DE3884741T2 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von UK-61.689 und Mikroorganismen zur Verwendung darin. - Google Patents

Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von UK-61.689 und Mikroorganismen zur Verwendung darin.

Info

Publication number
DE3884741T2
DE3884741T2 DE88309429T DE3884741T DE3884741T2 DE 3884741 T2 DE3884741 T2 DE 3884741T2 DE 88309429 T DE88309429 T DE 88309429T DE 3884741 T DE3884741 T DE 3884741T DE 3884741 T2 DE3884741 T2 DE 3884741T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
atcc
actinomadura
agar
medium
roseorufa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE88309429T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3884741D1 (de
Inventor
Iii Edward Joseph Tynan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Publication of DE3884741D1 publication Critical patent/DE3884741D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3884741T2 publication Critical patent/DE3884741T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/445—The saccharide radical is condensed with a heterocyclic radical, e.g. everninomycin, papulacandin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03—Actinomadura

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

  • Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von UK-61 689, einem anticoccidialen sauren polycyclischen Ether-Antibiotikum, das bislang nur auf chemischem Wege verfügbar war. Insbesondere betrifft sie die fermentative Erzeugung von UK-61 689 durch Züchten von Mutanten von Actinomadura roseorufa ATCC 53 666; und Actinomadura roseorufa-Mutanten von ATCC 53 665, ATCC 53 664 und ATCC 53 674.
  • EP-0 169 011, veröffentlicht am 22. Januar 1986, beschreibt die Erzeugung von UK-58 852, einem Antibiotikum mit polycyclischer Etherstruktur, erzeugt durch Züchtung von Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39 697 in einem wässerigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen.
  • UK-61 689, ein saures cyclisches Ethermonoglycon, weist die Formel (I) auf.
  • Seine Herstellung durch selektive saure Hydrolyse von UK-58 852, einem polycyclischen Etherdiglycon mit Formel (II)
  • wird in EP-A-0 255 335 beschrieben. Das darin beschriebene Verfahren umfaßt die saure Hydrolyse von UK- 58 852, vorzugsweise unter Verwendung von 1:1-Äquivalenten von p-Toluolsulfonsäure pro Äquivalent Natriumsalz von UK- 58 852 in Acetonitril/Wasser als Lösungsmittel bei Raumtemperatur.
  • Die Herstellung von UK-58 852, das seinerseits ein wirksames Antibiotikum, insbesondere ein anticoccidiales Mittel, darstellt, wird in der EP-Anmeldung 169 011, veröffentlicht am 22. Januar 1986, beschrieben. Es wird durch submerse aerobe Fermentation von Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39 697, in einem wässerigen Nährmedium erzeugt. Ebenfalls werden bei der Fermentation mit UK-58 852 zwei verwandte geringere Bestandteile erzeugt, wobei jedes davon bei der Bekämpfung der Coccidiose antibiotisch wirksam ist. Die zwei geringeren Bestandteile werden als CP-70 228 und CP-70 828 mit vorstehender Formel (II) bezeichnet, worin R ein Wasserstoffatom bedeutet und R¹ eine Methylgruppe darstellt und jeder der Reste R bzw. R¹ Methyl bedeutet.
  • Die Erfindung betrifft mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von UK-61 689, einem wertvollen sauren polycyclischen Ether-Antibiotikum und wirksamen anticoccidialen Mittel, umfassend das Züchten von Mutanten von Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 in einem wässerigen Nährmedium, bevorzugt unter submersen aeroben Bedingungen. Sie betrifft insbesondere Mutanten von ATCC 53 674 und 53 665, abgeleitet von Actinomadura roseorufa ATCC 53 666, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie UK-61 689 zusammen mit UK-58 852 erzeugen können und eine Mutante von ATCC 53 665, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im wesentlichen von UK-58 852 freies 61 689 erzeugen kann, wobei diese Mutante die bestimmenden Eigenschaften von Actinomadura roseorufa ATCC 53 664 aufweisen.
  • Die UK-61 689 und UK-58 852 erzeugenden Mikroorganismen werden durch Mutation von neuen Actinomadura roseorufa-Stämmen erhalten, die aus in Yamae Village, Kamamoto, Japan, gesammelten Erdproben isoliert und mit FD-27 684, (ATCC 53 666), bezeichnet wurden. N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (NTG) wurde als Mutierungsmittel verwendet. Einzelne Kolonien der behandelten Mikroorganismen wurden hinsichtlich der Erzeugung von UK-61 689 geprüft. Das allgemeine Verfahren umfaßte die Anzucht von ATCC 53 666 in einem wässerigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen und Schütteln bei einer Temperatur von 28ºC. Die Wahl des Mediums ist für das Wachstumsstadium nicht ausschlaggebend. Ein Medium, bestehend aus Cerelose (10,0 g), Maisstärke (5,0 g), Maisquellwasser (5,0 g), NZ Amin YTT (5,0 g), (eingetragenes Warenzeichen für den enzymatischen Aufschluß von Casein, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.) und Cobaltchlorid (0,002 g) werden in einem Liter Wasser suspendiert, der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und 800 ml in einen Fernbachkolben eingefüllt. Nach Sterilisieren durch Autoklavbehandlung werden die Kolben mit einer Schrägkultursuspension oder gefrorenem Pflanzenmycel geimpft und dann unter Bewegen auf einem Schüttler mit etwa 200 U/min und bei einer Temperatur von 28ºC für 8 Tage inkubiert. 50 ml aliquote Teile werden entnommen und das Mycel mit einem Teflonkolben-Gewebezerkleinerer homogenisiert, gefolgt durch Ultraschallzerkleinerung. Das zerkleinerte Mycel wird dann zentrifugiert, vom Medium freigewaschen, dann in 50 ml frischem Medium in einem 300 ml-Erlenmeyerkolben resuspendiert und unter Schütteln bei 32ºC für 2 Stunden inkubiert, wonach die Zellen wiederum zentrifugiert und mit sterilem Wasser vom Medium freigewaschen wurden und in 50 ml Tris(hydroxymethyl)aminomethanmalatpuffer pH 9,0 suspendiert wurden. Aliquote Teile dieser Suspension wurden dann mit dem Mutierungsmittel NTG bei Konzentrationen von 750 mcg bis 1500 mcg/ml für eine Stunde auf einem Wasserbadrotationsschüttler bei 250 bis 300 U/min und einer Temperatur von 34ºC behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen zentrifugiert, mit sterilem Wasser von dem Mutagen freigewaschen und im Kolben mit frischem Wachstumsmedium suspendiert, wonach diese dann unter Schütteln bei 32ºC in einem Kastenschüttler bei 200 U/min angezogen wurden. Nach 3 Tagen wurde der Mycelaufwuchs homogenisiert und beschallt. Aliquote Teile des beschallten Materials wurden in einer Konzentrationsreihe verdünnt und auf Platten mit festem Nährmedium gegeben und die Platten wurden bei 28ºC inkubiert bis die Kolonie bildenden Einheiten zum Überführen in die Schrägkultur von ausreichender Größe waren. Ein geeignetes Medium für Platten und Schrägkulturen ist das ATCC-Medium Nr. 172 mit N-Z Amintyp A (Humko Sheffield Chemical Co., Inc.), verdünnt auf 1,0 g/l. Die beimpften Schägkulturen wurden bei 28ºC für 10 bis 14 Tage wachsen lassen, wonach sie testbereit waren. Dies wurde durch Beimpf en in 300 ml-Erlenmeyerkolben ausgeführt, die 25 ml eines geeigneten Mediums enthielten (jede enthaltend Cerelose, 45,0 g; Sojamehl, 10,0 g; Maisquellwasser, 15,0 g; MnSO&sub4; H&sub2;O, 0,1 g; MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,1 g; Cobaltchlorid, 0,002 g; Calciumcarbonat, 3,0 g; 1 Liter Wasser und der pH-Wert des Mediums war auf 7,0 eingestellt). Nach Sterilisieren durch Autoklavbehandlung für 30 Minuten bei 121ºC wurden die Kolben mit den einzelnen Schrägkulturzüchtungsuspensionen beimpft und durch Schütteln bei 28ºC auf einem New Brunswick Schüttler für 7 Tage inkubiert. Die Mutantenkultur FD-28 454 (ATCC 53 674) wurde durch Prüfen der Methylisobutylketonextrakte geernteter Vollbrühe nach Besprühen entwickelter dünnschichtchromatografischer Platten (Kieselgel) mit Vanillinreagenz und Erhitzen bei 100ºC für 5 Minuten bestimmt. Das Laufmittel bestand aus 9 Teilen Chloroform zu 1 Teil Methanol und ergab Rf-Werte von ca. 0,3 für UK-61 689 und etwa 0,65 für UK-58 852. Die so erhaltene Mutantenkultur erzeugte ein Gemisch von UK-61 689 und UK- 58 852. Das Verhältnis von UK-61 689/UK-58 852 scheint in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen etwas zu schwanken. Die morphologischen und Kultureigenschaften der so erhaltenen Mutante sind im wesentlichen jene, die hier für A. roseorufa ATCC 53 666 beschrieben wurden. Die unterscheidende Eigenschaft dieser Mutante ist die Fähigkeit, ein Gemisch von UK-61 689 und UK-58 852 zu erzeugen, wobei UK-61 689 das vorwiegende Produkt darstellt. Züchten der Mutante und Gewinnen des Antibiotikums UK-61 689 können unter Bedingungen ausgeführt werden, die jenen ähneln, die bei früheren Fermentationen zum Gewinnen von Polyetherantibiotika angewendet wurden, siehe zum Beispiel US-Patentschrift 4 361 649. Die Züchtung findet vorzugsweise in wässerigem Nährmedium unter vorwiegend submersen aeroben Bedingungen unter Bewegen bei einer Temperatur von 24ºC bis 36ºC statt. Nährmedien, die zur Züchtung verwendbar sind, schließen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Zucker, Stärken und Glycerin, eine Quelle für organischen Stickstoff wie Casein, enzymatisches aufgeschlossenes Casein, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Weizengluten, Sojamehl, Fleischmehl und Fischmehl ein. Ebenfalls können eine Quelle von Wuchsstoffen wie Stärkesirup, Fischmehl, Baumwollsamenmehl und Hefeextrakt sowie Mineralsalze wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat und Spurenelemente wie Eisen, Magnesium, Kupfer, Zink, Cobalt und Mangan mit vorteilhaften Ergebnissen verwendet werden. Wenn übermäßiges Schäumen während der Fermentation auftritt, können Schaumbremser, wie Pflanzenöle oder Silicone, zu dem Fermentationsmedium zugegeben werden. Belüftung des Mediums in zur submersen Anzucht geeigneten Kesseln wird vorzugsweise in einer Geschwindigkeit von 1/2 bis 2 Volumina steriler Luft pro Volumen Fermentationsbrühe pro min aufrecht erhalten, eingedrückt in die Brühe über eine Anschwänzvorrichtung. Bewegen kann mit Hilfe von auf dem Gebiet der Fermentation üblichem Bewegen erfolgen. Die Geschwindigkeit hängt von der angewendeten Bewegungsart ab. Ein Schüttelkolben wird gewöhnlich bei 150 bis 300 Zyklen pro min betrieben, wogegen ein Fermenter gewöhnlich mit 300 bis 1700 U/min betrieben wird. Aseptische Bedingungen müssen natürlich beim Übertragen der Organismen und während der Anzucht aufrecht erhalten werden.
  • Das Inoculum zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotikums kann durch Anwendung einer Anzucht in einer Schrägkultur oder einer mit der Kultur beimpften Roux-Flasche oder von einer aufgetauten Mycelsuspension der Kultur erhalten werden. Ein für die anfängliche Anzucht des Organismus auf Schrägkulturen oder in Roux-Flaschen geeignetes festes Medium ist das ATCC-Medium Nr. 172. Das bereits bei den Mutierungsuntersuchungen erwähnte flüssige Medium ist zur Herstellung des vegetativen Mycels vor dem Einfrieren geeignet. Die Anzucht kann zur Beimpfung entweder von Schüttelkolben oder Beimpfungsgefäßen verwendet werden oder die Beimpfungsgefäße können aus dem Schüttelkolben beimpft werden. Eine maximale Anzucht in Schüttelkolben wird gewöhnlich in 4 bis 8 Tagen erreicht, wogegen das Beimpfen in submersen Beimpfungsgefäßen gewöhnlich am günstigsten innerhalb von 4 bis 5 Tagen erfolgt.
  • Der Verlauf der Erzeugung des Antibiotikums während der Fermentation kann qualitativ, wie bereits beschrieben, durch Dünnschichtchromatografie und visuelle Betrachtung nach Besprühen mit Vanillinreagenz beobachtet werden oder die entwickelte Platte kann ebenfalls mit Hirn-Herz-Infusionsagar, beimpft mit Bacillus subtilis überschichtet werden und bei 37ºC für 16 Stunden inkubiert werden, um die Antibiotika sichtbar zu machen. Dünnschichtchromatografie ist ebenfalls ein nutzbringendes Werkzeug zur Analyse der Zusammensetzung von reinen und gereinigten Materialien, die aus der Fermentationsbrühe extrahiert wurden. Ein HPLC-Verfahren, bei dem eine 10 cm x 4,6 mm Microbore C-18-Säule, ein Laufmittel 40/200/760 0,01 M Ammoniumcarbonat/Acetonitril/Methanol sowie ein RI-Detektor zur Anwendung kommen, kann zur quantitativen Bestimmung der Menge an UK-61 689 und dem miterzeugten UK- 58 852 in den Fermentationsbrühen verwendet werden.
  • Das durch die Fermentation der hier beschriebenen Mutanten erzeugte Antibiotikum UK-61 689 sammelt sich im Mycel und in der Brühe und kann durch Extrahieren der gesamten geernteten unfiltrierten Fermentationsbrühe, d.h. der gesamten Brühe, mit einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform, Essigsäureethylester, Methylisobutylketon oder Butanol bei dem natürlich vorherrschenden pH-Wert abgetrennt und isoliert werden. Alternativ dazu kann zur Vermeidung ernsthafter Emulsionsprobleme das Mycel abgetrennt werden und beide, Mycel und die geklärte Brühe, werden einzeln mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Lösungsmittelextrakte werden dann zu einem dünnen Sirup eingeengt und reines UK-61 689 chromatografisch erhalten.
  • Ein typisches Verfahren zur Trennung und Isolierung des Antibiotikums ist wie nachstehend: Die gesamte Brühe der Fermentation der Mutante wurde mit Methylisobutylketon extrahiert. Eindampfen des Extrakts unter vermindertem Druck ergab ein rötliches Öl, das in Essigsäureethylester gelöst wurde, und auf eine Kieselgelsäule gegossen wurde. Die Kieselgelsäule wurde dann mit Essigsäureethylester eluiert und die Eluate dünnschichtchromatografisch untersucht. Fraktionen, die UK-61 689 enthielten, wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Das so erhaltene UK-61 689 kann weiter durch Kristallisation aus Isopropylether gereinigt werden.
  • Das UK-61 689 kann von der Fermentation zusammen mit dem Mycel durch Eindampfen der gesamten Brühe in an sich bekannter Weise isoliert werden, einschließlich Sprühtrocknen oder durch Abtrennen des Mycels von der Brühe, durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die so erhaltenen Mycelprodukte enthalten UK-61 689 an der Oberfläche des Mycels und in den Zwischenräumen davon, wodurch das Mycel als Träger für UK-61 689 geeignet ist.
  • Ein einzelnes Kolonieisolat, bezeichnet mit FD-28474, der vorstehend genannten Mutante FD-28454 (ATCC 53 674) wurde selbst einer Mutagenese durch NTG gemäß vorstehendem Verfahren zur Herstellung von FD-28454, unterworfen. Dieses Verfahren ergab eine weitere Mutante (FD-28499), die morphologische und Kultureigenschaften von Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 zeigte und natürlich die der ersten erzeugten Mutante. Diese Mutante (FD-28499) unterschied sich jedoch von den Mutanten FD-28454 und 28474 dadurch, daß sie im wesentlichen UK-58 852 (d.h., < 1 %)- freies UK-61 689 erzeugte. Die Mutante FD-28499 wurde in gleicher Weise wie die zuerst beschriebene Mutante (FD-28454) gezüchtet und das UK-61 689, wie bereits beschrieben, durch Fermentation gewonnen.
  • Die letzte Mutante, benannt in der Kultursammlung Pfizer Inc. als FD-28499, die Mutanten FD-28454 und FD-28474 und der Ausgangsmikroorganismus FD-27684 wurden gemäß Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, einer anerkannten Hinterlegungsstelle, die die Beständigkeit der Hinterlegungen und die freie Zugänglichkeit dazu durch die Öffentlichkeit garantiert, wenn ein Patent auf der Gundlage dieser Anmeldung erteilt wird. Es wurden die Bezeichnungen Actinomadura roseorufa ATCC 53 664, ATCC 53 674, ATCC 53 665 bzw. ATCC 53 666 vergeben. Die Hinterlegungen sind während der Anhängigkeit dieser Anmeldung einer Person verfügbar, die durch den Beauftragten des United States Patent and Trademark Office als dafür berechtigt bestimmt wird unter 37 CFR 1.14 und 35 USC 122, und im Einklang mit ausländischen Patentrechten in Staaten, in denen nationale Anmeldungen dieser Anmeldung oder deren Nachanmeldungen eingereicht wurden. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der hinterlegten Mikroorganismen für die Öffentlichkeit werden nach der Erteilung des Patents unwiderruflich aufgehoben.
  • Taxonomische Untersuchungen an FD-27684, FD-28474 und FD-28499 wurden von L.H. Huang ausgeführt, der die folgenden Beschreibungen verfaßte.
  • Jede der Kulturen wurde aus einer Schrägkultur in ATCC Nr.172-Brühe überführt und für 4 Tage bei 28ºC auf einem Schüttler gezüchtet. Sie wurde dann für 20 min zentrifugiert, 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und in ein Medium, das gewöhnlich zur Identifizierung von Formen von Actinomycitalis verwendet wird, überführt.
  • Die Kulturen wurden bei 28ºC inkubiert und die Ergebnisse wurden bei verschiedenen Zeiten, jedoch meistens nach 14 Tagen erstellt. Die Farben wurden in üblicher Terminologie beschrieben, jedoch wurden exakte Farben durch Vergleich mit Farbplättchen des Color Harmony Manual, 4. Auflage, bestimmt. Das Verfahren der Gesamtzellenaminosäureanalyse war das von Becker et al. in Appl. Microbiol., 12, 421-423, 1964 beschriebene. Die Gesamtzellenzucker wurden durch Verfahren beschrieben von Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., 71, 934-944, 1968; und in Staneck und Roberts, Appl. Microbiol. 28, 226-231, 1974, analysiert. Zum Vergleich wurde die Kulturform von Actinomadura roseorufa ATCC 39 697 verwendet.
  • Die Medien zur Identifizierung für die Kultureigenschaften und Vergleiche hinsichtlich ihrer Zusammensetzungen waren wie nachstehend:
  • 1. Trypton-Hefeextraktbrühe - (ISP #1 Medium, Difco).
  • 2. Hefeextrakt-Malzextraktagar - (ISP #2 Medium, Difco).
  • 3. Hafermehlagar - (ISP #3 Medium, Difco).
  • 4. Anorganische Salze - Stärkeagar - (ISP #4 Medium, Difco).
  • 5. Glycerin - Asparaginagar - (ISP #5 Medium, Difco).
  • 6. Peptonhefeextrakteisenagar - (ISP #6 Medium, Difco).
  • 7. Czapek-Saccharoseagar - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2, Medium Nr. 1, Seite 328, 1961.
  • 8. Glucose - Asparaginagar, ebenda, Medium Nr. 2, Seite 328.
  • 9. Benett's Agar - ebenda, Medium Nr. 30, Seite 331.
  • 10. Emerson's Agar - ebenda, Medium Nr. 28, Seite 331.
  • 11. Nähragar - ebenda, Medium Nr. 14, Seite 330.
  • 12. Gordon und Smith's Thyrosinagar - R.E. Gordon und M.M. Smith, J. Bacteriol. 69: 147-150, 1955.
  • 13. Caseinagar - ebenda.
  • 14. Calciummalatagar - S.A. Waksman, Bacteriol. Rev. 21: 1-29, 1957.
  • 15. Gelatine - R. E. Gordon und J.M. Mihm, J. Bacteriol. 73: 15-27, 1957.
  • 16. Stärke - ebenda
  • 17. organische Nitratbrühe, ebenda
  • 18. Glucosenitratbrühe - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2, Medium Nr. 1, Seite 328, 1961, mit 3 g Glucose für 30 g Saccharose und unter Weglassen von Agar.
  • 19. Kartoffel-Karottenagar - M.P. Lechevalier, J. Lab. and Clinical Med. 71: 934-944, 1968, jedoch nur unter Verwendung von 30 g Kartoffeln, 2,5 g Karotten und 20 g Agar.
  • 20. 2 % Leitungswasseragar.
  • 21. Gauze's #1 Mineralagar - G.F. Gauze et al., Problems in the Classification of Antagonistic Actinomycetes, Engl. Ausg., Seite 13, 1957.
  • 22. Gauze's #2 Organischer Agar - ebenda.
  • 23. Rahmmilch - Difco.
  • 24. Zellstoffverwendung -
  • a) H.L. Jenson, Proc. Linn., Soc. N.S.W. 55: 231-248, 1930.
  • b) M. Levine und H.W. Schoenlein, A. Compilation of Culture Media, Medium Nr. 2511, 1930.
  • 25. Verwendung von organischen Säuren - R.E. Gordon et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 24: 54-63, 1974.
  • 26. Säureerzeugung aus freien Kohlenhydraten - ebenda.
  • 27. Hydrolyse von Hippurat und Äsculin - ebenda.
  • 28. Zersetzung von Adenin, Hypoxanthin, Xanthin und Harnstoff - ebenda.
  • 29. Widerstandsfähigkeit gegen Lysozym - ebenda.
  • 30. Verwendung von Kohlenhydrat - C-2-Medium, H. Nonomura und Y. Ohara, J. Ferment. Technol. 49: 887-894, 1971.
  • 31. Temperaturbereich - ATCC-Medium 172 ATCC Culture Collection Catalogue, 15. Ausg., Seite 608, 1982.
    • Eine Beschreibung der Kultur FD-27684 Hefeextrakt - Malzextraktagar
  • - gute Anzucht, rosarot bis rot (6 1/2ia, 7ia, 6ia), aufrecht, gekräuselt, mit weißem Luftmycel; umgekehrt rot (7ia); kein lösliches Pigment.
    • Hafermehlagar
  • - mäßiges Wachstum, cremefarben (2ca), leicht aufrecht, eben, oder als isolierte Kolonien auftretend; kein bis wenig Luftmycel, weiß; umgekehrt cremefarben (2ca); kein lösliches Pigment.
    • Anorganische Salze - Stärkeagar
  • - schlechter bis mäßiger Wuchs, farblos bis cremefarben (2ca), dünn, eben; kein bis spärliches weißes Luftmycel, umgekehrt gleiche Oberfläche; kein lösliches Pigment.
    • Glycerin - Asparaginagar
  • - schlechter bis mäßiger Aufwuchs, cremefarben (2ca), mit rosa bis roten Punkten (6ea, 6 1/2ga); kein oder spärliches Luftmycel; umgekehrt farblos bis cremefarben (2ca), mit roten Punkten; kein lösliches Pigment.
    • Czapek - Saccharoseagar
  • - Aufwuchs schlecht bis mäßig, cremefarben (2ca), mit rosa bis roten Punkten (5ea, 6 1/2ia); kein oder spärliches Luftmycel; umgekehrt farblos bis cremefarben (2ca); kein lösliches Pigment.
    • Glucose - Asparaginagar
  • - Aufwuchs mäßig bis gut, rosa bis rot (6 1/2ga, 6 1/2na), aufrecht; eben, granulär bis kraus; weißes bis blasrosa Luftmycel (6ea); umgekehrt rot (6 1/2ga, 6 1/2 ia); lösliches Pigment schwachgelb (3ca).
    • Gordon und Smith's Thyrosinagar
  • - mäßiger bis guter Aufwuchs, rosa-orange (5ea), mäßig aufrecht, kraus; kein oder spärliches Luftmycel, weiß; umgekehrt wie Oberfläche; lösliches Pigment gelblich (21c).
    • Calciummalatagar
  • - dürftiger Aufwuchs, farblos, dünn, glatt, kein Luftmycel; umgekehrt farblos, kein lösliches Pigment.
    • Caseinagar
  • - Aufwuchs mäßig bis gut, rosa-orange bis orange (4ia, 5ia), mäßig aufrecht, kraus, kein Luftmycel; umgekehrt gelblich bis schwach rosa (3ga, 5ea); mit braunem (31c) löslichem Pigment.
    • Bennett's Agar
  • - Aufwuchs gut, rot bis dunkelrot (6 1/2ne, 6 1/2ng), aufrecht, kraus; weites bis rosa (6ea) Luftmycel; umgekehrt rot (6 1/21c); mit braunem (3ne) löslichem Pigment.
    • Emerson's Agar
  • - Aufwuchs gut bis ausgezeichnet, orange (51a, 5na), aufrecht, kraus, mit weißem Luftmycel; umgekehrt orange (5ic); kein lösliches Pigment.
    • Nähragar
  • - Aufwuchs mäßig, schwach orange (5ea, 5ga), leicht aufrecht, glatt oder als isolierte Kolonien auftretend, kein Luftmycel; umgekehrt schwach orange (5ga); kein lösliches Pigment.
    • Gelatineagar
  • - Aufwuchs mäßig bis gut, schwach orange (4ga), mäßig aufrecht, glatt bis kraus; spärlich weißes Luftmycel; umgekehrt schwach orange (4ga); kein lösliches Pigment.
    • Stärkeagar
  • - Aufwuchs mäßig bis gut, schwach orange (5ga), mäßig aufrecht, glatt bis kraus; spärliches weißes Luftmycel; umgekehrt wie Oberfläche, kein lösliches Pigment.
    • Kartoffel-Karottenagar
  • - Aufwuchs schlecht bis mäßig, cremefarben bis schwach rosa (2ca, 4ca), dünn bis leicht aufrecht; spärlich weißes Luftmycel; umgekehrt cremefarben bis schwach rosa (4ca); kein lösliches Pigment.
    • Leitungswasseragar
  • - Aufwuchs schlecht, farblos bis cremefarben (1 1/2ca), dünn, glatt; spärliches weißes Luftmycel; umgekehrt wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
    • Gauze's Mineralmedium 1
  • - Aufwuchs mäßig, rosa bis rot (5ca, 6la) mit roten Punkten (61c), leicht aufrecht, glatt; kein oder spärliches weißes Luftmycel; umgekehrt wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
    • Gauze's organisches Medium 2
  • - Aufwuchs mäßig bis gut, rosa bis orange (5ga), mäßig aufrecht, leicht kraus; spärliches weißes Luftmycel; umgekehrt wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.
    • Morphologische Eigenschaften
  • - Nach 7 Wochen Inkubation wurden keine Sporen auf den verwendeten Medien gefunden. Auf Kartoffel-Karottenagar entstanden endständig an den Seiten oder dazwischen hyphale Verdickungen, die einzeln und glatt waren. Sie waren kugelförmig, oval bis elliptisch und 1,2 bis 2,5 um im Durchmesser oder 1,2 bis 2,2 x 0,9 bis 1,8 um. Ähnliche Strukturen wurden auch auf Hefeextrakt-Malzextraktagar, Hafermehlagar, Leitungswasseragar, Gelatineagar, Czapek-Saccharoseagar und Gauze's Mineralmedium 1 gefunden.
    • Biochemische Eigenschaften
  • - Melanin wurde nicht erzeugt; Schwefelwasserstoff wurde nicht erzeugt; Gelatine verflüssigt; Stärke nicht hydrolysiert; Nitrat zu Nitrit reduziert; schwacher Aufwuchs auf Jensen's Cellulosebrühe, jedoch kein Aufwuchs auf Levin's und Schoenlein's Cellulosebrühe; kein Abbau auf beiden Cellulosebrühen; Koagulation und Peptonisierung auf Milch; Aufspaltung auf Calciummalat negativ; Thyrosinaufspaltung positiv; Caseinaufspaltung positiv.
  • Kohlenhydratverarbeitung: Glucose, Rhamnose und Saccharose wurden verarbeitet; Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose und Xylose wurden nicht verarbeitet.
  • Die positiven Tests schließen ein: Verwendung von Acetat, Propionat und Pyruvat; Säureerzeugung aus Glucose, Rhamnose, Maltose und Trehalose.
  • Die nachstehenden Tests waren negativ: Zersetzung von Adenin, Xanthin, Hypoxanthin und Harnstoff; Hydrolyse von Äsculin und Hippurat; Widerstandsfähigkeit gegenüber Lysozym; Nutzung von Benzoat, Citrat, Dextrin, Lactat, Malat, Mucat, Oxalat, Phenol und Succinat; Säureproduktion aus Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Saccharose, Xylose, Adonit, Cellobiose, Dulcit, Erythrit, Galactose, Glycerin, Lactose, Mannose, Melezitose, Malibiose, &alpha;-Methyl-D-glucosid, Ribose, Salicin, Sorbit, Sorbose und Stärke.
    • Ganzzellenanalyse
  • - Die Ganzzellenhydrolysate enthalten meso- Diaminopimellinsäure, Galactose, Glucose, Madurose, Rhibose und Rhamnose. Temperatureinstellungen mäßiges Wachstum gutes Wachstum kein Wachstum
  • Kultur FD-27684 ist durch die Unfähigkeit, Melanin zu erzeugen; rosa, rosa bis orange, orange bis rotes Substratmycel; und die Anwesenheit von meso- Diaminopimellinsäure und Madurose als Ganzzellbestandteile gekennzeichnet. Ungeachtet eines langen Inkubationszeitraums von bis zu 7 Wochen war die Kultur nicht in der Lage, Sporen zu erzeugen, obwohl hyphale Verdickungen in einigen Medien erzeugt wurden. Sie wird der Gattung Actinomadura zugeordnet.
  • Kultur FD-27684 ist in den meisten Kultureigenschaften und fast allen biochemischen Eigenschaften ähnlich Actinomadura roseorufa Huang ATCC 39 697 (siehe Europäische Patentanmeldung 169 001). Auf Gelatineagar und Stärkeagar waren Kolonien von FD-27684 schwach orange anstatt schwach cremefarben. Auf Thyrosinagar und Emerson's Agar zeigten sie etwas hellorange Farbe anstatt braun. Kultur FD-27684 koaguliert, im Gegensatz zu A. roseorufa, Milch. Diese Unterschiede waren gering und folglich wird FD-27684 als neuer Stamm von A. roseorufa betrachtet.
  • Im Vergleich mit der Stammkultur FD-27684 erzeugt Mutante FD-28474 weniger Luftmycel auf Hefeextrakt- Malzextraktagar, Bennett's Agar, Gauze's organisches Medium 2, Gelatineagar und Stärkeagar. Kolonien der Mutante waren cremefarben anstatt orange auf Emerson's Agar und waren schwach rosa anstatt cremefarben bis schwach rosa auf Kartoffel-Karottenagar. Die Mutante erzeugt im Gegensatz zu ihrer Herkunft Schwefelwasserstoff. All die anderen Kultureigenschaften und chemischen Eigenschaften waren identisch. Die Mutante FD-28474 wird somit als neuer Stamm von Actinomadura roseorufa betrachtet.
  • Mutante FD-28499 teilte fast alle Kultureigenschaften und die gesamten biochemischen Eigenschaften beim Vergleich mit Kultur FD-28474, von der sie abgeleitet ist. Die Mutante wich von der Kultur FD-28474 nur in den dunkelbraunen anstatt braunroten Kolonien auf Hefeextrakt-Malzextraktagar und durch die Anwesenheit von einigen rosa Punkten auf Gauze's organisches Medium 2 ab. Somit wird FD-28499 als neuer Stamm von Actinomadura roseorufa betrachtet.
  • FD-28454 wurde nicht taxonomischer Untersuchung unterworfen. Da es jedoch von einem Stamm von Actinomadura roseorufa abgeleitet war und durch Mutation eines Stammes von Actinomadura roseorufa erzeugt wurde, wird es als Stamm Actinomadura roseorufa betrachtet.
  • Antibiotikum UK-61 689 zeigt Inhibitorwirkung gegen den Aufwuchs einer Zahl von grampositiven Mikroorganismen. In nachstehender Tabelle I werden die Ergebnisse der in vitro- Tests zusammengefaßt. Für diesen Test wird jeder Organismus in einer Reihe von Reagenzröhrchen, die Nährmedium enthalten, bei verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums UK-61 689 beimpft, um die minimale Konzentration der Verbindung in g/ml zu bestimmen, die das Wachstum der Organismen über einen Zeitraum von 24 Stunden hemmt (MIC). Tabelle I Antibakterielle Wirkung Organismus Stammnummer Clostridium perfringens Actinomyces pyogenes Treponema hyodysenteriae
  • Die Wirkungsdaten für UK-61 689 und dessen Salze gegen coccidiale Infektionen bei Hühnern wurden in folgender Weise erhalten. Gruppen von 3-5 Zehn-Tage-alten pathogenfreien weißen Leghornhähnchenküken wurden mit einer gleichförmig dispergierten, UK-61 689 oder dessen Natrium- und/oder Kaliumsalz enthaltenden Maischdiät gefüttert. Nach Erhalt dieser Ration für 24 Stunden wurde jedes Küken peroral mit Oocysten verschiedener Eimeria-Arten infiziert. Andere Gruppen von 3-5 Zehn-Tage-alten Küken wurden mit einer ähnlichen Maischdiät ohne Antibiotikum UK-61 689 oder dessen Salzen gefüttert. Sie wurden ebenfalls nach 24 Stunden infiziert und dienten als infizierte Kontrollen. Einer weiteren Gruppe von 3-5 Zehn-Tage-alten Küken wurde die gleiche Maischdiät ohne Antibiotikum UK-61 689 verfüttert und nicht mit Coccidia infiziert. Diese diente als normale Kontrolle. Die Ergebnisse der Behandlung wurden nach 5 Tagen im Fall von E. acervulina und in 6 Tagen für die anderen Befallsarten bewertet.
  • Die verwendeten Kriterien zum Messen der anticoccidialen Wirksamkeit bestehen in Läsionsbewertungen von 0 bis 4 für E. tenella nach J.E. Lynch, "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res., 22, 324-326, 1961; und 0 bis 3 für die anderen Arten auf der Grundlage einer Modifizierung des Bewertungssystems, angegeben von J. Johnson und W.H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970. Ein konstantes Verhältnis wurde durch Dividieren der Läsionsbewertung für jede behandelte Gruppe durch die Läsionsbewertung der infizierten Kontrolle erstellt.
  • UK-61 689 und dessen kationische Salze zeigen ausgezeichnete Aktivität gegen coccidiale Infektionen bei Geflügel. Wenn diese Verbindungen in das Kükenfutter in Konzentrationen von 15 bis 120 ppm eingegeben werden, sind sie wirksam, um Infektionen, hervorgerufen durch Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti und E. necatrix, zu bekämpfen.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung wird zur Verwendung bei der Behandlung von Coccidiose bei Geflügel in einem geeigneten Träger oral verabreicht. Zweckmäßigerweise wird die medikamentöse Behandlung einfach in dem Trinkwasser oder in dem Geflügelfutter ausgeführt, so daß eine therapeutische Dosierung des Mittels mit dem täglichen Trinkwasser oder der Geflügelfutterration aufgenommen wird. Das Mittel kann direkt in das Trinkwasser eingemessen werden, vorzugsweise in Form einer Flüssigkeit, eines wasserlöslichen Konzentrats (wie einer wässerigen Lösung eines wasserlöslichen Salzes) oder direkt dem Futter zugegeben werden als solches oder in Form einer Vormischung oder eines Konzentrats. Eine Vormischung oder ein Konzentrat als therapeutisches Mittel in einem Träger wird gewöhnlich für die Zugabe des Mittels in das Futter angewendet. Geeignete Träger sind nach Wunsch flüssig oder fest, wie Wasser, verschiedene Mehle, zum Beispiel Sojabohnenölmehl, Leinsamenölmehl, Maiskolbenmehl und Mineralgemische, die üblicherweise in Geflügelfutter verwendet werden. Ein besonders wirkungsvoller Trager ist Geflügelfutter selbst, d.h. eine geringe Portion an Geflügelfutter. Des weiteren kann das Mycel als Träger verwendet werden.
  • Der Träger erleichtert die gleichförmige Verteilung der Wirkstoffe in dem Fertigfutter, in dem die Vormischung vermischt wurde. Dies ist insofern wichtig, da nur kleine Anteile der vorliegenden wirksamen Mittel erforderlich sind. Es ist wichtig, dar die Verbindung in der Vormischung und folglich in dem Futter sorgfältig eingemischt wird. In diesem Sinne kann das Mittel in einem geeigneten öligen Bindemittel dispergiert oder gelöst werden, wie Sojabohnenöl, Maisöl, Baumwollsamenöl oder dergleichen oder in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel und dann mit dem Träger vermischt werden. Selbstverständlich können die Anteile an Wirkstoff in dem Konzentrat in breiter Weise variieren, da die Menge an Mittel in dem Fertigfutter durch Einmischen des geeigneten Anteils an Vormischung in das Futter eingestellt wird, um eine erwünschte Konzentration an therapeutischem Mittel zu erhalten.
  • Hoch wirksame Konzentrate können durch den Futterhersteller mit proteinischem Träger, wie Sojabohnenölmehl und anderen Mehlen, wie vorstehend beschrieben, vermischt werden, unter Herstellung konzentrierter Zusätze, die zur direkten Fütterung an das Geflügel geeignet sind. In diesen Fällen wird das Geflügel das übliche Futter zu sich nehmen. Alternativ dazu können derartig konzentrierte Ergänzungen dem Geflügelfutter unter Herstellung eines ernährungsmäßig ausgeglichenen fertigen Futters, das eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Erfindung enthält, beigegeben werden. Die Gemische werden sorgfältig durch Standardverfahren vermischt, wie mit einem V-Mischer, um Homogenität zu sichern.
  • Es wird natürlich für den Fachmann selbstverständlich sein, daß die Konzentrationen der hier beschriebenen Verbindung unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sind. Kontinuierliche gering konzentrierte medizinische Verabreichungen während der Aufwuchszeit, d.h. während der ersten 6 bis 12 Wochen sind für Küken eine wirksame prophylaktische Maßnahme. Bei der Behandlung von chronischen Infektionen können höhere Konzentrationen erforderlich sein, um die Infektion zu überwinden. Die Gebrauchskonzentration im Futter liegt im allgemeinen im Bereich von 15 bis 120 ppm. Wenn Trinkwasser verabreicht wird, wird die Konzentration jene sein, die die tägliche Dosis der medizinischen Behandlung bereitstellt, d.h. 15 bis 120 ppm, multipliziert mit dem Gewichtsverhältnis der durchschnittlichen täglichen Aufnahme des Futters zum durchschnittlichen täglichen Wasserverbrauch.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf die speziellen Einzelheiten dieser Beispiele beschränkt ist.
    • Beispiel 1 A. Herstellung der Beimpfung
  • Ein steriles wässeriges Medium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt. Bestandteil Gramm/Liter Cerelose Maisstärke Maisquellwasser NZ Amin YTT* Cobaltchlorid * (eingetragenes Warenzeichen für einen enzymatischen Caseinaufschluß, Humko Sheffield Chemical Co. Inc.)
  • Nachdem der pH-Wert auf 7,0 eingestellt wurde, wurde das Medium (800 ml) in einen 2800 ml-Fernbachkolben gegeben, mit Watte zugestopft, mit Papier überkappt und mit einem Autoklaven für 60 min bei 121ºC (15 psi) sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium mit einer vegetativen Zellsuspension aus einer Schrägkultur von FD-28454 (ATCC 53 674) beimpft. Die Kolben wurden bei 28ºC auf einem Rotationsschüttler mit einer Versetzung von 1 1/2 bis 2 1/2 Inches und 150 bis 200 Zyklen pro Minute für 6 Tage geschüttelt.
    • B. Fermentation und Isolierung von UK-61 689
  • Ein Fernbachkolben mit 800 ml der gezüchteten Kultur wurde zur Beimpfung in ein 14 l-Fermentationsgefäß gegeben, das 8 l steriles Medium der nachstehenden Zusammensetzung enthielt, zu dem 4 ml Siliconantischäumungsmittel zugegeben wurden: Bestandteil Gramm/Liter Cerelose Sojamehl Maisquellwasser Blutmehl Maismehl Calciumcarbonat pH, eingestellt auf 6,9-7,0
  • Die Fermentation wurde bei 30ºC ausgeführt unter Rühren bei 500 U/min und Belüftung mit 0,75 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute bis eine deutliche Aktivität erzeugt wurde. Das UK-61 689, UK-58 852 in der Brühe und den Isolierungsströmen wurde visuell unter Verwendung von mit einem Laufmittel, bestehend aus 10:1 Chloroform:Methanol entwickelten Kieselgeldünnschichtchromatografieplatten, bewertet. Die Platten wurden mit Vanillinreagenz (6 g Vanillin in 100 ml Ethanol und 3 % konzentrierte Schwefelsäure) besprüht und für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt. UK-61 689 erscheint als rötlich blauer Fleck. Alternativ dazu wurden die Platten mit B. subtilis beimpftem Agar überschichtet, zu dem 0,4 ml einer 5 %-igen Lösung von 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid zugegeben wurde und bei 37ºC für 16 Stunden inkubiert, um das Antibiotikum als farblose Fläche gegen einen roten Hintergrund sichtbar zu machen.
  • Die gesamte Brühe wurde dann mit Methylisobutylketon extrahiert und das Lösungsmittel unter Erhalt von 14,4 g Rückstand eingeengt. Das Material wurde an einer mit Kieselgel G-Säulen (70-230 mesh, Woelm) gepackten Säule 6 x 100 cm in Essigsäureethylester chromatografiert. Die Säule wurde mit Essigsäureethylester bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 20 ml/min entwickelt. Jeweils 10 ml Fraktionen wurden entnommen.
  • Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatografie auf Analtech Silicagel GF-Platten mit 9 CHCl&sub3;: 1 MeOH entwickelt und durch Besprühen mit Vanillinreagenz und Erhitzen sichtbar gemacht.
  • Die das Antibiotikum UK-61 689 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (Gesamtvolumen etwa 200 ml) und mit ca 2 g Darco G60 für 15 Minuten gerührt. Nach Entfernen des Kohlenstoffs durch Filtrieren wurde das Filtrat (Essigsäureethylester) mit zweibasigem Natriumphosphat, 5 % Puffer auf pH 10,0 mit 1N NaOH eingestellt, gewaschen. Nach dem Abtrennen wurde die Essigsäureethylesterschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum eingedampft. Das nach Eindampfen verbliebene viskose Öl wurde in einem geringen Volumen Heptan gelöst, wonach Kristallisation eintrat. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und unter Vakuum unter Erhalt von 1,4 g Antibiotikum UK-61 689 als Natriumsalz getrocknet;
  • Fp. 167ºC; 13C NMR (CDCl&sub3;) in ppm: 179,16, 107,54, 103,21, 97,80, 97,01, 87,02, 84,65, 84,28, 82,39, 82,10, 80,92, 80,28, 79,69, 77,62, 77,11, 76,60, 74,91, 74,65, 73,15, 70,19, 67,74, 66,94, 59,07, 56,84, 45,49, 39,92, 39,00, 36,55, 33,88, 33,79, 33,63, 33,51, 33,21, 32,51, 32,33, 30,63, 27,64, 26,98, 26,91, 26,16, 23,25, 18,43, 17,53, 17,00, 12,13, 11,05, 10,47.
  • Die Fraktionen mit UK-58 852 wurden vereinigt, mit ca 2 g Darco G60 wie vorstehend behandelt und dann eingeengt. Der Rückstand wurde in Hexan suspendiert und chargenweise mit Silicagel auf einem Filtertrichter behandelt. Das Absorptionsmittel wird mit Wasser gewaschen und dann mit Chloroform und Essigsäureethylester eluiert. Die Essigsäureethylesterfraktion wird eingeengt und der Rückstand erneut an Kieselgel chromatografiert und das Produkt aus Heptan unter Erhalt des Antibiotikums UK-58 852 als ein weißer Feststoff umkristallisiert.
    • Beispiel 2
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wurde nachgearbeitet unter Verwendung von FD-28499 (ATCC 53 664) anstatt von FD- 28454 (ATCC 53 674). HPLC des Methylisobutylketonextrakts der gesamten Brühe lieferte UK-61 689, das im wesentlichen frei (< 1 %) von UK-58 852 war. Sein dünnschichtchromatografisches Verhalten war identisch zu jenem, das in Beispiel 1 für UK- 61 689 berichtet wurde.
  • Die Säureform von UK-61 689 wird durch Rühren einer Chloroformlösung des Natriumsalzes mit einem gleichen Wasservolumen und Absenken des pH-Wertes auf 3,0 mit Phosphorsäure hergestellt. Die Phasen werden dann getrennt und das Chloroform im Vakuum unter Erhalt des Antibiotikums UK-61 689 als freie Säure eingedampft.
    • Beispiel 3
  • FD-28474 (ATCC 53 665) wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 fermentiert mit der Abweichung, daß das Fermentationsmedium kein Maisquellwasser oder Blutmehl enthielt. Die gesamten Brühen aus vier solcher Fermentationen wurden vereinigt und filtriert. Das Filtrat und das Mycel wurden mit Methylisobutylketon (3 x 200 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem Öl (18,5 g) eingeengt. Das Öl wurde dann in Aceton (200 ml) aufgenommen und die Lösung in zwei gleiche Volumina (I und II) aufgeteilt.
  • Der pH-Wert von Volumen I wurde durch Zugabe von wässerigem Natriumhydroxid (20 %) auf 12 eingestellt. Die alkalische Lösung wurde dann filtriert und zu einem Öl unter vermindertem Druck eingeengt. Aceton (10 ml), Heptan (79 ml) und Wasser (39 ml) wurden zu dem Öl zugegeben unter Herstellung dunkelbrauner Kristalle. Wiederaufschlämmen der Kristalle in Heptan ergab hellbraune Kristalle (2 g), die gemäß HPLC-Untersuchung 75 % UK-61 689 und 5 % UK-58 852 umfassen.
  • Volumen II wurde unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt und das Öl in Essigsäureethylester (100 ml) gelöst. Es wurde dann an einer Kieselgelsäule chromatografiert (500 g) unter Verwendung von Essigsäureethylester als Elutionsmittel. Die UK-61 689 angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und zu einem Öl eingeengt. Das Öl wurde in Aceton (10 ml)-Heptan (110 ml) aufgenommen und die erhaltenen Kristalle von UK-61 689 filtriert und getrocknet (1,2 g). UK- 58 852 wurde nicht isoliert.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung der Verbindung UK-61 689 der Formel (I)
umfassend das Fermentieren von Actinomadura roseorufa ATCC 53 665, ATCC 53 674 oder ATCC 53 664 in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis eine wesentliche Menge der Verbindung in der gesamten Brühe angereichert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindung der Formel (I) aus der Fermentationsbrühe zusammen mit dem Mycel gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, umfassend das Züchten von Actinomadura roseorufa ATCC 53 665 oder ATCC 53 674.
5 Verfahren nach Anspruch 2, umfassend das Züchten von Actinomadura roseorufa ATCC 53 664.
6. Actinomadura roseorufa ATCC 53 665 oder ATCC 53 674.
7. Actinomadura roseorufa ATCC 53 664.
8. Actinomadura roseorufa, gekennzeichnet durch die Fähigkeit, gemäß Anspruch 1 definiertes UK-61 689 im wesentlichen frei von UK-58 852 nach Züchten in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen zu erzeugen, wobei UK-58 852 die Formel:
aufweist.
9. Anticoccidiales Mittel, umfassend UK-61 689 in Verbindung mit Mycel, erzeugt in einem Verfahren gemäß Anspruch 1.
10. Neuer Stamm, zugehörig zur Gattung Actinomadura, wobei der Stamm erhalten wird durch Mutieren von Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 und der, sofern in einem wässerigen Nährmedium, umfassend eine verfügbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze unter aeroben Bedingungen fermentiert, gemäß Anspruch 1 definiertes UK-61 689 erzeugt.
11. Neuer Stamm, zugehörig zur Gattung Actinomadura, wobei der Stamm erhalten wird durch Mutieren von Actinomadura roseorufa ATCC 53 665 und der, sofern in einem wässerigen Nährmedium, umfassend eine verfügbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze unter aeroben Bedingungen fermentiert, gemäß Ansprüchen 1 bzw. 8 definiertes UK-61 689, im wesentlichen frei von UK-58 852, UK-61 689 und UK-58 852 erzeugt.
DE88309429T 1987-10-26 1988-10-10 Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von UK-61.689 und Mikroorganismen zur Verwendung darin. Expired - Lifetime DE3884741T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11356387A 1987-10-26 1987-10-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3884741D1 DE3884741D1 (de) 1993-11-11
DE3884741T2 true DE3884741T2 (de) 1994-01-27

Family

ID=22350157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE88309429T Expired - Lifetime DE3884741T2 (de) 1987-10-26 1988-10-10 Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von UK-61.689 und Mikroorganismen zur Verwendung darin.

Country Status (19)

Country Link
US (3) US5602012A (de)
EP (1) EP0314330B1 (de)
JP (1) JPH0674B2 (de)
CN (3) CN1025682C (de)
AT (1) ATE95568T1 (de)
AU (1) AU598160B2 (de)
CA (1) CA1340204C (de)
DE (1) DE3884741T2 (de)
DK (1) DK171880B1 (de)
ES (1) ES2059532T3 (de)
HU (2) HU205168B (de)
IE (1) IE61961B1 (de)
IL (1) IL88088A (de)
NZ (1) NZ226690A (de)
PH (1) PH26344A (de)
PL (1) PL160804B1 (de)
PT (1) PT88836B (de)
YU (2) YU46576B (de)
ZA (1) ZA887926B (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT59932A (en) * 1989-06-01 1992-07-28 Pfizer Microbiological process for producing acidic, polycyclic ether-type antibiotica
US5043353A (en) * 1989-10-10 1991-08-27 Eli Lilly And Company A80789 polyether antibiotic
US5242814A (en) * 1989-10-10 1993-09-07 Eli Lilly And Company Polyether antibiotic
AU653970B2 (en) * 1990-11-16 1994-10-20 Pfizer Inc. Semduramicin premix

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5182215A (en) * 1975-01-16 1976-07-19 Nippon Kayaku Kk Metakurirusan mataha akurirusanno seizoho
FR2408619A1 (fr) * 1977-10-07 1979-06-08 Rhone Poulenc Ind Nouvelle substance anticoccidienne et sa preparation par culture d'un streptomyces
US4278663A (en) * 1980-01-30 1981-07-14 Hoffmann-La Roche Inc. Antibiotic X-14868A, B, C and D
US4407946A (en) * 1981-10-22 1983-10-04 American Cyanamid Company Process for producing antibiotic X-14868A
AU546405B2 (en) * 1982-02-01 1985-08-29 Ppg Industries, Inc. Vanadium oxide coating
GB8417785D0 (en) * 1984-07-12 1984-08-15 Pfizer Ltd Polycyclic ether antibiotic
JPS62186787A (ja) * 1986-02-14 1987-08-15 Ss Pharmaceut Co Ltd 新規な微生物
GB8618844D0 (en) * 1986-08-01 1986-09-10 Pfizer Ltd Polycyclic ether antibiotics

Also Published As

Publication number Publication date
CN1089652A (zh) 1994-07-20
CN1089657A (zh) 1994-07-20
PH26344A (en) 1992-04-29
CN1057562C (zh) 2000-10-18
CN1036387A (zh) 1989-10-18
IE61961B1 (en) 1994-11-30
JPH01144988A (ja) 1989-06-07
ZA887926B (en) 1990-06-27
PT88836B (pt) 1993-01-29
YU198888A (en) 1990-02-28
EP0314330A2 (de) 1989-05-03
IE883216L (en) 1989-04-26
HUT50360A (en) 1990-01-29
IL88088A (en) 1992-08-18
US5602012A (en) 1997-02-11
PL160804B1 (pl) 1993-04-30
CN1025682C (zh) 1994-08-17
DE3884741D1 (de) 1993-11-11
YU194589A (en) 1990-04-30
AU598160B2 (en) 1990-06-14
AU2432488A (en) 1989-04-27
HUT53932A (en) 1990-12-28
US5679563A (en) 1997-10-21
HU895340D0 (en) 1990-01-28
PL275509A1 (en) 1989-05-02
EP0314330A3 (en) 1990-04-18
EP0314330B1 (de) 1993-10-06
YU47024B (sh) 1994-11-15
US5693524A (en) 1997-12-02
DK171880B1 (da) 1997-07-28
IL88088A0 (en) 1989-06-30
CA1340204C (en) 1998-12-15
ATE95568T1 (de) 1993-10-15
HU205168B (en) 1992-03-30
DK591388A (da) 1989-04-27
CN1045997C (zh) 1999-10-27
ES2059532T3 (es) 1994-11-16
YU46576B (sh) 1993-11-16
NZ226690A (en) 1992-01-29
JPH0674B2 (ja) 1994-01-05
HU201805B (en) 1990-12-28
DK591388D0 (da) 1988-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1160972A (en) Polyether compounds
US4148882A (en) Polycyclic ether antibiotics produced by new species of actinomycete
DK159451B (da) Poly(cyclisk ether)-forbindelser, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmaaden samt foderblandinger indeholdende forbindelserne og fremgangsmaade til fremme af vaekst og/eller foderudnyttelse hos svin og kvaeg
DE3880845T2 (de) Durch fermentation hergestellte antibiotika.
DE68905838T2 (de) Saures polycyclisches etherantibiotikum mit anticoccidiose- und wachstumsfoerderungsaktivitaet.
DE3884741T2 (de) Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von UK-61.689 und Mikroorganismen zur Verwendung darin.
DE68904348T2 (de) Polyaether-antibiotika.
DE3882490T2 (de) Saurer polyzyklischer Äther, verwendbar als Anticoccidiosemittel und als wachstumsförderndes Mittel.
DD208990A5 (de) Verfahren zur herstellung eines neuen, polycyclischen aetherantibiotikums
EP0236894B1 (de) Efomycin G, seine Herstellung und seine Verwendung als Leistungsförderer bei Tieren
EP0183214A2 (de) Organisch-chemische Verbindung, mikrobiologische Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
DE3511753A1 (de) Verwendung von efomycinen als wachstumsfoerderer, efomycine und ihre herstellung
DE69026742T2 (de) Saures polycyclisches Etherantibiotikum
US5399675A (en) Acidic polycyclic ether antibiotics and microorganisms useful in the production thereof
DD220336A5 (de) Verfahren zur herstellung von 19-epi-dianemycin
DE69124390T2 (de) Polycyclisches etherantibiotikum mit anticoccidose- und wachstumsförderungsaktivität
GB1566019A (en) Polycyclic ether antibiotic produced by species of dactylosporangium
HU195251B (en) Process for producing new antibioticum a 80190, derivatives and pharmaceutical compositions containing them
DE3500135A1 (de) Organisch-chemische verbindung, mikrobiologische verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition