JPS61254189A - パ−オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、微生物によるパーオキシダーゼの製造法に関
するものである。

［従来の技術］ パーオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で種々の化合
物（色原体も含めて）を酸化する酵素である。　この酵
素は、各種の臨床検査試薬として、また石油化学の触媒
としても利用されている。　さらに食品製造における加
熱処理程度の測定にも応用されている。　古く、パーオ
キシダーゼは、ワサビ大根、甘苦、ソラマメの葉、ワサ
ビ、牛乳、白血球に見出だされ、現在ではパーオキシダ
ーゼの工業的製造には、ワサビ大根が用いられている。

　　しかし、これらの植物を給源とするパーオキシダー
ゼの製造では、その量は、その年の収穫量によって異な
り、また動物起源では、それの量的人手は難しい。

そこでこの酵素を微生物を用いて、製造することを試み
た報告かある。　古くは、ストレプトコッカスファエ力
リス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉ’ａｅｃａｌｉ
ｓ）［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｌ＋ｅｍ、　Ｖｏｌ、２２
５＋５５７（’５７）］最近ではアルタナリア（Ａｌｔ
ｅｒｎａｌｉａ）属、コクリオボラス（Ｃ。

ｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、ペルキュラリア（Ｐｅｌｌ
ｉｃｕｌａｒｉａ）属、及びカーブラリア（Ｃ（Ｈｌｒ
ｖｕｌａｒｉａ）属［特公昭５８−５０３５号公報］、
オイディオデンドロン（Ｏ１ｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属
「特開昭５９−］、７７９０７５号公報がある。

［発明か解決しようとする問題点〕 前記の先願特許にも記載されているように、臨床検査薬
として使用するためには、色原体に対して広い特異性を
有することが好ましい。　そのうち、色原体として最も
汎用されている４−アミノアンチピリン−フェノール系
によって呈色するパーオキシダーゼが必要である。　　
したがってストレプトコッカス起源のパーオキシダーゼ
は、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−パーオキシダーゼであるので検査
薬には不適当である。

また、パーオキシダーゼ活性の検出が容易でかつ鋭敏で
あ加熱殺菌処理前後のパーオキシダーゼ活性を測ってそ
の殺菌程度の測定に利用されでいる。　この場合は、本
来牛乳が有しているパーオキシダーゼであるが、当然こ
の原理は他の加熱食品にも利用でトる。　加熱前の食品
に予めパーオキシダーゼを添加してお外、加熱後の活性
を測定するのである。

しめ化、添加するパーオキシダーゼの食品的安全性が大
切である。　ところが前記の微生物起源のパーオキシダ
ーゼはすべて食用としては利用されでいないため、その
安全性は不明である。　以上の諸問題点を解決するため
に本発明を行なった。

［問題点を解決するための手段１ 本発明者らは、生産性、特異性および安全性を一挙に満
足させるべくいろいろな微生物についてスクリーニング
した結果、ある属の食用茸にＭ量のパーオキシダーゼ活
性を見出だした。　　それはコプリヌス属の外のこでそ
の属の中には、古米から食用とされているものか多く、
安全性では問題が（前記特許に記載の微生物に比例しで
）少ない。　すなわち、本発明は、コプリヌス（Ｃｏｐ
ｒｉｎｕｓ）属に属しパーオキシダーゼ生産能を有する
微生物を栄養培地に培養し、培養物中にパーオキシダー
ゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
パーオキシダーゼの製造法である。

第１表にコプリヌス属に属する微生物のパーオキシダー
ゼ活性を示す。　活性測定は、０．００２５Ｍ−４−ア
ミ７アンチピリンー０．１７Ｍフェノール混合液１．４
ｍｌに０．００］、７Ｍ過酸化水素水１、．５Ｊを混ぜ
、それに酵素液０，１ｍｌ！を加え、２５°Ｃで３〜４
分間反応さぜ、５］、Ｏｎ　ｍの吸収を経時的に測定し
、その傾きａＡｓ１ｏ／ｍｉ口を酵素単位とした。

培養は、培養液としてポテト−シュクロース培地（ボテ
）　２００ｇの浸出液、シュクロース２０ｇを水１里に
溶解しｐ１１５〜６としたもの）、あるいはマツタケ培
地（エビオス５ｇ、グルコース２０ｇ。

を水１ｐ、に溶解し、ｉ１４．５としたもの）［醗酵研
究所発行Ｌｉ５ｔｏｆＣｕｌｔｕｒｅ　７　ｔ、ｂ　ｅ
ｄ　２７９頁に記載１を用い、それぞれの培地］、ＯＪ
。

をＩ−字試験管に入れ、１２１’０２０分間高圧殺菌し
たものに、第１表記載の菌の一白金耳を軽く押しっよ・
し、接種した。　約１週間、１ｏｏｒ、　ｐ、　ｍ、２
５℃で振どう培養して種菌を製した。　別途、同じ培地
１００ｄを５００ｍ１’、容坂ロフラスコに入れ、殺菌
し、前記の種菌１．０　ｍｆｌを接種した。　　３日間
同じ条件で振どう培養第１−表 し、得られた培養液のる液を酵素液とした。

これらの菌は、すべて醗酵研究所発行のｌｌ５Ｔ　ＯＦ
　ＣＵＬＴＵＲＥＳ７　ｔｌ＋　　ｅｄ　　（１，９８
４）に収載された公知の寄託菌であり該研究所・　　よ
１）入手することができる。　このうち、いくつかの菌
については食用菌としての習慣はないか゛同属に多くの
食用外のこが存在するということは少なくとも安全性の
点では前記の先願特許の微生物に比較すると安全である
と考えられる。　　ヒ）・ヨグケのある種のものは、酒
とともに食すると悪酔いすると言われているか、幼苗で
あれば問題はなく、アルコールをこれらの菌の培養には
通常の栄養源や添加物を含む培地で行なうことができる
。　炭素）原としては、グリセリン、グルコース、ガラ
クトース、マンノース、フラクトース、マルｌ−ス、シ
ュクロース、ラフィノース、キシロース、澱粉、水あめ
、ソルビトールなどの糖類、酢酸、クエン酸、コハク酸
、酪酸、パルミチン酸などの有機酸や脂肪酸、メチルア
ルコール、エチルアルコール、アミルアルコールなどの
アルコール類、ヘキサノ、オクテンなどの炭化水素類、
また窒素源としては脱脂大豆、カセイン、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンチーブリカー、各種アミノ
酸混合物などの天然窒素源の池、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機窒
素か利用できる。　この他、必要に応じて無機塩として
リン酸塩、塩化物、硫酸塩など、その他ビタミン類など
も添加した方がよい。　それらの配合割合は、それぞれ
の微生物に応じて適宜決定されるべきである。　培地の
ｐ＋＋や温度は、菌の種類によって若モ異なるか、大略
はｐ＋＋２〜１０．１０〜４０°Ｃであるが、好ましく
は各々ｐＨ４〜８．１５〜３５°Ｃである。　培養方法
は液体培養でも、面木培養でもよいが、その培養日数は
通常各々２〜７日、１．０−．６０日である。

さて、パーオキシダーゼの抽出方法は、それか菌体内か
菌体外かいずれの両分に多く存在するかによってはさほ
ど違わない。　液体培養した場合、菌体外であれば、培
養液をそのままろ過すればよいし、菌体内であれば菌体
をホモデナイズしたのち、同様に処理すればよい。　固
体培養の場合も同様で、菌の増殖した固体培地に水ある
いは適当な塩溶液を加え、抽出すればよい。続く精製は
通常の方法、すなわち硫安塩析、透析、有機溶媒沈澱、
各種クロマトグラフィー、電気泳動法等を単独あるいは
それらの組合せで行なうことができる。

１作用１ 代表例としてコプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕ
ｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）ＩＦ○３０１１６を用いて製し
たパーオキシダーゼ（本酵素と称す）の作用について記
す。

（１）活性の測定法 ４−アミンアンチピリン−フェノール系を水素供与体と
して用いた。　すなわち０．００２５Ｍ−４−アミノア
ンチピリンと０，１．７Ｍフェノールの混合液１．４４
と０．００２Ｍ過酸化水素の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，Ｏ）ｉ、５Ｊに酵素０．１．Ｊを加え、２５°Ｃ
で反応させ、５００ｎｍの吸光度を０．５〜２分間経−
８＝ 時的に測定した。　パーオキシダーゼ活性単位は１分間
当りの吸光度の増加量で示した。　すなわち、酵素反応
によって、反応１分間当り、吸光度が１増加した場合、
活性１とした。

（２）パーオキシダーゼの部分精製 ＰＳ培地（バレイショ２００ｇの浸出液とシュクロース
２０ｇに水を加えて１ｔとする。　詳細は醗酵研究所発
行１、ＩＳＴ　０ＦＣＵＬＴＵＲＥＳ　７１．ｌ＋　ｅ
ｄ　２７９頁）７０シを５０〇−容坂ロフラスコに分注
し、１２０’０３０分間殺菌。　斜面培地に増殖したコ
プリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　　ｃｉｎｅ
ｒｅｕｓ）　Ｉ　Ｆ○３０１．１６を約１ｃｍ２切り取
１）、それを無菌的に細く砕いたのちそれを上記ＰＳ培
地に接種し、２７°Ｃで７日間、ロータリーシェーカー
で振どう培養した。得られた培養液の布ろ過液（６１０
シ）に硫酸アンモニウムを３７０ｇ加えて溶解後−夜４
．５℃に放置。　ついで、セライトを用いて、ろ過し、
沈澱を集めて少量の水に再溶解後、透析チューブに入れ
、４．５’Ｃで２．５Ｘ１０　’Ｍ　ＦｅＣｌ３水溶液
（ｐＨ７，０）に対して透析し、その内液］、６ｍ旦を
得た。　この時点でパーオキシダーゼの全活性は、培養
ろ液の全活性の４５．７％となった。　この内液をＤＥ
ＡＥセルロースカラム（１８φＸ２３０ｍ＋ｎ、　０．
０１．Ｍ−リン酸緩衝液（ｐｔｉ７．５）で緩衝化）に
吸着させたのも、同じ濃度の緩衝液に０．１．Ｍ　ｔ４
ａｃｌを溶解した溶液で溶出、その溶出液を限外ろ過膜
（分子量５，０００）で濃縮し、相酸素液］、０　、５
　ｍ叩を得た。　この時点の全活性は培養ろ液全体に対
して１５．０％であった。　次に本酵素の種々の酵素化
学的性質を示す。

（３）作用特異性 本酵素は、主として過酸化水素に作用し、過酸化水素の
存在下で種々の水素供与体を酸化する。　反応式で示す
と次のとおりである。

Ｈ２Ｏ２＋ＡＩ（２→２Ｉ−■２０＋ＡここでＡＨ２は
水素供与体で、Ａはそれが酸化されたちのである。

（４）種々の水素供与一体に対する特異性種々の水素供
与体に刻する作用の強さの測定結果を第２表に示す。

（５）作用最適ｐＨ 第１図に示すように、本酵素は、ｐＨ３〜１１の範囲で
作用し、ｐＨ６〜９が至適ｐＨであった。

（６）　ｐｔｌ安定性 第２図に示すように、本酵素はｐｌ＋４〜９の間で安定
であった。

（７）温度安定性 本酵素をｐＨ８，０，０，］、Ｍリン酸緩衝液中で５５
°Ｃで１０分間加熱しでも活性は９０％以」−残存した
（第３図参照）。

［発明の効果］ 本発明によれば、フプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に
属し、ノ〈−オキシグーゼ生産能を有する微生物を培養
し、その培養物中に第２表 第２表中の値はフェノールを１００とした相月値で示し
た。

本酵素は特にアミノ系色原体に特によく作用することが
わかる。

生成蓄積されたパーオキシダーゼを採取することによっ
て、パーオキシダーゼを製造することができる。　本発
明によるパーオキシダーゼは、４−アミノアンチピリン
、０−ジアニシジン、０−トリジンなどのアミノ系色原
体に特によく作用するので、臨床検査薬として利用でと
る。　また、食用とされているコプリヌス属の微生物で
あるので、これから生産されるパーオキシダーゼは、食
品的に安全性が高く、利用範囲か゛拡大できる。

［実施例１ 次に、本発明の実施例を示す。

実施例１．　（液体培養の場合） ＰＳ培地（バレイショ５００．の浸出液にシュクロース
５０ｇを加え、水を加えて２．５１！とじた。　ｐＨは
５〜Ｇ）をジャーファーメンタ−（５ｆｉ容）に入れ、
１２０°Ｃ６０分間殺菌した後コプリヌス・シネレウス
（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　Ｃ１ｎｅｒｅｕｓ　Ｔ　Ｆ○３０
］、１．６）を予め同じ培地で前培養した種菌］００ｍ
１！を」二記ＰＳ培地に植菌した。

培養条件は回転数３５０−４５０ｒｐｍ、通気量１２７
ｍ１ｎ、温度２８°Ｃで３日間、通気攪拌培養した。　
その結果、１−につき活性２８３のパーオキシダーゼを
得ることができだ。

実施例２．　（固体培養の場合） ジャガイモ２００ｇを１１の熱水で浸出したろ液１２５
Ｊにシュクロース２．５８とセルロースパウダー１００
ｇを混合して、固型培地を作り、１．２０℃２０分間殺
菌した。　これにコブリヌスシネレウス（Ｃｏｐｒｉｎ
ｕｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）　Ｔ　Ｆｏ３０１１．４の試
験管斜面培養物を砕いたもの約１０白金耳を投入し、よ
く混合後、厚さ約０．５ｃｍの層とし、２５°Ｃで１４
日間静置培養した。　次いで、水５００ｍ旦を加え６０
分間室温に放置後、そのろ液からパーオキシダーゼを得
た。　活性は、１シにつき活性１１であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法によるパーオキシダーゼ（コプリ
ヌス、シネレウス　Ｉ　Ｆｏ　３０１．１６起）原）の
作用ｐｌ＋を示す。 第２図は、」−記パーオキシダーゼのｐ＋＋安定性を示
す図である。 第３図は、上記パーオキシダーゼの温度安定性を示す図
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属し、パーオキシ
   ダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養
   物中にパーオキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とするパーオキシダーゼの製造法。