DE69735872T2

DE69735872T2 - Menschliches adhäsionsmolekül occludin

Info

Publication number: DE69735872T2
Application number: DE69735872T
Authority: DE
Inventors: Shoichiro Kyoto-shi TSUKITA
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2017-03-06
Also published as: US6489460B1; EP1464704B1; EP1464704A2; DE69735872D1; DE69736820T2; EP0831148A4; US6559286B1; WO1997032982A1; EP1464704A3; EP0831148B1; EP0831148A1; JP3288716B2; DE69736820D1; EP1464703A3; EP1464703A2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Aminosäuresequenz des Membranproteins Occludin in einer undurchlässigen Verbindung (tight junction) (hiernach als "TJ" bezeichnet) eines Menschen und eine DNA, die die Aminosäuresequenz kodiert.
STAND DER TECHNIK
In vielzelligen Tieren ist die Information im Hinblick auf eine zelluläre Adhäsion zwischen benachbarten Zellen stark mit der Regulation und dem Erhalt vitaler Phänomene, wie z.B. einer zellulären Proliferation und Differenzierung, Entzündungen und Krebsmetastasen, verbunden. Interzelluläre Adhäsionsmoleküle, die an der Adhäsion der Zellen teilnehmen, ordnen sich häufig an den Oberflächen dieser Zellen zusammen an, um einen spezifisch differenzierten Membranbereich für die Adhäsion zu bilden. Insbesondere ist es für die interzellulären Adhäsionsmoleküle, wie z.B. die Cadherine bekannt, dass sie fest an das Cytoskelett an der Cytoplasmadomäne der Epithelzellen gebunden sind. Solche Membranregionen werden als interzellulärer Adhäsionsapparat bezeichnet und werden grob in die folgenden vier Strukturen klassifiziert: gap junction (GJ), adherens junction (AJ), Desmosom und Tight junction (TJ).
Diese Adhäsionsapparate wurden erstmalig unter einem Elektronenmikroskop identifiziert und als Ergebnis einer Untersuchung und Forschung der konstituierenden Proteine wurde die Wichtigkeit ihrer physiologischen und pathologischen Signifikanz zum Fokus eines erhöhten Interesses. Die Proteine, die als sogenannte Adhäsionsmoleküle bezeichnet werden, existieren spezifisch in diesem Adhäsionsapparat und die Adhäsionsmoleküle von AJ sind Cadherine und verschiedene Arten von Cadherinen, wie z.B. N-Cadherin und P-Cadherin, wurden bis jetzt identifiziert [Takeichi, M. et al., "Science", Bd. 251, S. 1451–1455 (1991)]. Als Adhäsionsmoleküle des Desmosoms sind Desmoglein und Desmocollin bekannt und gemäß kürzlichen Studien wurde klargestellt, dass ihre Strukturen ähnlich den Cadherinen sind [Buxton, R. S. et al., "J. Cell Biol.", Bd. 121, S. 481–484 (1993)]. Die Adhäsionsmoleküle von GJ werden Connexin genannt und es ist bekannt, dass Connexin Transmembrandomänen an vier unterschiedlichen Stellen aufweist und sowohl am N-terminalen als auch am C-terminalen Ende auf der Cytoplasmaseite der Membran vorsteht.
Die TJ ist ein interzellulärer Adhäsionsapparat, der für Epithel- und Endothelzellen besonders ist, wo die Zellmembranen von benachbarten Zellen als vollständig dicht abgedichtet gesehen werden. Die TJ umgibt individuelle Zellen und wirkt als Barriere um die Permeation wasserlöslicher Moleküle zwischen dem Lumen und Bandmembranseiten der Zellschicht zu blockieren oder zu regulieren. Es wurde auch beschrieben, dass sie als Zaun wirken, der die Zellmembran in apikale und basolaterale Seiten teilt, um die polare Verteilung solcher Membranproteine wie Ionkanäle und Pumpen, wie auch Lipiden auf der Zellmembrane, zu erhalten [Schneeberger, E. E. et al., "Am. J. Physiol.", Bd. 262, S. L647–L661 (1992)]. Aufgrund dieser Funktionen der TJ werden Milieus, bestehend aus unterschiedlichen Fluidzusammensetzungen auf gegenüberliegenden Seiten einer Zellschicht gebildet, so dass die Polarität der Zellschicht erhalten wird; daher kann die TJ als fundamentale Struktur von vitaler Wichtigkeit für vielzellige Organismen angesehen werden.
Eine Analyse der Molekularstruktur der TJ ist jedoch im Vergleich mit anderen Adhäsionsapparaten wenig fortgeschritten. Tatsächlich hat es einen ernsthaften Nachteil im Hinblick auf die Verfolgung einer molekularbiologischen Forschung für TJ bedeutet, dass das TJ-Adhäsionsmolekül selbst noch nicht identifiziert wurde.
Die vorliegenden Erfinder haben ein Verfahren zur Isolierung von AJ aus Rattenleber etabliert und haben viele Proteine, wie z.B. Radixin und ZO-1 aus diesem isolierten AJ identifiziert [Tsukita, Sh. Et al., "Curr. Opin. Cell Biol.", Bd. 4, S. 834–839 (1992)]. Von Forschungen an ZO-1 und histologischen Feststellungen für AJ und TJ kann geschlossen werden, dass die Proteine in AJ ebenfalls ein Protein von TJ enthalten. Im Hinblick hierauf haben die vorliegenden Erfinder AJ aus Hühnerleber isoliert, einen monoklonalen Antikörper gegen AJ als Antigen hergestellt und eine Strukturanalyse des TJ-bildenden Proteins unter Verwendung des Antikörpers, der spezifisch mit TJ reagiert, durchgeführt. Im Ergebnis waren die vorliegenden Erfinder bei der Strukturanalyse eines neuen konstituierenden Proteins erfolgreich, das anderen Proteinen nicht ähnelt und haben das Protein als Occludin bezeichnet [Furuse, M. et al., "J. Cell Biol.", Bd. 123, S. 1777–1788 (1993)].
Dieses Hühneroccludin ist ein 56Kda-Protein, gebildet aus 504 Aminosäuren, und dadurch gekennzeichnet, dass es insbesondere Transmembrandomänen an vier Stellen in der Hälfte vom N-terminalen Ende aufweist, wobei sowohl N- als auch C-terminale Enden ins Cytoplasma zeigen und zwei extrazelluläre Schlaufen aufweist.
Aus folgenden Studien wurde geschlossen, dass Occludin ein wichtiger Faktor bei der Analyse der physiologischen Funktion von TJ auf dem zellulären Niveau wie auch auf dem Gesamtkörperniveau wäre und dies hat erhebliche Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen. Auf dem 48. jährlichen Treffen der Japan Society for Cell Biology, Sendai, Japan, 18. bis 20. Oktober 1995, Bd. 10T, Nr. 6, S. 585, wird die Identifizierung von aus Kängururatte isoliertem Qccludin beschrieben. Weiterhin wird ein Anti-Occludinantikörper erwähnt.
Weitere Studien sind nichtsdestotrotz nicht fortgeschritten, da das Protein seinen Ursprung in einer Hühnerart hat, die sich von Menschen deutlich unterscheidet. So wurde eine Strukturanalyse von Occludin vom menschlichen Ursprung zum Zweck der Erhellung seiner physiologischen Funktion und einer medizinischen Analyse von TJ erwartet. Es gibt bis jetzt noch nicht Berichte über einen Erfolg bei der Erhellung des menschlichen Occludins trotz weltweitem Wettbewerb in der Forschung zu diesem Zweck auf diesem Gebiet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenzen von menschlichen Occludinen und die diese kodierenden DNAs bereitzustellen.
In ihrem Bericht über das Gen für das menschliche neuronale Apopotose-inhibitorische Protein (NAIP) dokumentierten Roy et al. das Auftreten eines DNA-Fragments, das eine Basensequenz besaß, die zum C-terminalen Bereich von Hühneroccludin analog war und zwar bei NAIP-Gendeletionsmutanten [Roy N., et al., "Cell", Bd. 80, S. 167–178 (1995)]. Um sicherzustellen, ob diese Sequenz tatsächlich einen Teil eines menschlichen Analogs von Occludin kodierte oder nicht, selektierten die gegenwärtigen Erfinder Primer aus der Basensequenz, analog zu derjenigen von Hühneroccludin und führten ein ausführliches Screening mit einer cDNA-Bibliothek von dem menschlichen Epithelzellstamm T84 als Matrize für die PCR durch. Die gegenwärtigen Erfinder waren so erfolgreich bei der Analyse der Gesamtstruktur von menschlichem Occludin. Weiterhin haben die Erfinder Anti-Occludin-minoklonale Antikörper hergestellt und mit histologischer Anfärbung verifiziert, dass die Occludine Transmembran-artige TJ-Proteine waren.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist mit Aminosäuresequenzen von menschlichem Occludin, DNAs, die sie kodieren, Anti-Occludin-monoklonalen Antikörpern und einem genetischen Analyseverfahren unter Verwendung derselben beschäftigt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die folgenden Aspekte:

(1) DNA zum Codieren eines menschlichen Occludinproteins mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 definiert.
(2) DNA zum Codieren eines menschlichen Occludinproteins gemäß Punkt 1, welche eine DNA definiert in SEQ ID NO: 4 ist.
(3) Vektor, welcher die DNA gemäß Punkten 1 oder 2 enthält.
(4) Nicht-menschliche Transformante, welche den Vektor gemäß Punkt 3 enthält.
(5) In vitro transformierte kultivierte Zelle, welche den Vektor gemäß Punkt 3 enthält.
(6) Menschliches Occludinprotein mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 definiert.
(7) Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß Punkt 6, umfassend die Schritte des Kultivierens der Transformante gemäß Punkt 5 und Sammeln des exprimierten Produkts.
(8) DNA-Sonde umfassend die Basensequenz, definiert in SEQ ID NO: 4.
(9) DNA-Primer enthaltend die Basensequenz wie in SEQ ID NO: 7 oder 8 definiert.
(10) Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das Protein gemäß Punkt 6 bindet.
(11) In-vitro-Analyseverfahren des DNA-Gens gemäß Punkt 2 in einer biologischen Probe, worin die DNA-Sonde gemäß Punkt 8 verwendet wird.
(12) In-Vitro-Screeningverfahren eines Wirkstoffs, der die Expression von Occludin beeinflusst, welches die Schritte umfasst: die Koexistenz von Occludin-exprimierenden Zellen und eines Analyten zu ermöglichen und dann die Expressionsmenge eines Occludingens der Zellen mittels des Verfahrens gemäß Punkten 10 oder 11 zu bestimmen.
(13) Assayreagens für Occludin in einer biologischen Probe, umfassend den Antikörper gemäß Punkt 10.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Durch den Erfolg der vorliegenden Erfinder bei der Identifizierung von Occludinanalogen bei Menschen wird es nun möglich, die Konstitution und Funktion von TJ auf dem molekularen Niveau strukturell und funktionell zu testen. Die Barriere- und Zaunfunktionen von TJ und die damit verwandten regulatorischen Mechanismen können durch Experimente analysiert werden, die die Kontrolle der Expression des Gens für Occludin oder die Inhibition der Occludinfunktion mit entweder einer Antisinnsonde oder einem Antikörper unter Verwendung verschiedener Arten von kultivierten menschlichen Zellen involvieren. Beispielsweise ist es nun möglich zu bestimmen, ob die Überexpression von Occludin-cDNA zu einem Anstieg der Zahl von TJ-Strängen führt oder auch nicht, die in gefriergekühlten aufgebrochenen Replikas beobachtet werden und nebenbei zu einer Erhöhung der Barrierefunktion führt. Weiterhin hat es die vorliegende Erfindung ermöglicht, ein einfaches Screening-Verfahren für Arzneimittel zu etablieren, die die TJ-Funktion beeinflussen. Beispielsweise können Arzneimittel, die die TJ-Funktion beeinflussen, unter Verwendung verschiedener Arten von Zellen, die Occludin exprimieren, einem Screening unterworfen werden, indem man die Zelle mit einem Testartikel reagieren lässt und darauffolgend die Menge des zellulären Occludingens oder der Occludinproteinexpression misst. Die Genanalyse kann unter Verwendung einer DNA-Sonde oder eines Primers oder anderer Mittel durchgeführt werden. Sie kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise das Northern-Blot-Verfahren oder das Southern-Blot-Verfahren, wobei RNA oder DNA auf übliche Weise aus einer Testprobe extrahiert werden und, falls nötig, vorbehandelt werden, dann auf einer Membran oder einem Gel elektrophoretisch behandelt und mit einer markierten DNA-Sonde hybridisiert werden und indem eine Polymerasekettenraktion (PCR) -Technik durchgeführt wird, wobei die Ziel-DNA unter Verwendung von Primern mit ungefähr 20 Basen, korrespondierend zu der relevanten Stelle und einer genomischen DNA oder cDNA als Matrize amplifiziert wird. Das Occludinprotein kann beispielsweise durch Verwendung eines Antikörpers quantifiziert werden.
Weiterhin wurde es auch möglich sicherzustellen, wie die TJ-Bildung an der Morphogenese verschiedener Organe beteiligt ist und ob ein funktionelles Versagen der TJ eine Beziehung zu verschiedenen pathologischen Zuständen hat, wie z.B. Entzündungen und einer Tumormetastase, indem verschiedene Arten von mutierten Mäusen und Occludingen-Knock-out-Mäusen hergestellt werden. Die Möglichkeit der Kontrolle der TJ-Funktion, insbesondere der Barrierefunktion ist ebenfalls in Verbindung mit einer Arzneimittelpermeabilität von Interesse. So wäre es möglich die Blut-Hirn-Schranke über eine Hoch- oder Herabregulation der Occludinsynthese in Epithelzellen des Gehirns zu kontrollieren. Die Kontrolle der TJ-Funktion in enterischen Epithelzellen ist notwendig, um eine Arzneimittelabsorption aus dem Verdauungstrakt zu regulieren. Es wird so möglich die Arzneimittelabsorption, insbesondere die Verteilung im Gehirngewebe zu kontrollieren, indem eine effektive Substanz verabreicht wird, die durch Screening aus Arzneimitteln gewonnen wurde, die die TJ-Funktion beeinflussen. So sollte die vorliegende Erfindung zur Erhellung der physiologischen Mechanismen, insbesondere der Blut-Hirn-Schranke wie auch für die Analyse, Diagnose und Behandlung von Erkrankungszuständen gut geeignet sein.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte DNA kann bei der Analyse von Genen für Occludinproteine und der Genexpression davon unter Verwendung von einem Teil davon als Primer oder Sonde verwendet werden. Die Bezeichnung "ein Teil" bedeutet hier, dass das als Primer oder Sonde zu verwendende Oligonucleotid mindestens eine relevante Sequenz mit 10 Basen oder vorzugsweise mindestens eine 15-Basensequenz umfasst oder noch bevorzugter ein korrespondierendes Polynucleotid, umfassend eine Sequenz mit ungefähr 20- bis 30-Basen, basierend auf der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung. Als Sonde kann ein höher makromolekulares Molekül oder sogar die Gesamt-DNA verwendet werden.
Es gibt ein Verfahren unter Verwendung von Anti-Sinn-DNA oder Anti-Sinn-RNA als Mittel zur Kontrolle der Funktion von Occludin. Das Verfahren soll den Fluss der Genexpression blockieren, indem in das Ablesen der genetischen Information auf irgendeiner Stufe der Genexpression, wie z.B. der DNA-Replikation, Transkription und Translation eingegriffen wird und das Antisinn-Verfahren verwendet eine Nucleinsäure oder ihr Analog für die Blockierung (Wickstrome, E. Hrsg., Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS. Wiley-Liss, New York, 1991). Die Erhellung der Occludin-DNA gemäß der vorliegenden Erfindung hat es ermöglicht, das Mittel zur Inhibition von Occludinfunktionen durch das Antisinn-Verfahren bereitgestellt werden. Die Länge des DNA-Oligomers hat einen Einfluss auf die Doppelstrang-Bildungsfähigkeit, Membranpermeabilität und Basensequenzspezifität; und mindestens 6 oder vorzugsweise mindestens 10-mer, üblicherweise 15 bis 30-mer können verwendet werden. Geeignete Sequenzen können auf der Basis der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung gewählt und durch Experimente verifiziert werden. Üblicherweise wird das Oligomer chemisch an seiner Phosphatgruppe, dem Zuckerbestand und den 3'- und 5'-Schwänzen modifiziert, um seine Stabilität zu erhöhen (Cook, P.D., Anticancer Drig. Des., 5, 585, 1991). Repräsentative Analaoge sind Oligophosphorthioate, worin eines der Sauerstoffatome der Internucleosidphosphodiestergruppe durch ein Schwefelatom ersetzt wird und Oligomethylsulfonat, wobei der Sauerstoff durch eine Methylgruppe ersetzt ist; alle solche Analoge sind gegen Nucleasen bemerkenswert stabil. Nebenbei gesagt werden auch solche Oligomere, die mit Acridin oder Polylysin gebunden sind und diejenigen, die N-Methylthymidylat enthalten, um die Stabilität des Hybriddoppelstrangs zu erhöhen, ebenfalls verwendet. Diese Oligomere können durch bekannte chemische Syntheseverfahren synthetisiert werden. Eine von der RNA der vorliegenden Erfindung abgeleitete Anti-Sinn-RNA kann ebenfalls verwendet werden.
Das Occludinprotein der vorliegenden Erfindung kann für die Herstellung eines Antikörpers unter Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils davon als Epitop und zur Verwendung des so hergestellten Antikörpers und diagnostisches Reagens verwendet werden. Die Bezeichnung Epitop bezeichnet eine Antigen-Determinante des Polypeptids; ein Epitop besteht in der Regel aus mindestens 6 Aminosäuren und es ist bekannt, dass ein Polypeptid, bestehend aus 6 Aminosäuren sich mit einem Antikörper kombiniert (JP-A-60-500684). Das antigene Peptid des Zielproteins bezeichnet ein Polypeptid, umfassend eine Reihe von mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise eine Reihe von mindestens 8 Aminosäuren, noch bevorzugter eine Reihe von mindestens 15 Aminosäuren oder weiter bevorzugt eine Reihe von mindestens 20 Aminosäuren, basierend auf der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung. Durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes Occludin ist ein Protein, das wie aus seiner Aminosäuresequenz in Analogie zu Hühneroccludin geschlossen, Transmembrandomänen an vier Stellen in einer Hälfte des N-terminalen Bereichs besitzt, wobei das N- und das C-terminale Ende dem Cytoplasma gegenüber liegen und zwei extrazelluläre Schlaufen aufweist. In dem Fall von menschlichem Occludin, dessen Aminosäuren 89-135 und 196-243-Bereiche vermutlich extrazellulär exponiert sind, können verschiedene Antikörper durch Selektion von antigenen Stellen hergestellt werden, die für diese Zwecke geeignet sind und als Mittel verwendet werden, um die TJ-Funktion aufzuhellen und als Mittel um durch den Antikörper die TJ-Funktion zu supprimieren. Es ist auch möglich die Teilpeptide als Mittel für ein Screening auf Verbindungen zu verwenden, die zu einer Bindung an diese Peptide in der Lage sind.
Proteine mit einer Aminosäuresequenz des Occludins der vorliegenden Erfindung, denen ein oder eine Vielzahl von Aminosäuren zugefügt wurden oder von denen eine oder eine Vielzahl von Aminosäuren entfernt oder subsituiert wurden, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
(1) HERSTELLUNG EINER cDNA-BIBLIOTHEK UND STRUKTURANALYSE VON OCCLUDIN
Die Herstellung von RNA kann unter Verwendung menschlicher oder tierischer Zellen (Zellstämme) als Rohmaterial durchgeführt werden, beispielsweise durch Extraktion mit einer Mischlösung aus Guanidinthiocyanat, einem Tensid, einem Chelatbildner und einem Reduktionsmittel, gefolgt von einer Phenolextraktion, Fraktionierung in organischen Lösungsmitteln (Chamezynski et al., Anal. Biochem., 162, 156, 1987) und darauffolgend Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsverfahren. Unter Verwendung der so erhaltenen RNA als Matrize wird eine doppelsträngige DNA auf übliche Weise, wie z.B. durch das cDNA-Syntheseverfahren (Gubler, U. et al., Gene, 25, 263, 1983) unter Verwendung von Zufallsprimern, reverser Transkriptase, DNA-Polymerase, usw. hergestellt. Eine DNA-Bibliothek kann durch Insertion der erhaltenen doppelsträngigen DNA in einen Bacteriophagen, λ zap oder λ gt11 auf übliche Weise hergestellt werden. Es können auch kommerzielle cDNA-Bibliotheken verwendet werden.
Gemäß dem Bericht von Roy et al. ist es möglich ein DNA-Fragment zu erhalten, von dem angenommen wird, dass es von Occludin-DNA-Ursprung ist, in dem auf geeignete Weise ein Primerbereich gewählt wird, basierend auf der Basensequenz, die zum C-Terminus des Hühneroccludins analog ist und zwar durch Amplifikation der DNA durch die PCR-Technik und durch Subklonieren. Ein darauffolgendes Screening der cDNA-Bibliothek mit diesem DNA-Fragment als Sonde und eine Analyse der Basensequenz des isolierten Klons kann zu einer Gesamtlängen-cDNA für Occludin führen. Die Struktur der Basensequenz wird durch das Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt (Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977) oder durch das Dideoxynukleotidketten-Terminationsverfahren (Sanger, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977). Die Aminosäuresequenz wird so auf der Basis der Basensequenz abgeleitet. Diese Genmanipulationen können durch bekannte übliche Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise gemäß denjenigen, die in Molecular Cloning; A Laboratory Manual, T. Maniatis et al. Hrsg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben werden.
(2) HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN
Um den monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird menschliches Occludin (und Hunde oder Maus als Referenz) als Antigen verwendet, der Komplex mit einem Trägerprotein wird, falls nötig, hergestellt und geeignete Tiere werden durch Inokulation mit dem Antigen immunisiert. Antikörper-bildende Zellen, die aus der Milz oder Lymphknoten der obigen immunisierten Tiere erhalten werden, werden mit Myelomzellen fusionier, wodurch Hybridome, die einen für Occludin stark spezifischen Antikörper erzeugen, selektiert werden, um den monoklonalen Antikörper herzustellen. Das Herstellungsverfahren kann gemäß bekannten vorherigen Verfahren durchgeführt werden.
Als Immunogen können alle solche Produkte, wie gereinigte natürliche Produkte und Produkte, die durch genetische Rekombinationsverfahren oder chemisches Synthese hergestellt wurden, verwendet werden. Für eine Herstellung von Occludin für das rekombinante DNA-Verfahren kann die cDNA, die das Occludin kodiert, mit dem Promotor stromabwärts eines Vektors religiert werden, der für die Expression von Occludin geeignet ist und zwar durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligase, um einen rekombinanten Expressionsvektor zu erhalten. Dieser Vektor ist nicht begrenzt, sofern er in einem Wirt repliziert und amplifiziert werden kann. Im Hinblick auf den Promotor und Terminator gibt es auch keine bestimmte Begrenzung, solange sie mit dem für die Expression der Basensequenz, die Occludin kodiert, verwendeten Wirt übereinstimmen; und geeignete Kombinationen, die für den Wirt geeignet sind, können ebenfalls praktisch sein. Der so erhaltene rekombinante Expressionsvektor wird in den Wirt durch das kompetente Zellverfahren eingeführt (J. Mol. Biol., 53, 154, 1970) oder auch das Calciumphosphatverfahren (Science, 221, 551, 1983) um einen Transformanten herzustellen. Organismen wie Escherichia coli und Tiere werden als Wirt verwendet und der erhaltene Transformant wird in einem für den Wirt geeigneten Medium kultiviert. Die Kulturinkubation wird üblicherweise bei einer Temperatur zwischen 20 und 45°C und einem pH zwischen 5 und 8 mit Belüftung und/oder Rühren je nach Bedarf durchgeführt. Die Isolierung und Reinigung von Occludin aus den kultivierten Mikroorganismen oder Zellen kann durch eine geeignete Kombination bekannter Verfahren der Isolation und Reinigung durchgeführt werden. Diese bekannten Verfahren beinhalten ein Aussalzen, ein organisches Lösungsmittelverfahren, eine Dialyse, eine Gelfiltration, eine Elektrophorese, eine Ionenaustauschchromatographie, eine Affinitätschromatographie und eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie.
Das Immunogen, Occludin, sollte vorzugsweise seine gesamte Struktur beibehalten, kann jedoch in Form eines Fragments oder eines Peptids mit einer Teilstruktur vorliegen; diese kann in geeigneter Weise aus der gesamten Aminosäuresequenz des Occludins gewählt werden. Für die Herstellung des Fragments oder Peptids können ein Verfahren, wie eine chemische Synthese, das oben erwähnte Genrekombinationsverfahren oder ein Abbau eines natürlich auftretenden Artikels verwendet werden.
Verschiedene Kondensationsmittel können für die Herstellung des Immunogen-Trägerprotein-Komplexes verwendet werden; Reagenzien, wie Glutaraldehyd, Carbodiimid und Maleimidaktivierter Ester, können verwendet werden.
Das Trägerprotein kann eines von denjenigen sein, die üblicherweise verwendet werden, wie z.B. Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Hämocyanin und üblicherweise wird das Verfahren, bei dem eine 1- bis 5-fache Menge eines Trägerproteins an ein Antigen gekoppelt wird, verwendet.
Für die Immunisierung verwendete Tiere beinhalten die Maus, die Ratte, das Kaninchen und Meerschweinchen und die Inokulation wird durch subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion bewirkt. Die Verabreichung des Immunogens kann in Form einer Mischung mit komplettem Freund-Adjuvant oder inkomplettem Adjuvant durchgeführt werden und wird üblicherweise alle 2 bis 5 Wochen durchgeführt. Antikörper-erzeugende Zellen, die aus der Milz oder Lymphknoten der immunisierten Tiere erhalten wurden, werden mit Myelomzellen fusioniert und als Hybridome isoliert. Die verwendeten Myelomzellen sind diejenigen der Maus, Ratte oder von menschlichem Ursprung, und sind vorzugsweise allogen zu den Antigen-erzeugenden Zellen, die verwendet werden, können jedoch in einigen Fällen xenogen sein.
Die Manipulation der Zellfusion kann beispielweise gemäß dem Verfahren von Milstein und Köhler (Nature, 256, 495, 1975) durchgeführt werden. Verwendete Fusogene beinhalten Mittel, wie Polyethylenglycol und das Sendai-Virus und die Zellfusion kann durch Inkubation der Antikörper-erzeugenden Zellen mit Myelomzellen in einem geeigneten Populationsverhältnis von 1:1 bis 10:1 bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C, vorzugsweise zwischen 30 und 37°C für ungefähr 1 bis 10 Minuten unter Verwendung von Polyethylenglycol (mittleres Molekulargewicht: 1.000 bis 4.000) in der Regel mit einer Konzentration von ungefähr 20 bis 50 % durchgeführt werden.
Verschiedene immunochemische Verfahren können für das Screening von Hybridomen verwendet werden, die einen Anti-Occludinantikörper erzeugen. Die Verfahren beinhalten den Enzym-gebundenen Immunosorbens Assay (ELISA) unter Verwendung von mit Occludin beschichteten Mikrotiterplatten, einen Enzymimmunoassay (EIA) unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die mit einem Anti-Immunoglobulinantikörper beschichtet sind und Western-Blot-Verfahren, worin Proben, die Occludin enthalten, mit der darauffolgenden Verwendung von Nitrozellulose-Transfermembranen elektrophoretisch behandelt werden.
Klone werden von diesen Vertiefungen weiter beispielsweise durch limitierende Verdünnung erhalten. Das Screening und Züchten der Hybridome wird in einem Kulturmedium für tierische Zellen (z.B. RPMI 1640), enthaltend 10 bis 20 fötales Rinderserum, in der Regel mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) versetzt, durchgeführt. Der so erhaltene Klon wird intraperitoneal in BALB/c-Mäuse transplantiert, die vorher mit Bristan behandelt wurden und Ascites, enthaltend eine hohe Konzentration eines monoklonalen Antikörpers wird 10 bis 14 Tage später gesammelt, so dass der Ascites als Quelle für die Reinigung des Antikörpers verwendet werden kann. Weiterhin werden die klonierten Hybridomzellen so kultiviert, dass die kultivierten Zellen als Quelle für die Reinigung des Antikörpers verwendet werden können. Bekannte Verfahren für die Reinigung des Immunoglobulins können für die Gewinnung des monoklonalen Antikörpers verwendet werden; die Gewinnung kann beispielsweise einfach durch Mittel, wie eine Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionierung, Ethanolfraktionierung, Verwendung von Antionenaustauschern und eine Affinitätschromatographie erreicht werden.
Bei immunologischen Verfahren unter Verwendung des Anti-Occludin-monoklonalen Antikörpers, der gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wird es möglich, eine qualitative und quantitative Bestimmung von Occludin in biologischen Proben durchzuführen. Als immunologische Verfahren können konventionelle Verfahren, wie ein immunohistologisches Färben, ein Enzymimmunassay, ein Agglutinierungstest, ein kompetitiver Assay und ein Sandwich-Verfahren für Proben von biologischen Proben verwendet werden, die auf geeignete Weise verarbeitet wurden, je nach Bedarf, z.B. durch Isolation der Zellen und Extraktion. Die immunohistologische Färbung kann beispielsweise durch das direkte Verfahren unter Verwendung eines markierten Antikörpers oder das indirekte Verfahren unter Verwendung eines markierten Antikörpers gerichtet gegen den Antikörper, der an das Zielantigen gebunden ist, durchgeführt werden. Alle solchen bekannten Markierungssubstanzen, wie fluoreszierende Mittel, radioaktive Substanzen, Enzyme, Metalle und Farbstoffe können als Markierungsmittel verwendet werden.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann in Form eines Fab' oder Fab-Fragments nach Entfernung des Fc' oder Fc-Bereiches verwendet werden oder in Form eines Polymers von einem der Fragmente.
Weiterhin kann er sich auch in Form eines chimären Antikörpers, eines humanisierten Antikörpers oder eines menschlichen Antikörpers befinden.
BEISPIEL
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail mit spezifischen Ausführungsformen durch die folgenden Beispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung soll natürlich nicht auf die folgenden Beispiele begrenzt sein.
BEISPIEL 1 STRUKTURANALYSE VON MENSCHLICHEM OCCLUDIN
Basierend auf einer Basensequenz eines Teils des menschlichen NAIP-defizienten Gens, analog zum C-Terminus von Hühneroccludin, wurde eine PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der SEQ ID NO: 7 und 8 als Primer durchgeführt. Eine λgt11-cDNA-Bibliothek wurde durch Reinigung von Poly(A)+RNR aus einer Quelle, bestehend aus einem menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamm T84 und unter Verwendung des TimeSaver-cDNA-Synthese-Kits (Handelsname; Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) und dem GIGAPACK II Packaging Extract (Stratagene Inc.) durchgeführt. Die PCR wurde mit dieser Bibliothek als Matrize und mit diesen beiden Primern durchgeführt und ergab ein cDNA-Fragment mit 363 Basenpaaren.
Dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung des DIG Labeling Kits (Handelsname; Boehringer Mannheim) DIG-markiert und die Bibliothek wurde damit, verwendet als Sonde, einem Screening unterworfen. Im Ergebnis wurden drei cDNR-Klone isoliert, ihre Insertionsstellen wurden geschnitten und sie wurden in pBluescript SK(–) subkloniert. Von diesen nahm man an, dass die beiden Klone phOc6 und phOc16 einen gesamten ORF enthielten und diese beiden klonierten Stränge wurden im Hinblick auf ihre Basensequenzen analysiert, wobei die Ergebnisse demonstrierten, dass die Basensequenzen die gesamte Struktur von menschlichem Occludin kodierten. Die kodierende Sequenz wurde unter Verwendung eines 7-deaza Sequenase Version Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Handelsname; Applied Biosystems) bestimmt. Die Basensequenz ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz in Sequenz Nr. 1.
Als Referenz wurde die Struktur von Hunde- und Mausoccludin auf dieselbe Weise wie oben beschrieben bestimmt, wobei λgt11- bzw. λ10-cDNA-Bibliotheken, hergestellt aus Hundenieren (MDCK) -Zellen und Mauslungenzellen verwendet wurden. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz von Hundeoccludin sind in Sequenz Nrn. 5 und 2 und die Basensequenz und Aminosäuresequenz von Mausoccludin in Sequenz Nrn. 6 und 3 dargestellt. Escherichia coli JM 109, das die menschliche Occludin-cDNA enthielt, wurde am 15. März 1996 hinterlegt (Hinterlegungsnr. FERM BP-5477) beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Ministery of International Trade and Industry, Japan (Adresse: 1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305 Japan).
BEISPIEL 2 HERSTELLUNG EINES ANTI-HUMANEN OCCLUDIN-MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS
Das cDNA-Fragment, das die Cytoplasmaregion der C-terminalen Seite von menschlichem Occludin kodierte, wurde durch Schneiden des pBluescript SK(–)-Vektors, enthaltend Sequenz Nr. 4 wie beschrieben in Beispiel 1, mit den Restriktionsenzymen Ssp I und EcoR I (die beide Produkte von Takara Shuzo Co., Ltd. sind) erhalten. Dieses Fragment wurde in den pGEX-3X-Vektor eingeführt und Escherichia coli, das mit diesem Vektor transformiert war, wurde kultiviert, um ein GST-Fusionsprotein herzustellen. Ratten wurden mit diesem Fusionsprotein als Antigen immunisiert, so dass ein monoklonaler Antikörper hergestellt wurde.
Die Rattenimmunisierung wurde durch Injektion des Antigens in Dosen von 300 μg/Injektion in die hintere Pfote, zunächst als Emulsion mit komplettem Freund-Adjuvans und dem Antigen allein zweimal danach (an den Tagen 3 und 7 nach der ersten Injektion) durchgeführt. Am auf die letzte Injektion folgenden Tag wurden inguinale Lymphknoten aus den immunisierten Tieren ausgeschnitten und für eine Zellfusion verwendet.
Die Rattenlymphocyten und Mausmyelom-P3-Zellen wurden in einem Verhältnis von 2,5:1 kombiniert und die Mischung wurde in RPMI-Medium inkubiert, enthaltend 1 g Polyethylenglycol (mittleres Molekulargewicht 4.000), darin gelöst und zwar für 2 Minuten gemäß dem modifizierten Verfahren von Köhler et al., um eine Fusion der Zellen zu ermöglichen. Die fusionierten Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit HAT-Medium, enthaltend 10 % HCF (Bokusui-Braun) für 9 Tage ausgesät, gefolgt von einer Inkubation in HT-Medium und darauffolgend in Kolben mit RPMI-Medium. Hybridome wurden durch einen Assay der Überstände von Vertiefungen, die ein zelluläres Wachstum im Hinblick auf Antititer unter Verwendung des Immunoblot-Verfahrens und fluoreszierendem Antikörperfärben bei Kulturen vom menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamm T84 und durch limitierende Verdünnung aus den richtigen Vertiefungen kloniert. Die Hybridomzellen wurden bei berechneter Konzentration von 7 Zellen/Vertiefung in Mikrotiterplatten ausgesät und durch ein Immunoblot-Verfahren einem Screening unterworfen, um klonale Hybridomzellstämme zu verifizieren und zu isolieren. Die Antikörper wurden aus den Kulturüberständen des Hybridoms gereinigt.
BEISPIEL 3 ZELLFÄRBUNG
Menschliche Verdauungstrakt-Epithelzellen wurden in 3 Formalin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur 15 Minuten fixiert und weiter mit 0,2 % Triton X-100 in PBS bei Raumtemperatur 15 Minuten behandelt. Nach einem Blockieren der Zellen mit 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) wurde die Testsubstanz zugefügt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem darauffolgenden Waschen wurde FITC-markierter Anti-Ratten-Immunoglobulinantikörper zugefügt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einem Abwaschen von nicht umgesetzten Antikörper und einer Überprüfung mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Ergebnisse der Doppelimmunfluoreszenzfärbung mit monoklonalen Antikörper zu dem TJ-verwandten Protein ZO-1 und dem antimenschlichen Occludin-monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind in der Figur dargestellt.
Da insgesamt dasselbe Färbemuster wie das von ZO-1 (wie in der Literatur berichtet) beobachtet wurde, wurde bewiesen, dass das menschliche Protein der vorliegenden Erfindung ein menschliches Homolog des TJ-Adhäsionsmoleküls Occludin ist.
BEISPIEL 4 EXPRESSION VON OCCLUDIN IN ZEREBROVASKULÄREN ZELLEN
Da man annimmt, dass zerebrale vaskuläre Endothelzellen, die die Blut-Hirn-Schranke bilden, eine sehr hoch elektroresistente TJ aufweisen, anders als periphere vaskuläre Endothelzellen untersuchte ich die Verteilung und Expression von Occludin in kultivierten Schweingehirnvaskulären Endothelzellen (PBEC), die die hoch elektroresistenten TJ besaßen und kultivierte Schweineaorta-Endothelzellen (PAEC).
Als Schweineoccludin-cDNA-Fragment wurde eine 363 Basenfragment durch Amplifikation mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung des 1359–1391 Sinnstrangs (Sequenz Nr. 7) und 1692–1721 Anti-Sinnstrangs (Sequenz Nr. 8) der menschlichen Occludin-DNA-Sequenz (Sequenz Nr. 4) als Primer. Die Aminosäuresequenz, basierend auf einer Analyse der kodierenden Basensequenz des Fragments zeigte einen hohen Homologiegrad zu den Aminosäuresequenzen der menschlichen, Maus- und Hundeoccludine und verifizierte so, dass das Fragment eine cDNA für Schweineoccludin war. ³²P-markiertes Fragment wurde als Sonde verwendet.
Um eine mRNA von den kultivierten Zellen herzustellen, wurde eine Agarosegel-elektrophoretisch behandelte Probe auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit der cDNA-Sonde unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei ein RNA-Isolationskit (Stratagene) verwendet wurde. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass die Occludin-mRNA eine starke Bande bei ungefähr 2,4 kb in PBEC aufwies, während bei PAEC nur eine sehr schwache Band an dieser Position bemerkt wurde.
Die Expression von Occludin in diesen Zellen wurde unter Verwendung eines Anti-Mausoccludinantikörpers als monoklonaler Antikörper, der spezifisch Säugeroccludine erkennt und eines Antikörpers gegen des TJ-verwandte Protein ZO-1 verglichen.
Ein Anti-Mausoccludin-Rattenantikörper wurde unter Verwendung von Mausoccludin:Gluthation-S-Transferase fusioniertes Protein als Antigen hergestellt und ein FITC-markierter Anti-Ratten-IgG-Schafantikörper wurde für den Nachweis des Antikörpers verwendet. Wenn gleiche Proteinmengen der Extrakte von aufgebrochenen kultivierten Zellen durch Immunoblot nach einer eindimensionalen Gelelektrophorese analysiert wurden, wurde eine starke Occludinbande bei ungefähr 58KD in PBEC nachgewiesen, während eine deutlich schwächere Bande bei dieser Position bei den PAEC bemerkt wurde. Andererseits gab es keine deutliche Differenz der Expression von ZO-1 zwischen den beiden Zellarten. Bei einer Immunanfärbung zeigten die PBEC eine deutliche Occludinexpression mit derselben kontinuierlichen interzellulären Lokalisierung wie ZO-1, wie in der Immunoblot-Studie beobachtet. Bei PAEC wurde demgegenüber Occludin kaum nachgewiesen und ZO-1 zeigte eine diskontinuierliche interzelluläre Lokalisierung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die relativ ausgeprägte Expression von Occludin bei PBEC für die Bildung der hoch elektroresistenten TJ nötig ist und bringen Beweise dar, dass Occludin das konstituierende Protein von TJ ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 sind Fotografien, die Zeichnungen ersetzen, die die Morphologie von Organismen darstellen. Foto A ist eine mit einem anti-menschlichen Occludin-Ratten-monoklonalen Antikörper gefärbte immunofluoreszierende Mikrofotografie des kultivierten menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamms T84. Foto B ist eine mit einem Maus-monoklonalen Antikörper gegen das TJ-Auskleidungsprotein ZO-1 gefärbte Immunfluoreszenz-Mikrofotografie des kultivierten menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamms T84. Dieselben Stellen von T84 wurden fotografiert. SEQUENZPROTOKOLL
ANHANG 1
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA zum Codieren eines menschlichen Occludinproteins mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 definiert.
DNA zum Codieren eines menschlichen Occludinproteins gemäß Anspruch 1, welche eine DNA definiert in SEQ ID NO: 4 ist.
Vektor, welcher die DNA gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.
Nicht-menschliche Transformante, welche den Vektor gemäß Anspruch 3 enthält.
In vitro transformierte kultivierte Zelle, welche den Vektor gemäß Anspruch 3 enthält.
Menschliches Occludinprotein mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 definiert.
Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß Anspruch 6, umfassend die Schritte des Kultivierens der Transformante gemäß Anspruch 5 und Sammeln des exprimierten Produkts.
DNA-Sonde umfassend die Basensequenz definiert in SEQ ID NO: 4.
DNA-Primer enthaltend die Basensequenz wie in SEQ ID NO: 7 oder 8 definiert.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das Protein gemäß Anspruch 6 bindet.
In-vitro-Analyseverfahren des DNA-Gens gemäß Anspruch 2 in einer biologischen Probe, worin die DNA-Sonde gemäß Anspruch 8 verwendet wird.
In-Vitro-Screeningverfahren eines Wirkstoffs, der die Expression von Occludin beeinflußt, welches die Schritte umfaßt: die Koexistenz von Occludin-exprimierenden Zellen und eines Analyten zu ermöglichen und dann die Expressionsmenge eines Occludingens der Zellen mittels des Verfahrens gemäß Anspruch 10 oder 11 zu bestimmen.
Assayreagens für Occludin in einer biologischen Probe, umfassend den Antikörper gemäß Anspruch 10.