DE3882144T2

DE3882144T2 - Geflügelpocken-virus-promotoren.

Info

Publication number: DE3882144T2
Application number: DE88909479T
Authority: DE
Inventors: Matthew Binns; Michele Boursnell; Joan Campbell; Fiona Tomley
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1993-10-07
Anticipated expiration: 2008-10-22
Also published as: AU2618088A; AU613291B2; DE3882144D1; GB2211504A; EP0389509B1; EP0389509A1; GB2211504B; GB8724885D0; GB8824746D0; US5182210A; WO1989003879A1; JPH03500604A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der rekombinanten DNA- Technologie und betrifft Promotoren, die bei der Expression fremder DNA, die in einen Geflügelpockenvirus-Vektor inseriert ist, nützlich sind.

2. Stand der Technik

Bei den Pockenviren handelt es sich um große Viren mit einer komplexen Morphologie, die lineare, doppelsträngige DNA- Genome enthalten. Sie gehören zu den wenigen Gruppen von DNA- Viren, die im Zytoplasma der Zelle repliziert werden. Sie können in 6 Gattungen unterteilt werden: Ortho-Pockenviren, Vogelpockenviren, Ziegenpockenviren, Kaninchenpockenviren, Para-Pockenviren und Entomopockenviren. Das Kuhpockenvirus, ein Ortho-Pockenvirus, ist das am besten untersuchte Pockenvirus und ist Gegenstand von US-Patent 4 603 112 (Paoletti et al.). Das Geflügelpockenvirus ist ein Vogelpockenvirus.
Jüngste Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie haben es ermöglicht, daß das Kuhpockenvirus als ein Vektor verwendet werden kann, um fremde Gene zu tragen und zu exprimieren; vergl. den Übersichtsartikel von M. Mackett & G.L. Smith, Journal of General Virology, Bd. 67, S. 2067-2082 (1986). Bestimmte Eigenschaften des Kuhpockenvirus führen dazu, daß es für diesen Zweck geeignet ist. Erstens toleriert es große Mengen an zusätzlicher DNA in seinem Genom, und zwar mindestens bis zu 25000 Basenpaare. Zweitens codiert es für seine eigene RNA-Polvmerase, die spezifisch die Transkription von Messenger-RNA initiiert, und zwar beginnend mit den viralen Promotor-Sequenzen auf dem DNA-Genom. Die RNA- Polymerase II der Wirtszellen erkennt diese viralen Promotoren nicht, und die RNA-Polvmerase des Kuhpockenvirus transkribiert auch nicht von Promotoren, die von der RNA- Polymerase der Wirtszelle erkannt werden. Diese beiden Eigenschaften ermöglichen es, daß fremde Gene in das Genom des Kuhpockenvirus unter der Kontrolle des Promotors des Kuhpockenvirus inseriert werden. Aufgrund der enormen Größe des Genoms des Kuhpockenvirus (186000 Basenpaare) und aufgrund der Tatsache, daß die DNA allein nicht infektiös ist, sind herkömmliche rekombinante DNA-Techniken des Schneidens mit einem Restriktionsenzym und des Ligierens der DNA-Fragmente in das Genom technisch nicht durchführbar.
Daher wird DNA in das Genom nach einem Verfahren der homologen Rekombination eingeführt. Die homologe Rekombination umfaßt im wesentlichen (1) die Vorauswahl eines Abschnittes des Genoms des Kuhpockenvirus (VV) in einer Region, die die Replikation und normale Funktion des Virus nicht beeinträchtigt (nachstehend als "nicht-essentielle Region" bezeichnet), (2) die Herstellung eines Konstrukts aus einem Abschnitt aus fremder DNA in einer Kopie der nicht- essentiellen Region, so daß die fremde DNA von ausgedehnten Sequenzen der nicht-essentiellen Region der UV-DNA flankiert wird, (3) die Co-Infektion von Zellen geeigneter Gewebekulturen mit dem UV und dem Konstrukt und (4) das Selektieren von UV enthaltenden Zellen, in denen der zuvor ausgewählte Abschnitt in vivo ausgetauscht (rekombiniert) worden ist, so daß er im Genom durch die Konstrukt-DNA ersetzt ist.
Um das fremde Gen in das Konstrukt zu inserieren, sollte das Konstrukt selbst in einem Vektor, z.B. einem Plasmid, enthalten sein. Es sollte auch einen Promotor zur Regulation der Expression der fremden DNA innerhalb des Virus umfassen. Das Verfahren ist ausführlicher in dem vorstehend zitierten Übersichtsartikel von Mackett und Smith beschrieben. Kuhpockenvirus-Vektoren sind auf diese Weise experimentell bei der Expression von DNA für mehrere virale Proteine verwendet worden; vergl. z.B. M.Kieny et al., Nature, Bd. 312, S. 163-166 (1984) über die Expression eines Tollwutvirus-Glycoproteins. Da der Kuhpockenvirus-Vektor abgeschwächt werden kann, d.h. so verändert werden kann, daß er weniger virulent ist, ohne seine Verwendung als Vektor zu beeinträchtigen, bestehen für ihn erhebliche Einsatzmöglichkeiten bei Impfungen.
Es ist seit einigen Jahren bekannt, daß prinzipiell eine ähnliche Technologie auf das Geflügelpockenvirus (FPV) angewandt werden kann, vergl. z.B. M.M. Binns et al., Israel Journal of Veterinary Medicine, Bd. 42, S. 124-127 (1986) wobei ein Vektor zur Impfung von Geflügel bereitgestellt werden kann. Wie UV weist auch FPV ein Genom von einer enormen Größe auf (es ist sogar größer als das von UV: Schätzungen reichen von 240 bis 360 Kilobasen), und es ist nicht bekannt, bis zu welchem Ausmaß es dem des Kuhpockenvirus ähnlich ist.
Eines der wesentlichen Erfordernisse für die Expression fremder DNA in einem FPV-Vektor ist ein starker Promotor, der von der RNA-Polymerase von FPV erkannt wird. Mehrere Promotoren sind in UV identifiziert worden, aber ihre relative Stärke ist nicht vollständig untersucht worden. Die hauptsächlichen Vektoren sind die folgenden:
1. p7.5. Der Promotor für ein Polypeptid mit 7,5 Kilodalton, der frühe und späte Aktivitäten aufweist, ist vielfach zur Expression von Genen, die in Kuhpockenviren inseriert wurden, verwendet worden; vergl. S. Venkatesan et al., Cell, Bd. 125, S. 805-813 (1981), M.A. Cochran et al., J. Virol., Bd. 54, S. 30-37 (1985).
2. p11. Das Gen für das hauptsächliche strukturelle Polypeptid mit 11 Kilodalton, das an der Berührungsstelle der HindIII-Fragmente F/E des KuhPockenvirus liegt, weist einen späten Promotor auf, der vielfach verwendet worden ist; vergl.C. Bertholet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82, S. 2096-2100 (1985).
3. pTK. Promoviert das Thymidinkinase-Gen, das im HindIII- Fragment J des Kuhpockenvirus liegt; vergl. J.P. Weir et al., Virology, Bd. 158, S. 206-210 (1987). Dieser Promotor ist nicht oft verwendet worden, und man nimmt an, daß er nicht stark ist.
4. pF. Promotor für ein unbekanntes, frühes, nichtessentielles Gen, das im Hindill-Fragment F des Kuhpockenvirus liegt; vergl. D. Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80, S. 5364-5368 (1983) . Es ist kürzlich gezeigt worden, daß er "vergleichsweise wenig wirksam" ist, d.h. 10-fach weniger wirksam als der TK-Promotor; vergl. B.E.H. Coupar et al., J. Gen. Virol., Bd. 68, S. 2299-2309 (1987).
5. p4b. Das 4b-Gen codiert für ein Kernprotein mit 62 Kilodalton. Es weist einen sPäten Promotor auf, der im HindIII-Fragment A des Kuhpockenvirus liegt; vergl. J. Rosel et al., J. Virol., Bd. 56, S. 830-838 (1985). Das 4b-Protein macht etwa 10 % der viralen Proteine beim Kuhpockenvirus aus.
6 und 7. pM und pI. Diese beiden nicht charakterisierten frühen Kuhpockenvirus-Promotoren aus den HindIII-Fragmenten M bzw. I werden bei der Konstruktion eines multivalenten Kuhpockenimpfstoffes verwendet; vergl. M.E. Perkus et al., Science, Bd. 229, S. 981-984 (1985).
8. p28K. promoviert ein für ein späteres Kernprotein von 28 Kilodalton codierendes Gen; vergl. J.P. Weir et al., J. Virol., Bd. 61, S. 75-80 (1987). Er ist nicht in großem Umfang verwendet worden.
Da Informationen über die genomische DNA-Sequenz von FPV (und natürlich auch von UV, da nur etwa ein Drittel der genomischen DNA-Sequenz von UV veröffentlicht worden ist) fehlen, ist es nicht möglich, vorauszusagen, ob ein spezieller, in UV bekannter Promotor ein Gegenstück in FPV hat, und auch die Wirksamkeit des Promotors kann nicht vorausgesagt werden.
Es sind nur sehr begrenzte Daten über die DNA-Sequenz des FPV-Genoms veröffentlicht worden. So haben D.B. Boyle et al., Virology, Bd. 156, S. 355-365 (1987), die Sequenz des Thymidinkinase-Gens (TK-Gens) und flankierende Sequenzen mit insgesamt 1061 Basenpaaren veröffentlicht. Diese Autoren haben die FPV-TK-Promotorregion untersucht und dabei festgestellt, daß sie eine sogenannte Consensus-Sequenz, die elf UV-Gen-Promotoren gemeinsam ist, enthält [A. Plucienniczak et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 985- 998 (1985)]. Man nimmt an, daß diese "Consensus-Sequenz" auf TATA -- (20 bis 24 bp) -- AATAA beruht, aber es treten viele Abweichungen davon auf, und der gesamte Bereich ist so AT- reich, daß die Bezeichnung "Consensus-Sequenz" keine kritische Bewertung erkennen läßt. Darüberhinaus unterschieden sich die Abstände zwischen diesen Consensus-Sequenzen und den 5'-Enden der TK-mRNA zwischen FPV und VV. Da festgestellt wurde, daß das FPV-TK-Gen in einem Kuhpockenvirus-Vektor exprimiert wird, also von der UV-RNA- Polymerase erkannt wird, kann auf einen gewissen Grad an Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Promotoren geschlossen werden. Es folgt daraus natürlich nicht, daß jeder UV- Promotor hochgradig homolog zu jedem FPV-Promotor ist, und unveröffentlichte Daten der Erfinder der vorliegenden Anmeldung deuten in der Tat an, daß dies nicht der Fall ist.
Weitere Angaben zum Stand der Technik werden nach dem Abschnitt "Zusammenfassende Darstellung der Erfindung", ohne den der Zusammenhang nicht deutlich wäre, behandelt.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Ein wesentlicher Teil der Erfindung rührt von der Lokalisierung einiger FPV-Gene, der Untersuchung der damit verbundenen nicht-codierenden 5'-Bereiche auf ihre Promotorstärke und der dabei erfolgten Auswahl bestimmter starker Promotoren her.
Mehrere Bereiche des FPV-Genoms sind bei Forschungen, die zu der Erfindung geführt haben, untersucht worden. Einer dieser Bereiche entsteht durch Schneiden der DNA mit dem Enzym BamHI, Auswählen eines Plasmids mit einem Insert von etwa 11,2 Kilobasen aus einer Reihe dabei gebildeter Plasmide und Untersuchen dieses DNA-Abschnittes. Ein weiterer Bereich entstand durch Zufallsklonierung des FPV-Genoms und Vergleich dieser Sequenzen mit denen von DNA des vorstehend erwähnten 4b-Gens des Kuhpockenvirus.
Als Ergebnis sind vier starke Promotoren gefunden worden. Erfindungsgemäß werden verschiedene DNA-Moleküle bereitgestellt, die diese enthalten. Die wissenschaftlichen Zusammenhänge bezüglich der Promotoren von Pockenvirus-DNA sind gegenwärtig nur wenig bekannt. Es ist bekannt, daß bestimmte Regionen des 5'- oder "Upstream"-Endes eines Genes dazu dienen, die Transkription von genomischer DNA in Messenger-RNA zu unterstützen, und zwar durch Binden der RNA- Polymerase, die an der Transkription beteiligt ist, so daß die mRNA, die das Startcodon des Gens enthält, transkribiert werden kann. Derartige Upstream-Bereiche werden als Promotor bezeichnet. Es ist oftmals nicht mit Sicherheit möglich zu sagen, welche Nucleotide der Upstream-Sequenz essentiell und welche nicht-essentiell für die Promotion sind, und die minimale oder maximale Länge des Promotors ist auch nicht mit großer Genauigkeit bekannt. Obwohl dieser Mangel an Genauigkeit hinsichtlich der Anordnung und der Länge des Promotors auf den ersten Blick ziemlich unbefriedigend zu sein scheint, stellt er in der Praxis kein Problem dar, da es normalerweise nicht schadet, zusätzliche DNA jenseits der Regionen, die der Transkription der DNA dient, einzuschließen. Wie ferner nachstehend beschrieben wird, ist es durch mühsame Versuche möglich, diese Region genauer zu bestimmen. Aufgrund dieser Umstände ist es daher eher angebracht, den Promotor durch Angabe des Gens, dem er vorausgeht, als durch Angabe der Sequenz des Promotors zu definieren. Die fraglichen Gene sind diejenigen der offenen Leserahmen ORF8, ORF5 und ORF10 des BamHI-Fragments und des Gens von FPV, das dem 4b-Gen des Kuhpockenvirus am meisten entspricht (das dazu die höchste Homologie aufweist). Das letztgenannte FPV-Gen wird zweckmäßigerweise als FP4b bezeichnet. Diese Gene werden nachstehend in Beispiel 1 vollständig identifiziert.
Diese Gene können auf verschiedene Weise definiert werden, wobei natürlich jeweils zu beachten ist, daß zweifellos kleine Differenzen in den Sequenzen zwischen verschiedenen Stämmen oder Typen von FPV auftreten. Eine bequeme, willkürliche Art der Definition besteht in der Angabe eines geeigneten Abschnittes der Aminosäuresequenz, für die sie codieren. Man kann vernünftigerweise annehmen, daß die ersten 10 oder vorzugsweise die ersten 20 Aminosäuren eine einzigartige Sequenz in FPV darstellen. Dementsprechend beruht eine zweckmäßige Definition der vier Gene auf den ersten 20 Aminosäuren, die nachstehend angegeben sind:
(1) das FP4b-Gen, das für ein Protein von etwa 657 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz beginnt:
(2) das ORF8-Gen des BamHI-Fragments, das für ein Protein von etwa 116 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz beginnt:
(3) das ORF5-Gen des BamHI-Fragments, das für ein Protein von etwa 105 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz beginnt:
4) das ORF10-Gen des BamHI-Fragments, das für ein Protein von etwa 280 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz beginnt:
In bezug auf die Gene ist es natürlich klar, daß zwischen verschiedenen FPV-Stämmen Variationen bei den 20 Aminosäuren mit großer Wahrscheinlichkeit auftreten. Wahrscheinlich besteht eine Homologie von mindestens 90 % für das gesamte Gen, aber es kann eine geringere Homologie für die ersten 20 Aminosäuren bestehen, und zwar vielleicht bis zu 3 oder 4 Unterschieden. Es ist jedoch mit Sicherheit anzunehmen, daß kein Fachmann Zweifel daran haben wird, welches Gen gemeint ist, unabhängig vom genauen Grad der Abweichung der Sequenz der ersten 10 oder 20 Aminosäuren.
Es wird erwartet, daß es in Kürze möglich sein wird, eine teilweise Karte des FPV-Genoms zu erstellen. FPV weist, wie andere Pockenviren, ein lineares Genom mit Ähnlichkeiten zwischen den Enden auf: Die endständigen Sequenzen werden umgekehrt wiederholt. Innerhalb dieser endständigen umgekehrten Wiederholungen (TIR, "terminal inverted repeats") treten hintereinander liegende Wiederholungssequenzen auf. Der BamHI-Verdau führte zu Klonen, die diese endständigen umgekehrt Wiederholungssequenzen (TIR) enthielten, und es wurde bestimmt, daß ein Abschnitt von etwa 3,7 bis 4,0 kb an einem Ende eines ungefähr 11,2 kb großen Fragments (der linke Teil der Sequenz davon wird nachstehend gezeigt) innerhalb einer TIR bei dem untersuchten FPV-Stamm liegt. Man nimmt an, daß das FP4b-Gen in einem zentralen Bereich des Genoms liegt. Die Anordnung der 0,79 kb langen Sequenz ist gegenwärtig unbekannt.
Die Erfindung umfaßt ein DNA-Molekül, das im wesentlichen aus der nicht-codierenden DNA am 5'-Ende jedes der vorstehend identifizierten Gene besteht und den Promotor davon umfaßt. Nicht-codierend bedeutet nicht für dieses Gen codierend; sie kann für ein anderes Gen codieren oder als Promotor dienen. Abschnitte von beliebiger, vernünftiger Länge derartiger DNA, typischerweise mit bis zu 150, üblicherweise mit bis zu 100 und insbesondere mit bis zu 80 Nucleotiden (oder Basenpaaren im Fall von dsDNA) des 5'-Endes (selbst wenn es für DNA innerhalb des nächsten Gens entlang des Genoms codiert) werden in dieser Anmeldung als "Promotor-DNA" bezeichnet.
Die Erfindung schließt auch einen Rekombinationsvektor ein, der einen Klonierungsvektor umfaßt, der eine nicht- essentielle Region (NER) der Sequenz von FPV enthält, wobei diese NER von DNA unterbrochen wird, die aus folgendem besteht oder folgendes einschließt (a) erfindungsgemäße Promotor-DNA, gefolgt von (b) einem fremden Gen (d.h. einem Gen, das man in den FPV-Vektor inserieren möchte), das durch den Promotor transkribierbar ist.
Gemäß einem speziellen Aspekt schließt die Erfindung einen Rekombinationsvektor ein, der folgende Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge umfaßt:
(1) eine erste homolog rekombinierbare Sequenz des Geflügelpockenvirus-Genoms (FPV-Genoms),
(2) eine Sequenz innerhalb eines ersten Abschnitts einer nicht-essentiellen Region (NER) des FPV-Genoms,
(3) erfindungsgemäße FPV-Promotor-DNA,
(4) ein fremdes Gen, das in 3'-Richtung des Promotors transkribierbar ist (wobei die RNA-Polymerase des Geflügelpockenvirus bei Bindung an den Promotor das fremde Gen in mRNA transkribiert),
(5) eine Sequenz innerhalb eines zweiten Abschnitts der gleichen NER des FPV-Genoms, wobei die erste und zweite Sequenz vorzugsweise in der gleichen relativen Orientierung im FPV-Genom wie der erste und der zweite Abschnitt der NER liegen, und
(6) eine zweite homolog rekombinierbare Sequenz des FPV- Genoms, wobei die Sequenzen (1) und (6) die NER des FPV- Genoms flankieren und in der gleichen relativen Orientierung in dem Rekombinationsvektor vorliegen, wie sie innerhalb des FPV-Genoms vorliegen.
Gemäß einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung ein DNA- Konstrukt ein, das einen erfindungsgemäßen Promotor umfaßt, der transkribierbar mit einem fremden Gen verknüpft ist. Ein derartiges Konstrukt oder eine derartige "Kassette" kann in einen Klonierungsvektor inseriert werden, der dann als rekombinanter Vektor, der bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Rekombinationsvektors nützlich ist, verwendet werden kann.
Ferner schließt die Erfindung Wirte, die die erfindungsgemäßen Rekombinationsvektoren und rekombinanten Vektoren in sich tragen, ein, insbesondere einen bakteriellen Wirt, der einen Plasmidvektor in sich trägt.
Die Erfindung zielt ferner auf einen rekombinantes FPV, bei dem es sich um das Produkt einer homologen Rekombination von FPV mit einem erfindungsgemäßen Rekombinationsvektor, der ein fremdes Gen enthält, handelt; auf ein Verfahren zur homologen Rekombination; auf tierische Zellen, die mit einem derartigen rekombinanten FPV infiziert sind; auf ein Verfahren zur Invitro-Kultur dieser infizierten Zellen; und auf den erfindungsgemäßen Rekombinationsvektor zur Verwendung bei der Impfung eines darauf ansprechenden Tieres, speziell eines Huhns, ab.

Weitere Beschreibung des Standes der Technik

Auf dem "International Poxvirus Workshop" in Cold Spring Harbor, New York, vom 24.-28. September 1986 hielt F.M. Tomley einen Diavortrag mit dem Titel "Molecular structure and organisation of an 11.3 kb fragment of fowlpoxvirus". In diesem Vortrag stellte er einen Abriß der vorläufigen Ergebnisse der Sequenzierung des BamHI-Fragments von 11,2 kb vor (zu diesem Zeitpunkt nahm man an, daß es 11,3 statt 11,2 kb lang ist). Der Vortrag beschäftigte sich mit dem AT- Reichtum des Fragments, umfaßte ein Dia, das 20 offene Leserahmen zeigte, diskutierte die codonverwendung in FPV, verglich das vorhergesagte FPV-Polypeptid von 48 Kilodalton (hier "ORF1") mit einem frühen UV-Protein von 42 Kilodalton und verglich andere vorhergesagte Polypeptide mit Leber-Lectinen und Anti-Alpha-Trypsinogen. Die Funktionalität der ORF und die Stärke der Genexpression wurden nicht erwähnt, und es wurde auch kein Abschnitt der DNA-Sequenz gezeigt. Der gleiche Vortrag wurde auf dem "Herpes/Poxvirus Workshop" der "Society for General Microbiology" in St. Andrews, Schottland, im April 1987 gehalten. Auf der entsprechenden Tagung im September 1987 zeigten. J.I.A. CamPbell et al. ein Poster, das das terminale BamHI- Fragment von FPV, das zwischen dem BamHI-Fragment von 11,2 kb und dem Ende des Genoms liegt betraf. DNA-Sequenzen wurden nicht gezeigt.
Während des Prioritätsjahres haben F.M. Tomley et al. in J. Gen. Virology, Bd. 69, S. 1025-1040 (1988) die vollständige Sequenz des BamHI-Fragments zusammen mit einigen Einzelheiten des Zusammenhangs zwischen vorhergesagten Polypeptiden und anderen Proteinen angegeben. Eine Studie der funktionellen Promotoraktivität der Sequenzen in 5'-Richtung (Upstream- Richtung) der 12 hauptsächlichen ORF wird als unveröffentlichtes Ergebnis zitiert. Diese Daten wurden zum ersten Mal in einem Poster offenbart, das M.E.G. Boursnell et al. auf dem "VIIth International Poxvirus/Iridovirus Meeting" in Heidelberg vom 22.-26. August 1988 zeigten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein allgemeines Schema eines Verfahrens zur homologen Rekombination, das auf Geflügelpocken-Viren angewandt wurde;
Figg. 2 und 3 sind Plasmidkarten, die schematisch die Ableitung des erfindungsgemäßen Rekombinationsvektors, der zur homologen Rekombination nützlich ist, zeigen;
Fig. 4 ist eine Plasmidkarte, die die Herkunft eines Konstrukts zum Testen von erfindungsgemäßen FPV-Promotoren in einem transienten Assay zeigen.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Während die genaue Länge der zur Promotion erforderlichen DNA nicht bekannt ist, wird sie im allgemeinen auf bis zu 100 Basenpaare vom Startpunkt der RNA angesetzt, aber dies kann bis zu 50 Basenpaare entfernt vom Startpunkt des Gens (ATG- Codon) sein. Dementsprechend ist eine DNA-Sequenz, die innerhalb von 150 Basenpaaren, weniger bevorzugt 100 oder sogar 80 Basenpaaren vom 5'-Ende des Gens (unmittelbar dem Startcodon vorausgehend) enthalten ist, von besonderem Interesse für die Zwecke der Erfindung. Die DNA-Sequenzen dieser 150 Basenpaare sind nachstehend für die Gene (1) bis (4) gezeigt (zur Erleichterung des Lesens sind die Basen willkürlich in Blöcke von 10 unterteilt)
In den vorstehenden Sequenzen folgt ein ATG-Startcodon auf der rechten Seite oder am 3'-Ende.
Die Größe des Teils der nicht-codierenden Sequenz in 5'- Richtung, die für eine wirksame Promotion erforderlich ist, ist nicht genau bekannt. Es können jedoch Versuche durchgeführt werden, um diese Frage zu beantworten, und in der Tat sind einige Versuche für UV durchgeführt worden. Folglich wären ähnliche Versuche möglich, um die Sequenzen, die bei FPV erforderlich sind, zu bestimmen. Eine derartige Technik ist die Deletionskartierung: durch das einfache Mittel des Entfernens von Teilen der im Test befindlichen Sequenz und Untersuchung der danach erzielten Wirksamkeit der Sequenz bei der Promotion können die für die Promotoraktivität ausreichenden Sequenzen identifiziert werden. Auf diese Weise ist beim Kuhpockenvirus festgestellt worden, daß 100 Basenpaare (bp) der Sequenz in 5'-Richtung des Gens für das Protein mit 11 Kilodalton ausreichend sind, um als Promotor zu wirken und zeitlich die späte Transkription zu regulieren; vergl. C. Bertholet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) , Bd. 82, S. 2096-2100 (1985) Deletionen, die etwa 15 bP auf der 5'-Seite der angenommenen Stelle, an der die mRNA-Transkription startet, belassen, führen immer noch zu hohen Expressionsgraden; vergl. C. Bertholet et al., EMBO Journal, Bd. 5, S. 1951-1957 (1986). M. Manggi et al., EMBO Journal Bd. 5, S. 1071-1076 (1986), haben jedoch festgestellt, daß das gleiche Fragment mit einem geringeren Grad funktioniert, wenn es an eine neue Position transloziert wurde. An dieser neuen Position hatten Deletionen, die 32 bp auf der 5'-Seite des ATG-Startcodons beließen, keine Wirkung auf die Promotorstärke. M.A. Cochran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 82, S. 19-23 (1985), zeigten, daß die Aktivität des UV-Promotors für das Polypeptid mit 7,5 Kilodalton in einem Segment von etwa 30 bp lag. J.P. Weir und B. Moss, Virology, Bd. 158, S. 206-210 (1987), stellten fest, daß 32 bp in 5'-Richtung des RNA- Startpunkts ausreichten, um die Promotion des Thymidinkinase- Gens (TK-Gens) in UV korrekt zu regulieren.
Eine 228 bp umfassende DNA-Sequenz im vorderen Bereich eines späten Gens für ein Protein mit 28 Kilodalton (von den Positionen -218 bis +10 relativ zum RNA-Startpunkt) wurde im vorderen Bereich des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gens (CAT) angeordnet, und es wurde festgestellt, daß sie als Promotor wirkt; vergl. J. Weir und B. Moss, J. Virology, Bd. 61, S. 75-80 (1987). Eine Reihe von 5'-Deletionen, die sich in Richtung auf die RNA-Startstelle erstreckten, wurden durchgeführt. Es trat eine allmähliche Verringerung der Expression von CAT auf, sowie sich die Deletionen von -61 bis -18 erstreckten. Mutanten, die 18 bp vor und 10 bp nach dem RNA-Startpunkt enthielten, exprimierten das CAT-Gen immer noch als ein spätes Gen, jedoch auf einem submaximalen Niveau.
Während es mit der Deletionskartierung möglich ist, diejenigen Sequenzen, die für eine Promotionsaktivität ausreichen, zu definieren, ist es nicht möglich, die exakten Basen, die für die Aktivität innerhalb der definierten Sequenzen erforderlich sind, genau festzulegen. Verschiedene Forscher haben Basen innerhalb der angenommenen Promotorsequenzen geändert, und zwar entweder durch Synthese spezifischer Oligonucleotide (vergl. M. Hanggi et al., a.a.O.) oder durch gerichtete Mutagenese (vergl. J.P. Weir und B. Moss, J. Virology, Bd. 61, S. 75-80 (1987)). In beiden Fällen hatten Änderungen sehr weniger, ja selbst einzelner Basen starke Einflüsse auf die Wirksamkeit der Promotion, und daher konnten einzelne wichtige Basen identifiziert werden. Da jedoch manche Änderungen in der Sequenz ohne Verlust an Promotionswirkung möglich sind, ist es klar, daß es erforderlich ist, daß die Erfindung Sequenzen abdeckt, die variabel sind, und zwar sowohl durch Substitution als auch durch Deletion oder Addition ausgehend von den nicht- codierenden Sequenzen mit einer Länge bis zu 150 bp, auf die vorstehend Bezug genommen wurde.
Der Rekombinationsvektor kann eine zusätzliche Sequenz zu der hier als Promotor-DNA bezeichneten enthalten. Die zusätzliche Sequenz kann (a) eine zusätzliche Sequenz mehr als 150 bp in 5'-Richtung vom ATG-Startcodon, (b) eine in die 150 bp ohne Zerstörung der Promotoraktivität inserierte Sequenz oder (c) einen Teil der Sequenz des FPV-Gens (einschließlich des ATG- Startcodons und vorwärts), z.B. bis zu 100 bp davon, umfassen.
Die vorstehenden Versuche erfordern das Testen der Wirksamkeit des Promotors. Es ist zu diesem Zweck nicht erforderlich, das Promotor-Gen-Konstrukt in FPV einzuführen und die Expression des Genprodukts zu beobachten. Eine schnellere Methode, die als transienter Assay bekannt ist, kann für UV verwendet werden; vergl. M.A. Cochran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 82, S. 19-23 (1985). Beim transienten Assay wird der Promotor mit einem Gen mit einem leicht nachzuweisenden Produkt verknüpft. Ein Plasmid, das dieses Konstrukt enthält, wird anschließend in eine Zelle eingeführt, die mit dem Virus infiziert worden ist. Die virale RNA-Polymerase kann vom Promotor aus transkribieren, obwohl der Promotor nicht dem viralen Genom einverleibt worden ist. Da die Expression nur solange andauert, wie sowohl die Virus-DNA als auch die Plasmid-DNA in der Zelle zusammen vorliegen, wird diese Form der Expression als "transient" (vorübergehend) bezeichnet. Zwei verschiedene Markergene sind in transienten Assay-Systemen für Kuhpockenviren verwendet worden, und zwar das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen (CAT-Gen) (vergl. M.A. Cochran et al., a.a.O.) und das β-Galactosidase-Gen (lacZ- Gen) (vergl. D. Panicali et al., Gene, Bd. 47, S. 193-199 (1986)). Unter Verwendung des CAT-Gens wurden die im Test befindlichen Promotorsequenzen in den vorderen Bereich des vollständigen CAT-Gens, das sein eigenes ATG-Startcodon einschloß, kloniert. Dies ist also eine "transkriptionale Fusionssequenz", d.h., die Sequenzen sind in einer nicht- codierenden Region verschmolzen. Im Fall des β-Galactosidase-Gens (lacZ-Gens) wurden sowohl ein transkriptionaler als auch ein translationaler Fusionsvektor beschrieben, beide für transiente Assays und zur Untersuchung in Rekombinanten. Der translationale Fusionsvektor enthielt ein β-Galactosidase-Gen ohne eigenes Startcodon, so daß die Fusion innerhalb der codierenden Region erfolgt. Das ATG-Startcodon wurde von dem im Test befindlichen UV-Promotor bereitgestellt. Das β- Galactosidase-Gen (lacZ-Gen) wurde daher so kloniert, daß es sich innerhalb des Rahmens mit dem UV-Gen-Startcodon befand, wobei das UV-Gen mit dem lacZ-Gen vor Codon 9 des letzteren verschmolzen wurde. Der Promotor befand sich also exakt in der gleichen Umgebung bezogen auf das in dem Fusionsvektor verwendete Startcodon, wie in seiner nativen Position.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde das lacZ-Gen nur für den transienten Assay zur Bestimmung der Promotorstärke verwendet. Es ist natürlich klar, daß bei der Ausführung der Erfindung ein fremdes Gen, das zur Verbesserung der Verfassung von Geflügel von Bedeutung ist, in das Geflügelpockenvirus inseriert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Gen um ein Gen, das in vivo als Untereinheit- Vakzin geeignet ist, z.B. um ein oder mehrere Gene, die unter dem Virus der infektiösen Bronchitis ("Infectious Bronchitis Virus", IBV), dem Virus der infektiösen Schleimbeutelerkrankung ("Infectious Bursal Disease Virus") dem Virus der Newcastle-Erkrankung ("Newcastle Disease Virus, NDV") , dem Virus der Marekschen Erkrankung ("Marek's disease Virus"), dem infektiösen Laryngotracheitis-Virus und Genen, die für antigene Proteine von Eimeria-Spezies codieren, ausgewählt sind. Spezielle Gene, die von Interesse sind, sind die Spike-Gene von IBV und die HN- und F-Gene von NDV, die in der PCT-Anmeldung WO 86/05806 und in EP-A-0 227 414 (beide National Research Developement Corporation) beschrieben sind. Damit ein fremdes Gen in vivo korrekt translatiert wird, ist es erforderlich, daß das fremde Gen sein eigenes ATG- Startcodon in der Region, die unmittelbar dem Promotor folgt, inseriert hat.
Es ist erforderlich, eine nicht-essentielle Region des FPV zu lokalisieren, in die der erfindungsgemäße Promotor und das gewünschte fremde Gen inseriert werden. Prinzipiell könnten sie an beliebigen Stellen des FPV-Genoms, die die Grundfunktionen des Virus nicht beeinträchtigen und nicht mit der Wirkung des FPV-Promotors oder des Fremdgens in Wechselwirkung treten, inseriert werden. Es kann sich um eine codierende oder eine nicht-codierende Region handeln. In UV ist das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen) oft für diesen Zweck verwendet worden; vergl. etwa Beispiel 4 der zuvor erwähnten Patentanmeldung WO 86/05806, in der die Expression des IBV- Spike-Gens in UV unter Verwendung des Kuhpocken-Promotors für das Polypeptid mit 7,5 Kilodalton und der nicht-essentiellen Region von TK beschrieben wird.
Es ist klar, daß die Detektion der Insertion des fremden Gens von der Detektion von viral infizierten Zellen, die keines der nicht-essentiellen Gene, z.B. TK, bilden, abhängt. Derartige Zellen werden als "TK minus" beschrieben.
Alternativ dazu kann man das TK-Gen oder eine markerlose, codierende oder eine nicht-codierende Region verwenden und die Insertion des fremden Gens durch einen Hybridisierungs-Assay nachweisen, bei dem eine markierte Nucleotidsequenz, die komplementär zu der fremden Gensequenz ist, eingesetzt wird.
Die am 24. März 1988 veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 88/02022 (CSIRO) beschreibt ein Verfahren zur stabilen Insertion eines fremden Gens innerhalb des TK-Gens von FPV, und zwar mit Hilfe eines dominanten, selektierbaren Markergens ("Ecogpt") und eines UV-Promotors. Der Offenbarung dieser Patentanmeldung kann man sich in der vorliegenden Erfindung bedienen, und zwar durch Austausch eines erfindungsgemäßen FPV-Promotors gegen den UV-Promotor. Die Verwendung des FPV-Promotors wird bevorzugt, da sie wahrscheinlich für die veterinärmedizinischen Zulassungsbehörden eher akzeptabel ist.
Der erfindungsgemäße Promotor und das fremde Gen müssen anschließend in die nicht-essentielle Region (NER) des FPV- Genoms inseriert werden. Das Verfahren der homologen Rekombination, das durch Fig. 1 der Zeichnung verdeutlicht wird, stellt einen Weg dar, um dies durchzuführen. Ein Fragment der genomischen DNA, das die NER enthält, wird in einen Klonierungsvektor subkloniert. Gegebenenfalls kann es gekürzt werden, um den größten Teil der flankierenden Sequenzen zu entfernen. Es wird dann in dem Klonierungsvektor ein Konstrukt hergestellt, das einen Teil der NER (beginnend an einem Ende davon), gefolgt von dem erfindungsgemäßen FPV- Promotor ("P") , gefolgt von dem fremden Gen, gefolgt von im wesentlichen dem Rest der NER (endend am anderen Ende davon), umfaßt. In einem geeigneten Vektor bildet dieses Konstrukt den Rekombinationsvektor, der zur Transfektion von Zellen verwendet wird, die mit FPV infiziert sind, und zwar z.B. nach der Calciumphosphat-Methode, wobei die Rekombination zwischen den NER-Sequenzen im Vektor und den NER-Sequenzen in FPV erfolgt. FPV nimmt dann automatisch dieses veränderte Genom wieder auf, und daher ist verändertes FPV (rekombinantes FPV) Teil der Erfindung.
Figg. 2 und 3 der Zeichnungen verdeutlichen alternative Methoden zur Herstellung des vorstehend genannten Rekombinationsvektors. Mit Bezug auf Fig. 2 wird eine nicht- essentielle Region mit zwei Restriktionsstellen A und B in einen geeigneten Vektor inseriert, der nur zur Veranschaulichung als Plasmid beschrieben wird. In einem weiteren Plasmid mit den gleichen (oder hinsichtlich der Ligation kompatiblen) Restriktionsstellen A und B wird ein Konstrukt aus der erfindungsgemäßen FPV-Promotorsequenz, gefolgt von der Sequenz des fremden Gens, gebildet. Es ist natürlich wesentlich, daß dieses Konstrukt so hergestellt wird, daß die mRNA-Transkription am Beginn oder vor dem Startcodon des fremden Gens beginnt. Da es zeitaufwendig ist, genau zu bestimmen, wo der Start der mRNA-Transkription durch einen speziellen Promotor bewirkt wird, ist es bequemer, einfach 100 oder insbesondere 150 Basenpaare der Promotor-DNA, die dem FPV-Gen, die sie normalerweise promoviert, unmittelbar vorangeht, zu inserieren, um eine gute Funktion des Promotors sicherzustellen. Es ist aber natürlich klar, daß Teile der Promotor-DNA durch Behandlung mit Restriktionsenzymen entfernt werden können, um die Promotor-DNA zu verkürzen und dabei unnötige Sequenzen zu eliminieren, wenn die Zeit, um die vorstehend genannten Versuche durchzuführen, zur Verfügung steht. Es wird angenommen, daß eine derartige Anpassung eine unwesentliche Veränderung einer speziellen Ausführungsform der beschriebenen Erfindung ist. Ebenso gut ist es möglich, die Promotor-Sequenz am 3'-Ende davon auszudehnen, d.h., einige Basenpaare ihrer natürlichen FPV-Gensequenz einzuschließen. Dies wird normalerweise zu einer In-vivo-Expression eines translationalen Fusionsproteins führen, wenn die fremde Gensequenz so angeordnet ist, daß sie im Rahmen mit dem natürlichen FPV-Gen liegt. Ein derartiges Protein ist jedoch nicht besonders erwünscht, und in der Tat kann jede beliebige kurze Sequenz von Nucleotiden zwischen der Promotor-DNA und dem Startcodon des fremden Gens angeordnet werden.
Die Restriktionsstellen A und B sind in der Plasmid-DNA, die die FPV-Promotor-DNA und das fremde Gen flankiert, lokalisiert. Natürlich könnte A innerhalb der Promotor-DNA liegen, wenn sie in einen nicht-funktionellen Teil davon fällt. Während aus Gründen der Einfachheit zwei verschiedene Restriktionsstellen gezeigt sind, könnte es sich natürlich auch um die gleichen Restriktionsstellen handeln. Es kann sich um Stellen mit überstehenden Enden oder mit glatten Enden handeln, und sie können künstlich durch Auffüllen mit Nucleotiden und/oder durch Ligieren zusätzlicher Nucleotide hergestellt werden, und zwar in einer Weise, die im Bereich der rekombinanten DNA-Technik gut bekannt ist. Bequemerweise werden A und B in dem Konstrukt vom Typ 2 in identische Stellen mit glatten Enden (C, nicht gezeigt) umgewandelt, und anschließend läßt man sie an einer einzigen Stelle C mit glatten Enden (wodurch A und B ersetzt werden) innerhalb der NER rekombinieren. Es muß natürlich darauf geachtet werden, Restriktionsstellen auszuwählen, die in der Vektor-DNA einzigartig sind, um eine Rekombination anderer DNA-Sequenzen zu verhindern.
DNA von den beiden Plasmiden wird in vitro ligiert und anschließend in den Wirt transformiert, und zwar mit geeigneten Restriktionsenzymen, um das endgültige Konstrukt vom Typ 1 zu bilden. Das Promotor-Fremdgen-Konstrukt vom Typ 2 wird natürlich in einer ähnlichen Weise aus einem Vektor hergestellt, der den Promotor und einen anderen Vektor mit dem Fremdgen enthält.
Fig. 3 verdeutlicht eine weitere Methode zur Herstellung erfindungsgemäßer rekombinanter Vektoren. Bei dieser Methode stellt man zunächst ein Konstrukt her, das einen ersten Teil der NER, gefolgt von dem erfindungsgemäßen FPV-Promotor, gefolgt von einer kurzen Nucleotidsequenz, die mindestens eine Klonierungsstelle zum Einführen eines fremden Gens enthält, gefolgt von einem zweiten Teil der NER, bei dem es sich einfach im wesentlichen um den Rest der NER handeln kann, umfaßt. Natürlich kann fast jeder DNA-Abschnitt eine Klonierungsstelle, die in der einen oder anderen Weise zur Einführung eines fremden Gens geeignet ist, bereitstellen. Vorzugsweise enthalten diese Konstrukte eine mehrfache Klonierungsstelle, d.h., einen kurzen DNA-Abschnitt, der die Stellen für eine Reihe verschiedener Restriktionsenzyme, z.B. mindestens zehn, enthält. Ein derartiges Konstrukt ist dann vielseitig verwendbar, da es viel einfacher ist, DNA, die fast beliebige fremde Gene flankiert, an Stellen nahe jedem Ende davon zu schneiden und das fremde Gen in die mehrfache Klonierungsstelle, die in Fig. 3 verdeutlicht ist, zu inserieren. Aus Gründen der Einfachheit sind nur zwei Stellen x und Y gezeigt, und wiederum können diese gegebenenfalls aufgefüllt und ausgedehnt oder zurückgeschnitten werden, um identische Stellen mit glatten Enden (Z, wodurch X und Y ersetzt werden) zu erhalten. In dem endgültigen Konstrukt ist die Promotor-DNA von dem fremden Gen durch einen Abschnitt der mehrfachen Klonierungsstelle getrennt, aber dies beeinträchtigt die Transkription der mRNA in dem endgültigen Virus nicht.
Bei beiden Methoden der Konstruktion wird die NER durch den Promotor und das fremde Gen geteilt. Es ist natürlich nicht wesentlich, daß sie im zentralen Bereich geteilt wird. Es ist auch nicht wesentlich, daß der zweite Teil der NER den gesamten Überschuß oder Rest der NER ausmacht. Solange jedes Ende der NER einen ausreichend langen Abschnitt von DNA zur homologen Rekombination enthält oder davon flankiert wird, spielt es keine Rolle, wenn ein Teil der NER irgendwo dazwischen herausgeschnitten wird oder wenn zusätzliche (irrelevante) DNA bei der Herstellung des Rekombinationsvektors inseriert wird. Offensichtlich ist es nicht erforderlich, daß es sich bei der verwendeten NER um die vollständige Region oder das vollständige Gen, das im FPV-Genom als nicht-essentiell identifiziert wurde, handelt. Ein beliebiger Teil davon reicht aus, und der Ausdruck "Ende" in bezug auf die NER bedeutet dann das Ende des ausgewählten Teils.
Angaben zu anderen Vektoren als FPV-Vektoren (oder UV- Vektoren) bedeuten beliebige geeignete prokaryontische oder eukaryontische Klonierungsvektoren, die zur Massenproduktion des Konstrukts in einem geeigneten Wirt geeignet sind. Bei prokaryontischen Vektoren handelt es sich normalerweise um Plasmide oder Phagen. Geeignete prokaryontische Wirte umfassen Bakterien. Eukaryontische Vektoren, wie solche aus Pilzen, Hefen und tierischen Zellen, z.B. SV40, können eingesetzt werden, wenn dies als geeigneter erscheint.
Obwohl der verwendete Rekombinationsvektor normalerweise aus doppelsträngiger DNA besteht, ist es möglich, einzelsträngige DNA zur homologen Rekombination-zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Rekombinationsplasmid, das die NER, den Promotor und das fremde Gen enthält, muß dann gegen FPV-DNA bei der homologen Rekombination ausgetauscht werden. Zu diesem Zweck werden geeignete Geflügelzellen mit FPV infiziert. Offensichtlich ist es nicht besonders sinnvoll, FPV vom Wildtyp zu verwenden. FPV kann leicht abgeschwächt werden (so mutiert werden, daß es weniger virulent ist), und zwar durch beliebige herkömmliche Methoden zur Abschwächung.
Es sind viele verschiedene Methoden zur Selektion der rekombinanten Viren verfügbar, und sie sind für UV in dem Übersichtsartikel von M. Mackett und G.L. Smith, a.a.O beschrieben worden. Diese Methoden sind erfindungsgemäß anwendbar. Bei Verwendung des TK-Gens als NER besteht eine Methode darin, ein Gemisch aus Viren, das das gewünschte (rekombinante) Virus enthält, auf frische TK-minus-Zellen in einem Wachstumsmedium mit BUdR zu übertragen. BUdR tötet das ursprüngliche Virus, das TK-positiv war, so daß die erfindungsgemäß hergestellten TK-minus-Mutanten selektiert werden können. Eine andere Methode besteht darin, das Rekombinationsplasmid zu vergrößern, so daß es einen FPV- Promotor oder, weniger günstig, einen UV-Promotor zusammen mit einem zusätzlichen Markergen, das vorzugsweise selektierbar ist, wie Ecogpt, das aber möglicherweise auch nicht selektierbar ist, wie β-Galactosidase, innerhalb der NER einschließt, und anschließend Rekombinanten unter Verwendung einer Eigenschaft des Markergens zu detektieren, z.B. im Fall der β-Galactosidase durch die blauen Plaques, die erzeugt werden, wenn 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D- galactopyranosid (X-gal) als Substrat im Wachstumsmedium vorhanden ist.
Die selektierten TK-minus-Zellen, die das FPV (das ein deletiertes TK-Gen aufweist, aber ein fremdes Gen besitzt) enthalten, werden anschließend in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF), Hühner-Fibroblasten oder Hühnerembryo-Epithelzellen, die durch herkömmliche Gewebekulturmethoden gewonnen wurden, und zwar hauptsächlich durch Trypsin-Behandlung von Geweben oder der chorio-allantoischen Membran (CAM) von Mühner- oder Truthahneiern mit Embryonen, gezüchtet. Zur Verabreichung an Vögel kann das rekombinante Virus den Vögeln als Aerosol, im Trinkwasser, oral, durch intramuskuläre Injektion oder durch Impfung in das Flügelgewebe gegeben werden. Bestandteile wie Magermilch oder Glycerin können zur Stabilisierung des Virus verwendet werden.
Während die Erfindung hauptsächlich auf die Behandlung von Hühnern abzielt, ist sie möglicherweise in bezug auf andere Tiere, die in sicherer Weise mit FPV infiziert werden können, von Interesse. Es ist sogar möglich, daß es als unbedenklich angesehen wird, Menschen mit FPV zu infizieren, nachdem geeignete Versuche durchgeführt worden sind. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

1. Virusstamm

Der Stamm HP438 des Geflügelpockenvirus wurde von den Professoren A. Mayr und H. Mahnel, Ludwig-Maximilians- Universität München, erhalten. Der Stamm HP438 wurde aus dem pathogenen Stamm HP1 durch 438 Passagen in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) in Gewebekultur erhalten, vergl. A. Mayr et al., Zentralblatt für Veterinärmedizin, Bd. B13, S. 1-13 (1966) . Der Stamm HP441, der verwendet wurde, um DNA zum Klonieren zu erhalten, wurde durch drei weitere Passagen in CEF-Zellen erhalten.

2. Gewebekulturmedium

CEF-Zellen wurden in einem Medium der Bezeichnung 199 (Wellcome) gezüchtet, das mit Penicillin (200 Einheiten/ml), Streptomycin (200 ug/ml), Fungizon (2 ug/ml) und 10 % Serum aus neugeborenen Kälbern (CS) versetzt wurde.

3. Reinigung des Virus und Extraktion der DNA daraus

Geflügelpockenviren des Stammes HP441 wurden auf konfluente Monoschichten von CEF-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion von ungefähr 1 pro Plaque bildender Einheit (pfu) pro Zelle überimpft. Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium vorgewaschen, und die Virus-Impfkultur wurde zu den Zellen in 1 ml serumfreiem Medium pro Flasche von 75 cm² gegeben. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37ºC mit dem Ziel, eine Adsorption des Virus an den Zellen zu ermöglichen, wurden 10 ml eines 2 % Kälberserum (CS) enthaltenden Mediums zugegeben. Nach 5 Tagen wurde ein ausgeprägter zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet, und zu diesem Zeitpunkt wurde der Überstand gewonnen. Die Zellbruchstücke wurden vom Überstand durch Zentrifugieren bei 2500 U/min für 10 Minuten in einem Rotor der Bezeichnung "Sorvall GSA" entfernt. Das Virus wurde dann aus dem Überstand durch Zentrifugation bei 14000 U/min für 30 Minuten in einem Rotor der Bezeichnung "Sorvall 5534" pelletiert. Das virale Pellet wurde in 10 millimolarer Tris-Lösung vom pH-Wert 9,0 resuspendiert, und es wurde nochmals bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um jegliches verbliebenes Zellmaterial zu entfernen.
Um die DNA aus dem Virus zu extrahieren wurde ein gleiches Volumen an Lysispuffer (100 millimolar TRIS-HCl vom pH-Wert 7,8, 2 millimolar EDTA, 54 % Saccharose, 2 % SDS, 200 millimolar 2-Mercaptoethanol) zu der Virussuspension gegeben. Proteinase K wurde dann als Feststoff zu 500 ug/ml zugegeben. Dieses Gemisch wurde 2 Stunden bei 50ºC und anschließend über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Lösung wurde anschließend langsam und vorsichtig viele Stunden mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:48:2 Vol./Vol./Vol., gesättigt mit 10 millimolar TRIS-HCI vom pH-Wert 7,5, 1 millimolar EDTA) und anschließend mit Ether extrahiert. 2,5 Volumenteile absolutes Ethanol wurden zugegeben, um die virale DNA auszufällen. Die virale DNA wurde in 10 millimolar TRIS-HCI vom pH-Wert 7,5, 1 millimolar EDTA (TE) oder in entionisiertem Wasser resuspendiert.

4. Klonierung der viralen DNA in Plasmidvektoren

1 ug FPV-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (BRL) geschnitten und in das mit BamHI geschnittene und mit Phosphatase behandelte Plasmid pUC13 (Pharmacia) ligiert. Nach Transformation in den E. Coli-Stamm TGI unter Anwendung von Standardmethoden (vgl. D. Hanahan, J. Mol. Biol., Bd. 166, S. 557-580 (1983)) wurden Kolonien, die Plasmide mit inserierten DNA-Fragmenten enthielten, durch die weiße Farbe auf den X-gal-Indikatorplatten identifiziert. Kolonien wurden mit Nick-Translationssonden von FPV-DNA (radioaktiv markiert) untersucht, und Plasmide, die FPV-DNA-Inserts enthielten, wurden durch Restriktionsverdau von Plasmid-DNA, die nach der Methode von D.5. Holmes et al., Anal. Biochem., Bd. 114, S. 193-197 (1981) isoliert wurde, und auch von in CsCl- Gradienten gereinigter DNA analysiert. Man erhielt eine Reihe von rekombinanten Plasmiden, die FPV-DNA-Inserts enthielten, und eines davon, das als pMH23 bezeichnet wurde und ungefähr 11,2 Kilobasen aufwies, wurde zur Sequenzierung ausgewählt. EcoRI-Klone von FPV-DNA wurden auf die gleiche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Kolonien nicht mit radioaktiv markierter viraler DNA untersucht, sondern in Glycerinkulturen als "Bibliothek" gelagert wurden.

5. Sequenzierung von pMH23

Um das virale Insert pMH23 zu sequenzieren, wurden Zufallssubklone von pMH23 durch Klonieren von mit Ultraschall behandelten Fragmenten von pMH23 in mit SmaI geschnittenem und mit Phosphatase behandeltem M13mp10 (Amersham International PLC) erzeugt. Klone, die virale Inserts enthielten, wurden durch Koloniehybridisierung mit radioaktiv markiertem Insert aus pMH23 identifiziert. Die Didesoxy- Sequenzierung mit [³²P]dATP wurde angewandt, um die vollständige Sequenz des viralen Inserts zu bestimmen.

6. Zufallssequenzierung des Geflügelpockenvirus-Genoms

Rekombinante Plasmide mit Geflügelpocken-DNA-Inserts wurden in ähnlicher Weise wie vorstehend erhalten, wobei man jedoch von Viren, die weitere drei Mal passiert wurden (HP444), ausging. Die Zufallssequenzierung des viralen Genoms wurde wie im vorstehenden Abschnitt 5 durchgeführt. Mit Ultraschall behandelte Fragmente der viralen DNA wurden in M13mp10 kloniert und direkt ohne eine Identifizierungsstufe sequenziert.

7. Identifizierung angenommener Promotorsequenzen

Die als Promotoren zu testenden Sequenzen wurden in zwei Weisen identifiziert:
a) Sequenzen in "Upstream"-Richtung von (unmittelbar in 5'- Position von) offenen Leserahmen in der pMH23-Sequenz wirken wahrscheinlich als Promotoren im Virus und waren daher Kandidaten zum Test in einem transienten Assay-System.
b) Sequenzen in "Upstream"-Richtung eines Gens mit großer Homologie zu dem 4b-Gen des Kuhpockenvirus wurden durch Vergleich der Aminosäuren, für die die FPV-DNA codiert, mit denen, für die UV-4b codiert, ausgewählt.
Die offenen Leserahmen (ORFs) in pMH23 und das FP4b-Gen wurden wie folgt identifiziert.

(a) Offene Leserahmen

Die vollständige Sequenz des pMH23-Inserts ("BamHI-Fragment mit 11,2 kb") wurde bestimmt, und sie weist eine Länge von 11225 Nucleotiden auf. Diese Sequenz ist nachstehend gezeigt ein Nucleotid, das sich beim Sequenzieren verschiedener M13-Klone von FPV unterschied; Stern = Stop-Codon) . Eine Computeranalyse der Sequenz zeigte das Vorliegen mehrerer ORFs. Wenn nur ORFs mit einer Länge von mehr als 150 Basen berücksichtigt werden, dann sind 19 vollständige potentielle Gene vorhanden, aus denen Polypeptide mit 58 bis 418 Aminosäuren vorhergesagt werden können. Die mit 1 bis 12 numerierten ORFs wurden als die hauptsächlichen ORFs betrachtet, und zwar entweder aufgrund ihrer Größe oder aufgrund ihrer Codonverwendung. Die Start- und Stopp- Positionen dieser ORFs sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Sieben weitere ORFs wurden als weniger bedeutend angesehen, und zwar entweder, da sie überlappen, oder da sie in anderen potentiellen Genen enthalten sind, oder aufgrund ihrer Codonverwendung. Tabelle 1 Offene Leserahmen des BamHI-Fragments in pMH23 aus dem Geflügelpockenvirus Start Stopp Zahl der Aminosäuren Größe in Kilodalton * ORF 3, 5, 6, 7, 10, 11 und 12 werden auf dem Strang, der dem gezeigten komplementär ist, transkribiert, d.h. in der umgekehrten Richtung in bezug auf die anderen.
Sequenzen in "Upstream"-Richtung der elf größten hauPtsächlichen ORFs wurden in translationale lacZ- Fusionsvektoren zur Messung der Promotoraktivität in einem transienten Assay-System kloniert.

(b) FP4b-Gen

Zufallsklone der Geflügelpockenvirus-DNA wurde sequenziert. Die Sequenz jedes Klons wurde auf dem Computer in die sechs möglichen Rahmen translatiert und mit einer Bibliothek der veröffentlichten Kuhpockenvirus-Sequenzen verglichen. Mehrere Geflügelpockenvirus-Gene mit einem gewissen Grad an Homologie zu Kuhpockenvirus-Genen wurden nachgewiesen. Bei einem der auf diese Weise identifizierten Gene handelte es sich um ein Geflügelpockenvirus-Gen mit hoher Homologie zum 4b-Gen aus Kuhpockenviren (dieses Gen wird hier als FP4b-Gen bezeichnet). Der M13-Klon, der diese Sequenzen enthielt, wurde als Sonde für eine EcoRI-Bibliothek von Geflügelpockenvirus-Klonen (siehe vorstehend) verwendet, und es wurde ein Klon, der DNA von 2,7 Kilobasen enthielt, detektiert. Der Klon wurde sequenziert, wie für pMH23 beschrieben wurde, und es wurde festgestellt, daß er das 5'- Ende des FP4b-Gens, in "Upstream"-Richtung liegende angenommene Promotorsequenzen und das 3'-Ende eines anderen offenen Leserahmens enthielt.

8. Assay für die Promotorstärke

(a) Translationale Fusionsvektoren

Translationale Fusionsvektoren ermöglichen es, potentielle Promotorsequenzen bis einschließlich des Startcodons des Testgens an ein Gen mit einem leicht nachweisbaren Produkt zu fusionieren. So sind die im Test befindlichen Promotorsequenzen in exakt dem gleichen Sequenzkontext relativ zum Start des ORF wie im ursprünglichen Gen, und nur die codierenden Sequenzen des Gens sind verändert. In diesem Fall verwendete translationale Fusionsvektoren weisen das β- Galactosidase-Gen (lacZ) als einen nachweisbaren Marker auf und werden als pNM480, pNM481 und pNM482 bezeichnet. Es handelt sich um Modifikationen von pMC1403 (vergl. M.J. Casadaban et al., J. Bacteriology, Bd. 143, S. 971-980 (1980)), die von Minton, Gene, Bd. 31, S. 269-273 (1984) durchgeführt wurden. Die modifizierten Vektoren weisen zusätzliche einzigartige Klonierungsstellen auf, die in allen drei Leserahmen verfügbar sind.

(b) Geflügelpockenvirus-Sequenzen zur Klonierung in translationalen Fusionsvektoren

M13-Zufallssubklone, die zur Sequenzierung erzeugt worden waren, wurden verwendet, um Testsequenzen in "Upstream"- Richtung des lacZ-Gens anzuordnen. M13-Klone, die in "Downstream"-Richtung genau unterhalb eines ATG-Codons begannen und in "Upstream"-Richtung (in den angenommenen Promotor) liefen, wurden ausgewählt. Fragmente wurden aus diesen Klonen ausgeschnitten, und zwar unter Verwendung von Restriktionsenzymstellen im M13-Polylinker, und sie wurden in pNM-Vektoren, die mit geeigneten Restrikt ionsenzymen geschnitten worden waren, kloniert. Der entsprechende Klon wurde so ausgewählt, daß vergleichsweise wenig von dem FPV- Gen-ORF in dem Fusionsprotein vorhanden war, und der entsprechende Vektor wurde so ausgewählt, daß sich wenige Aminosäuren, für die FPV-ORF codierte, im Rahmen mit dem lacZ-Gen befanden. Aus diesem Grund unterscheiden sich die Vektoren in einem oder zwei Nucleotiden, und sie werden als pNM 480, 481 und 482 bezeichnet. Plasmide, die Geflügelpockenvirus-Sequenzen enthielten, die ein vollständiges lacZ-Gen erzeugt hatten, wurden vorläufig entweder durch die blaue Farbe auf den Bakterienplatten oder durch Verwendung von Sonden mit radioaktiv markierter Geflügelpockenvirus-DNA identifiziert, und sie wurden definitiv durch Sequenzieren über die Fusionsstelle in den angenommenen Promotor hinein identifiziert. Fig. 2 zeigt, wie alle diese Klone (mit der Ausnahme von Nr. 1) in die pNM- Vektoren kloniert wurden. (Da der einzige geeignete M13-Klon für ORF1 in einer unterschiedlichen Orientierung vorlag, mußten unterschiedliche Restriktionsenzyme verwendet werden. Das pNM480-Plasmid wurde mit BamHI und HindIII geschnitten, und zwar unter Verwendung einer BamHI-Stelle zwischen den markierten EcoRI- und HindIII-Stellen, und die HindIII-Stelle wurde an ihren Enden in geeigneter Weise repariert, um das BamHI-HaeIII-Promotorfragment, das aus dem M13-Vektor ausgeschnitten worden war, aufzunehmen) . Tabelle 2 enthält eine Liste der beteiligten ORFs, die Namen der verwendeten M13-Klone, die verwendeten pNM-Vektoren und die Zahl der von den Geflügelpockenvirus-ORFs (d.h. von dem Methionin- Startcodon aus), die an den Fusionsprodukten beteiligt waren, codierten Aminosäuren. Tabelle 2 Translationale Fusionskonstrukte von Promotoren (plus einem Teil des ORF) mit dem lacZ-Genkonstrukt. Ausgangsvektor pNM Endvektorkonstrukt Zahl der Aminosäuren des ORF Nucleotidlänge der nicht-codierenden 5'-Sequenz bisher unbekannt

(c) Untersuchung von Promotoren in einem transienten Assay- System

Hühnerembryo-Fibroblast-Zellen (CEF) aus einer Vorkultur in 24-Zellen-Kulturschalen (Linbro) wurden mit Geflügelpockenvirus des Stammes HP441 infiziert, wenn die Zellen zu 80-90 % konfluent waren. Zu-verschiedenen Zeiten nach der Infektion wurde DNA in die Zellen nach einem Transfektionsverfahren mit Calciumphosphat eingeführt. Das System wurde im Hinblick auf Multiplizität der Infektion, Zeitpunkt der DNA-Transfektion und Menge der DNA für die Transfektion optimiert, und zwar unter Verwendung des Plasmids pMM6, das den 11K-Promotor aus dem Kuhpockenvirus enthält, der mit dem β-Galactosidase-Gen verschmolzen ist, wobei festgestellt wurde, daß es β-Galactosidase-Aktivität in diesem transienten Assay-System in FPV-infizierten Zellen exprimiert. Obwohl Unterschiede zwischen einzelnen Versuchen auftraten, funktionierte die angewandte Technik konsistent, wenn sie intern mit pMM6 als positiver Kontrolle und einem Plasmid, das irrelevante Sequenzen enthielt, als negativer Kontrolle kontrolliert wurde.
Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen wurden mit 1 pfu an FPV-HP441 pro Zelle infiziert. Ausfällungen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen durch Zugabe der folgenden Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge hergestellt: pNM-Plasmid-DNA (0,2 ug-5 ug) plus 1 ug FPV-"Helfer" -DNA, 100 ul mit HEPES gepufferte Kochsalzlösung (pH-Wert 7,12) und schließlich 7 ul einer 2 in CaCl&sub2;-Lösung. Es wurde leicht gegen die Platten geklopft, um den Inhalt zu mischen. Anschließend beließ man die Platten 20-30 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich eine gerade sichtbare, feine Ausfällung entwickelt hatte. Platten mit 24 Vertiefungen von Zellen, die transfiziert werden sollten, wurden bei Raumtemperatur mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung vorgewaschen, und anschließend wurde die geeignete Ausfällung 4 oder 20 Stunden nach der Infektion der Zellen zugegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde der überschüssige Ausfällung entfernt, und 0,5 ml Medium der Bezeichnung 199 mit einem Gehalt an 5 % CS wurden zugegeben. Die transfizierten Zellen wurden erneut wie üblich für weitere 48 Stunden inkubiert.
Die β-Galactosidase-Aktivität wurde wie folgt bestimmt.
Das Medium der Gewebekultur wurde vorsichtig durch Absaugen entfernt, und die Zellen wurden in 50 ul 0,25 in TRIS-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 und 5 millimolar Dithiothreit (DTT) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden dreimal eingefroren und aufgetaut und anschließend auf Platten mit 96 Vertiefungen überführt, um den Gehalt an β-Galactosidase zu bestimmen. Zu jedem Lysat wurden 1 ul eines Puffers mit 60 millimolar Na&sub2;HPO&sub4;, 40 millimolar NaH&sub2;PO&sub4;, 10 millimolar KCl, 1 millimolar MgCl&sub2;, 50 millimolar 2-Mercaptoethanol und 100 ul 2 mg/ml ortho-Nitrophenylgalactose (ONPG) in 60 millimolar Na&sub2;HPO&sub4; und 40 millimolar NaH&sub2;PO&sub4; gegeben. Bei ONPG handelt es sich um ein kolorimetrisches Substrat für β- Galactosidase, dessen Farbe sich von farblos zu gelb ändert. Der Assay wurde bis zu zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, bis sich die Farbe entwickelte, und anschließend wurden 100 ul 2 m Na&sub2;CO&sub3;-Lösung zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Die Intensität der gelben Farbe wurde durch Messen der Absorption bei 405 nm in den einzelnen Vertiefungen ELISA-Platten- Lesegerät gemessen.

Ergebnisse der Promotor-Assays

Die Sequenzen aus dem vorderen Bereich der elf größten hauptsächlichen ORF von pMH23 und aus dem vorderen Bereich des FP4b-Gens (siehe vorstehend) sind in translationalen Fusionsvektoren (Vektoren, die das lacZ-Gen enthalten) kloniert worden, und ihre Aktivität als Promotoren wurde in einem transienten Assay-System gemessen. Die vorstehende Tabelle 2 enthält eine Liste dieser Konstrukte. Von den 14 getesteten FPV-Promotor-Konstrukten wurde bei fünf konsistent eine Promotoraktivität festgestellt. Bei diesen handelte es sich um die beiden FP4b-Konstrukte, den ORF8-Promotor (13,2K- Gen), den ORF5-Promotor (12,5K-Gen) und den ORFI0-Promotor (33,0K-Gen). Bei allen diesen handelt es sich um erfindungsgemäße Promotoren. Die restlichen Konstrukte wiesen geringere Aktivitäten auf. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse von drei Versuchen. Ein Stern bezeichnet Konstrukte, die einen erfindungsgemäßen Promotor enthalten. Tabelle 3 Messung der Promotorstärke in einem Assay auf β-Galactosidase unter Verwendung eines kolorimetrischen Substrats (*=erfindungsgemäß) Versuch A Optische Dichte bei 405 nm Menge an zugegebener DNA (20 Stunden nach der Infektion) Endvektorkonstrukt nicht durchgeführt Versuch B (DNA früher zugegeben als in A) Optische Dichte bei 405 nm Menge an zugegebener DNA (4 Stunden nach der Infektion) Endvektorkonstrukt Gesamtes Keine Versuch C (Wiederholung von B) Optische Dichte bei 405 nm Menge an zugegebener DNA (4 Stunden nach der Infektion) Endvektorkonstrukt Gesamtes Keine
Für Experiment A wurde die DNA 20 Stunden nach der Infektion und für die Experimente B und C, die im wesentlichen identisch waren, 4 Stunden nach der Infektion zugegeben. Es ist interessant festzustellen, daß einige der Promotoren anscheinend eine höhere Aktivität haben, wenn die Zugabe früh nach der Infektion erfolgt. Z.B. führt der ORF5-Promotor bei Zugabe 4 Stunden nach der Infektion zu einer höheren Aktivität als der ORF8-Promotor, während er bei späterer Zugabe eine geringere Aktivität aufweist. Es kann sein, daß es sich bei ORF5 um einen frühen Promotor handelt, der nicht gut funktioniert, wenn er vergleichsweise spät während der Infektion zugegeben wird. Andererseits scheint der ORF10- Promotor besser zu funktionieren, wenn er später während der Infektion zugegeben wird. Beide FP4b-Konstrukte ergeben konsistent hohe Aktivitäten.
Teile der Sequenzen der Konstrukte, die zum Testen des FP4b- Promotors, des ORF8-Promotors (13,2K), des ORF5-Promotors (12,5K) und des ORF10-Promotors (33K) verwendet wurden, sind nachstehend gezeigt. Jede Sequenz beginnt und endet mit DNA des beteiligten pNM-Vektors und zeigt, wie die dazwischenliegende Sequenz aus den Geflügelpockenvirus- Sequenzen plus M13-DNA aufgebaut ist. Zwei der angenommenen Promotorsequenzen sind in zwei separaten Konstrukten getestet worden, wobei jedes der Konstrukte eine unterschiedliche Zahl von für Aminosäuren codierenden ORF-Sequenzen im Fusionsprodukt aufwies. Es handelt sich um das Fp4b30/FP4b31- Paar und das pNMGB86/pNMSAU4-Paar. In beiden Fällen waren die Promotoraktivitäten zwischen den beiden Mitgliedern des Paares sehr ähnlich, was anzeigt, daß die Länge des Geflügelpockenvirus-Gens im Fusionsprodukt nicht kritisch ist. Teil der Sequenz von pNM4b3O pNM481-Sequenz MI3-Sequenz Start der Geflügelpocken Ende der FP-Sequenz Teil der Sequenz von pNM4b31 pNM48I-Sequenz MI3-Sequenz Start der Geflügelpocken Ende der FP-Sequenz Teil der Sequenz von pNMGC44 pNM482-Sequenz M13 Sequenz Start der Geflügelpocken-(KP)-Sequenz Teil der Sequenz von pNMGK4 pNM482-Sequenz MI3-Sequenz Start der Geflügelpocken-(FP)-Sequenz Teil der Sequenz von pNMGF7 pNM48I-Sequenz MI3-Sequenz Start der Geflügelpocken-(FP)-Sequenz (genaues linkes Ende unbekannt) Fortsetzung der FP-Sequenz

Insertion von Genen in das Geflügelpockenvirus

Fremde Gene werden in das Virus durch ein Verfahren der homologen Rekombination eingeführt. Dieses Verfahren ist in der Literatur ausführlich für das Kuhpockenvirus beschrieben worden, und ein analoges Verfahren kann für das Geflügelpockenvirus verwendet werden.

1. Infektion des Virus und Transfektion der DNA

Flaschen von 25 cm² mit CEF-Zellen bei etwa 80 % Konfluenz werden mit etwa 10&sup7; pfu (etwa 3 pfu/Zelle) von einem abgeschwächten Stamm des Geflügelpockenvirus in 1 ml serumfreiem Medium infiziert. Die Flaschen werden 2 Stunden unter gelegentlichem leichten Schütteln bei 37ºC inkubiert. Anschließend werden 5 ml Medium mit der Bezeichnung 199 (Gibco) mit 5 % Kälberserum zugegeben, und die Zellen werden weitere 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
30 Minuten vor dem Ende dieser 2 Stunden werden die DNA/Calciumphosphat-Ausfällungen hergestellt. 20 ug Plasmid-DNA, die ein "Konstrukt vom Typ 1" enthält und daher nichtessentielle Regionen des FPV einschließt, plus 2 ug Geflügelpockenvirus-"Helfer"-DNA werden in 1 ml HEPES- gepufferte Kochsalzlösung (HBS) vom pH-Wert 7,12 in einem Röhrchen ("bijou") gegeben (HBS enthält 0,818 % NaCl (Gew./Vol.), 0,594 % HEPES (Gew./Vol.), 9,02 % Na&sub2;HPO&sub4; wasserfrei (Gew./Vol.), eingestellt auf einen pH-Wert von 7,12 mit 1 in NaOH). 66 ul 2 m CaCl&sub2; werden langsam entlang der Seite des Röhrchens zugegeben. Man läßt das Gemisch 20-30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, wobei sich eine feine Ausfällung bildet.
Nach 2-stündiger Inkubation werden die Zellen zweimal bei Raumtemperatur mit HBS gewaschen, und der Niederschlag wird vorsichtig zu den Zellen gegeben. Man läßt dieses Gemisch 40 Minuten bei Raumtemperatur stehen, und anschließend werden 5 ml Medium der Bezeichnung 199 mit 5 % Kälberserum zugegeben, und die Zellen werden 3 bis 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Medium wird dann gegen frisches Medium ausgetauscht.

2. Nachweis von Rekombinanten

Nachdem man das Virus 3-5 Tage in den Zellen wachsen ließ (dies ist der Zeitpunkt, zu dem der vollständige zytopathische Effekt sichtbar wird), werden die Zellen und der Überstand geerntet und dreimal eingefroren und aufgetaut. Das Nachwuchsvirus wird dann auf CEF-Zellen mit etwa 500- 1000 Plaques pro 10 cm Petrischale gegeben, und darüber wird ein Medium mit einem Gehalt an 1 % Agarose mit niedriger Geliertemperatur gegeben. Die Plaques werden dann auf Nitrocellulose übertragen und mit DNA-Sonden des fremden Gens, das in das Geflügelpockenvirus inseriert ist, nach der Methode von L. Villareal et al., Science, Bd. 196, S. 183-185 (1977) untersucht. Plaques, die sich bei Zugabe der Sonde aufhellen, werden aus der Agarose-Deckschicht (die bei 4ºC gelagert worden ist) entnommen, dreimal eingefroren und aufgetaut und erneut plattiert. Die Plaques werden anschließend erneut mit Sonden aus fremder DNA untersucht, um zu bestätigen, daß das rekombinante Virus erfolgreich aus der Agarose-Deckschicht isoliert worden ist.

Infektion von Hühnern mit dem rekombinanten Virus

Zweiundzwanzig 5-Tage alte Hühner werden in einen Behälter (46 cm x 46 cm x 58 cm) gegeben. Eine Spritzpistole wird verwendet, um ein feines Aerosol aus 80 ml Wasser mit 1,5 x 10&sup8; pfu an dem Virus, der in Hühnerembryo-Fibroblastzellen gezüchtet wurde, herzustellen. Diese Impfung wird wiederholt, wenn die Hühner 26 Tage alt sind.

Claims

1. Geflügelpockenvirus-Promotor-DNA (FPV-Promotor-DNA) zur Promotion der Transkription eines in einen FPV-Vektor inserierten Fremdgens, wobei die DNA den Promotor eines beliebigen der folgenden FPV-DNA-Gene umfaßt und im wesentlichen aus Sequenzen unmittelbar am 5'-Ende des Gens besteht, die für dieses Gen nicht-codierend sind:

(1) das FP4b-Gen, bei dem es sich um das Gen in FPV handelt, das den höchsten Grad an Homologie mit dem 4b-Gen des Kuhpockenvirus aufweist, und das für ein Protein von etwa 657 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz:

oder einer geringfügigen Variation dieser Sequenz beginnt;

(2) das ORF8-Gen des BamHI-Fragments, das für ein Protein von etwa 116 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz:

der einer geringfügigen Variation dieser Sequenz beginnt;

(3) das ORF5-Gen des BamHI-Fragments, das fur ein Protein von etwa 105 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz:

oder einer geringfügigen Variation dieser Sequenz beginnt;

(4) das ORF10-Gen des BamHI-Fragments, das fur ein Protein von etwa 280 Aminosäuren codiert und mit der folgenden Sequenz:

oder einer geringfügigen Variation dieser Sequenz beginnt;

2. FPV-Promotor-DNA nach Anspruch 1, wobei die nichtcodierende Sequenz eine Länge von bis zu 150 Nucleotiden, die dem startcodon des Gens unmittelbar vorausgehen, aufweist.

3. FPV-Promotor-DNA nach Anspruch 2, wobei die nichtcodierende Sequenz eine Länge von bis zu 80 Nucleotiden, die dem startcodon des Gens unmittelbar vorausgehen, aufweist.

4. FPV-Promotor-DNA nach Anspruch 2 innerhalb einer beliebigen der folgenden Sequenzen von 150 Nucleotiden, die dem startcodon des Gens unmittelbar vorausgehen:

oder innerhalb einer geringfügigen Variation einer derartigen Sequenz.

5. Rekombinationsvektor, umfassend einen Klonierungsvektor, der als ein Insert eine Sequenz einer nicht-essentiellen Region (NER) von FPV enthält, wobei die NER von DNA unterbrochen wird, die (a) Promotor-DNA nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, gefolgt von (b) einem fremden, durch den Promotor transkribierbares Gen, umfaßt.

6. Rekombinationsvektor, umfassend einen Klonierungsvektor, der als Insert folgende Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge enthält:

(1) eine erste homolog rekombinierbare Sequenz des Geflügelpockenvirus-GenomS (FPV-Genoms),

(2) eine Sequenz innerhalb eines ersten Abschnitts einer nicht-essentiellen Region (NER) des FPV-Genoms,

(3) FPV-Promotor-DNA gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, oder 4,

(4) ein fremdes Gen, das in 3'-Richtung ("downstream") des Promotors transkribierbar ist (wobei die RNA- Polymerase des Geflügelpockenvirus bei Bindung an den Promotor das fremde Gen in mRNA transkribiert)

(5) eine Sequenz innerhalb eines zweiten Abschnitts der gleichen NER des FPV-Genoms, wobei die erste und zweite Sequenz in der gleichen relativen Orientierung im FPV- Genom wie der erste und der zweite Abschnitt der NER liegen, und

(6) eine zweite homolog rekombinierbare Sequenz des FPV- Genoms, wobei die Sequenzen (1) und (6) die NER des FPVGenoms flankieren und in der gleichen relativen Orientierung in dem Rekombinationsvektor vorliegen, wie sie innerhalb des FPV-Genoms vorliegen.

7. DNA-Kassette, die einen FPV-Promotor nach einem der sprüche 1, 2, 3 oder 4 umfaßt und transkribierbar mit einem fremden Gen verknüpft ist.

8. Rekombinanter Klonierungsvektor, der die DNA-Kassette gemäß Anspruch 7 enthält.

9. Rekombinantes Geflügelpockenvirus (FPV), bei dem es sich um das Produkt der homologen Rekombination eines Ausgangs-FPV mit der Insert-DNA eines Rekombinationsvektors nach Anspruch 5 oder 6 handelt.

10. In-vitro-Kultur von tierischen Zellen, die mit einem Virus nach Anspruch 9 infiziert sind.

11. Kultur nach Anspruch 10, wobei es sich bei den tierischen Zellen um Hühnerzellen handelt.

12. Rekombinates FPV nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Impfung eines darauf ansprechenden Tieres.

13. Rekombinantes FPV nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Tier um ein Huhn handelt.