DE69205342T2

DE69205342T2 - Anregender Wirkstoff für Leydig-Zellen.

Info

Publication number: DE69205342T2
Application number: DE69205342T
Authority: DE
Inventors: C Wayne Bardin; C Yan Cheng
Original assignee: Population Council Inc
Current assignee: Population Council Inc
Priority date: 1991-06-18
Filing date: 1992-04-16
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2012-04-17
Also published as: EP0519889B1; US5304603A; EP0519889A3; EP0519889A2; ATE128987T1; DE69205342D1; JPH05271296A; CA2065919A1

Description

Die Erfindung betrifft Peptide, die zur Stimulation von Androgenen einsetzbar sind, Verfahren zu ihrer Isolierung und Herstellung und ihre Anwendung.
Der Hoden männlicher Tiere einschließlich der Menschen ist in zwei funktionelle Teile geteilt. Ein Teil ist zur Herstellung von Sperma verantwortlich und enthält eine dichtgepackte Reihe tubulärer Spiralen, die als Tubulus seminiferus (Hodenkanälchen) bekannt sind. Die Hodenkanälchen bilden den Großteil der Testes-Struktur. Die in den Hodenkanälchen lokalisierten hormonproduzierenden Zellen, die bei der Umwandlung von Keimzellen zu Spermazellen beteiligt sind, sind als Sertoli-Zellen bekannt. Der andere Teil der Testes enthält Leydig-Zellen. Leydig-Zellen sind für die Produktion von Androgenen oder männlichen Sexualhormonen verantwortlich. Diese Leydig-Zellen liegen zwischen den verschiedenen Spiralen der Hodenkanälchen eingestreut.
Es war seit Jahren bekannt, daß bei Bindung einer bestimmten Chemikalie an spezielle Membranrezeptoren auf Leydig-Zellen eine Reihe von Reaktionen initiiert wird, die in der Produktion und Sekretion von Androgenen resultiert. "Androgen" bezieht sich auf eine Familie männlicher Sexualhormone, die Dihydrotestosteron, Androstendion und Testosteron und andere Verbindungen umfaßt. Androgene wie Testosteron spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung männlicher Geschlechtscharakteristika wie dem Wachstum des Penis, der Muskeln und des Bartes als auch im Tieferwerden der Stimme. Von dem von den Leydig-Zellen sezernierten Testosteron war ebenfalls bekannt, daß es an spezifische Rezeptoren in den Sertoli-Zellen bindet und daß diese Bindung zur Spermaproduktion wichtig ist.
Die Verbindung, von der bekannt war, daß sie an Leydig-Zellen bindet, war das Luteinisierende Hormon (LH), das von der Hypophyse unter dem Gehirn sezerniert wird. (Eine in weiblichen Tieren produzierte, funktionell analoge Verbindung ist das Choriongonadotropin (CG) oder das humane Choriongonadotropin (hCG), das ebenfalls an LH-Rezeptoren auf Leydig-Zellen binden kann. CG ist leichter erhältlich als LH, und deshalb verwenden klinische Untersuchungen häufig CG anstelle von LH. Da sie untereinander funktionell austauschbar sind, bezeichnet man sie häufig als "LH/CG".) Man nahm ursprünglich an, daß die Bindung von LH/CG an die Leydig-Zelle der einzige Mechanismus zur Initiation der Produktion von Androgenen sei. Von einer weiteren Verbindung, dem follikelstimulierenden Hormon (FSH), war bekannt, daß es von der Hypophyse unter dem Gehirn freigesetzt wird, und daß es an spezielle Membranrezeptoren auf den Sertoli-Zellen bindet. Man glaubte, daß die Bindung von FSH gemeinsam mit Testosteron an die Sertoli-Zellen die Schlüsselrolle in der Spermaproduktion darstellt.
Diese vereinfachten Erklärungen der Wirksamkeit der Sertoliund Leydig-Zellen waren gut für ein grundlegendes Verständnis der testikulären Biologie. Es gab jedoch bestimmte Situationen, bei denen diese Erklärungen genau nicht paßten. Beispielsweise wurde gefunden, daß bei Zerstörung von Sertoli- Zellen die sie umgebenden Leydig-Zellen eine schnelle Vergrößerung erfuhren, ohne daß sich die LH-Spiegel veränderten. Dies legt nahe, daß der Lebenszyklus beider Arten von Zellen, zumindest bis zu einem gewissen Ausmaß, unabhängig voneinander ist. Weiterhin gibt es eine Erkrankung bei Kindern, die bewirkt daß die Leydig-Zellen eine große Menge von Testosteron produzieren, auch bei Fehlen von LH. Man glaubte lange, daß es irgendeine andere Substanz gibt, die in den Testes enthalten ist, die die Leydig-Zellen zur Produktion von Androgen in diesem Fall aktiviert. Schließlich werden im Fetus Testosteron oder andere Androgene produziert, bevor die Leydig-Zellen-LH- Rezeptoren wirksam sind. Diese Beobachtungen legten eine symbiotische Beziehung zwischen den Sertoli-Zellen und den Leydig-Zellen unabhängig von ihren bekannten Rollen bei der Spermazellproduktion nahe.
Das Verständnis der chemischen Wechselwirkung zwischen den Sertoli-Zellen und den Leydig-Zellen nahm, insbesondere während der letzten zehn Jahre, schrittweise zu. Während dieses Zeitraums wurden die Ergebnisse einer Anzahl von Untersuchungen veröffentlicht, und diese Untersuchungen scheinen die symbiotische Beziehung von Sertoli-Zellen und Leydig-Zellen zu untermauern. Wenn beispielsweise Leydig-Zellen aus Schweinen alleine in chemisch definiertem Medium kultiviert werden, wiesen die Zellen eine Regression auf und zeigten den Verlust des glatten endoplasmatischen Reticulums und ein Anschwellen der Mitochondrien. Diese Veränderungen wurden durch die Zugabe entweder von LH, das die Leydig-Zellen stimuliert, oder von FSH, das die Sertoli-Zellen stimuliert, zum Medium nicht verhindert.
Im Gegensatz dazu ergab die Co-Kultivierung von Leydig- und Sertoli-Zellen, daß in den Leydig-Zellen das glatte endoplasmatische Reticulum auf dem gleichen Niveau verbleibt wie das in Leydig-Zellen aus unversehrten Tieren. Weiterhin schien die Zugabe von FSH zur Co-Kultur die Leydig-Zellenentwicklung zu stimulieren. (Tabone, et al., '84) (1). Derartige Beobachtungen führten zahlreiche Forscher dazu, in verschiedenen, nicht fraktionierten biologischen Flüssigkeiten aus Testes nach Faktoren zu suchen, die die Leydig-Zellfunktion beeinflussen. Diese Untersuchungen führten zur Identifizierung sowohl inhibitorischer als auch stimulatorischer Aktivitäten.
Die stimulatorischen Aktivitäten umfassen eine Gruppe biologischer Aktivitäten, die gegen Hitze, Säuren oder organische Lösungsmittel stabil zu sein scheinen und zur Erhöhung sowohl der basalen als auch der LH-stimulierten Testosteronsekretion befähigt scheinen. Diese Faktoren weisen ein mittleres Molekulargewicht von zwischen etwa 5.000 und etwa 10.000 auf. (Syed Int. J. Androls, '86) (Sharp & Cooper '84) (2).
Andere Forscher identifizierten eine weitere Gruppe von stimulatorischen Aktivitäten von Leydig-Zellen, die sowohl hitzeals auch enzymsensitiv sind und die Proteine mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen etwa 10.000 und 60.000 zu sein scheinen. Diese Faktoren können ebenfalls sowohl die basal als auch die LH-stimulierte Testosteronsekretion stimulieren. (Sharpe INSERM '84); (Sharp & Bartlett '85) (3); (Sharp Mol. Cell Endo. '88); (Benahmed Am. J. Phys. '85); (Benahmed J. Ster. Biochem. '86) (4); (Parvinen Mol. Cell Endo. '84); (Papadopoulus '87a); (Papadopoulus '87b); (Verhoeven & Cailleau '85) (14); (Verhoeven & Cailleau '87); (Janecki Mol. Cell Endo. '85) (5); (Jansz Biol. Reprod. '87); und (Liu & Dahl '88).
In einem bekannten Verfahren, das in Journal of Endocrinology, Band 114, Nr. 3, 1987, S. 459 bis 467 von V. Papadopoulos et al. mit dem Titel "Adult rat Sertoli cells secrete a factor or factors which modulate Leydig cell function" (6) beschrieben ist, wird ein im wesentlichen unspezifischer, unreiner Stimulationsfaktor (oder -faktoren) mit Proteinnatur mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 10.000 und 50.000 offenbart. Der Faktor (oder die Faktoren) könnten jedoch irgendein beliebiger Stimulator sein, einschließlich beispielsweise LH, hCG oder Inhibin, der in derartigen Flüssigkeiten auffindbar ist, der jedoch von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durch Reinigung ausgeschlossen wurde.
Die vorliegenden Erfinder isolierten ein bisher unbekanntes Protein, das wichtige und einzigartige Wirksamkeiten aufweist und das potentiell signifikante therapeutische Eigenschaften besitzt. Dieser Faktor, der als Leydig-Zellstimulator oder "LCS" bekannt ist, wirkt auf solchen Wegen, die für andere identifizierte stimulatorische Faktoren nicht charakteristisch sind. Weiterhin wirkt LCS bei der Verstärkung und in einigen Fällen bei einer synergistischen Verstärkung der Produktion von Androgenen wie Testosteron bei Co-Verabreichung mit LH/CG. Diese Entdeckung schafft nicht nur ein besseres Gesamtverständnis des Zusammenspiels zwischen den Sertoli-Zellen und den Leydig-Zellen, sondern ist weiterhin bei der Behandlung der Infertilität, bei niedriger Spermienanzahl, bei frühzeitiger oder bei spätem Einsetzen der Pubertät als auch bei anderen Erkrankungen nutzbringend einsetzbar.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Isolation von LCS in im wesentlichen reiner und isolierter Form.
Ein weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Leydig-Zellstimulators oder "LCS", der in im wesentlichen reiner und isolierter Form vorliegt.
Diese und andere Aufgaben wurden durch die Entdeckung eines Verfahrens zur Isolation von LCS umgesetzt. LCS ist ein Polypeptid mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, mit der Fähigkeit, eine wenigstens 200%ige Zunahme der Androgensekretion durch Leydig- Zellen im Vergleich zu dem Grundniveau der Androgensekretion dieser Zellen zu stimulieren.
Gemäß einer Ausführungsform des Isolationsverfahrens umfaßt das Verfahren als Schritte die Bereitstellung eines mit primären, Sertoli-Zellen angereicherten Kulturmediums, die Fraktionierung dieses Mediums durch sequentielle HPLC auf einer präparativen Anionen-Austauschsäule, das Sammeln und Vereinigen der Fraktionen des Peaks 1, eine Trennung der gesammelten Peak 1-Fraktionen über eine präparative Gelpermeationssäule, Sammeln und Vereinigen der Fraktionen zwischen den Peaks 2 und 3, Durchführung einer weiteren Trennung der vereinigten Fraktionen zwischen den Peaks 2 und 3 durch C4-Umkehrphasen-HPLC, Sammeln und Vereinigen der dem Peak 1 entsprechenden Fraktionen, Durchführung einer Diphenyl-Umkehrphasen-HPLC an den vereinigten Peak 1-Fraktionen, Sammeln und Vereinigen der Fraktionen des Peaks 3, C18-Umkehrphasen-HPLC der vereinigten Fraktionen des Peaks 3 und Sammeln der Fraktionen, die entsprechend dem Peak 4 eluieren.
Demnach wird ein isolierter und im wesentlichen reiner Leydig- Zellstimulator bereitgestellt, der ein Peptid mit einem Mr-Wert zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, darstellt und der die Fähigkeit aufweist, eine wenigstens 200%ige Zunahme der Androgensekretion durch Leydig- Zellen im Vergleich zu dem Grundniveau der Androgensekretion dieser Zellen zu stimulieren.
Der Ausdruck "signifikante Zunahme in der Androgensekretion" wird vorliegend so verwendet, daß bei Gabe von LCS zu den Leydig-Zellen der Spiegel der hieraus resultierenden vermehrten Androgen-Sekretion signifikant höher ist als derjenige, der durch die Verabreichung einer funktionell äquivalenten Dosis eines beliebigen anderen bekannten Stimulationsfaktors realisiert werden könnte. Tatsächlich kann die Verabreichung von LCS an Leydig-Zellen eine wenigstens 200%ige Zunahme im Spiegel der Androgensekretion im Vergleich zu den Basalspiegeln bewirken, und sie kann häufig eine Zunahme von bis zu 300% oder darüber bewirken. Im Gegensatz dazu sind diejenigen bekannten Stimulationsfaktoren, die unabhängig eine erhöhte Androgensekretion bewirken können, zur Produktion von Zunahmemengen von mehr als etwa 100% über den Basalmengen nicht befähigt. "Grundniveau" oder "Grundmengen" oder "Grundspiegel" oder "Grundniveau der Androgensekretion" etc. bezieht sich auf die Androgenmenge, die von Leydig-Zellen produziert wird, nachdem sie aus einem Tier entfernt und wie im Beispiel III beschrieben in Kultur gegeben wurden.
Erfindungsgemäß identifiziertes und isoliertes LCS weist Eigenschaften auf, die es einzigartig machen. Es ist klar, daß LCS ungleich LH ist. Das mittlere Molekulargewicht von LCS liegt zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, während LH und tatsächlich auch CG ein ungefähres Molekulargewicht von etwa 28.500 aufweisen. Andere Daten unterstützen die Unterschiede zwischen diesen Verbindungen ebenfalls. Beispielsweise sind LH und CG aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt, während LCS aus einem einzelnen Polypeptid zusammengesetzt ist. Weiterhin reagieren die gegen LH und CG gerichteten Antikörper nicht mit LCS. Weiterhin scheinen LH/CG und LCS auf der Grundlage vollständig unterschiedlicher biochemischer Mechanismen zu wirken. Speziell stimuliert LH/CG die Produktion an zyklischem AMP (cAMP) in Leydig-Zellen bei Bindung an den Leydig-Zellrezeptor. Wenn LCS an Leydig-Zellen bindet, wird keine vergleichbare Zunahme an cAMP bewirkt.
Wie LH/CG kann LCS, das selbständig wirkt, jedoch eine signifikante Zunahme der Androgensekretion durch Leydig-Zellen im Vergleich zu dem Grundniveau stimulieren. Tatsächlich sezernieren LCS-behandelte Leydig-Zellen Androgen bei einem Niveau, das, in einigen Fällen, dem Niveau der Androgensekretion entspricht, das durch das Einwirkenlassen einer maximal stimulatorischen Dosis von LH/CG auf Leydig-Zellen resultiert. Wenn LCS zur Behandlung bestimmter Leydig-Zellen, beispielsweise unreifer Rattenzellen, verwendet wird, kann die Menge an Androgensekretion diejenige Menge überschreiten, die durch die Exposition der gleichen Zellen auf eine maximal stimulatorische Dosis von LH/CG resultiert.
Wie die Tabelle 1 veranschaulicht, scheint kein anderer bekannter und charakterisierter Stimulationsfaktor, der Leydig- Zellen beeinflußt zur unabhängigen Produktion derartiger Mengen an Androgensekretion befähigt zu sein. TABELLE 1 Name stimuliert Basal-Testosteron % Zunahme über das Grundniveau bei alleiniger Verabreichung Literatur Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 Fibroblastenwachstumsfaktor Inhibin nein
1. Lin, T. et al. Endocrinology 119:1641, 1986
2. Rigandiere, N. International Journal of Andrology 1:165, 1988
3. Sordoillet, Molecular and Cellular Endocrinology 58:283, 1988
4. Hsueh, A. Proceedings of the National Academy of Science 84:5082, 1987
5. Lin, T. Endocrinology 125:2134, 1989
Die überraschendste und unerwartetste Eigenschaft von LCS ist vielleicht seine Fähigkeit, bei Verabreichung in Kombination mit LH/CG ein Niveau an Androgensekretion zu ermöglichen, das größer ist als dasjenige Niveau, das durch Verabreichung einer maximalen Dosis von LH/CG allein realisiert werden konnte. Vorher war die Auffassung weit verbreitet, daß die von Leydig- Zellen sezernierte Adrogenmenge bei Verabreichung einer maximal stimulatorischen Dosis von LH/CG die höchste Menge an Androgensekretion sei, die aus Leydig-Zellen realisiert werden könnte. Die vorliegenden Erfinder fanden jedoch unerwarteterweise, daß durch Co-Verabreichung von LH/CG mit LCS die Spiegel der Androgensekretion signifikant erhöht werden können. Diese Entdeckung ist insbesondere überraschend, wenn man in Betracht zieht, daß die Kombination anderer stimulatorischer Faktoren mit LH keinen höheren Androgensekretionsspiegel ergibt als denjenigen, der durch Behandlung der Leydig-Zellen mit einer maximalen stimulatorischen Dosis von LH/CG alleine bewirkt werden konnte.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutisch aktive Zusammensetzung bereitzustellen, die zur Stimulation und Verstärkung der Produktion von Androgen in eine derartige Behandlung benötigenden Tieren einsetzbar ist.
Die Erfindung wird in den beiligenden Ansprüchen definiert.
Demnach wird eine Anzahl pharmazeutischer Zubereitungen bereitgestellt, die zu diesen Zwecken einsetzbar ist. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen stellen pharmazeutisch aktive Zusammensetzungen dar, die zur Stimulation und Verstärkung der Androgenproduktion in solchen Tieren, die eine derartige Behandlung benötigen, einsetzbar sind, wobei die Zusammensetzungen die nachfolgenden Elemente umfassen: einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen Leydig-Zellstimulator, der ein Polypeptid mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, ist und der die Fähigkeit aufweist, eine wenigstens 200%ige Zunahme der Androgensekretion durch Leydig-Zellen im Vergleich zur basalen Menge der Androgensekretion dieser Zellen zu stimulieren. Der Leydig-Zellstimulator wird in einer Menge bereitgestellt, die ausreichend ist, um die Androgenproduktion zu stimulieren und zu verstärken. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind zur Behandlung der hier beschriebenen, mit Androgenen zusammenhängenden Erkrankungen einsetzbar. Diese Zusammensetzungen sind jedoch insbesondere zur Behandlung von Patienten einsetzbar, die geringe Spiegel an LH/CG-Rezeptoren aufweisen oder denen derartige Rezeptoren fehlen. Dies kann sich dann ergeben, wenn Patienten aufgrund eines primären testikulären Versagens hohe LH-Spiegel aufweisen. Hohe Spiegel an LH können die Anzahl an funktionsfähigen LH/CG-Rezeptoren "nach unten regulieren" und ihre Anzahl verringern. In gleicher Weise entwickeln Patienten mit einer Leydig-Zellen-"Aplasie" keine normalen Leydig-Zellen, da sie entweder keine LH/CG-Rezeptoren aufweisen oder ihre Rezeptoren nicht funktionell sind.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können weiterhin eine pharmazeutisch aktive Zusammensetzung umfassen, die zur Stimulation und Verstärkung der Androgenproduktion in eine derartige Behandlung benötigenden Tieren einsetzbar ist, wobei die Zusammensetzungen die nachfolgenden Elemente umfassen: einen pharmazeutisch verträglichen Träger; eine erste Menge eines Leydig-Zellstimulatorpeptids mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, und mit der Fähigkeit, eine Zunahme der Androgensekretion durch Leydig-Zellen im Vergleich zum Grundniveau der Androgensekretion dieser Zellen um wenigstens 200% oder mehr zu stimulieren; und LH/CG in einer zweiten Menge. Die ersten und zweiten Mengen an LCS bzw. LH/CG sind ausreichend und wirksam, um eine Androgenproduktion durch Leydig-Zellen zu stimulieren, die über einer Androgenproduktion liegt, die dadurch bewirkt wird, daß die Leydig-Zellen entweder einer ersten Menge an LCS oder einer zweiten Menge an LH/CG ausgesetzt werden, oder die mit einer derartigen Androgenproduktionsmenge gleichzusetzen ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die sowohl LH/CG als auch LCS umfaßt, könnte eine höhere Menge an Androgenproduktion ergeben, als ansonsten erwartet worden wäre. Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung könnte dramatische Wirkungen auf ein Tier zeigen, das an Infertilität und/oder an einer unzureichenden Androgenproduktion leidet. Falls beispielsweise ein Organismus eine geringe Spermienzahl aufweist, die auf durch einen geringen Prozentsatz nicht lebensfähiger Leydig-Zellen bewirkte niedrige Testosteronmengen zurückzuführen ist, könnte die Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, einschließlich sowohl LH/CG und LCS, durchgeführt werden, um die Testosteronproduktion durch die verbliebenen lebensfähigen Leydig-Zellen zu erhöhen. Demnach werden von der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Anwendung von LCS, entweder allein oder in Kombination mit LH/CG, zur Behandlung von mit einer niedrigen Androgensekretion einhergehenden Erkrankungen speziell mit umfaßt.
Da die vorliegenden Erfinder gefunden haben, daß die LCS-Sekretion durch die Sertoli-Zellen direkt mit der Bindung von FSH an diese Zellen verbunden ist, kann es möglich sein, die Androgensekretion durch Erhöhung des den Sertoli-Zellen verabreichten FSH zu erhöhen. Dies würde eine Reaktionskette in Gang setzen, die die Stimulation und die Freisetzung von LCS und die nachfolgende Stimulation einer Androgenproduktion umfassen würde. Die Verwendung von LH/CG und FSH zur Erhöhung der Produktion an Androgen wird hierdurch ebenfalls mit umfaßt.
Zur Bereitstellung einer brauchbaren Quelle an im wesentlichen reinen LCS muß eine Wirtszelle mit nicht-nativer DNA bereitgestellt werden, die zur Expression eines Polypeptids mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, befähigt ist, und die in der Lage ist, eine Zunahme von wenigstens etwa 200% der Androgensekretion durch Leydig-Zellen im Vergleich zum Basalniveau der Androgensekretion dieser Zellen zu stimulieren.
Bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen im einzelnen beschrieben:
Fig. 1 veranschaulicht graphisch den an unreifen Leydig-Rattenzellen bei Anwendung keiner Substanz (C), LH oder LCS produzierten Testosteronspiegel;
Fig. 2 veranschaulicht graphisch den intrazellulären cAMP- Spiegel, der aufgrund der Einwirkung keiner Substanz (C), von LH oder LCS akkumuliert; und
Fig. 3 veranschaulicht graphisch den durch die individuelle Anwendung keiner Substanz (C), von LH, LCS und durch die kombinierte Anwendung von LH und LCS auf unreife Leydig-Rattenzellen produzierten Testosteronspiegel.
Fig. 4 veranschaulicht die Aminosäuresequenz des amino-terminalen oder N-terminalen LCS-Bereichs.
Die Erfinder fanden und isolierten ein Protein, dessen Existenz und Aktivität sowohl überraschend als auch unerwartet waren. Nachdem das gereinigte LCS durch SDS-PAGE sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen auf einem 12,5% T SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt worden war, wurde bestimmt, daß LCS einen scheinbaren bzw. offensichtlichen Mr- Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, und bevorzugter von etwa 17.000, aufweist. Weiterhin wurde gefunden, daß LCS eine einzelne Polypeptidkette ist.
LCS kann durch eine Anzahl von Wegen, beispielsweise durch seine Aminosäuresequenz, charakterisiert werden. Beispielsweise weist LCS einen amino-terminalen Abschnitt mit der Struktur (SEQ. ID No. 1) auf, die in den anliegenden Ansprüchen definiert wird. LCS weist weiterhin eine einzigartige Aktivität auf, und dieses Peptid könnte ebenfalls durch seine charakteristische Aktivität definiert werden.
Ein Weg zur Anwendung der Aktivität von LCS zur Charakterisierung ist der Vergleich von LCS mit den Verbindungen, die am wahrscheinlichsten die Androgensekretion stimulieren, nämlich LH/CG. Wie LH/CG ist LCS zur Stimulation signifikanter Erhöhungen in der Androgensekretion über das Basalniveau der Sekretion von Leydig-Zellen befähigt. Unter gewissen Umständen beginnt sich die von Leydig-Zellen aufgrund der Exposition dieser Zellen mit LCS sezernierte Androgenmenge den Mengen anzunähern, die durch Verabreichung einer funktionell äquivalenten Dosis an LH/CG erhältlich ist. In jedem Fall liegt die durch Anwendung von LCS sezernierte Hormonmenge beträchtlich näher an den Mengen, die durch Anwendung von LH/CG erreicht werden, als bei den Mengen, die durch Anwendung irgendwelcher anderer bekannter stimulatorischer Faktoren erreicht werden.
Vergleiche beispielsweise die Ergebnisse, die durch die Anwendung von LCS/hCG und einer Mischung von LCS/hCG im Vergleich zu anderen Stimulationsfaktoren, wie sie in der Tabelle 2 beschrieben sind, erhalten werden. TABELLE 2 Wirkungen des Leydig-Zellstimulators (LCS), der entsprechend den Verfahren des Beispiels 11 aus Kulturmedium mit angereicherten Sertoli-Zellen isoliert wurde, auf die Steroidgenese reifer Leydig-Zellen. Reife Leydig-Zellen wurden nach den im Beispiel III beschriebenen Verfahren hergestellt, und der Bioassay auf LCS wurde nach dem im Beispiel IV beschriebenen Verfahren durchgeführt. HCG wurde als positive Kontrolle verwendet. Probe Testosteron (ng/5 x 104 Zellen/24 Stunden)* ausschließlich Leydig-Zellen gereinigter LCS (5 ng/Kulturvertiefung) hCG (1 ng/Kulturvertiefung) hCG (1 ng/Kulturvertiefung plus gereinigter LCS (5 ng/Kulturvertiefung) * Alle Daten bedeuten Mittelwerte + Standardabweichung für ein gegebenes Experiment, das aus drei Wiederholungen besteht. Diese Versuche wurden wenigstens dreimal unter Verwendung unterschiedlicher Probenansätze wiederholt, und in jedem Kall wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten.
Im Gegensatz dazu und unter Bezugnahme auf die bekannten, in der Tabelle 1 angeführten stimulatorischen Aktivitäten sollte die Verabreichung einer maximalen Stimulatordosis an Fibroblastenwachstumsfaktor an Leydig-Zellen eine nicht mehr als 100%ige Zunahme über die Basalspiegel ergeben. Unter Verwendung der in der Tabelle 2 beschriebenen Zahlen würde das Ergebnis einer derartigen Anwendung Testosteronspiegel von etwa 60 ergeben, verglichen mit 120, die durch Anwendung von gereinigtem LCS und 150 für hCG erhalten werden. Die Tabelle 2 zeigt weiterhin, daß, aufgrund des Rechenfehlers, gereinigter LCS den gleichen Spiegel an Stimulatoraktivität wie hCG oder LH ergeben könnte.
Tatsächlich kann mit bestimmten Typen von Leydig-Zellen, wie unreifen Leydig-Rattenzellen, die Verabreichung von LCS in der Erreichung einer Androgenspiegelproduktion resultieren, die über derjenigen liegt, die durch die Anwendung von LH/CG erreichbar ist. Unter Bezugnahme auf die Fig. 1 ergab die Anwendung einer maximalen Stimulationsdosis von LH auf unreife Leydig-Rattenzellen einen geringeren Spiegel an Testosteronsekretion als die Exposition derartiger Leydig-Zellen gegen eine maximale Stimulationsdosis an LCS.
In ähnlicher Weise kann LCS durch seine Art der Androgenstimulation charakterisiert werden. Wie die Fig. 2 zeigt, ergab die Anwendung einer maximalen Stimulationsdosis LH auf unreife Leydig-Rattenzellen eine signifikante cAMP-Zunahme. Im Gegensatz dazu ergab die Anwendung einer maximalen Stimulationsdosis LCS auf unreife Leydig-Rattenzellen keine signifikante Zunahme in der intrazellulären cAMP-Akkumulation.
LCS ist weiterhin durch seinen Vergleich mit anderen Stimulationsfaktoren charakterisierbar. Wenn andere Stimulationsfaktoren an Leydig-Zellen allein verabreicht werden, sind die Ergebnisse in einer von zwei Kategorien verallgemeinerbar. Die erste Kategorie, die in der Tabelle 1 gezeigt ist, umfaßt solche Faktoren, die keine zusätzliche Stimulation induzieren.
Die Stimulationsverbindungen sind nur wirksam, wenn sie mit LH co-verabreicht werden. Dies unterscheidet sich deutlich von LCS, da LCS zur unabhängigen Produktion signifikanter Zunahmen der Androgensekretion durch Leydig-Zellen befähigt ist. Die zweite Gruppe von Verbindungen, die ebenfalls in der Tabelle 1 gezeigt ist, kann eine meßbare Zunahme an Androgensekretion ergeben. Jedoch ist die Menge der Androgensekretion in bezug auf die Grundniveaus dramatisch geringer als diejenige, die durch Anwendung von LCS erhältlich ist. Die größte prozentuale bekannte Zunahme, die auf die Anwendung eines anderen Stimulationsfaktors zurückzuführen ist, liegt 100% über den Grundniveaus. Vergleiche hierzu die Tabelle 1.
Im Gegensatz dazu weist LCS die Fähigkeit auf, die Androgensekretion von Leydig-Zellen um wenigstens 200% im Vergleich zu den Grundniveaus dieser Zellen zu erhöhen. Tatsächlich können Zunahmen von 300% oder darüber erreicht werden. Vergleiche hierzu die Tabelle 2.
Am wichtigsten jedoch ist, daß dann, wenn irgendeiner der bekannten Stimulationsfaktoren zu einer maximalen Stimulationsdosis von LH/CG hinzugefügt wird, der erhaltene Androgensekretionsspiegel nicht über demjenigen liegt, der durch Verabreichung dieser Dosis von LH/CG alleine erreichbar ist. Im Gegensatz dazu liegt der Spiegel der Androgensekretion, der durch Verabreichung von LCS und einer maximalen Stimulationsdosis von LH/CG erreichbar ist, über demjenigen, der durch die Verabreichung einer maximalen Stimulationsdosis von LH/CG alleine erreichbar ist. Wie die Tabelle 2 zeigt betrug die Testosteronsekretion aus reifen Leydig-Zellen bei Anwendung einer maximalen Stimulationsdosis von LCS allein etwa 120. Der von reifen Leydig-Zellen sezernierte Testosteronspiegel betrug bei Einwirkung von hCG allein etwa 150. Es wurde ziemlich unerwartet gefunden, daß dann, wenn die maximale Stimulationsdosis von LCS und hCG an reife Leydig-Zellen gleichzeitig verabreicht wurde, der resultierende Testosteronsekretionsspiegel 180 betrug. Dramatischere Ergebnisse wurden dann erhalten, wenn das gleiche Verfahren bei unreifen Leydig-Rattenzellen angewandt wurde. Wie die Fig. 3 zeigt, ergab LCS einen erhöhten Testosteronsekretionsspiegel bei Verabreichung an unreife Leydig-Zellen allein und bei Vergleich mit dem durch LH sezernierten Testosteronspiegel. Tatsächlich ergab die Verabreichung von LH an diese Leydig-Zellen eine etwa acht- bis neunfache Zunahme der Testosteronsekretion. Die Anwendung einer maximalen Stimulationsdosis an LCS ergab eine etwa acht- bis zwölffache Zunahme der Testosteronsekretion. Wenn die maximalen Stimulationsdosen von LH und LCS vereinigt und an diese Leydig-Zellen verabreicht wurden, ergab sich ein synergistischer Spiegel an Testosteronsekretion. Tatsächlich wurde eine etwa 35-fache Zunahme der Testosteronsekretion festgestellt.
LCS ist ein natürlich vorkommendes Protein in männlichen Tieren. Es ist jedoch aufgrund der Komplexität der intra-testikulären Flüssigkeit schwierig, LCS in isolierter, gereinigter und anwendbarer Form zu erhalten. Ein Verfahren zur Gewinnung von LCS in gereinigter und anwendbarer Form ist die Verwendung von Komplextrennverfahren. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt allgemein die Herstellung einer Kultur mit angereicherten Sertoli-Zellen. Dies wird erreicht durch Entfernung von Aggregaten an Sertoli-Zellen, die durch enzymatische Behandlung der Tubuli seminiferi eines Tieres gewonnen wurden. Diese Zellen werden wiedergewonnen, isoliert, in Kunststoffkulturschalen plattiert und mit einem geeigneten Medium vermischt. Im Medium produzieren die Sertoli-Zellen natürlicherweise LCS, das gesammelt und vom mit Sertoli-Zellen angereicherten Kulturmedium durch eine komplexe Reihe von Trennschritten, wie sie im Beispiel II beschrieben sind, abtrennbar ist. Sobald LCS durch das oben beschriebene Trennverfahren aufgereinigt wurde, kann die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz durchgeführt werden.
Eines der Hauptziele bei der Durchführung der Analyse der N- terminalen Sequenz liegt in der Definition der Identität des gereinigten Proteins, die durch Vergleich mit existierenden Protein- und Gendatenbanken herausgefunden wird. Die Analyse der N-terminalen Sequenzen wird an Peptidfragmenten durchgeführt, die durch Abbau mit Trypsin/Protease V8/CNBr erhalten wurden (Cheng, C.Y., Musto, N.A., Gunsalus, G.L., Frick, J., und Bardin, C.W. (1985) J. Biol. Chem. 260:5631-5640; Hammod, G.L., Underhill, D.A., Smith, C.L. Goping, I.S., Harley, M.J., Musto, N.A., Cheng, C.Y., und Bardin, C.W. (1987) FEBS Letts. 215:100-104; und Gross, E. (1967) Meth. Enzymol. 11:238-255), um eine ausreichende Sequenzinformation zur Herstellung von Antikörpern gegen Peptidfragmente zu erhalten und um Oligonukleotide für Genklonierungsversuche herzustellen. Die Peptidfragmente werden entweder durch SDS-PAGE getrennt, auf PVDF- Membran übertragen und sequenziert, oder durch C18-Umkehrphasen-HPLC. Das oben genannte Verfahren wird geeignet sein, um ausreichende Sequenzdaten für anschließende Untersuchungen zu gewinnen, falls das zu untersuchende Protein nicht bis fast zur Homogenität gereinigt werden kann, während das zuletzt genannte Verfahren die Technik der Wahl sein wird, da etwa 30-50 PTH-(Phenylthiohydantoin-)Aminosäuren in einem einzelnen Sequenzierungsexperiment bestimmbar sind. Zur Bestimmung von Cystein (Cys) wird die reaktive Thiolgruppe durch geeignete chemische Verfahren durch S-Alkylierung mit 4-Vinylpyridin wie oben beschrieben neutralisiert (Hawke, D. und Yuan, P. (1987) Applied Biosystems User Bull. 28:1-8). Der N-terminale oder amin-terminale Abschnitt von LCS wird durch (SEQ. ID No. 1) gekennzeichnet und ist in der Fig. 4 angegeben. Xaa ist eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren.
Sobald ein Teil der Aminosäuresequenz bekannt ist, sind spezifische polyklonale Antikörper herstellbar. Polyklonale Antikörper werden unter Verwendung etablierter Verfahren (Vaitukaitis, J.L., Robbins, J.B., Nieschlag, E., und Ross, G.T. (1971) J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991) wie vorher beschrieben (Cheng, C.Y. und Bardin, C.W. (1987) J. Biol. Chem. 262:12768-12779 (7); Cheng, C.Y., Mathur, P.P., und Grima, J. (1988) Biochemistry 27:4079-4088 (8)); und Cheng, C.Y., Bardin, C.W., Musto, N.A., Gunsalus, G.L., Cheng, S.L. und Ganguly, M. (1983) J. Clin. Endocrinol. Metab. 56:68 75) hergestellt. Dann, wenn die Gewinnung einer ausreichenden Menge an Proteinen nicht möglich ist, schlagen die vorliegenden Erfinder vor, polyklonale Antikörper gegen synthetische Peptidfragmente herzustellen, die unter Verwendung der aus der Proteinsequenzanalyse der internen Fragmente erhaltenen Information konstruiert werden. Die chemische Synthese von 10 bis 30 Aminosäureresten wird durch das Festphasenverfahren (Merrifield, .B. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154) an der Rokkefeller University Protein Chemistry Core Facility durchgeführt. Das synthetische Peptid wird dann mit poly-L-Lysin durch etablierte Verfahren (Posnett, D.N., McGrath, H., und Tam, J.P. (1988) J. Biol. Chem. 263:1719-1725) vernetzt. Kurz gesagt, werden 0,5 mg des synthetischen Peptids mit 0,5 mg Carbodiimid umgesetzt, und das synthetische Peptid wird an poly-L-Lysin-hydrobromid
(Mr-Wert 30.000-70.000) gekoppelt. Dies wird als Immunogenquelle zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet. Die Monospezifität der Antiseren wird durch Kreuzimmunoelektrophorese oder Immunoblots bestimmt, wie dies an anderer Stelle beschrieben wurde (Cheng, C.Y. und Bardin, C.W. (1986) Biochemistry 25:5276-5288 (9); Cheng, C.Y. und Bardin, C.W. (1987) J. Biol. Chem. 262:12768-12779 (7); Cheng, C.Y., Mathur, P.P., und Grima, J. (1988) Biochemistry 27:4079-4088 (8)).
Zu den Hauptaufgaben bei der Herstellung polyklonaler Antikörper gehört die Identifizierung der für LCS kodierenden komplementären DNA (cDNA). Diese cDNA wird in eine geeignete Wirtszelle transfiziert. Mit monospezifischen polyklonalen Antikörpern werden testikuläre cDNA λ gt11-Expressionsbibliotheken der Ratte gescreent (Young, R.A. und Davis, R.W. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1194-1198), und die für diese Faktoren kodierende cDNA enthaltenden Klone werden weiter durch Epitopselektion charakterisiert (Weinberger, C., Hollenberg, S.M., Ong, E.S., Harmon, J.M., Bower, S.T., Cidlowski, J., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., und Evans, R.M. (1985) Science 228:740-742), wie dies vorher beschrieben wurde (Cheng, C.Y., Chen, C.-L.C., Feng, Z.M., Marshall, A., und Bardin, C.W. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155:398-404). Falls eine cDNA mit vollständiger Länge unter Verwendung dieses Ansatzes nicht erhältlich ist, wird eine synthetische Oligonukleotidprobe auf der Grundlage der teilweisen N-terminalen und internen Aminosäuresequenzen oder Nukleotidsequenzen synthetisiert werden und als alternativer Screening-Ansatz verwendet werden (Hammond, G.L., Underhill, D.A., Smith, C.L., Goping, I.S., Harley, M.J., Musto, N.A., Cheng, C.Y., und Bardin, C.W. (1987) FEBS Letts. 215-100-104). Mit [³²P]-markierten synthetischen Oligonukleotidproben wird die Bibliothek gescreent (Wallace, R.B., Johnson, M.J., Hirose, T., Miyake, T., Kawashima, E.H., und Itakura, K. (1981) Nucleic Acids Res. 9:879-894). Im Falle von Sequenzen, die nur in sehr geringer Anzahl vorkommen, werden synthetische Oligonukleotide als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Das PCR-Verfahren wird zur Amplifizierung spezifischer cDNAs aus mRNA-Präparationen durch Synthese von einem internen Oligonukleotid-Primer und Oligo dT verwendet (Berchtold, M.W. (1989) Necleic Acids Res. 17:453). Die so erhaltene cDNA wird verwendet, um die vollständige LCS-Sequenz, wie sie hier beschrieben wird, zu bestimmen, und sie wird ebenfalls zur Herstellung von LCS in Wirtszellen verwendet.
Restriktionsendonuclease wird zur Spaltung des cDNa-Inserts von der λ-DNA verwendet, dieses Insert wird in pGEM\-3Z-Vektor subkloniert und, wie vorher beschrieben, sequenziert (Cheng, C.Y., Chen, C.-L.C., Feng, Z.M., Marshall, A., und Bardin, C.W. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155:398-404; und Tabor, S. und Richardson, C.C. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4767-4771). Hierdurch wird die gesamte Aminosäuresequenz von LCS erhalten.
Ein anderes Verfahren zur Gewinnung einer cDNA oder einer genomischen DNA-Sequenz, die für LCS kodiert und die geeigneten Regulationssignale wie eine hieran gebundene Genpromotorsequenz und eine Genterminatorsequenz aufweist, wird hierdurch ebenfalls bereitgestellt. Nach Expression der für dieses Peptid kodierenden Gensequenz in der Wirtszelle kann LCS entweder aus dem verbrauchten Umgebungsmedium (falls das Protein von der Wirtszelle ausgeschieden wird) oder durch Zerstörung der Wirtszelle und Abtrennung von LCS hiervon gesammelt werden.
Die Wirtszelle für dieses Verfahren kann entweder eine prokaryotische Zelle, beispielsweise eine Bakterienzelle, oder eine eukaryotische Zelle, beispielsweise eine Pflanzen- oder Tierzelle, sein. Zur Herstellung im großen Maßstab sind Mikrobenwirte wie Bakterien oder Hefe verwendbar. Alternativ hierzu sind andere Genexpressionssysteme zur Produktion dieser Peptide verwendbar, beispielsweise kultivierte Säugerzellen.
Für LCS-kodierende Gene sind beispielsweise vollständig durch chemische Synthesen herstellbar oder können teilweise aus einem Teil oder vollständig aus einer Sequenz bestehen, die aus natürlichen Sequenzen stammt, die für ein Peptid kodieren. Eine chemische Synthese von Oligonukleotiden, die vollständig aus Desoxyribonukleotiden bestehen, kann durch Anwendung von Lösungschemie erhalten werden oder bevorzugt auf Festträgern durchgeführt werden. Es wurden verschiedene chemische Synthesen für Oligonukleotide entwickelt, und sie umfassen Phosphotriester-, Phosphit-triester- und Phosphoramidit-chemische Verfahren. Vergleiche M.H. Caruthers, "New methods for chemically synthesizing deoxyoligonucleotides" in Methods of DNA and RNA Sequencing (S.M. Weissman, Ed.; Praeger Publishers, New York), (1983), 1-22, und K. Itakura et al., "Synthesis and use of synthetic oligonucleotides:, Ann. Rev. Biochem. 53 (1984), 323-356. Chemische Syntheseverfahren unter Verwendung von Phosphoramidit wie solche unter Verwendung von N,N-Dimethylaminophosphoramiditen oder Beta-Cyanoethyl-diisopropylamino-phosphoramiditen oder Desoxyribonucleosid-morpholino-methoxyphosphinen werden aufgrund ihrer effizienten Kopplung der Neocleotide an eine wachsende Oligonukleotidkette und aufgrund der Stabilität der verwendeten chemischen Reagenzien bevorzugt. Die bevorzugteste Phosphoramiditchemie ist diejenige, die Beta-Cyanoethyldiisopropylamino-phosphoramidite verwendet, da diese im Vergleich zu vergleichbaren Zwischenprodukten eine hervorragende Stabilität aufweist und toxische Reagenzien wie Thiophenol vermieden werden. Vergleiche S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, "Deoxynucleoside Phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis", Tetrahedron Lett. 22, (1981), 1859-1862; L.J. McBride und M.H. Caruthers, "An investigation of several deoxynucleotide phosphoramidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides:, Tetrahedron Lett. 24, (1983), 245-248; T. Dorper und E.L. Winnakker, "Improvements in the phosphoramidite procedure for the synthesis of oligodeoxyribonucleotides", Nuc. Acids Res. 11, (1983) 2575-2584; und S.P. Adams et al., "Hindered dialkylamino nucleoside phosphite reagents in the synthesis of two DNA 52-mers", J. Amer. Chem. Soc. 105, (1983), 661-663. Die Phosphoramidit-Chemie auf Festträgern besteht, kurz gesagt, aus der Anlagerung eines modifizierten Nukleotids an ein Feststoffmaterial wie Glas, Silicagel, Folyacrylamid, Cellulose, Polystyrol, Nitrocellulose oder ein anderes, in üblicher Weise chemisch inertes Material. Die Nukleotidphosphatgruppe und beliebige exozyklische Stickstoffatome in der Nukleotidbase werden auf derartigen Trägern mit chemischen Gruppen geschützt, um unerwünschte Nebenreaktionen während der linearen Verlängerung der Oligonukleotidkette zu verhindern. Derartige Anlagerungen sind durch eine Vielzahl von Linker- oder Spacer- Resten erreichbar; zu den bevorzugten Linkern gehören jedoch üblicherweise langkettige Alkylamine. Vergleiche M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, U.S. Patent Nr. 4 458 066. Das angeheftete Nukleotid wird an der 5'-Zuckerposition mit einer säurelabilen chemischen Dimethoxytritylgruppe geschützt, die mit einer Säure wie Benzolsulfonsäure, Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure entfernt wird, um eine 5'-OH-Gruppe zur Kopplung freizusetzen, wodurch die Verknüpfung zusätzlicher Nukleotide beginnt. Bevorzugte Säuren für diesen Entblockierungsschritt oder Aktivierungsschritt sind Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure. Anschließend wird in Gegenwart einer schwachen Säure ein Phosphoramidit-Monomer-Nukleosid zugesetzt das in ähnlicher Weise wie das an den Feststoffträger angebrachte Nukleotid geschützt ist, um einen nukleophilen Angriff der 5'-OH-Gruppe auf das Phosphoramidit-Reagens zu unterstützen. Bevorzugte schwache Säuren für den Kopplungsschritt umfassen Tetrazol, Aminhydrochloride und 3-Nitrotriazol, wobei die bevorzugteste schwache Säure Tetrazol ist. Kopplungs-Fehlstellen auf dem Festträger werden dann durch Acetylierung freier Hydroxylgruppen mit Essigsäureanhydrid blockiert oder gecappt. Ein bevorzugtes Co-Reagens im Capping- Schritt ist 1-Methylimidazol. Die natürliche Internukleotid- Phosphatdiester-Verbindung wird anschließend bei jedem Nukleotid-Zugabezyklus durch Behandlung der wachsenden Nukleotidketten auf dem Feststoffträger mit einer milden Oxidationsmischung erzeugt. Dieser Oxidationsschritt wandelt Phosphor (III) zum stabileren Phosphor (V)-Oxidationszustand um und verhindert einen Nukleotidkettenabschnitt an irgendwelchen nachfolgenden Entblockierungs- oder Aktivierungsbehandlungsschritten durch Säurespezies wie Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure. Iod wird als oxidierende Spezies mit Wasser als Sauerstoffdonor verwendet. Bevorzugte Co-Reagenzien umfassen Tetrahydrofuran und Lutidin. Nach einer Waschung des Festträgers mit wasserfreiem Acetonitril kann der Entblockierungs/Kopplungs-/Oxidations-/Capping-Zyklus so oft wie notwendig wiederholt werden, um das Oligonukleotid oder die Oligonukleotide der Wahl herzustellen, wobei jedes Mal das entsprechende geschützte Beta-Cyanoethylphosporamidit-Nukleosid verwendet wird, um das eine Purin- oder Pyrimidinbase tragende Nukleotid der Wahl zu insertieren. Die Purinbasen werden entweder Adenin oder Guanin auf dem eingesetzten Nukleotid, und die Pyrimidinbasen werden bevorzugt Cytosin oder Thymidin sein. Die Einfachheit der chemischen Synthese der Oligonukleotide führte zur Entwicklung praktischer Anleitungen für Laborarbeit und zur verbreiteten Anwendung kommerzieller automatisierter DNA- Synthesegeräte. Vergleiche M.H. Caruthers, "Gene synthesis machines: DNA chemistry and its uses", Science 230, (1985), 281-285; und J.W. Efcavitch, "Automated System for the optimized chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications (Alan R. Liss, Inc., New York), (1988), 221-234. Kommerzielle Instrumente sind aus verschiedenen Quellen erhältlich, beispielsweise DuPont Company (Wilmington, DE), Milligen/BioSearch, Inc. (San Rafael, CA) und Applied Biosystems (Foster City, CA).
Der letzte Kopplungsschritt der Oligonukleotide kann unter Verbleib der 5'-terminalen Dimethoxytritylgruppe oder unter deren Abspaltung abgeschlossen werden. Die Dimethoxytritylgruppe wird bevorzugt zur nachfolgenden Reinigung der Oligonukleotide mit der vollen Länge belassen. Von den vollständig synthetisierten und mit einer Schutzgruppe versehenen Oligonukleotiden müssen die Schutzgruppen entfernt, und die Oligonukleotide müssen vom Festträger vor der Aufreinigung abgespalten werden. Der die vollständigen Oligonukleotide tragende Festträger wird mit frischem, konzentrierten Ammoniumhydroxid bei Raumtemperatur für wenigstens eine Stunde behandelt, um die Oligonukleotide vom Trägerharz abzuspalten. Der Feststoffträger wird dann mit konzentrierterem Ammoniumhydroxid gewaschen, und das vereinigte konzentrierte Ammoniumhydroxid wird bei 55-60ºC wenigstens acht Stunden lang in einem verschlossenen Gefäß inkubiert, um die chemischen Schutzgruppen von den geschützten Basen zu entfernen. Die Probe wird dann abgekühlt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Probe kann weiterhin aus frischem konzentrierten Ammoniumhydroxid oder Ethanol mit wenigstens 95 Vol.-% Reinheit erneut abgedampft werden. Die Endprobe kann dann im lyophilisierten (trockenen) Zustand aufbewahrt oder in sterilem destillierten Wasser vor der Aufbewahrung bei -20ºC resuspendiert werden. Vergleiche PCR- Mate Model 391 user's manual, supra, und M.H. Caruthers et al., "Chemical Synthesis of Deoxyoligonucleotides by the Phosphoramidite Method", Methods in Enzymology 154, (1987), 287-313.
Alle Oligonukleotide, die geschnitten sind und denen die Schutzgruppen entfernt wurden und die durch eines der oben beschriebenen bevorzugten Verfahren hergestellt wurden, sind durch ein oder mehrere der aus dem Stand der Technik bekannten verschiedenen Verfahren herstellbar. Diese Reinigungstechniken umfassen Polyacrylamidgelelektrophorese, Agarosegelelektrophorese, Größenausschlußchromatographie, Affinitätschromatographie, HPLC und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Techniken beschränkt. Das bevorzugte Verfahren wird aus den nachfolgenden Reinigungstechniken ausgewählt: Polyacrylamidgelelektrophorese, HPLC und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Ein derartiges bevorzugtes Verfahren ist die präparative Polyacrylamidgelelektrophoresereinigung von Oligonukleotiden, denen eine Dimethoxytritylgruppe am 5'-Terminus fehlt, auf einem vertikalen 12% Polyacrylamidplattengel, 20 x 20 x 0,15 cm, in 7 M Harnstoff, 90 mM Tris-HCl, pH 8,3, 90 mM Borat, 12 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Ein Teil jedes zu reinigenden Oligonukleotids (0,3-3,0 A&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten) wird unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft, in Formamid:1 mM Dinatrium-EDTA (größer als 9:1), das wenigstens 0,01% Bromphenolblau und wenigstens 0,01% Xylencyanol enthält, resuspendiert, 2-3 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt, schnell in eine Eisaufschlämmung gesetzt und dann in einzelne Vertiefungen (wenigstens 6 mm Breite) gegeben. Die Probe(n) wird bzw. werden bei 40-45 W zur Anode hin einer Elektrophorese unterworfen, bis das Bromphenolblau bis zu wenigstens 2/3 der Polyacrylamidgel-Länge gewandert ist. Die Oligonukleotide mit der vollen Länge werden dann dadurch sichtbar gemacht, daß das Polyacrylamidgel auf ein Stück einer flexiblen, klaren Kunststoffolie, beispielsweise Saran Wrap, gegeben wird, wobei das Gel auf eine dünne Chromatographieplattenschicht (z.B. Silicagel F-254; Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA), die einen Fluoreszenzindikator enthält, gesetzt wird, und das Polyacrylamidgel wird unter Beleuchtung mit kurzwelligem Ultraviolettlicht geprüft. Das Material mit der vollständigen Bandenlänge wird dann im Polyacrylamid ausgeschnitten und ist aus dem Gel durch verschiedene Verfahren, beispielsweise Elektroelution oder einfache Diffusion in Puffer, isolierbar und aufreinigbar. Das bevorzugte Extraktionsverfahren ist die Diffusion in 0,5 ml 0,3 M Natriumacetat, pH 7,5 über Nacht unter Schütteln und nachfolgende Extraktionen der wäßrigen Phase mit Phenol:Chloroform (1:1, v:v) und Ethanolpräzipitation. Das präzipitierte Oligonukleotid kann dann in einem geeigneten Volumen (üblicherweise im Bereich von 10-1.000 Mikrolitern) eines geeigneten Puffers, beispielsweise 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Dinatrium-EDTA oder in sterilem destillierten Wasser resuspendiert und bei -20ºC gelagert werden. Vergleiche den Abschnitt 2.12, "Purification of oligonucleotides using denaturing polyacrylamide gel electrophoresis" in Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Eds., (1989).
Ein alternatives und bevorzugteres Reinigungsverfahren, das sich auch zur Reinigung von Oligonukleotiden eignet, die einen Dimethoxytritylrest am 5'-Terminus tragen, ist die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf einer HPLC-Umkehrphasensäule. Eine derartige HPLC-Umkehrphasensäule kann mit beliebigen auf Silica- oder auf Polymer basierenden Harzen bepackt werden, die kommerziell von einer Anzahl von Firmen erhältlich sind, beispielsweise Millipore/Waters (Milford, MA), The Nest Group (Southboro, MA), Rainin Instrument Company, Inc. (Woburn, MA), J. T. Baker Inc. (PHillipsburg, NJ), Alltech Associates Inc. (Deerfield, IL), oder Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Die Oligonukleotide werden aufgeladen, fraktioniert und von einer derartigen HPLC-Säule beispielsweise durch einen Acetonitrilgradienten in irgendeinem geeigneten, nicht destruktiven Puffer eluiert. Bevorzugte Acetonitrilgradienten liegen im Bereich von 5% bis 40% und bevorzugter im Bereich von 5% bis 30% in 0,1 M Triethylammoniumacetat, ph 7,0, Puffer. Bevorzugte HPLC-Umkehrphasensäulen umfassen solche mit gebundenen linearen Alkylkettenresten, beispielsweise C&sup4;-, C&sup8;- oder C¹&sup8;-Alkylketten. Die das gereinigte Oligonukleotid mit der vollständigen Länge enthaltenden Fraktionen werden dann vereinigt, unter Vakuum verdampft und in 3% (v/v) Essigsäure in Wasser bei Raumtemperatur 10-30 Minuten lang resuspendiert. Die detritylierten Oligonukleotide werden dann ethanol-präzipitiert oder durch andere geeignete Mittel wie Größenausschlußchromatographie gereinigt. Alternativ hierzu können die detritylierten Oligonukleotide mit der vollständigen Länge ebenfalls durch HPLC unter Verwendung verschiedener Säulenarten und Gradientenmaterialien gereinigt werden. Anleitungen hierfür sind beispielsweise in G. Zon und J. A. Thompson, "A review of high-performance liquid chromatography in nucleic acids research", BioChromatography 1, (1986), 22-32 zu finden.
Es werden ein oder mehrere synthetische Oligonukleotide notwendig sein, um ein teilweises oder vollständiges synthetisches Gen für die vorliegende Erfindung herzustellen. Beliebige geeignete Oligonukleotide und/oder Teile eines natürlichen Gens oder ein ganzes natürliches Gen wie ein natürliches LCS- Gen können zu einem für LCS kodierenden Gen dadurch zusammengestellt werden, daß diese DNAs durch Mittel wie Erhitzen, Vermischen mit einem chaotropen Reagens wie Harnstoff oder Formamid oder Einwirkenlassen einer alkalischen Lösung denaturiert werden. Phosphatreste können wahlweise enzymatisch an beliebige DNAs oder Oligonukleotide, denen Phosphatreste fehlen, angebracht werden, wobei ein Enzym wie T4-Polynukleotidkinase verwendet wird. Vergleiche Abschnitt 3.10 in Current Protocols in Molecular Biology, supra. Anschließend werden beliebige Oligonukleotide, die zur Herstellung eines Gens, das von der Erfindung mit umfaßt wird, verwendet werden, und in Gegenwart oder Abwesenheit beliebiger zusätzlicher natürlicher DNAs renaturiert oder einer Annealing-Behandlung unterzogen, wobei geeignete Mittel, beispielsweise langsames Abkühlen auf Raumtemperatur oder Dialyse, zur Entfernung aller chaotropen Mittel verwendet werden. Diese einer Annealing-Behandlung unterzogenen DNAs können kovalent durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym wie T4 DNA-Ligase verbunden werden. Vergleiche Abschnitt 3.14 in Current Protocols in Molecular Biology, supra.
Falls notwendig und wenn geeignet, können durch diese Mittel hergestellte, für Peptide kodierende Genprodukte zum Anhängen an genregulatorische DNA-Sequenzen durch Behandlung mit Restriktionsendonukleasen entsprechend den Beschreibungen der Hersteller oder durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Vergleiche beispielsweise T. Maniatis et al., Molecular Cloning, supra, S. 104-106.
Genregulationssignale, die an für Peptide kodierende Gene angehängt werden, um sie zur Expression als Protein in einer definierten Wirtszelle zu befähigen, können Genpromotorsequenzen umfasen, bei denen es sich um DNA-Sequenzen handelt, die durch die biologische Maschinerie der Wirtszelle erkannt werden und die die Transkription der DNA-Sequenz in Messenger-RNA (mRNA) durch eine RNA-Polymerase in der Wirtszelle induzieren. Diese mRNA muß dann dazu befähigt sein, daß sie auf Ribosomen in der Wirtszelle in ein Proteinprodukt übersetzt wird. Die Genpromotorsequenzen können teilweise oder vollständig von in Zellen gefundenen Promotorsequenzen, nicht jedoch von solchen der Wirtszelle, abstammen, solange sie den oben genannten Kriterien zur Transkription und Translation genügen. Ein üblicher Weg, um dies zu erreichen, ist die Insertion der komplementären DNA in einen Expressionsvektor mit einem Promotor, der eine TATA-Box umfaßt und entweder ein hormon- oder ein metallresponsives Element aufweist. Wenn dieser Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle transfiziert wird, wird die Wirtszelle LCS in großen Mengen als Antwort auf das Hormon oder das Metall produzieren.
Ein zweites Genregulationselement, das einem LCS-Gen zur Expression von LCS angefügt werden kann, ist ein Genterminator oder eine Polyadenylierungssequenz. Diese DNA-Sequenz enthält eine genetische Information, die die weitere Transkription unterbricht und stoppt und, im Falle eukaryontischer Zellen, die Information enthält, die die Anlagerung eines oder mehrerer Adenosinnukleotide an das 3'-Ende der mRNA steuert. Eine Genterminatorsequenz kann einen Teil einer Terminatorsequenz oder die vollständige Terminatorsequenz aus dem Genom der Wirtszelle oder aus dem Genom einer anderen Zelle darstellen, von der bekannt ist, daß sie zur entsprechenden Terminierung der Transkription in der Wirtszelle befähigt ist. Ein Beispiel für eine derartige Sequenz wäre die Salmonella typhimurium his-operon, rho-unabhängige Transkriptionsterminatorsequenz (vergleiche beispielsweise M.E. Winkler, Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology [F.C. Neidhardt, Ed.-in-chief; American Society for Microbiology, 1987], Kapitel 25) oder die Octopinsynthase-Terminatorsequenz aus Agrobacterium tumefaciens Ti-Plasmid (vergleiche beispielsweise H. DeGreve et al., "Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmidencoded octopine synthase gene", J. Mol. Appl. Genet. 1, (1982), 499-511).
Ein Peptid, das ein Gen oder Gene mit anhängenden Genregulationssignalen exprimiert, wird bevorzugt in eine Wirtszelle entweder prokaryontischen oder eukaryontischen Ursprungs für die beabsichtigte LCS-Expression eingeführt. Die Mittel zur Einführung sind im Stand der Technik bestens beschrieben, und sie hängen von der Art der Wirtszelle, in der die Genexpression durchgeführt werden soll, ab. Beispielsweise ist die Transformation von Bakterienzellen mit extern zugeführter DNA wie Zellen von Escherichia coli durch ein Calciumchlorid-Verfahren erreichbar. Typischerweise werden das Peptidgen oder die Peptidgene mit den anhängenden Genregulationssequenzen vor dem Transformationsverfahren in einem geeigneten Transformationsvektor kovalent gebunden. Ein Überblick über derartige Vektoren findet sich in Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses by R. L. Rodriguez and D. T. Denhardt (Butterworths, Boston; 1988). Vergleiche ebenfalls T. Maniatis et al., Molecular Cloning, supra, S. 247-255.
Nach Expression mit einem derartigen Genexpressionssystem in einer geeigneten Wirtszelle kann das Peptid durch herkömmliche Mittel extrahiert und/oder gereinigt werden. Verfahren zur Extraktion des Peptids aus Wirtszellen umfassen Hitze- und/oder enzymatische Lyse der Wirtszelle, Solubilisierung in einem Lipidlösungsmittel oder einer wäßrigen organischen Mizell-Lösung, und Zerbrechen der Zellmembranen und/oder der Zellwände unter Druck, wobei die Wirtszellen durch eine French-Presse gedrückt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Zell-Lyse im Falle von Bakterien als Wirtszellen hängt vom beabsichtigten Produktionsmaßstab ab. Bei einer Produktion im großen Maßstab ist ein Aufbrechen der Bakterienzellen unter Hitze oder Druck bevorzugt. Vergleiche beispielsweise H. Hellebust, "Different approaches to stabilize a recombinant fusion protein", Bio/Technology 7, (1989), 165-168. Der extrahierte LCS ist in seiner unmittelbaren Form ohne weitere Aufreinigung verwendbar, oder er kann teilweise oder vollständig durch Anwendung einer oder mehrerer Fraktionierungen des Zellinhalts durch Verfahren wie Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese, Affinitätschromatographie oder ähnlichem gereinigt werden.
Während LCS zum besseren Verständnis des Zusammenspiels der Hoden dienen kann, weist die Isolierung dieses Peptids weit wichtigere pharmazeutische Anwendungen auf. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind zur Behandlung von Tieren einsetzbar, die an Fehlfunktionen leiden, die auf die Androgenwirkung zurückzuführen sind, beispielsweise hypogonadotroper Hypogonadismus, Anorchie, Orchitis, Leydig-Zellen-Aplasie, verzögert einsetzende Pubertät und Infertilität.
Wenn die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen nur LCS zur Erhöhung der Androgensekretion durch Leydig-Zellen enthalten, hängt die bereitgestellte LCS-Menge von einer Vielzahl von Faktoren ab. Zunächst hängt die bereitgestellte LCS- Menge von der Größe und vom Gewicht des eine derartige Behandlung benötigenden Patienten und vom Ausmaß der gewünschten erhöhten Androgensekretion ab. Weiterhin hängt die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verabreichte LCS-Menge zu einem gewissen Grad von der Art des verwendeten Zufuhrträgers ab und von der Häufigkeit der verabreichten Dosierungen. Eine einzelne maximale Stimulationsdosis von hCG (6000 IU entsprechen etwa 0,46 mg) wird das Serumtestosteron für vier Tage in einem männlichen Erwachsenen über das Normalniveau erhöhen. Eine maximale Stimulationsdosis von LCS wird ähnliche Ergebnisse ergeben. Deshalb wenden etwa 2,3 mg LCS benötigt werden, und sie müssen zwei- bis dreimal pro Woche an einen männlichen Erwachsenen verabreicht werden. Eine derartige Behandlung wird häufig verwendet, um die Geschlechtsreife in Personen abzuschließen, die ihre pubertäre Entwicklung aufgrund einer Leydig-Zellen-Aplasie, Anorchie oder Orchitis nicht vollständig abschließen konnten. In der klinischen Praxis werden manchmal geringere Mengen als die maximalen Mengen in einer Dosis von 1.000-2.000 IU jeden zweiten Tag zur Behandlung der Infertilität und des hypogonadotropen Hypogonadismus verwendet. Dosen von zwischen etwa 0,4 und etwa 0,8 mg LCS, die jeden zweiten Tag verabreicht werden, könnten deshalb ähnliche Wirkungen zeigen. Demnach können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zwischen etwa 0,1-5,0 mg LCS, und bevorzugter zwischen etwa 0,4 und etwa 2,4 mg LCS enthalten, und die Verabreichung dieser LCS-Menge wird jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Zustand, der Größe des Patienten und von anderen, dem Arzt bekannten Faktoren stattfinden. Wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weiterhin entweder LH oder CG enthalten, wird die Menge LH/CG zwischen etwa 0,1-0,46 mg liegen.
Während viele Verfahren zur Verabreichung von LCS an beispielsweise männliche Individuen umfaßt werden, umfassen die bevorzugten Verfahren die Verabreichung von LCS durch intramuskuläre oder subkutane Injektion. Dies ist ebenfalls das bevorzugte Verfahren zur Verabreichung von LH, hCG und FSH. Natürlich können einzelne Dosen beliebiger dieser Verbindungen auf der Grundlage der Serumtestosteronspiegel während der Behandlung in jedem Individuum in der benötigten Weise eingestellt werden. Erfindungsgemäß und zur Erzielung der maximalen Testosteronsekretion durch Leydig-Zellen würde eine Dosisform verabreicht werden, die beispielsweise 0,46 mg hCG und 2,3 mg LCS (maximale Stimulationsdosen an hCG und LCS) enthalten. Hierdurch wurde unerwarteterweise gefunden, daß der Androgensekretionsspiegel höher liegt als derjenige, der durch die Anwendung einer maximal stimulatorischen Dosis von LH allein erreichar wäre, wobei vor dieser Entdeckung davon ausgegangen wurde, daß die Verabreichung ausschließlich von LH den höchstmöglichen Spiegel an Androgensekretion ergibt.
Natürlich können auch die pharmazeutisch verträglichen Salze von LH/CG, FSH oder LCS verabreicht werden.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Dosisformen werden durch Auflösen von trockenem LCS in Wasser hergestellt. Falls beispielsweise 2,5 mg LCS zu verabreichen sind, werden bevorzugt 25 mg LCS in 10,0 cm³ Wasser gelöst. Zu dieser Lösung kann eine Anzahl üblicher Hilfsstoffe gegeben werden. Die üblichsten, erfindungsgemäß einsetzbaren Hilfsstoffe zur Herstellung parenteraler Dosisformen umfassen D-Mannitol oder D-Lactose, 5% als Stabilisator, Serumalbumin in einer Konzentration von 0,1- 1%, um die Oberflächenadsorption zu inhibieren und um während der Lyophilisierung als Cryoschutzmittel zu wirken; und/oder Natriumcitrat oder Natriumacetat als Puffer, falls erforderlich. Falls LCS, entweder allein oder in Kombination mit beispielsweise LH/CG, in einer parenteralen Verdünnung anstelle einer lyophilisierten Form verabreicht wird, sollten 0,5% Chlorbutanol oder 0,01% Dimerosol in die Formulierung als Konservierungsmittel gegeben werden. Deshalb kann beispielsweise die oben beschriebene 2,5 mg/ml-Formulierung weiterhin 5% D-Mannitol, 0,5% Serumalbumin und eine ausreichende Puffermenge enthalten, um einen pH-Wert von etwa 7,4 aufrechtzuerhalten.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen weiter beschrieben. Diese Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung der Erfindung. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel I: Herstellung eines mit primären Sertoli-Zellen angereicherten Kulturmediums

Mit Sertoli-Zellen angereicherte Kulturen wurden aus 20 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten unter Verwendung der Verfahren von Mather & Sato (1979) hergestellt, wobei geringfügige Veränderungen vorgenommen wurden, wie sie an anderer Stelle beschrieben wurden (Cheng et al., 1986; Cheng und Bardin, 1987 (7)). Aggregate von Sertoli-Zellen mit 5-10 Zellen, die aus den enzymatischen Behandlungen unter Verwendung von Collagenase/Dispase gewonnen wurden (Chen et al., 1986), wurden durch ein Monofilament-Nylongewebe (Nitex HC3-102) von um Mesh filtriert, viermal in serumfreiem Kulturmedium (F-12/DME, 1:1, v/v, supplementiert mit 1,2 mg/l Natriumdicarbonat, 15 mM HEPES und 20 mg/l Gentamycin) bei 800 g (je 5 Min.) gewaschen. Die Zellen wurden in 100 mm Kunststoffkulturschalen in einer Dichte von 4,5 x 10&sup6; Zellen pro Schale (je 9 ml) in serumfreiem Medium, supplementiert mit 10 ug/ml Insulin, 5 ug/ml Human-Transferring, 2,5 ug/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 5 ug/ml Bacitracin, 2 x 10&supmin;&sup7; M Testosteron und 300 ug/ml Schaf-FSH, plattiert. Bacitracin wurde in das Kulturmedium aufgenommen und als unspezifischer Protease-Inhibitor verwendet (Patty et al., '77; Simmons und Ritzmann, '89). Die Zellen wurden bei 30ºC in einer befeuchteten Kulturkammer mit 95% Luft und 5% CO&sub2; gehalten. Verbrauchtes Medium wurde am Tag 4 gesammelt, und frisches Medium wurde zugegeben, und die Zellen wurden weitere 4 Tage lang kultiviert. Anschließend wurde das Medium gesammelt, vereinigt und bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert. 350 ml von mit primären Sertoli-Zellen angereichertem Kulturmedium pro Kultur unter Verwendung von 20 Ratten im Alter von 20 Tagen wurden routinemäßig erhalten. Ein 6 l-Ansatz von mit 5ertoli-Zellen angereicherten Primärkulturen wurde zur Aufreinigung und Verwendung von bereits beschriebenen Verfahren verarbeitet (Cheng und Bardin, 1986; 1987; Cheng et al., 1988 (10)). Die Konzentration und die Äquilibrierung des Mediums wurde mit einer mit 8 Millitan -Platten mit einem Mr-Ausschluß bei 10.000 (Cheng et al., 1989 (11)) ausgerüsteten Millipore- Minitan -Ultrafiltrationseinheit durchgeführt. Alle Verfahren wurden, falls nicht anders beschrieben, bei 4ºC durchgeführt. Die Probe wurde vor Verwendung durch eine 0,2 um Nalgene-Filtereinheit filtriert.

Beispiel II - Isolierung von LCS

Anionenaustausch-HPLC

Die zur präparativen Fraktionierung von mit primären Sertoli- Zellen angereichertem Kulturmedium auf einer Mono Q HR 10/16 (16 x 100 mm I.d.; Teilchengröße 10 um) verwendeten Verfahren wurden wie bereits beschrieben durchgeführt (Cheng und Bardin, 1986; 1987; Cheng et al., 1988, 1989; Cheng, 1990). Gegen Lösungsmittel A (20 mM Tris, pH 7,4 bei 22ºC) äquilibriertes Medium, das auf etwa 100 ml im obigen Schritt eingeengt worden war, wurde auf die präparative Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min. aufgebracht, und die Proteine wurden unter Verwendung eines linearen Salzgradienten mit 0-80% Lösungsmittel B (20 mM Tris, pH 7,4 bei 22ºC, enthaltend 600 mM NaCl) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min. über einen Zeitraum von 120 Min. eluiert.
Die aus der Anionenaustausch-HPLC-Säule und aus zur anschließenden HPLC-Reinigung verwendeten Säulen gewonnenen Eluate wurden gleichzeitig durch UV-Absorption bei 280 nm und durch Diodenanordnungstechnologie unter Verwendung eines LKB-Modells 2140 Rapid Spectral Detectors mit einem Wellenlängenspektrum im Bereich zwischen 190 und 370 nm und einer Integrationszeit von 1 Sekunde geprüft. Die Daten wurden gewonnen und verarbeitet, und unter Verwendung eines mit einem Videographik-Adaptor, der an den Rapid Spectral Detektor angeschlossen war, ausgerüsteten Personal Computers wurde ein Chromatogramm erstellt. Die Verwendung der Diodenarray-Technologie zur Aufzeichnung des Protein-Elutionsprofils ergibt viele wertvolle Strategien zur anschließenden Reinigung möglicher parakriner Faktoren, die im mit Sertoli-Zellen angereichertem Kulturmedium enthalten sind, da Proteine, die bei 280 nm schwach oder gar nicht absorbieren, ohne weiteres unter Verwendung dieser Technik identifizierbar sind. Somit kann die Komplexität der Proteinmischungen in einer gegebenen Säulenfraktion ohne weiteres identifiziert werden.
Nach der Trennung der Sertoli-Zellproteine durch HPLC wurden insgesamt 12 Hauptprotein-Peaks beobachtet. Dann wurde von jeder Fraktion ein Aliquot entnommen und unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels IV für LCS einem Bioassay unterworfen. Die in jeder Testkavität enthaltenen Testosteronkonzentrationen wurden durch einen Radioimmunoassay bestimmt. Es wurde nur die Bioaktivität unter dem Peak I gesammelt, vereinigt und zur anschließenden Reinigung verarbeitet.

Gelpermeations-HPLC

Eine präparative Gelpermeations-HPLC wurde im wesentlichen wie bereits beschrieben durchgeführt (Cheng und Bardin, 1987 (7); Cheng et al., 1988a; Cheng et al., 1988b; Cheng, 1990 (15)). Die Fraktionen, die eine die Leydig-Zell-Steroidgenese stimulierende biologische Aktivität enthielten, wurden vereinigt, auf etwa 2 ml unter Verwendung einer Ultrafiltrationseinheit Amicon Modell 8010 mit einer YM-10-Membran mit einem Mr-Ausschluß bei 10.000 konzentriert und gegen PBS-Puffer (10 mM Natriumphosphat, pH 6,8 bei 22ºC, enthaltend 0,15 M NaCl) äquilibriert. Die Probe wurde auf eine BioSil TSK-250 HPLC- Größenausschlußsäule (21,5 x 600 mm I.d.) mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. aufgebracht, und die Proteine wurden unter Verwendung von PBS-Puffer eluiert, und die Eluate wurden durch UV-Absorption bei 280 nm untersucht. Man fand insgesamt vier Protein-Hauptpeaks, und die biologische Aktivität wurde unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels IV überprüft. Die Aktivität wurde in Fraktionen zwischen den Peaks 2 und 3 lokalisiert, Diese Fraktionen wurden vereinigt, gegen doppelt destilliertes Wasser unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit (Modell 8010) mit einer Amicon YM- 10-Membran äquilibriert und lyophilisiert.

C4-Umkehrphasen-HPLC

Der in der lyophilisierten Probe enthaltene Leydig-Zellstimulator wurde in 2 ml Lösungsmittel A [5% ACN (Acetonitril)/95% H&sub2;O, 0,1% TFA (Trifluoressigsäure), v/v] resuspendiert und auf eine präparative Vydac C4-HPLC-Umkehrphasensäule (22 x 250 mm I.d., Teilchengröße 10 um) mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/Min. aufgebracht. Die Proteine wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten mit 5-80% Lösungsmittel B (95% ACN/5% H&sub2;O, 0,1% TFA, v/v) über einen Zeitraum von 90 Min. eluiert. Insgesamt wurden 12 Proteinpeaks beobachtet. Von jeder dieser Fraktionen wurde ein Aliquot gemäß dem Verfahren des Beispiels IV einem Bioassay auf LCS unterzogen. Die biologische Aktivität eluierte unter dem Proteinpeak 1 (Fig. 3C). Die Fraktionen unter diesem Peak wurden gesammelt und lyophilisiert.

Diphenyl-Umkehrphasen-HPLC

Aus dem obigen Schritt gewonnener, teilweise gereinigter LCS wurde in 200 ul Lösungsmittel A (5% ACN/95% H&sub2;O, 0,1% TFA, v/v) resuspendiert und auf eine Vydac-Diphenyl-Umkehrphasen-HPLC Säule (4,6 x 250 mm I.d.; Teilchengröße 5 um) aufgebracht. An die Säule gebundene Proteine wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40-100% Lösungsmittel B (95% ACN/5% H&sub2;O), 0,1% TFA, v/v) über einen Zeitraum von 120 Min. eluiert, und insgesamt wurden 8 Proteinpeaks erhalten. Die biologische Aktivität, bestimmt unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels IV, war unter dem Proteinpeak 3 lokalisiert. Die Fraktionen unter diesem Peak wurden vereinigt, lyophilisiert und in 200 ml Lösungsmittel A resuspendiert.

C18-Umkehrnhasen-HPLC

Der aus der Phenyl-Umkehrphasen-HPLC wiedergewonnene, teilweise gereinigte LCS wurde in 200 ul Lösungsmittel A resuspendiert und auf eine Vydac C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (4,6 x 250 mm I.d.; Teilchengröße 5 um) aufgebracht. Zur Elution der gebundenen Proteine wurde ein linearer Gradient von 10-70% Lösungsmittel B (95% ACN/5% H&sub2;O, 0,1% TFA, v/v) über einen Zeitraum von 100 Min. bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. verwendet. Insgesamt wurden 9 Proteinpeaks gefunden, und die biologische Aktivität wurde unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel IV unter dem Proteinpeak 4 identifiziert. Unter Verwendung der oben genannten Verfahren erhielten die Erfinder aus 6 1, etwa 200 mg Gesamtprotein enthaltendem Ausgangsmedium ein gereinigtes Protein, wobei ein Reinigungsgrad um das etwa 1940-fache und eine Wiedergewinnung von etwa 1,4% der biologischen Aktivität erhalten wurden.

Beispiel III Herstellung gereinigter Leydig-Zellen

Leydig-Zellen wurden aus Testes unter Verwendung einer Modifikation der bereits beschriebenen Verfahren isoliert (Lefevre et al., 1983 (12); Simpson et al., 1987). Eine Gruppe von 10 Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 80 Tagen wurde durch Ersticken getötet. Die Testes wurden entfernt und in serumfreies Medium [Ham's F-12 Nährmischung: Dulbecco's-modifiziertes Eagles (DME), 1:1, v/v], supplementiert mit 1,2 g/Liter Natriumbicarbonat, 15 mM HEPES und 20 mg/Liter Gentamycin, überführt. Die Organe wurden zweimal in diesem Medium gewaschen, um Blutplättchen und verbliebenes Gewebe zu entfernen. Die Testes wurden dann entkapselt und in F-12/DME-Medium, supplementiert mit 0,05% Collagenase-Dispase/0,005% Sojabohnentrypsin-Inhibitor (w/v) in einem Gesamtvolumen von 5 ml/Testis in konischen 50 ml-Kulturröhrchen inkubiert. Die Kulturröhrchen wurden in einem Umwälzwasserbad bei 35ºC suspendiert und mit einer Geschwindigkeit von 80 Bewegungen/Minute 20 Minuten lang geschüttelt. Die Rohzellsuspension wurde zweimal durch Rytex - Polyamidnylonfaser (3-60/45 Mesh) (Tetko Inc.) filtriert. Die Zellen wurden zweimal in F-12/DME-Medium bei 200 g 7 Minuten lang gewaschen und in serumfreiem Medium mit einer Konzentration von 50 x 10&sup6; pro 0,5 ml pro Gradientenfraktionierung resuspendiert. Ein diskontinuierlicher Percoll (Pharmacia/LKB Biotechnology)-Gradient von 20-80% wurde in einem runden, 15 ml Corning-Bodenzentrifugenröhrchen unter Verwendung zweier Stammlösungen A (Percoll: 10x F-12/DME-Medium; 9:1, v/v) und B (F-12/DME-Medium) hergestellt. Durch Vermischen geeigneter Volumina an Lösungen A und B und sorgfältigem Einschichten in das 15 ml Einwegzentrifugenröhrchen mit der höchsten Konzentration an Percoll am Boden wurden 13 Lösungen mit zunehmenden Percoll-Konzentrationen von 20-80% der Lösung A hergestellt. Die Zellen wurden sorgfältig auf die oberste Schicht des diskontinuierlichen, 20%igen Percoll-Gradienten geschichtet und bei 1.000 g 20 Minuten lang bei 22ºC zentrifugiert. Insgesamt 12 sichtbare Banden mit testikulären Zellen wurden an jeder Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen Percoll-Konzentrationen festgestellt. Die Zellfraktion einer jeden Percoll-Gradientengrenzfläche wurde sorgfältig durch Pipettieren entfernt, zweimal in F-12/DME-Medium gewaschen und durch Zentrifugation bei 200 g für 10 Minuten sedimentiert und in F-12/DME-Medium, supplementiert mit Insulin (10 ug/ml) und Transferring (5 ug/ml), resuspendiert. Die Zellzahl wurde unter Verwendung eines Hämocytometers bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Tryptanblaufarbstoff-Ausschluß bestimmt, und die Authentizität der Leydig-Zellen wurde durch 3ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD)-Histochemie, wie bereits beschrieben, bestimmt (Wiebe, 1976; Steinberger et al., 1966; Browning et al., 1981). Leydig-Zellen mit mehr als 90%iger Reinheit wurden in den Schichten zwischen 8, 9 und 10 erhalten, was durch 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-Färbung verifiziert wurde. Routinemäßig wurden 5 x 10&sup6; gereinigte Leydig-Zellen pro Aufreinigung unter Verwendung fünf adulter Ratten erhalten. Für Bioassays wurden gereinigte Leydig-Zellen auf 50.000 Zellen/ml F-12/DME-Medium, wie oben beschrieben mit Insulin und Transferring supplementiert, verdünnt.

Beispiel IV Bioassay des LCS

Durch die im Beispiel III beschriebene Percoll-Gradientenzentrifugation gereinigte Leydig-Zellen wurden in 24 Multi-Wells- Kulturschalen plattiert. Jede Kulturvertiefung enthielt 50.000 gereinigte Leydig-Zellen, die in 1 ml F-12/DME serumfreiem Medium suspendiert waren. Zur Lokalisierung der Stimulationsaktivität wurde ein Aliquot von 1-50 ul von jeder Säulenfraktion oder Probe entnommen und mit gereinigten Leydig-Zellen 24 Stunden lang in einem Feuchtinkubator bei 35ºC mit 95% Luft-5% CO&sub2; inkubiert. Anschließend wurde für Testosteron- und/oder cAMP-Bestimmung durch Radioimmunoassays ein Aliquot entnommen. Es wurden Kontrollversuche durchgeführt, bei denen gereinigte Leydig-Zellen mit verschiedenen Dosen an hCG (0,02 10 ng/ml) oder ohne Zugabe von Hormonen 24 Stunden lang inkubiert wurden.

cAMP-Bestimmung

Zur cAMP-Bestimmung wurde verbrauchtes Medium bei 100ºC 10 Minuten lang am Ende des Kulturzeitraums erhitzt, um die Phosphordiester-Aktivität zu inaktivieren, in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert, um alle Trümmer zu entfernen und bei -20ºC gelagert, bis sie ausgetestet wurden. Die cAMP-Konzentrationen wurden dann unter Verwendung von Radioimmunoassay-Kits der Fa. Amersham (Arlington Heights, IL) unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten Verfahren abgeschätzt.

Testosteronbestimmung

Zur Testosteronbestimmung wurde ein Aliquot des verbrauchten Mediums von jeder Kulturvertiefung entnommen und durch Radioimmunoassay unter Verwendung von Anti-Testosteron-3-(0-carboxymethyl)-oxim-BSA (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY) und [1,2,6,7-³H]-Testosteron (New England Nuclear, S.A. 89 Ci/mMol) bestimmt. Anti-Testosteron-Antikörper wurden 1:80 unter Verwendung von 0,05 M Tris, pH 8,0 bei 22ºC verdünnt, und zu jedem Teströhrchen wurden insgesamt 500 ul zugegeben, das 100 ul Probe und 100 ul [³H]-Testosteron in einem Testendvolumen von 700 ul pro Röhrchen enthielt. Die Teströhrchen wurden bei 37ºC 1 Stunden lang inkubiert, worauf sich eine 15-minütige Inkubation bei 4ºC anschloß, und 200 ul mit Dextran beschichteter künstliche Kohlelösung (0,5% künstliche Kohle, 0,05% Dextran T-70, w/v, in 0,05 M Tris, pH 8,0 bei 22ºC) wurden auf jedes Röhrchen gegeben, um freies und gebundenes [³H]-Testosteron abzutrennen. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines β-Flüssigszintillationszählers, LKB-Modell 1209 Rackbeta bei einer Zähleffizienz von 28% bestimmt. Die minimal nachweisbare Dosis betrug 1,5 pg/Teströhrchen, und die 50% Verschiebung der gebundenen Aktivität war bei 20 pg Testosteron. Man erhielt eine Dosis-Antwort-Kurve der Testosteronproduktion unter Verwendung von mit Percoll gereinigten Leydig-Zellen durch hochgereinigten Leydig-Zellstimulator (0,01-5 ng Protein), die eine maximale Stimulierung um das 10-fache über dem Basaltestosteronniveau bei 5 ng mit einer halbmaximalen Stimulation bei 0,6 ng Protein zeigte.
Unter Verwendung eines Pools an mit Sertoli-Zellen angereichertem Kulturmedium, der aus 20 Tage alten Sprague-Dawley- Ratten in Gegenwart von 300 ng/ml Schaf-FSH hergestellt wurde, wurde ein Laborstandard des LCS hergestellt. Verfahren zur Herstellung von mit Sertoli-Zellen angereichertem Kulturmedium sind im Beispiel I und detaillierter in Cheng et al., '86; Cheng et al., '87; Cheng et al. '89; und Cheng und Bardin,'86 beschrieben. Eine serienmäßige Dosis dieses mit CYCSTD-1-0-1 bezeichneten Laborstandards ließ man in jedem Bioassay in Aliquots von 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 1 und 2 ul mitlaufen; bei 0,7 ul/Vertiefung wurde eine halbmaximale Stimulation beobachtet.
Unter Verwendung von gereinigtem hCG mit Dosen von 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 5 und 10 ng/ml wurde eine Reihe positiver Kontrollen etabliert; bei 0,08 ng/ml wurde eine halbmaximale Stimulation beobachtet, und die maximale Stimulation lag bei 1 ng/ml (Fig. 2B).
Negative Kontrollen wurden unter Verwendung von Puffern aus jedem HPLC-Reinigungsschritt, die für die Reinigung dieses biologischen Faktors verwendet wurden, hergestellt.
Bei Verwendung eines Ansatzes eines mit Sertoli-Zellen angereicherten Rohkulturmediums (CYCSTD-1-0-1) und verschiedener Dosen an hochgereinigtem hCG wurde festgestellt, daß 1,2 ul CYCSTD-1-0-1 einer Einheit an Bioaktivität äquivalent war. Der Variationskoeffizient zwischen den einzelnen Tests betrug etwa 20%

Beispiel V Bestimmung der FSH-Wirkungen auf die Produktion dieses LCS durch Sertoli-Zellen

Verschiedene FSH-Dosen im Bereich zwischen 0-1.000 ng/ml wurden verschiedenen Schalen mit mit Sertoli-Zellen angereicherten Kulturen, die gemäß Beispiel I am Tag 0 hergestellt worden waren, zugegeben, und verbrauchtes Medium wurde am Tag 4 zum Bioassay auf Leydig-Zellstimulator gemäß den im Beispiel IV beschriebenen Verfahren gesammelt. Es wurde beobachtet, daß die LCS-Produktion stark von FSH abhängig war. Speziell wurden Sertoli-Zellen (4,5 x 10&sup6; Zellen/9 ml Schale) in Gegenwart verschiedener FSH-Konzentrationen (0-1.000 ng/ml) vier Tage lang kultiviert. Die Schalen wurden abgeschlossen, und 100 ml verbrauchten Mediums wurden abgezogen und auf Leydig-Zellstimulator unter Verwendung von 5 x 10&sup5; gereinigter Leydig-Zellen/Vertiefung 24 Stunden lang einem Bioassay unterzogen.

Beispiel VI Strukturanalyse

Wenn der im Beispiel II erhaltene Ansatz aus gereinigtem Material durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen auf einem 12,5% T SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt wurde, beobachtet man nur eine einzelne silbergefärbte Bande mit einem scheinbaren Mr-Wert von 17.000, was auf eine einzelne Polypeptidkette hindeutet. Die Proteinkonzentration wurde auf Silber gefärbtem SDS-Polyacrylamidgel durch densitometrisches Abtasten unter Verwendung von silbergefärbtem BSA als Standard quantifiziert. Das densitometrische Abtasten wurde auf einem ECg10 Densitometer (E-C-Apparatus Corp. Petersburg, FL) durchgeführt, das mit einem Hewlett-Packard (Modell HP3394A)-Integrator bei 600 nm, wie bereits beschrieben (Silvestrini et al., 1989) (13), verbunden war.

Beispiel VII Testosteronsekretion durch unreife Leydia-Zellen

Bezugnehmend auf die Fig. 1 wurde LCS gemäß den im Beispiel II beschriebenen Verfahren aus mit Sertoli-Zellen angereichertem Kulturmedium wie im Beispiel I beschrieben hergestellt. Leydig-Zellen aus unreifen Tieren wurden gemäß den im Beispiel III für adulte Leydig-Zellen beschriebenen Verfahren gereinigt. Maximale Stimulationsdosen an LH und LCS wurden entsprechend den im Beispiel IV beschriebenen Bioassay-Techniken verwendet. Die Testosteronsekretion wurde nach 5 Stunden LH- und LCS-Exposition bestimmt. Sowohl LH als auch LCS bewirkten eine etwa 10-fache Zunahme der Testosteronsekretion durch unreife Leydig-Zellen (C = Kontrolle).

Beispiel VIII cAMP-Akkumulation durch unreife Leydiq-Zellen

Bezugnehmend auf die Fig. 2 wurde die Wirkung von LH und LCS auf die interzelluläre cAMP-Akkumulation bestimmt. Die Untersuchungen wurden unter Verwendung von Leydig-Zellen aus unreifen Tieren durchgeführt, die gemäß dem im Beispiel III für adulte Leydig-Zellen beschriebenen Verfahren gereinigt wurden. LCS wurde gemäß den im Beispiel II beschriebenen Verfahren aus wie im Beispiel I beschrieben mit Sertoli-Zellen angereichertem Kulturmedium hergestellt. Maximale Stimulationsdosen an LH und LCS wurden gemäß der im Beispiel IV beschriebenen Bioassay-Technik verwendet. LH produzierte eine mehr als vierfache Zunahme an cAMP-Akkumulation in den Leydig-Zellen. Im Gegensatz dazu ergab LCS keine signifikante Zunahme in der cAMP- Akkumulation in Leydig-Zellen.

Beispiel IX Synergistische Wirkung auf unreife Leydig-Zellen

Bezugnehmend auf die Fig. 3 wurden die Wirkungen einer maximalen Stimulationsdosis an LH und LCS auf die Testosteronsekretion durch unreife Leydig-Zellen analysiert. LCS wurde durch das im Beispiel II beschriebene Verfahren gereinigt. Die Herstellung unreifer Leydig-Zellen benutzte das gleiche Verfahren, das im Beispiel III zur Herstellung von reifen Leydig- Zellen verwendet wurde. Der Bioassay auf LCS und LH war der gleiche wie im Beispiel IV beschrieben. Sowohl LH als auch LCS ergaben eine Zunahme um wenigstens etwa das 10-fache der Testosteronsekretion. Die Kombination einer maximalen LCS-Dosis und einer maximalen LH-Dosis ergab jedoch eine synergistische Zunahme an Testosteron (etwa 35-fach).
Die Grundsätze, die bevorzugten Ausführungsformen und die Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung wurden in der obenstehenden Beschreibung angegeben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen beschränkt, da diese lediglich zur Veranschaulichung der Erfindung dienen und nicht zu deren Beschränkung. Abänderungen sind möglich, ohne von der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung abzuweichen.

FIG. 1:

TESTOSTERON pg/10&sup5;
LEYDIG-ZELLEN/5 Std.

FIG 2:

INTRAZELLULÄRES cAMP
pMole/10&sup5; LEYDIG-ZELLEN/5 Std.

FIG 3:

TESTOSTERON pg/10&sup5;
LEYDIG-ZELLEN/5 Std.

Claims

1. Leydig-Zellen-Stimulator, umfassend ein Polypeptid mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, dadurch gekennzeichnet, daß der Leydig-Zellen-Stimulator in einer im wesentlichen reinen und isolierten Form vorliegt und eine aminoterminale Aminosäuresequenz SEQ ID 1 aufweist.

2. Leydig-Zellen-Stimulator nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Fähigkeit, eine Zunahme der Androgen-Sekretion durch Leydig-Zellen im Vergleich zu dem Grundniveau der Androgen-Sekretion dieser Zellen um wenigstens 200 % oder mehr zu stimulieren.

3. Pharmazeutisch aktive Zusammensetzung zur Stimulierung und Erhöhung der Androgen-Produktion in Tieren, die eine derartige Behandlung benötigen, gekennzeichnet durch einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen Leydig-Zellen-Stimulator, umfassend ein Polypeptid mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, und mit der Fähigkeit, eine Zunahme der Androgen-Sekretion von Leydig-Zellen im Vergleich zum Grundniveau der Androgen-Sekretion dieser Zellen um wenigstens 200 % oder mehr zu stimulieren, wobei der Leydig-Zellen-Stimulator in einer Menge bereitgestellt wird, die wirksam ist, um die Androgen- Produktion zu stimulieren und zu erhöhen und er einen N- terminalen Abschnitt der Struktur SEQ ID 1 aufweist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Leydig-Zellen-Stimulator in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes vorliegt.

5. Pharmazeutisch aktive Zusammensetzung zur Stimulierung und Erhöhung der Produktion von Androgen in Tieren, die eine derartige Behandlung benötigen, gekennzeichnet durch einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen Leydig-Zellen-Stimulator, umfassend eine Polypeptid mit einem Mr-Wert von zwischen etwa 17.000 und etwa 20.000, bestimmt durch SDS-PAGE, und mit einem N-terminalen Abschnitt der Struktur SEQ ID 1 mit der Fähigkeit, eine Zunahme der Androgen-Sekretion durch Leydig-Zellen im Vergleich zum Grundniveau der Androgen-Sekretion dieser Zellen um wenigstens 200 % oder mehr zu stimulieren und das in einer zweiten Menge bereitgestellte LH/CG, wobei die ersten und zweiten Mengen an Leydig-Zellen-Stimulator und LH/CG wirksam sind, um die Androgen-Produktion durch die Leydig-Zellen stärker zu stimulieren als dadurch, daß die Leydig-Zellen entweder der ersten Menge an Leydig- Zellen-Stimulator oder der zweiten Menge an LH/CG ausgesetzt werden.

6. Pharmazeutisch aktive Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Mengen ausreichend sind, um die Androgen-Produktion durch Leydig-Zellen in gleicher Höhe oder höher zu stimulieren als dann, wenn die Leydig- Zellen entweder einer maximalen Stimulatordosis LH/CG oder einer maximalen Stimulatordosis an Leydig-Zellen- Stimulator ausgesetzt werden.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Leydig-Zellen-Stimulator und LH/CG in maximaler Dosis vorliegen.

8. Verwendung eines Polypeptids mit einem Mr-Wert von zwischen 17.000 und 20.000 und einer N-terminalen Sequenz der Struktur SEQ ID 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Produktion an Androgen.

9. Verwendung eines Polypeptids mit einem Mr-Wert von zwischen 17.000 und 20.000 und einer N-terminalen Sequenz der Struktur SEQ ID 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Produktion an Androgen, in vivo, durch seine Verabreichung in Form einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus LCS oder einer Mischung aus LCS und LH/CG an ein eine derartige Behandlung benötigendes Tier in solchen Mengen, die ausreichend sind, um die Produktion des Androgens zu erhöhen.