DE3886072T2 - Bestimmungsverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid. - Google Patents

Bestimmungsverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid.

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DE3886072T2 DE88103705T DE3886072T DE3886072T2 DE 3886072 T2 DE3886072 T2 DE 3886072T2 DE 88103705 T DE88103705 T DE 88103705T DE 3886072 T DE3886072 T DE 3886072T DE 3886072 T2 DE3886072 T2 DE 3886072T2
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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Analysenverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, insbesondere auf ein Analysenverfahren, dessen Empfindlichkeit stark verbessert wurde, so daß das Verfahren fähig ist, Spurenmengen von Wasserstoffperoxid nachzuweisen, ohne daß es notwendig ist, gefährliche Materialien oder eine teuere Apparatur zu verwenden.
  • In letzter Zeit hat der Nachweis von Wasserstoffperoxid mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Beispielsweise wird Wasserstoffperoxid in manchen Ländern als Bleichmittel für Lebensmittel verwendet. Allerdings sollte das nach dem Bleichen in den Nachrungsmitteln zurückbleibende Wasserstoffperoxid im wesentlichen Null sein, um einer Gesundheitsgefährdung vorzubeugen. Eine weitere Anwendung der Wasserstoffperoxid-Analyse kann auf dem klinischen Gebiet gefunden werden. Beispielsweise besteht noch immer ein Bedarf an einem einfachen, schnellen und empfindlichen Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Levels einer bestimmten Substanz, einschließlich Glucose und Cholesterin usw., in klinischen Proben wie z.B. Patientenplasma. Wenn ein hochempfindliches Analysenverfahren für Wasserstoffperoxid verfügbar sein wird, wird es möglich sein, eine solche Substanz in einer Probe vorteilhaft quantitativ zu bestimmen, indem eine Spurenmenge Wasserstoffperoxid nachgewiesen wird, das durch ein Enzym wie Oxidase aus dieser Substanz produziert wird.
  • Ein bekanntes Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, das in einer Probe vorliegt oder durch ein Enzym produziert wird, umfaßt die Reaktion von 4-Aminoantipyrin und Phenol mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart einer Peroxidase als Katalysator, um die Bildung der rotgefärbten Chinone zu erleichtern, deren Extinktion dann mit einem Spektralphotometer gemessen wird. Eine Unzulänglichkeit dieses Verfahrens besteht darin, daß keine ausreichende Empfindlichkeit erreicht werden kann, da die Messung mit einem Spektralphotometer durchgeführt wird, welches die durch die Reaktion zwischen dem oben genannten Reagens und Wasserstoffperoxid hergestellte Farbe nachweist. Ferner beinhaltet dieses Verfahren einen Inkubationsschritt, welcher notwendig ist, um das Reaktionsgemisch zur Entwicklung der roten Farbe der Chinone usw. auf einer konstanten Temperatur zu halten. Somit ist für dieses Analysenverfahren ein beträchtlicher Zeitaufwand nötig.
  • Die EP-A-0 200 565 offenbart eine 4-Aminoantipyrin/Phenol- Analyse, bei der natürliche Meerrettich-Peroxidase durch ein Peroxidase-Enzym ersetzt ist, das von Fungi der Gattung Corpinus stammt.
  • Die EP-A-0 179 486 und die EP-A-0 171 074 beschreiben Verfahren zur Herstellung von Peroxidasen unter Verwendung von Mikroorganismen. Von schnell wachsenden Mikroorganismen wie z.B. Fungi-Stämmen der Gattung Corpinus bzw. Arthromyces wurden Peroxidasen erhalten, die ähnliche Merkmale wie Meerrettisch-Peroxidase aufweisen. Diese Enzyme sind geeignet, als diagnostisches oder klinisches Reagens in einer normalen farbstoffbildenden lndikatoranalyse eingesetzt zu werden.
  • Aus der GB-A-2 167 421 sind verschiedene Peroxidasen bekannt, die von Mikroorganismen, z.B. Coprinus, abgeleitet sind und die als klinisches diagnostisches Reagens zur Verwendung in der Farbentwicklung von Wasserstoff-liefernden Chromogenen einsetzt werden können.
  • In der analytischen Chemie, die in Kliniken durchgeführt wird, ist in jüngerer Zeit die Radioimmunanalyse aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit als ausgezeichnetes Mittel zum Nachweis von Spurensubstanzen eingeführt worden. Da allerdings die Radioimmunanalyse große Sicherheitsvorkehrungen erfordert und eine Gesundheitsgefährdung darstellen kann, kann diese Analyse die spektralphotometrische Analyse nicht ersetzen.
  • Ein anderes Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid verwendet die Chemilumineszenz-Reaktion, um die Wasserstoffperoxid-Menge schnell zu bestimmen. Diese Chemilumineszenz-Analyse ist eine bekannte Technik und ist zum Nachweis von Wasserstoffperoxid wie auch zur Bestimmung der Menge von Fettperoxiden verwendet worden und wird sogar in Immunoanalysen eingesetzt. Dieses Verfahren wird zur Analyse von Wasserstoffperoxid wie folgt durchgeführt:
  • Ein Lumineszenz-Reagens wird einer Probe zugesetzt, welche Wasserstoffperoxid enthält, das in der Probe vorliegt oder dort in situ hergestellt wird; die Intensität der so hergestellten Lumineszenz wird dann im Verhältnis zur Wasserstoffperoxidmenge gemessen. Der Ausdruck "Lumineszenz- Reagens", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Einzelsubstanz oder eine Kombination von Substanzen, welche mit Wasserstoffperoxid, insbesondere in Gegenwart einer Peroxidase unter Bildung von Chemilumineszenz reagieren kann. Derartige Lumineszenz-Reagenzien umfassen Luminol, Isoluminol usw. Wenn das Lumineszenz-Reagens aus Verbindungen vom Luminol-Typ ausgewählt ist, ist der Katalysator für die Reaktion zwischen dem Reagens und Wasserstoffperoxid aus der aus Kaliumferrocyanid, K&sub2;S&sub2;O&sub4;, NaClO, Fe(II)-Salzen, Mikroperoxidase, Peroxidase und dergleichen bestehenden Gruppen ausgewählt. Peroxidase wird am häufigsten verwendet, da es die nachteiligen Wirkungen der Hintergrund-Lumineszenz eliminiert. Das Reaktionsschema ist wie folgt:
  • Wenn Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophtalazin-1,4-dion) und Peroxidase mit Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, wird Aminophthalsäure im angeregten Zustand produziert. Der hier betrachtete Mechanismus der Lumineszenz-Herstellung ist jener, daß Aminophthalsäure beim Zurückkehren in den Grundzustand Lichtenergie bei 425 nm aussendet. Die Lumineszenz-Analyse hat im Vergleich zu den herkömmlichen spektralphotometrischen Analysen die folgenden Vorteile:
  • (1) relativ hohe Empfindlichkeit, welche 10² bis 10³ mal so hoch wie jene in der Spektralphotometrie ist;
  • (2) einfache Apparatur, welche geringe Kosten verursacht (der einzig wesentliche Teil einer Apparatur für die Lumineszenz-Analyse ist ein Detektor zum Sammeln der Photone und daher besteht kein Bedarf an einer Lichtquelle oder einem Spektrographen, welche beide in einem Gerät zur Spektralphotometrie unbedingt notwendig sind); und
  • (3) weiter dynamischer Bereich bei der Messung der Lumineszenz, welcher eine Linearität der Messung liefert, die sich über die Lumineszenz-Intensität in der Größenordnung von 10&sup5;-10&sup6; erstreckt.
  • Die EP-A-0 210 449 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Aminen in biologischen Flüssigkeits-Proben, wobei die Lumineszenz-Reaktion einer Substanz in Gegenwart von oxidiertem Wasserstoffperoxid als Stand der Technik zur Herstellung eines nachweisbaren Output-Signals verwendet wird. Das Analysensystem ist speziell für den Nachweis spezifischer Diaminpolyamin-Verbindungen entworfen, wohingegen die Chemilumineszenz-Reaktion hinsichtlich des verwendeten Enzyms nicht speziell optimiert worden ist.
  • Die EP-A-0 184 919 versucht, die Stabilisierung des Enzyms in sogenannten verstärkten Chemilumineszenz-Reaktionen zu verbessern. Die sehr kurze Lebensdauer der Lichtemission in einer herkömmlichen Chemilumineszenz-Analyse wurde durch Zusatz von bestimmten Stickstoff-haltigen Materialien allein oder mit Verstärkern wie z.B. Jodbenzol- oder Benzothiazol-Derivaten überwunden. Diese Verbindungen verlangsamen die Emissionsrate des Lichts und dehnen die Enzymaktivität in einer Chemilumineszenz-Reaktion über einen längeren Zeitraum aus.
  • Einer der bekannten Nachteile der herkömmlichen Chemilumineszenz-Analyse ist ihre im allgemeinen geringe Leistungsfähigkeit, welche im Vergleich zur Biolumineszenz- Analyse nur eine geringe Reaktionsgeschwindigkeit hat. Deshalb muß eine Apparatur mit einem äußerst empfindlichen Detektor zur Reaktion auf das schwache Licht ausgestattet sein, so daß die Apparatur trotz ihrer mechanischen Einfachheit extrem teuer ist.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Analysenverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid bereitzustellen, wobei die Lumineszenz-Herstellung während der Analyse stark verbessert wird, was zu einer hohen Analysenempfindlichkeit führt, die vorzugsweise über 10 mal, am bevorzugtesten über 100 mal höher ist als die der herkömmlichen Analyse.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Analysenverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid bereitzustellen, bei dem die Notwendigkeit für eine teure Apparatur zum Nachweis der Chemilumineszenz eliminiert ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein hochempfindliches Analysenverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid in einer Probe bereitzustellen, bei dem die Probe mit einem Lumineszenz-Reagens in Gegenwart einer Peroxidase, die durch einen Mikroorganismus prodziert wird, der zur Spezies Fungi imperfecti oder Fungi Basidiomycetes gehört, der fähig ist, eine Peroxidase zu produzieren und der aus der aus Arthromyces ramosus und Coprinus cinereus bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und bei dem die resultierende Chemilumineszenz als Maß für den Wasserstoffperoxid-Level in der Probe bestimmt wird.
  • Fig. 1 stellt eine Eichkurve dar, die die überlegene Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Analyenverfahrens, das Mikroorganismen-Peroxidase verwendet, im Vergleich zur herkömmlichen Chemilumineszenz-Analyse, bei der Meerrettich- Peroxidase verwendet wird, zeigt.
  • Fig. 2 stellt die Relation von Lumineszenz-Intensität zu Peroxidase-Konzentration in dem erfindungsgemäßen Analysenverfahren bzw. dem herkömmlichen Analysenverfahren dar. Die durchgezogenen Linien stellen die Gesamtlumineszenz gegenüber der Peroxidase-Konzentration dar, während die gebrochenen Linien die Lumineszenz pro Einheit Peroxidase gegenüber der Peroxidase-Konzentration darstellen.
  • Fig. 3 vergleicht die Ergebnisse der Lumineszenz-Intensität zwischen ARP (Arthromyces ramosus = Peroxidase) und HRP (horseradish peroxidase = Meerrettichperoxidase) bei der Messung von Wasserstoffperoxid aus der Glucoselösung.
  • Fig. 4 vergleicht die Ergebnisse der Lumineszenz-Intensität zwischen ARP und HRP bei der Messung von Wasserstoffperoxid aus der Cholesterinlösung.
  • Fig. 5 stellt zwei Eichkurven von Glucosekonzentration gegen Lumineszenz-Intensität dar, die mit einem Lumineszenz- Photometer gemessen wurde, welches Wasserstoffperoxid, das aus Glucoselösungen verschiedener Konzentrationen hergestellt wurde, mißt. Die obere Linie wurde mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von ARP erhalten, und die untere Linie wurde nach dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von HRP erhalten.
  • Fig. 6 stellt zwei Eichkurven dar, bei denen die Cholesterin- Konzentration gegen die Lumineszenz-Intensität aufgetragen ist. Die Lumineszenz-Intensität wurde durch das Lumineszenz-Photometer gemessen, welches Wasserstoffperoxid, das aus Cholesterinlösungen verschiedener Konzentrationen hergestellt wurde, nachweist. Die obere Linie wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von ARP erhalten, und die untere Linie wurde nach dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von HRP erhalten.
  • Es wurde nun herausgefunden, daß, wenn eine besondere Peroxidase, welche durch bestimmte Mikroorganismen produziert wird, in einer Chemilumineszenz-Analyse für Wasserstoffperoxid eingesetzt wird, eine Analyse von extrem hoher Empfindlichkeit, welche oft 100 oder mehr mal höher ist als die der herkömmlichen Analyse, erhalten werden kann.
  • Die Peroxidase, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann aus einer Kultur Peroxidaseproduzierender Mikroorganismen erhalten werden. Beispiele für spezielle Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt als Peroxidase-Quellen verwendet werden, sind jene, die zu Fungi imperfecti oder Fungi Basidiomycetes gehören. Ein besonders bevorzugter Fungi imperfecti-Mikroorganismus ist Arthromvces ramosus, welcher nach dem Budapester Vertrag an dem Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt wurde und die Akzessions- Nummer FERM BP-838 hat. Arthomyces ramosus ist in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 043987/86 und in der EP-A- 0 171 074 offenbart. Bevorzugte Fungi Basidiomycetes- Mikroorganismen sind die der Gattung Coprinus, und besonders bevorzugt sind Coprinus cinereus IFO 8371, Corpinus cinereus IFO 30114, Coprinus cinereus IFO 30627, Coprinus cinereus IFO 30628 und Coprinus cinereus IFO 31333, welche alle am Institute for Fermentation, Osaka, Japan hinterlegt sind und in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 104784/86 offenbart sind.
  • Es sollte selbstverständlich sein, daß Fachleute auf diesem Gebiet keine besonderen Schwierigkeiten haben, Peroxidasen aus einer Kultur der genannten Mikroorganismen zu erhalten und zu reinigen. Das Enzym kann beispielsweise durch eine Kombination verschiedener Ionenaustauscher-Chromatographien gereinigt werden. Vorzugsweise wird das Enzym so weit gereinigt, daß der RZ-Wert 1,0, vorzugsweise 2,0, übersteigt und daß die spezifische Aktivität, wie sie nach dem 4-Aminoantipyrinphenol-Verfahren gemessen wird, 50 E/mg Festsubstanz, insbesondere 100 E/mg Festsubstanz übersteigt.
  • Es wird davon ausgegangen, daß die Mikroorganismen, die zur Produktion der im wesentlichen gleichen Peroxidase, wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, nicht auf die oben angeführten begrenzt sind. Daher wird irgendeine Peroxidase, welche durch einen Mikroorganismus produziert wird, im Voraus von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange die genannte Peroxidase zur Verbesserung der Analysenempfindlichkeit in einer Chemilumineszenz-Analyse für Wasserstoffperoxid wirksam ist. Solche Peroxidasen werden im folgenden mit dem allgemeinen Begriff "Mikroorganismen- Peroxidase" bezeichnet.
  • Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Analyse werden die besonderen Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit von dem verwendeten Lumineszenz-Reagens variieren, wenn aber Luminol als Reagens verwendet wird, sind die folgenden Bedingungen bevorzugt. Ein Aliquot einer Probe, welche Wasserstoffperoxid enthält, wird mit einem geeigneten Puffer, der leicht alkalisch ist und vorzugsweise einen pH von etwa 9 hat, gemischt. Es wird eine Luminollösung zugesetzt, so daß eine Endkonzentration von 0,01 - 1 mM erreicht wird. Eine Mikroorganismen-Peroxidase kann entweder in die Luminollösung gemischt werden und der Probe zugesetzt werden oder sie kann separat zugesetzt werden. Die Peroxidase wird vorzugsweise mit 2 x 10&supmin;&sup5; bis 2 x 10&supmin;² E/ml verwendet, um genaue Analysenergebnisse zu erhalten. Das Gemisch wird dann bei 10 - 50ºC 5 - 60 Min. lang reagieren gelassen. Die Fluoreszenz- Intensität wird bei etwa 425 nm gemessen. Der Wasserstoffperoxid-Spiegel kann durch Auswerten des Wertes für die Fluoreszenz-Intensität mit einer Eichkurve, welche unter den gleichen Bedingungen aus einer Reihe von Wasserstoffperoxid-Lösungen mit bekannten Konzentrationen erstellt wurde, bestimmt werden.
  • Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist unerwartet hoch. Wasserstoffperoxid kann in Mengen, die 10 p Mol/ml klein sind, nachgewiesen werden. Es wird erwartet, daß diese Empfindlichkeit durch Auswahl geeigneter Bedingungen gesteigert werden kann. Das Verfahren hat auch einen vorteilhaft weiten dynamischen Bereich, der sich in der Größenordnung von über 10³ erstreckt.
  • Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist es leicht zu verstehen, daß ein wichtiger Aspekt des vorliegenden Verfahrens die Tatsache ist, daß in einer Chemilumineszenz-Analyse zum Nachweis von Wasserstoffperoxid eine Mikroorganismen- Peroxidase anstelle einer Meerrettich-Peroxidase verwendet wird. Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren mit verschiedenen Veränderungen oder Modifikationen durchgeführt werden, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen. Beispielsweise kann die Chemilumineszenz-Analyse durch das unterbrochene Strömungs-Verfahren durchgeführt werden. Alle derartigen Modifikationen oder Veränderungen sollen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein. Es sollte auch selbstverständlich sein, daß das nachzuweisende Wasserstoffperoxid durch Wirkung eines Oxidase- Enzyms in situ in einer Probe aus einer Substanz hergestellt werden kann, wobei das Enzym vorzugsweise spezifisch für diese Substanz ist, wodurch die Menge dieser Substanz indirekt bestimmt wird. Beispiele für solche Substanzen, die fähig sind, Wasserstoffperoxid mit einer Oxidase zu produzieren, sind Glucose, Cholesterin, Harnsäure usw.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf das folgende Experiment und die nichtbeschränkenden Beispiele detaillierter erläutert.
    • EXPERIMENT
  • Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die Wirksamkeit einer Mikroorganismen-Peroxidase bei der Verbesserung der Empfindlichkeit einer Chemilumineszenz-Analyse zum Nachweis von Wasserstoffperoxid zu bestätigen und gleichzeitig die bevorzugte Menge der Peroxidase, die in dem erfindungsgemäßen Analysenverfahren verwendet wird, zu bestimmen. Die Konzentration an Wasserstoffperoxid wurde konstant gehalten und die Enzymmenge wurde geändert. Es wurden 700 ul einer 1 mM Luminollösung in einem 50 mM-Pyrophosphat-Puffer, der ARP (2 ug/ml - 0,01 ug/ml) oder HRP (2,2 ug/ml - 0,04 ug/ml) enthielt, hergestellt. Zu dieser Lösung wurden 100 ul Wasserstoffperoxid-Lösung (10 uM) in einem Pyrophosphat-Puffer (50 mM, pH 9,0) gegeben. Dann wurde die Chemilumineszenz- Intensität gemessen. Die Gesamtmengen der produzierten Chemilumineszenz wie auch die Menge pro 1 ug Peroxidase wurden in Fig. 2 aufgetragen. Unter Bezugnahme auf die durchgezogene Linie für ARP in Fig. 2 wid festgestellt, daß ARP eine größere Chemilumineszenz bei höheren Konzentrationen produziert. Allerdings war die Reaktion bei höherem ARP-Spiegel für ein Lumineszenz-Photometer zu schnell, um die gesamte emittierte Chemilumineszenz zu sammeln, so daß die Chemilumineszenz- Menge, die pro Einheit ARP nachgewiesen wurde, verringert war, selbst wenn eine größere Gesamtmenge an Chemilumineszenz beobachtet wurde. Andererseits wurde eine konstante Chemilumineszenz-Emission pro Einheit ARP im niedrigeren ARP- Bereich beobachtet, obgleich die gesamte Chemilumineszenz- Emission erniedrigt war. Daher konnte eine ausgezeichnete mengenabhängige Korrelation zwischen der Gesamtmenge der Chemilumineszenz und der ARP-Menge festgestellt werden, was naheliegt, daß diese Analyse zum Nachweis eines sehr niedrigen Wasserstoffperoxid-Spiegels besonders geeignet ist. Die Ergebnisse in Fig. 2 zeigen darüber hinaus, daß die Empfindlichkeit bei dieser Chemilumineszenz-Analyse, die eine Mikroorganismen-Peroxidase verwendet, etwa 100 mal so hoch war wie jene, die durch die herkömmliche Analyse, wo HRP verwendet wurde, erreicht wurde.
    • BEISPIEL 1
  • Es wurde eine Eichkurve zum Nachweis von Wasserstoffperoxid gemäß dem Analysenverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt, und die Empfindlichkeit der Analyse wurde mit jener der herkömmlichen Chemilumineszenz-Analyse, in welcher Meerrettich-Peroxidase (HRP) verwendet wird, verglichen.
  • Zu 700 ul Wasserstoffperoxid-Lösung (100 uM - 0,01 uM) in 50 mM-Pyrophosphat-Puffer (pH 9,0) wurde Luminollösung (1 mM), die ARP (2 ug/ml), CCP (3 ug/ml) oder HRP (2,2 ug/ml) in 100 ul 50 mM-Pyrophosphat-Puffer (pH 9,0) enthielt, gegeben; die Intensität der emittierten Lumineszenz wurde mit einem Lumineszenz-Photometer (Lumac BIOCOUNTER M2010, 3M, Pharm. Co.) gemessen. Die Konzentration des entsprechenden Enzyms wurde auf der Basis des Gehalts, wie er durch die Extinktion bei 403 nm gemessen wurde, bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 1 angegeben. Das erfindungsgemäße Verfahren, das eine Mikroorganismen-Peroxidase (d.h. ARP oder CCP) verwendet, zeigte eine gute mengenabhängige Korrelation zwischen der Konzentration von Wasserstoffperoxid, die zu analysieren ist, und der Lumineszenz-Intensität, wohingegen das herkömmliche Verfahren, welche Meerrettich-Peroxidase verwendet, keine ausreichend klare mengenabhängige Beziehung zeigte. Zusätzlich war die durch die beiden Mikroorganismen-Peroxidasen produzierte Lumineszenz 30 mal so stark wie jene, die durch Meerrettich-Peroxidase produziert wurde. Folglich liefert das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis. von Wasserstoffperoxid, der in einer Probe vorliegt oder künstlich erzeugt wird, welches eine Peroxidase verwendet, die von Mikroorganismen stammt, eine höhere Empfindlichkeit und Genauigkeit als die herkömmliche Chemilumineszenz-Analyse.
    • BEISPIEL 2
  • Die Lumineszenz-Intensitäten, die von ARP und HRP produziert werden, wurden in dem unterbrochenen Fließverfahren verglichen. Das in diesem Beispiel gemessene Wasserstoffperoxid wurde in der Probe durch Wirkung von Glucose-Oxidase (100 E/mg, im Handel erhältlich von Toyobo Co., Japan) oder Cholesterin-Oxidase (5 E/mg, handelsüblich erhältlich von Amano Pharma. Co., Japan) aus Glucose oder Cholesterin hergestellt. Genauer ausgedrückt, es wurden 200 ul Glucose-Oxidase-Lösung (2,6 mg/ml) dem Gemisch, das 60 ul Glucoselösung (10 mM) und 1 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) enthielt, zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 5 Min. bei 37ºC reagieren gelassen und dann wurde 1 ml Aliquot der Mischung zu 9 ml Pyrophosphat-Puffer gegeben (50 mM, pH 9,0), um die Reaktion zu beenden. Andererseits wurden 400 ul Cholesterin-Oxidase-Lösung (2,3 mg/ml) einem Gemisch, das 240 4l Cholesterin-Lösung (100 ug/ml) und 2 ml Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,0), der 0,05% Triton X-100 enthielt, umfaßte, zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde 10 Min. bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Ein 2 ml Aliquot der umgesetzten Lösung wurde mit 8 ml Pyrophosphatpuffer-Lösung (50 mM, pH 9,0) gemischt, um die Reaktion zu beenden.
  • Die Probe, welche Wasserstoffperoxid enthielt, das durch Enzymwirkung, wie oben beschrieben, hergestellt worden war, wurde mit Luminol (1 mM) in einer Pyrophosphatpuffer (50 mM, pH 9,0), der ARP zu 50 ug/ml oder HRP zu 55 ug/ml enthielt, gemischt, dann wurde die Lumineszenz-Intensität mit einem Unterbrechungs-Strömungs-Photometer (Yunion Giken Co., Japan: Type RA-401) gemessen. Fig. 3 vergleicht die Ergebnisse der Lumineszenz-Intensität von ARP und HRP bei der Messung von Wasserstoffperoxid aus der Glucoselösung und Fig. 4 vergleicht jene aus der Cholesterinlösung. Wie klar ersichtlich ist, war die durch ARP erreichte Lumineszenz-Intensität stärker als jene, die durch HRP erreicht wurde; d.h. 49 mal stärker im Fall von Cholesterin und mehr als 365 mal stärker im Fall von Glucose.
  • Die obigen Ergebnisse zeigen die Überlegenheit der Mikroorganismen-Peroxidase in einer Chemilumineszenz-Analyse für Wasserstoffperoxid sehr deutlich.
    • BEISPIEL 3
  • Es wurden Glucoselösungen mit verschiedenen Konzentrationen hergestellt und 60 ul jeder dieser Lösungen wurde mit 1 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) gemischt. Zu dieser Lösung wurden 200 ul Glucose-Oxidase-Lösung (2,6 mg/ml) gegeben; das resultierende Gemisch wurde 5 Min. lang bei 37ºC reagieren gelassen Ein 1 ml Aliquot der umgesetzten Lösung wurde zu 9 ml eines Pyrophosphatpuffers (50 mM, pH 9,0) gegeben, um die Reaktion zu beenden. Ein 700 ul Aliquot wurde aus der umgesetzten Lösung pipettiert und mit 100 ul Luminollösung (1 mM) in Pyrophosphat-Puffer (50 mM, pH 9,0), die entweder ARP (2 ug/ml) oder HRP (2,2 ug/ml) enthielt. Die so hergestellte Lumineszenz-Intensität wurde mit einem Lumineszenz-Photometer gemessen und die Ergebnisse wurden als zwei Eichkurven dargestellt, die in Fig. 5 gezeigt sind. Die Ergebnisse zeigen, daß die durch ARP produzierte Lumineszenz 28 mal so stark war wie jene, die durch HRP erhalten wurde, was die große Eignung von ARP für die hochempfindliche Chemilumineszenz-Analyse von Wasserstoffperoxid nahelegt.
    • BEISPIEL 4
  • Es wurden Cholesterinlösungen mit Verschiedenen Konzentrationen hergestellt, und 120 ul jeder dieser Lösungen wurde mit 1 ml Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,0), der 0,05% Triton X-100 enthielt, gemischt. Dieser Lösung wurden 200 ul Cholesterin-Oxidase-Lösung (0,2 mg/ml) zugesetzt; das resultierende Gemisch wurde bei 37ºC 15 Min. lang reagieren gelassen Ein 1 ml Aliquot der umgesetzten Lösung wurde zu 4 ml Pyrophosphat-Puffer (50 mM, pH 9,0) gegeben und die Reaktion wurde beendet. Ein 700 ul Aliquot wurde aus der umgesetzten Lösung pipettiert und mit 100 ul Luminollösung (1 mM) in einem Pyrophosphat-Puffer (50 mM, PH 9,0), die entweder ARP (2 ug/ml) oder HRP (2,2 4g/ml) enthielt, gemischt Die so hergestellte Lumineszenz-Intensität wurde mit einem Lumineszenz-Photometer gemessen und die Ergebnisse wurden als zwei Eichkurven dargestellt, die in Fig. 6 gezeigt sind. Die Ergebnisse zeigen, daß die durch ARP produzierte Lumineszenz 134 mal so stark war wie jene, die durch HRP erhalten wurde, was die große Eignung von ARP für die hochempfindliche Chemilumineszenz-Analyse von Wasserstoffperoxid nahelegt.
  • Die vorstehenden Beispiele beweisen die Tatsache, daß die durch Mikroorganismen-Peroxidase produzierte Lumineszenz über 100 mal so stark ist wie jene, die durch Meerrettich- Peroxidase produziert wird. Dementsprechend liefert das erfindungsgemäße Verfahren eine erfolgreiche Chemilumineszenz- Analyse, ohne daß ein besonders empfindliches Lumineszenz- Photometer benötigt wird, wie es bei der herkömmlichen Chemilumineszenz-Analyse von Wasserstoffperoxid notwendig ist.
  • Das erfindungsgemäße Analysenverfahren kann auch auf das Enzymimmunoassay angewendet werden. Bei Betrachtung der Sandwich-Analyse als einem typischen Enzymimmunoassay wird beispielsweise eine zu bestimmende Substanz (z.B. Insulin) in einer Probe mit einem ersten Anti-Insulin-Antikörper umgesetzt, welcher an der Innenwandoberfläche eines Behälters immobilisiert worden ist. Der Behälter wird dann mit einem geeigneten Medium wie z.B. PBS gewaschen und ein zweiter Anti- Insulin-Antikörper, welcher mit einer Peroxidase (POD) oxidiert worden ist, wird zugesetzt. Der Behälter wird erneut gewaschen und eine bekannte Menge an H&sub2;O&sub2; wird zugesetzt und anschließend das Lumineszenz-Reagens, wodurch die Emission von Lumineszenz auftritt. Die Intensität der Lumineszenz wird zu der Menge der POD sein, die an der Behälteroberfläche befestigt ist. Gemäß Fig. 2 hat die Mikroorganismen-Peroxidase eine höhere Empfindlichkeit als Meerrettich-Peroxidase. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Analysenverfahren, wenn es auf den Enzymimmunoassay angewendet wird, die übermäßige Verwendung des wertvollen Enzyms vermeidet.

Claims (8)

1. Analysenverfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid in einer Probe, bei dem die Probe in Gegenwart einer Peroxidase, die durch einen Mikroorganismus produziert wird, der zur Spezies Fungi imperfecti oder Fungi Basidiomycetes gehört, der fähig ist, Peroxidase zu produzieren und der aus der aus Arthromyces ramosus und Coprinus cinereus bestehenden Gruppe ausgewählt ist, mit einem Lumineszenz-Reagens in Kontakt gebracht wird und die resultierende Chemilumineszenz als Maß für den Wasserstoffperoxidlevel in der Probe bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Arthromyces ramosus die Akzessions-Nummer FERM BP-838 hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Mikroorganismus zu Coprinus cinereus gehört.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Mikroorganismus Coprinus cinereus JFO 8371, Corpinus cinereus JFO 30114, Coprinus cinereus JFO 30627, Corpinus cinereus JFO 30628 oder Coprinus cinereus JFO 31333 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Lumineszenz- Reagens Luminol ist, und die Fluoreszenz-Intensität mit einem Chemilumineszenz-Photometer bei der Wellenlänge 425 nm bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Analysenverfahren fähig ist, Wasserstoffperoxid bei einem Mindestlevel von 10 p Mol/ml nachzuweisen.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das zu bestimmende Wasserstoffperoxid durch Wirkung eines Oxidase-Enzyms auf eine in der Probe enthaltene Substanz in situ in der Probe hergestellt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Substanz, welche der Wirkung des Enzyms unterworfen wird, aus Glucose und Cholesterin ausgewählt ist.
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