DE3910856C2

DE3910856C2 -

Info

Publication number: DE3910856C2
Application number: DE3910856A
Authority: DE
Inventors: Robert H. Portola Valley Calif. Us Slocum; Patrick L. Y. Belmont Calif. Us Lee; Vivian San Jose Calif. Us Arrizon-Lopez
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1992-05-14
Also published as: DE3910856A1; US4959176A; JPH01307660A; SE8901563L; SE8901563D0

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Bereitung wäßriger Pufferlösungen zur Verwendung bei Ionenaustausch-Amino säure-Analysesystemen und näherhin besonders zur Verwen dung mit Systemen, bei denen Bauteile aus rostfreiem Stahl Anwendung finden. Im Fall von zur Durchführung von Trennungen durch Ionenaustauschchromatographie ausgelegten Aminosäureanalysesystemen ist es üblich, besondere und ziemlich teure rostfreie Materialien wie beispielsweise Carpenter 20 und Inconel zu verwenden, um der korrodie renden Zusammensetzung der herkömmlichen Pufferlösungen standzuhalten. Speziell und ausschließlich für Ionenaus tausch-Aminosäureanalyse bestimmte und ausgelegte Instrumente sind gewöhnlich sehr kompliziert-aufwendig, teuer und daher nicht in breitem Umfang verfügbar. HPLC- Instrumente ("High Performance Liquid Chromatography instruments", "Instrumente für Hochleistungs-Flüssigchromato graphie") andererseits sind verhältnismäßig billig, in breitem Umfang verfügbar und werden auch für Aminosäure analyse nach sogenannten Umkehrphasenverfahren ("reverse phase methods") verwendet. Im allgemeinen sind die Umkehr phasenverfahren nicht ebenso zufriedenstellend wie Ionen austauschverfahren; die letzteren dienen daher zur Auf stellung des Standards für alle anderen Verfahren. Da die Bauteile der HPLC-Systeme, wie beispielsweise Pumpen, Probeninjektoren, motorisch betätigbare Ventile, Chroma tographiesäulen usw. ähnlich den in Ionenaustausch- Chromatographieinstrumenten verwendeten sind, hat es viel fache Versuche gegeben, eine Ionenaustauschsäule in ein HPLC-Instrument einzubauen bzw. einzubeziehen, derart daß dieses zur Durchführung der klassischen Aminosäure- Analyse nach Moore & Stein verwendet werden könnte. Es wurde jedoch rasch entdeckt, daß die herkömmlichen Puffer für Ionenaustausch-Chromatographie die Bauteile aus rost freiem Stahl von HPLC-Systemen schnell angreifen und so nicht nur die Lebensdauer dieser Bauteile verkürzen, sondern auch infolge der resultierenden Metallionen rasch die Wirkungsweise und Leistung der Ionenaustauschharze beeinträchtigen. Eine Reihe von Versuchen, dieses Problem dadurch zu vermeiden, daß man aus den Pufferlösungen solche Bestandteile, wie beispielsweise Chloridionen, von denen bekannt ist, daß sie rostfreien Stahl korrodieren, eliminiert, sind in der Literatur beschrieben und eine derartige Ausführung ist auch kommerziell verfügbar. Leider wird zwar die Korrosion dadurch eliminiert, jedoch ist die Chromatographieleistung dieser Puffer insgesamt nicht gleich der von chloridhaltigen Puffern, wie sie in den speziell und ausschließlich für Ionenaustausch- Aminosäure-Analyse ausgelegten Systemen verwendet werden; das Bedürfnis der Benutzer nach einer der Leistung eines speziell und ausschließlich für Ionenaustausch-Aminosäure- Analyse ausgelegten Analysators äquivalenten Leistung wird hierdurch somit nicht befriedigt.

Aus der DE-OS 22 00 882 ist es im Zusammenhang eines chromatographischen Trennverfahrens für Aminosäurengemische unter Verwendung einer Säule mit einem Kationenaustauschharz bekannt, als Pufferlösung ein Alkalimetallsalz einer Säure mit einem pK-Wert kleiner als 5 zu verwenden, wobei das Alkalimetallsalz aus der Gruppe Natrium, Lithium und Kalium und das Anion aus der Gruppe Zitrat, Azetat, Phormat und Phosphat gewählt werden kann und vorzugsweise Natriumzitrat verwendet wird. Die Wahl dieses Puffers dient hierbei zur qualitativen Verbesserung der Ionen austausch-Chromatographie, insbesondere zur Verkürzung der Trenndauer und zur Vermeidung von Basislinienauswanderungen. Das Problem der Ermöglichung der Durchführung von Ionenaus tausch-Chromatographietrennung von Aminosäuregemischen in nicht hierauf spezialisierten HPLC-Geräten ist hierbei nicht berührt.

Ausgehend von dem Stand der Technik betrifft die vorliegende Erfindung wäßrige Pufferlösungen zur Trennung der Komponenten einer Aminosäurengemischprobe nach dem Ionenaustauschverfahren, wobei die Pufferlösung Alkalimetallsalze dreibasischer organischer Säure enthält.

Der Erfindung liegt als Aufgabe die Schaffung derartiger Pufferlösungen zugrunde, welche die Durchführung der Ionenaustausch- Chromatographie zur Trennung von Aminosäuregemischen in herkömmlichen, nicht auf die Ionenaustausch-Chromatographie zur Trennung von Aminosäuregemischen spezialisierten HPLC-Chromatographiesystemen ermöglicht und hierbei gute, mit den auf die Ionenaustausch-Chromatographie spezialisierten teuren Systemen vergleichbare Chromatographieleistungen ergibt.

Zu diesem Zweck ist bei einer Pufferlösung der genannten Art gemäß der Erfindung vorgesehen, daß die Pufferlösung im wesentlichen halogenfrei ist und zusätzlich Alkalimetallnitrate, Salpetersäure sowie ein Schimmelbildungsinhibitormittel enthält.

Mit derartigen erfindungsgemäß ausgebildeten Pufferlösungen wird bei der Verwendung herkömmlicher HPLC-Chromatographie-Systeme zur Trennung von Aminosäuregemischen mittels Ionenaustausch-Chromatographie eine unerwünschte Verringerung der Lebensdauer der Geräte durch übermäßige Korrosion der in derartigen HPLC-Systemen verwendeten Bauteile aus rostfreiem Stahl vermieden und es werden vergleichbar gute Chromatographie-Trennleistungen wie mit herkömmlichen korrodierenden Pufferlösungen in speziell und ausschließlich für Ionenaustausch-Chromatographie ausgelegten Instrumenten erreichbar.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Alkalimetall aus der Gruppe Natrium, Lithium und Kalium gewählt und dient als dreibasische organische Säure Zitronensäure.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung lassen sich die oben genannten Ziele durch eine oder mehrere Pufferlösungen erzielen, die im wesentlichen aus destilliertem oder entionisiertem Wasser bestehen und:

(a) 0,5 bis 5 Gew.-% Natriumcitrat;
(b) 0 bis 6 Gew.-% Natriumnitrat;
(c) 0,01 bis 4 Vol.-% konzentrierte Salpetersäure;
(d) 0 bis 0,1 Gew.-% Benzoesäure sowie
(e) 0 bis 0,003 Gew.-% Äthylmercurithiosalicylsäure

enthalten, wobei diese Pufferlösungen so zusammengesetzt und zubereitet sind, daß die Natriumionenkonzentration im Bereich von 0,12 N bis 1,2 N beträgt. Je nach dem jewei ligen Anwendungsfall wird die Pufferlösung so eingestellt, daß sie einen pH-Wert im Bereich von 1,0 bis 6,9 besitzt.

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß sich brauchbare Ionen austausch-Pufferlösungen herstellen lassen, indem man Natrium ganz oder teilweise (unter entsprechender Anpassung im Hinblick auf die unterschiedlichen Molekulargewichte) durch Lithium, Kalium, Rubidium oder Cäsium ersetzt. Des gleichen, wenngleich dies weniger geläufig ist, ist es auch möglich, das Citratsalz ganz oder zum Teil durch Salze anderer dreibasischer Säuren zu ersetzen. Die Benzoe säure und die Äthylmercurithiosalizylsäure dienen beide als Schimmelbildungsinhibitor und können durch zahlreiche andere bekannte Ersatzstoffe wie beispielsweise Phenol, Toluol und Oktanolsäure ersetzt werden.

In vielen Fällen ist es im Zusammenhang der Trennung komplexer Aminosäuregemische durch Ionenaustausch-Chromato graphie üblich, zwei oder mehr Pufferlösungen mit unterschied lichen pH-Werten zu verwenden, wobei man im Verlauf eines einzigen Analysevorgangs von der einen zur anderen Puffer lösung übergeht. Ein bevorzugter Satz derartiger, nach Maß gabe der vorstehenden Leitlinien zusammengesetzter Puffer lösungen ist in der nachstehenden Tabelle 1 zusammenge stellt:

Tabelle 1

Chloridfreie Hydrolysatpuffer

Die mit diesen chloridfreien Puffern durchgeführte Trennung komplexer Gemische ist vollständig mit der unter Verwendung herkömmlicher chloridhaltiger Puffer vergleichbar. Die Auflösung eng benachbarter Eluier-Dubletten (Sattel-zu- Scheitelwert-Verhältnis, "valley-to-peak ratios") liegt in der Größenordnung von 75%. Mit chloridfreien Puffern nach dem bekannten Stand der Technik zeigen diese Dubletten (typischerweise Threonin/Serin) allgemein eine Auflösung von weniger als 50%. In der nachstehenden Tabelle 2 werden zum Vergleich die aus identischen Proben mit den chloridhaltigen und den chloridfreien Puffersystemen getrennten Aminosäuremengen zusammengestellt.

Tabelle 2

Sattel/Scheitelwert-Verhältnisse von chloridhaltigen und nicht-chloridhaltigen Puffern (% Auflösung)

Über eine Periode von sechs Monaten wurden über 700 Proben analysen mit diesen Puffern auf einem automatischen Amino säureanalysator durchgeführt, in welchem die Ionenaustausch harzträger Sinterscheiben aus rostfreiem Stahl waren. Es trat keine signifikante Verringerung der Auflösung der Säule und kein Anzeichen, daß das Ionenaustauschharz im Verlauf dieses Experiments eine Verschlechterung erfuhr, auf. Mit herkömmlichen chloridhaltigen Puffern hätten sich die Trägerscheiben aufgelöst und bereits lange vor dem mecha nischen Ausfall der Apparatur hätten die Metallionen die Wirkungsweise des Ionenaustauschharzes zerstört.

Zur Bestimmung der Verweilzeit und der Konzentrations reproduzierbarkeit wurde eine Reihe von Trennvorgängen mit dem gleichen Satz von Pufferlösungen an einem Proben gemisch aus 17 Aminosäuren und HN₃ vorgenommen. Die Ver weildauerkoeffizienten variierten dabei im Bereich von 0,05 bis 0,43%, mit einem Mittelwert von 0,23%. Die Konzentrationskoeffizienten variierten gemäß Tabelle 3 im Bereich von 0,44 bis 1,70%, mit einem Mittelwert von 0,83%.

Tabelle 3

Konzentrations-Reproduzierbarkeit (nano Mol pro 50 Mikroliter)

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Trennleistung dieser Puffer lösungen in jeder Hinsicht gleich der der herkömmlichen chloridhaltigen Pufferlösungen ist.

Beim Trennen freier Aminosäuren in physiologischen Flüssig keiten durch Ionenaustausch-Chromatographie werden Schlüssel- Trennungen ("key separations") nur mit Lithium- statt mit Natrium-Pufferlösungen vorgenommen. Ein bevorzugter Satz derartiger Lithium-Pufferlösungen ist in der nachfolgenden Tabelle 4 beschrieben:

Tabelle 4

Chloridfreie physiologische Flüssigkeitspuffer

Die mit diesem Satz Pufferlösungen erhaltenen Trennungen und Scheitelwert-Auflösungen sind in gleicher Weise zufrie denstellend wie die unter Verwendung herkömmlicher chlorid haltiger Lithiumpuffer an physiologischen Flüssigkeiten erzielten Ergebnisse.

Die vorstehend beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen dienen selbstverständlich nur der Erläuterung; sie können in für den Fachmann im Lichte der erfindungsgemäßen Lehre naheliegender Weise mannigfach abgewandelt und modifiziert werden, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

Claims

1. Wäßrige Pufferlösungen zur Trennung der Komponenten einer Aminosäurengemischprobe nach dem Ionenaustauschverfahren, wobei die Pufferlösung Alkalimetallsalze dreibasischer organischer Säuren enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung im wesentlichen halogenfrei ist und zusätzlich Alkalimetallnitrate, Salpetersäure sowie ein Schimmelbildungs-Inhibitormittel enthält.

2. Pufferlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalimetall aus der Gruppe Natrium, Lithium und Kalium gewählt ist.

3. Pufferlösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die dreibasische organische Säure Zitronensäure ist.

4. Pufferlösung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,5 bis 5 Gew.-% Natriumcitrat, 0 bis 6 Gew.-% Natriumnitrat, 0,01 bis 4 Vol.-% konzentrierte Salpetersäure, 0 bis 0,1 Gew.-% Benzoesäure sowie 0 bis 0,003 Gew.-% Äthylmercurithiosalizylsäure enthält.

5. Pufferlösung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 3,28, die Natriumcitratkonzentration 1,721 Gew.-%, die Salpetersäurekonzentration 1,6 Vol.-% und die Benzoesäurekonzentration 0,025 Gew.-% beträgt.

6. Pufferlösung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 6,39, die Natriumcitratkonzentration 1,721 Gew.-%, die Natriumnitratkonzentration 4,68 Gew.-%, die Salpetersäurekonzentration 0,005 Vol.-% und die Äthylmercurisalizylsäurekonzentration 0,001 Gew.-% beträgt.

7. Pufferlösung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch einen pH-Wert von 3,98, eine Lithiumcitratkonzen tration von 1,348 Gew.-%, eine Lithiumnitratkonzentration von 2 Gew.-%, eine Salpetersäurekonzentration von 1,5 Vol.-% und eine Benzoesäurekonzentration von 0,025 Gew.-%.