den Ansprüchen 11 bis 13 zur Diagnose männlicher Infertilität.