PT88836B - Processo microbiologico para a producao uk-61,689 e de microorganismos uteis para esse fim - Google Patents

Description

PFIZER INC.

PROCESSO MICROBIOLOGICO PARA A PRODUÇÃO UK-61,689 E DE MICROORGANISMOS UTEIS, PARA ESSE FIM

-2fc.

a partir de mutantes de Actinomadura roseorufa, caracterizados pela capacidade em produzirem, por fermentação, UK-61,689, um antibiótico anticocicliaco de éter policiclico, açiclico, préviamente disponível sómente por hidrólise acida selectiva de UK-UK-58,852; e de Actinomadura roseorufa tendo as caracteristicas identificadoras de ATCC 53666; ATCC 53665; ATCC 53664 e ATCC 53674.

A fermentação é levada a efeito num meio nutriente contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos, sob condiçoes de fermentação aerobica submersa, até se acumular no caldo total uma quantidade substancial do referido composto.

Este invento diz respeito a um processo microbiológico para produção de UK-61689, um antibiótico anticooddial de eter policidico acidico previamente disponível sómente por meios químicos. Mais particularmente diz respeito a produção fermentativa de UK-61689 por cultivo de Actinomadura roseorufa tendo as caracteristicas identificadoras de ATCC 53666; e as mutantes Actinomadura roseorufa tendo as caracteris ticas identificadoras de ATCC 53665, ATCC 53664 e ATCC 53674.

EP-O169O11, publicada em 22 de Janeiro de 1986 descreve a produção de UK-58852, num antibiótico de eter policidico produzido por cultivo de Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697 num meio nutriente aquoso sob condiçoes aerobicas submersas.

cona acidico tem a

UK-61689 e um eter policidico monoglifórmula (I),

(I)

A sua preparaçao pela hidrólise ácida selectiva de UK-58852, num éter diglicona policiclico tendo a fórmula (II) ,

e descrito na aplicaçao da Patente Britânica N^a 8618844, arquji vada em 1 de Agosto de 1986. 0 processo ai descrito compreende a hidrólise ácida de UK-58852, usando preferivelmente 1:1 equi. valentes de ácidos patoluenosulfonico por equivalentes do sal de sódio de UK-58852 em acetonitrilo/água como solvente à temperatura ambiente.

A preparaçao de UK-58852, ele próprio um antibiótico eficaz, especialmente agente anticoccidial, é descrito na aplicaçao EP 169011, publicada em 22 de Janeiro de 1986. Ê produzido por fermentação aerobica submersa em meio nutriente aquoso de Actinomadura roseorufa Huang sp. nov.,

ATCC 39697. Também produzido na fermentação com UK-58852 estão dois componentes menores relacionados, cada num dos quais é antibioticamente efectivo no controlo da coccidiose. Os dois componentes menores designados como CP-70228 e CP-70828, têm fórmula (II), acima, em que R eR^ é metil, respectivamente.

Este invento diz respeito a processos microbiologicos para fabricar UK-61689, um antibiótico valioso de éter policiclico acidico e anticoccidial potente, o qual compreende a cultura de mutantes de Actinomadura roseorufa ATCC 53666 num meio nutriente aquoso sob, as condiçoes aerobicas, preferivelmente submersas. Diz especialmente respeito a mutantes ATCC 53674 e 53665 derivados de Actinomadura roseorufa ATCC 53666, os quais sao caracterizados pela sua capacidade em produzir UK-61689 juntamente com UK-58852 e a um mutante de ATCC 53665, o qual é caracterizado pela sua capacidade em produzir 61689 substancialmente livre de UK-58852, tendo o referido mutante as caracteristicas identificadoras de Actinomadura roseorufa ATCC 53664.

Os microorganismos productores de UK-61689 e UK-58852 foram obtidos por mutaçao de uma nova estirpe de Actinomadura roseorufa, designada FD-27684, (ATCC 53666), isolada de uma amostra de solo recolhida em Yamae Village, Kamamoto, Japan. Usamos N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) como agente mutante. As colonias simples do microorganismo tra tado foram a seguir examinadas para a produção de UK-61689.

produto geral compreende o crescimento de ATCC 53666 num meio nutriente aquoso sob condiçoes aerobicas submersas com agitaçao a uma temperatura de 28°C. A escolha do meio para o estágio de crescimento nao é critica num meio formado por cere

-6lose (10,0 g), amido de milho (5,0 g) , infusão de licor de milho (5,0 g), NZ Amina YTT (5,0 g), (marca registada para digestão enzimática da caseína, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.), e cloreto de cobalto (0,002 g) é suspenso em um litro de água, pH ajustado a 7,0 com hidroxido de sódio e distribuído (800 ml) num frasco Fernbach. Apos esterilização por autoclave, os frascos sao inoculados com uma suspensão de crescimento em ladeira ou micelio vegetativo congelado, e a seguir incubados com agitaçao num vibrador a cerca de 200 rev/min e numa temperatura de 28°C durante 8 dias. Uma parte aliquota de 50 ml é a seguir removida e o micélio homogenizado num almofariz com tecido Teflon seguido por fragmentaçao ultrasónica. Os micélios fragmentados foram a seguir centrifugados, lavados para retirar o meio e a seguir resuspensos em 50 ml de meio fresco num frasco Erlen. meyer de 300 ml, e incubados por agitaçao a 32°C durante duas horas apos o que as células foram de novo centrifugadas, lavadas com água estéril para libertar o meio e suspensas em 50 ml de tampao tris(hidroximetil)aminometano-malato pH 9,0. Aliquotas desta suspensão foram a seguir tratadas com um agente NTG mutagénico a concentrações de 750 mcg/ml durante uma hora num agitador rotativo em banho de água a 250 a 300 rev/min., e uma temperatura de 34°C. Apos tratamento as células foram centrifugadas, lavadas para ficarem sem mutagem com agua esteril e suspensas em frascos do meio de crescimento fresco as quais cresceram por agitaçao a 32°C num agitador de cabine a 200 rev/min. Apos três dias o crescimento das micelias foi homogenizado e sonicado. As aliquotas do sonicado foram serialmente diluidas, colocadas em lamelas de um meio nutriente sólido e as lamelas i incubadas a 28°C. até as unidades formadoras de colónias serem de tamanho suficiente para transferência para planos inclinados. Um meio apropriado para lamelas e planos inclinados e o meio ATCC No. 172 com Amina NZ Tipo A (Humko Sheffield Chemical Co., Inc) diminuído para 1,0 g/1. 0s planos inclinados inoculados foram deixados crescer a 28°C durante 10 a 14 dias após cujo

tempo eles estavam prontos para teste. Isto foi feito por inoculação de frasco Erlenmeyerrde 300 ml contendo 25 ml de um meio apropriado (um tal meio contem cerelose, 45,0 g; farinha de soja, 10,0 g; infusão de licor de milho, 15,0 g; MnSO^.I^O, 0,1 g; MgSO^.7H2O, 0,1 g; cloreto de cobalto, 0,002 g; e carbonato de cálcio, 3,0 g; num litro de agua e o pH do meio é ajustado a 7,0). Após esterilização por autoclave durante 30 minutos a 121°C, os frascos foram inoculados com suspensões individuais de crescimento em ladeira e incubados por agitaçao a 28°C num agitador New Brunswick durante 7 dias. A cultura mutante FD-28454 (ATCC 53674) foi detectada examinando extractos de metilisobutilcetona de caldos da colheita global após lamelas cromatograficas de camada fina desenvolvidas por atomizaçao (silica gel) com reagente vanilina e aquecimento a 100°C durante cinco minutos. 0 sistema de desenvolvimento era composto de 9 partes de cloroformio para uma parte de metanol o qual originou valores Rf de v0,3 para UK-61689 e UK-58852. A relaçao UK-61689/UK-58852 parece variar de algum modo dependente das con dições de fermentação. As características morfológicas e cultu. rais do mutante assim obtido sao substancialmente as descritas aqui para A. roseorufa ATCC 53666. As características de distin çao deste mutante é a sua capacidade em produzir uma mistura de UK-61689 e UK-58852 na qual UK-61689 é o produto predominante. A cultura do mutante e isolamento do antibiótico UK-61689 pode ser efectuada sob condiçoes analogas as empregadas nas fermentações anteriores originando antibióticos poliéter. Ver, por exemplo a Patente U.S. 4361649. A cultura toma preferivelmente lugar em meio nutriente aquoso preferivelmente sob cond’ çoes aeróbicas submersas com agitaçao a uma temperatura de 24 υ até 36°C. Meio nutriente útil para a cultura inclui uma fonte de carbono assimilável tal como açucares, amidos e glicerol; uma fonte de azoto orgânico tal como caseina, digestivo enzimatico de caseina, farinha de soja, farinha de semente de algodao, farinha de amendoim, glúten do trigo, farinha de soja, •h| o

farinha de carne e farinha de peixe. Uma fonte de substâncias de crescimento tal como cereais solúveis, farinha de peixe, farinha de semente de algodao e extracto de fermento bem como sais minerais tal como cloreto de sodio e carbonato de cálcio e traços de elementos tal como ferro, magnésio, cobre, zinco, cobalto e manganésio podem também ser utilizados com resultados vantajosos. Se houver formaçao excessiva de espuma durante a fermentação, podemos adicionar agentes anti-espuma tal como óleos vegetais ou silicones ao meio de fermentação. A aeraçao do meio em vasos para crescimento submerso e preferivelmente mantida com um ritmo de 1/2 a 2 volumes de ar esteril por volu_ me de caldo de fermentação por minuto forçado no caldo através de um atomizador. A agitaçao pode ser mantida por meio de agitadores geralmente familiar aos especialistas na arte de fermentação. A velocidade de agitaçao depende do agitador emprega^ do. Um frasco de agitaçao é normalmente usado de 150 a 300 ciclos por minuto enquanto um fermentador é normalmente usado de 300 a 1700 revoluções por minuto. Condiçoes asepticas devem, claro ser mantidas através da transferencia do organismo e durante o seu crescimento.

A inoculação para preparaçao do antibiótico de acordo com este invento pode ser obtido empregando o crescimento de uma parte obliqua da cultura de garrafas Roux inoculadas com a cultura ou uma suspensão de micélia derretida da cultura. Um meio sólido próprio para o crescimento inicial do organismo em plano inclinados e garrafas Roux e o Meio ATCC No. 172. 0 meio liquido préviamente mencionado no estudo mutacional ó próprio para preparar a micélia vegetativa antes de congelar. 0 crescimento pode ser usado para inocular ou os fras cos de agitaçao ou vasos de inoculação ou os vasos de inoculação podem ser semeados a partir de frascos de agitaçao. 0 cres cimento máximo nos frascos de agitaçao é normalmente atingido em 4 a 8 dias, enquanto a inoculação em vasos submersos de injo culaçao será normalmente no periodo mais favorável em 4 a 5

-9ς.

dias .

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Ο progresso da produção antibiótica durante a fermentação pode ser qualitativamente vigiado por cromatografia de camada fina após visualizaçao por atomizaçao com o reagente vanilina como préviamente descrito ou a lamela desenvolvida pode também ser coberta com infusão de agar do int rior do cerebro semeada com Bacillus subtilis e incubada a 37 v durante 16 horas para visualizar os antibióticos. A cromatogra^ fia de camada fina é também uma ferramenta útil para analizar a composição dos materiais em bruto e purificados extraidos a partir do caldo de fermentação. Um método HPLC empregando uma coluna C-18 microburaco 10 cm x 4,6 mm, uma fase móvel 40/200/ /760 carbonato de amónio 0,01 M/acetonitrilo/metanol, empregan. do um detector de indice de refracçao para quantificar o valor de UK-61689 e UK-58852 co-produzido nos caldos de fermentação.

antibiótico UK-61689 produzido por fermentação dos mutantes aqui descritos acumula-se no micélio e no caldo e pode ser separado e recolhido por extracçao de to_ do o caldo da colheita de fermentação nao filtrado, i.e., o cal do global, com um solvente orgânico tal como clorofórmio, acetato de etil, metilisobutil cetona ou butanol ao pH que existe naturalmente. Alternativamente, para evitar problemas sérios de emulsão o micélio é separado e quer ele quer o caldo clarificado extraído individualmente com um solvente orgânico. Os extractos de solvente sao a seguir concentrados num xarope fino e o UK-61689 puro obtido por cromatografia.

Um método tipico de separaçao e recuperação do antibiótico e como se segue:

caldo global da fermentação do mutante foi extraído com metil lisobutil cetona. A evaporaçao do extracto in vacuo originou

um óleo avermelhado o qual foi dissolvido em acetato de etil e deitado numa coluna de silica gel. A coluna de silica gel foi a seguir eluida com acetato de etil e os eluatos examinados por cromatografia de camada fina. Juntamos as fracçoes contendo UK-61689 e evaporamos a secura. 0 UK-61689 assim obtido pode ser adicionalmente purificado por cristalizaçao a partir de éter isopropilico.

UK-61689 pode ser recolhido a partir da fermentação em associaçao com o micélio por evaporaçao de todo o caldo por métodos conhecidos, incluindo a secagem por atomizaçao, ou por separaçao do micélio do caldo por filtraçao ou centrifugação. Os produtos miceliais assim obtidos compreendem UK-61689 sobre a superfície do micélio e nos seus interstícios tornando o micélio um suporte útil para UK-61689.

Uma colonia simples, designada FD-28474, do mutante FD-28454 acima descrito (ATCC 53674) foi ela própria submetida a mutagenese por NTG de acordo com o processo acima descrito para a preparaçao de FD-28454. Este processo deu origem a mais um mutante (FD-28499) o qual βχι56Ξ33 caracteristicas morfológicas e culturais de Actinomadura roseorufa ATCC 53666 e, claro está, do primeiro mutante produzido. No entanto, este mutante (FD-28499) difere dos mutantes FD-28454 e 28474 no facto de produzir UK-61689 substancialmente livre (i.e., <1%) de UK-58852. 0 mutante FD-28499 é cultivado da mesma maneira que e o mutante primeiro descrito (FD-28454) e o UK-61689 recolhido da fermentação como préviamente descrito.

Este último mutante, identificado na colecçao de cultura de Pfizer Inc. como FD-28499, mutantes FD-28454 e FD-28474, e o microorganismo de partida FD-27684, foram depositados sob os termos do Tratado de Budapeste na Amerji

can Type Culture Colection, Rockville, Maryland, um depositário reconhecido originando permanência dos depósitos e sua pronta acessibilidade ao público se uma patente for garantida sobre esta aplicaçao. Foram-lhes dadas as designações Actinomadura roseorufa ATCC 53664, ATCC 53674, ATCC 53665 e ATCC 53666, respectivamente. Os depósitos estão disponiveis, durante a pendência desta aplicaçao, a uma pessoa determinada pelo Comissário do United States Patent and Trademark Office, para isso autorizado sob o 37 CFR 1,14 e 35 USC 122, e de acordo com as leis de Patente estrangeiras em paises em que as contra, partes desta aplicaçao, ou a sua descendência, sao arquivados. Todas as restrições sobre a disponibilidade para o publico dos microorganismos depositados serão irrevogavelmente removidas apos garantia de uma patente nela.

Investigações taxonomicas de FD-27684, FD-28474 e FD-28499 foram efectuadas por L.H. Huang que forneceu as descrições seguintes.

Cada uma das culturas foi plantada a partir de um plano inclinado no caldo ATCC n^e172 e cresceu du^ rante quatro dias a 28°C num agitador. Foi a seguir centrifugado durante 20 minutos, lavada três vezes com água estéril destilada e plantada num meio vulgarmente usado para identificação de membros de Actinomycetales.

As culturas foram incubadas a 28°C e os resultados estavam prontos a tempos variáveis mas o mais vulgarmente foram tomados a 14 dias. As cores foram descritas na terminologia usual, mas as cores exactas foram determinadas por comparações com bocadinhos de cor do Color Harmony Manual, Quarta edição. 0 método de análise amino-ácido da célula global é o descrito em Becker et al., Appl. Microbiol., 12, 421-423,

1964. Os açucares da célula global foram analizados pelos méto dos descritos em Lechevalier, 7· Lab < Clin. Med., 71, 934-944, 1968; e em Stanek and Roberts,Appl. Microbiol. 28, 226-231, 1974. Para fins de comparaçao, usamos a cultura tipo Actinomadura roseorufa ATCC 39697.

meio de identificação usado para a caracterizaçao das culturas e referências a sua composição sao como se segue:

1) Tryptone - caldo de extracto de Fermento - (meio ISP $1, Difco).

2) Extracto de Fermento - Extracto de Agar de Malte (meio ISP $2, Difco).

3) Agar de farinha de aveia - (meio ISP ^3, Difco).

4) Sais inorgânicos - Agar de Amido - (meio ISP #4, Difco).

5) glicerol - Agar de Asparagina - (meio ISP ^-5, Difco).

6) (meio ISP

Peptona - Agar de Ferro # 6, Difco) de Extracto de Fermento -13-

7) Czapek - Agar de Sacarose - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, meio n^a 1, p,328, 1961.

8) Glicose - Agar Asparagina - Ibid, meio n^a2, p.328.

9) Agar de Bennett - Ibid, meio n^e30, p.331.

10) Agar de Emerson - Ibid, meio n^a28, p.331.

11) Agar nutriente - Ibid, meio n^a14, p.330.

12) Agar Tyrosine de Gordon e Smith - R.E. Gordon and

M.M. Smith, Bacteriol. 69: 147-150, 1955.

13) Agar de Caseina - Ibid.

14) Agar de Malato de Cálcio - S.A. Walkman, Bacteriol.

Rev. 21: 1-29, 1957.

15) Gelatin - R.E. Gordon and J.M. Mihm, J Bacteriol.

73: 15-27, 1957.

16) Amido - Ibid.

17) Caldo de Nitrato Orgânico - Ibid.

18) Caldo de nitrato de Dextrose - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, meio n^e.l, p.328, 1961, com 3g de dextrose substituidas por 30g de sacarose e agar omitido.

19) Agar de Batata cenoura - M.P. Lechevalier, J. Lab. anel Clinicai Med. 71: 934 - 944, 1968, mas usa sómente 30g d batatas, 2,5g de cenouras e 20g de agar.

20) 2% de agar da Água da torneira

21) Agar Mineral η^Ι de Gauze - G.F. Gauze et al., Pro blems in the Classification of Antagtomistic Actinomycetes, English Ed., p.13, 1957.

22) Agar Orgânico =#2 de Gauze - Ibid.

23) Espuma do Leite - Rifco.

24) Utilização da Celulose a) H.L. Jensen, Proc Linn. Soc. N.S.W. 55; 231-248 1930.

b) M. Levine and H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, meio n^e2511, 1930.

25) Utilização de Ácidos Orgânicos - R.E. Gordon et al.

Int. J. Syst. Bacteriol. 24: 54-63, 1974.

26) Produção de Ácidos a partir de Carbohidratos - Ibid

27) Hidrólise de Hipurato e Esculina - Ibid.

28) Decomposição de Adenina, Hipoxantina, Xantina e Ureia - Ibid.

29) Resistência a Lisozima - Ibid.

30) Utilização de Carbohidrato - Meio C-2, H. Nonomura and Y. Ohara, J. Fermente. Technol. 49: 887-894, 1971.

31) Gama de temperatura - Meio ATCC 172 em ATCC Culture Collection Catalogue, 15th ed., p. 608, 1982.

Uma descrição da Cultura FD-27684

Agar de Extracto de Fermento - Extracto de Malte - Bom crescimento, cor de rosa - vermelho a vermelho (6 1/2 ia, 7 ia, 6 ia) elevado, enrugado, com micélio branco aéreo; vermelho inverso (7 ia); nenhuma pigmento solúvel.

Agar de farinha de aveia - Crescimento moderado, creme (2ca), levemente elevado, suave, ou aparecendo como colónias isoladas; micélio aéreo nenhum a raro, branco; creme inverso (2ca); nenhum pigmento solúvel.

Sais Inorgânicos - Agar de Amido - Crescimento pobre a moderado, incolor a creme (2ca), fino, liso; micélio aereo nenhum a raro, branco; reverso o mesmo que na superfície; nenhum pigmen to solúvel.

Glicerol - Agar de Asparagina - Crescimento pobre a moderado, creme (2ca), com pontos cor de rosa a vermelho (6ea, 6 1/2 ga) micélio aereo nenhum a escasso, branco; reverso incolor a creme (2ca), com pontos vermelhos; nenhum pigmento solúvel.

Czapek - Agar de Sacarose - Crescimento pobre a moderado, creme (2ca), com pontos cor de rosa a vermelho (5ea, 6 1/2 ia);

micélio aereo nenhum a escasso, branco; incolor a creme (2ca);

nenhum pigmento solúvel.

Glicose - Agar de Asparagina - Crescimento moderado a bom, cor

de rosa a vermelho (6 1/2 ga, 6 1/2 na), éLevado; liso, granular a enrugado; micélio aéreo branco a cor de rosa pálido (6ea) reverso vermelho (6 1/2 ga, 6 1/2 ia); pigmento solúvel amarelado pálido (3ca).

Agar Tirosina de Gordon e Smith - Crescimento moderado a bom, cor de rosa - laranja (5ea), moderadamente elevado, enrugado; micélio aereo nenhum a escasso, branco; reverso o mesmo que a superficie; pigmento solúvel amarelado (21c).

Agar de Malato de Cálcio - Crescimento escasso, incolor, fino, suave, nenhum micélio aereo; reverso incolor; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Caseina - Crescimento moderado a bom, cor de rosa - la. ranja a laranja (4ia, 5ia), moderadamente elevado, enrugado, nenhum micélio aéreo; reverso amarelado a cor de rosa pálido (3ga, 5ea); com pigmento castanho solúvel (31c).

Agar de Bennett - Bom crescimento, vermelho a vermelho escuro (6 1/2 ne, 6 1/2 ng), elevado, enrugado; micélio aéreo branco a cor de rosa (6ea); reverso vermelho (6 1/2 lc); com pigmento castanho solúvel (3ne).

Agar de Emerson - Crescimento bom a excelente, cor de laranja (51a, 5na), elevado, enrugado, com micélio aéreo branco; rever so cor de laranja (5ic); nenhum pigmento solúvel.

Agar Nutriente - Crescimento moderado, cor de laranja pálido (5ea, 5ga), levemente elevado, suave, ou aparecendo como colónias isoladas, nenhum micélio aéreo; reverso cor de laranja pálido (5ga); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Gelatina - Crescimento moderado a bom, cor de laranja pálido (4ga), moderadamente elevado, suave a enrugado; micelio aéreo escasso, branco; reverso cor de laranja pálido (4ga); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Amido - Crescimento moderado a bom, cor de laranja pálido (5ga), moderadamente elevado, suave a enrugado; micélio aéreo escasso, branco; reverso o mesmo que a superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Batata Cenoura - Crescimento pobre a moderado, creme a cor de rosa pálido (2ca, 4ca), fino a levemente elevado; micelio aereo escasso, branco; reverso creme a cor de rosa pálido (4ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Agua da Torneira - Crescimento pobre, incolor a creme (1 l/2ca), fino, suave; micélio aéreo escasso, branco; reverso o mesmo que a superfície; nenhum pigmento solúvel.

Meio Mineral 1 de Gauze - Crescimento moderado, cor de rosa a vermelho (5ca, 6ea) , com pontos vermelhos (6 lc), levemente elevado, suave; micélio aéreo nenhum a escasso, branco; reverso o mesmo que a superfície; nenhum pigmento solúvel.

Meio Orgânico 2 de Gauze - Crescimento moderado a bom, cor de rosa - cor de laranja (5ga), moderadamente elevado, levemente enrugado; micélio aéreo escasso, branco; reverso o mesmo que a superfície; nenhum pigmento solúvel.

Propriedades Morfologicas - Apos sete semanas de incubaçao, nenhuns esporos foram encontrados em qualquer dos meios usados. No agar de batata cenoura, no entanto, produziram-se inchaços hifais lateralmente ou intercalarmente; e eram simples e suaves. Eles foram globosos, ovais a elípticos, e mediam 1,2 - 2,5 m de diâmetro ou 1,2 - 2,2 x 0,9 - 1,8 m. As estruturas análogas foram também observadas no agar de extracto de fermento - extracto de malte, agar de comida de gato, agar de agua da torneira, agar de gelatina, agar de Czapek-sacarose, e meio mineral 1 de Gauze.

Propriedades Bioquímicas - Melanina nao produzida; ácido sulfidrico nao produzido; gelatina liquefeita; amido nao hidrolizado; nitrato reduzido a nitrito; crescimento ligeiro em caldo de celulose de Jensen mas nenhum crescimento em caldo de celulose de Levine e Schoenlein; nenhuma desintegração em ambos os caldos de celulose; coagulaçao e peptonizaçao no leite; digestão negativa do cálcio malago; digestão positiva da tirosina; dige^ tao positiva da caseina.

Utilização do carbohidrato; glicose, ramnose e sacarose utilizada; arabinose, fructose, inositol, manitol, rafinose, exilose nao utilizados.

Os testes positivos incluem; utilização de acetato, propionato e piruvato; produção de acido a partir de glicose, ramnose, maltose e trehalose.

Os testes seguintes foram negativos; decomposição de adenina, xantina, hipoxantina, e ureia; hidrólise de esculina e hipurato; resistência a lisozima; utilização de benzoato, citrato, dextrina, lactato, malato, mucato, oxalato, fenol e succinato; produção de ácido a partir de arabinose, fructose, inositol, manitol, rafinose, sacarose, xilose, adonitol, celobiose, dulcitol, eritritol, galactose, glicerol, lactose, manose, melezitose, malibiose, alfa-metil-D-glucosida, ribose, salicina, sorbitol, sorbose, e amido.

Análise da célula global - os hidrolisatos da célula global con têm ácido mesodiaminopimélico, galactose, glicose, madurose, ribose e ramnose.

Relações de Temperatura -	37°C	45°C
21°C	28°C
Crescimento	Bom	Crescimento	Nenhum
Moderado	Crescimento	Moderado	Crescimento

A cultura FD-27684 é caracterizada pela incapacidade para produzir melanina; o substracto micélio cor de rosa, cor de rosa-cor de laranja, cor de laranja a vermelho; e a presença de ácido meso-diamino pimélico e madurose como com ponentes da célula global. A despeito do longo periodo de incubação de até sete semanas, a cultura falhou em produzir esporos embora se tivessem produzidos inchaços linfais nalguns meios. É atribuível ao genus Actinomadura.

21A cultura FD-27684 era análoga a Actinomadura roseorufa Huang ATCC 39697 (ver Aplicaçao da Patente Europeia 169001) na maioria das características culturais e em quase todas as propriedades bioquímicas. No agar gelatina e no agar amido, as colonias de FD-27684 eram cor de laranja pálido em vez de creme pálido. Em agar tirosina e agar Emerson elas apresentaram alguma cor de laranja em vez de castanho. A cultura FD-27684, nao como a A. roseorufa, coagulou o leite. Estas diferenças eram menores e por isso a cultura FD-27684 é considerada como uma nova estirpe de A. roseorufa.

Comparada com a cultura paterna FD27684, o mutante FD-28474 produziu menos micélio aereo no agar do extracto do fermento - extracto do malte, agar de Bennett, meio orgânico 2 de Gauze,.agar de gelatina e agar de amido.

As colonias do mutante eram cremes em vez de cor de laranja no agar de Emerson e eram cor de rosa pálido em vez de creme a cor de rosa pálido no agar de batata cenoura. 0 mutante, nao como o seu paterno, produziu ácido sulfidrico. Todas as outras características culturais e propriedades bioquimicas eram idên ticas. Assim, o mutante FD-28474 e considerado como uma nova estirpe de Actinomadura roseorufa.

Comparada com a cultura FD-28474 a pajc tir da qual derivou, o mutante FD-28499 partilhou quase todas as características culturais e todas as propriedades bioquimicas. 0 mutante diferiu da cultura FD-28474 sómente nas colónias castanho escuro em vez de vermelho escuro sobre o agar de extracto de fermento-extracto de malte na presença de alguns pontos cor de rosa no meio orgânico 2 de Gauze. Assim, o mutante FD-28499 é considerado como uma nova estirpe de Actinomadura roseorufa.

FD-28454 taxonomico. No entanto, uma vez pe de Actinomadura roseorufa, e pe de Actinomadura roseorufa, ó Actinomadura roseorufa.

nao foi submetida a estudo que era derivado de uma estirpor mutaçao produziu uma estix considerado ser uma estirpe de antibiótico UK-61689 exibe acçao inibidora contra o crescimento de um numero de microorganismos de Gram positivo. Na Tabela I, a seguir, resumem-se os resultados dos testes in vitro. Para este teste cada organismo é inoculado numa serie de tubos de ensaio contendo meio nutriente e con centraçoes variáveis de Antibiótico UK-61689 para determinar a concentração mínima do composto em g/ml a qual inibe o crescimento do organismo durante um periodo de 24 horas (MIC).

Tabela I

Actividade Antibacteriana

Organismo	Estirpe Ne.	MIC jug/ml
Clostridium perfringens	10A006	50
	10A009	12,5
Actinomyces pyogenes	14D002	50
	14D008	50
	14D011	50
Treponema Hyodysenteriae	94A001	3,12
	94A002	3,12
	94A007	1,56
	94A008	1,56

Os dados de efieacia para UK-61689 e seus sais contra infecções coccidiais em galinhas foram obtidos na maneia seguinte. Grupos de 3-5 com dez dias de idade, de pintainhos de frangos leghorn brancos sem patogénio foram alimentados com uma dieta esmagada contendo UK-61689 ou seu sal de sódio e/ou potássio nele úniformemente disperso. Após passar 24 horas com esta raçao, cada pintainho foi inoculado per os com oocistos das espécies particulares Eimeria a serem testados. Outros grupos de 3-5 pintainhos com dez dias de ida. de foram alimentados com uma dieta esmagada análoga sem Antibiótico UK-61689 ou seus sais. Eles foram também infectados após 24 horas e serviram como controlos infectados. Ainda outro grupo de 3-5 pintainhos com dez dias de idade foram alimentados com a mesma dieta esmagada sem antibiótico UK-61689 e nao foram infectados com coccidia. Estes serviram como controlos normais. Os resultados do tratamento foram avaliados após cinco dias no caso de E, acervulina, e seis dias para to. dos os outros desafios.

critério usado para medir a actividade anticoccidial consiste de lesões marcadas ou pontuadas de 0 a 4 para E. tenella a partir de J.E. Lynch, A new Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity, Am. J. vet. Res« , 22, 324-326, 1961; e 0 a 3 para as outras espécies baseadas na modificação do sistema de pontuaçao inventado por J. Johnson and W.H. Reid, Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in chicks, Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970. Foi estabelecido uma relaçao constante por divisão da pontuaçao da lesão de cada grupo tratado pela pontuaçao da lesão do control infectado.

UK-61689 e os seus sais catiónicos exibem excelente actividade contra infecçoes coccidiais na criação. Quando incorporados na dieta das galinhas a niveis de 15 a 120 ppm, estes compostos sao eficazes no controlo de infecçoes devidas a Eimeria tenella, E. maxima, E. acervulina, E. brunetti e E, necatrix.

Para uso no tratamento de coccidiosis nos galináceos, o composto deste invento é administrado oralmente num suporte apropriado. Convenientemente, a medicaçao é simplesmente realizada na água de beber ou na raçao dos galináceos, de tal modo que uma dosagem terapêutica do agente é ingerida com a água diária ou raçao dos galináceos. 0 agente pode ser directamente medido em água de beber, preferível-25mente na forma de um‘concentrado liquido solúvel em água (tal como solução aquosa de um sal solúvel em água) ou adicionado directamente ã raçao, tal qual, ou na forma de um premix ou concentrado. Um premix ou concentrado de agente terapêutico num suporte é vulgarmente empregado para a inclusão do agente na raçao. Suportes apropriados sao líquidos ou sólidos, co mo desejado, tal como agua, e varias farinhas; por exemplo, farinha de óleo de soja, farinha de óleo de linhaça, farinha de espiga de milho, e misturas minerais tal como sao vulgarmente empregadas nas rações para os galináceos. Um suporte particularmente eficaz é a própria raçao dos frangos; isto é, uma pequena porção da raçao. Alem disso, o micélio pode ser usado como suporte. 0 suporte facilita a distribuição uniforme dos materiais activos na raçao acabada com a qual o premix e misturado. Isto é importante porque sómente sao necessárias pequenas porçoes dos presentes potentes agentes. Ê importante que os compostos sejam vigorosamente misturados no premix e, subsequentemente, a raçao. A este respeito, pode ser disperso ou dissolvido num veiculo oleoso apropriado tal como óleo de soja, óleo de milho, óleo de semente de algodao, e analogos, ou num solvente orgânico volátil e a seguir misturado com o suporte. Sera apreciado que as proporçoes de material activo no concentrado sao capazes de uma ampla variaçao uma vez que a quantidade de agente na raçao acabada pode ser ajustada pór mistura da proporção apropriada de premix com a raçao para obter o nivel desejado de agente terapêutico.

Concentrados de alta potência podem ser misturados pelo fabricante das rações com suporte proteináceo tal como farinha de óleo de soja e outras farinhas, como acima descrito, para produzir suplementos concentrados os quais sao proprios para alimentaçao directa aos galináceos. Em tais casos, permite-se que a criaçao consuma a dieta usual. Alternativamente, tais suplementos concentrados podem ser adicio-26-

nados diresctamente â raçao dos galináceos para produzir uma raçao acabada, nutricionalmente balanceada, contendo um nivel terapêuticamente efectivo do composto deste invento. As misturas sao vigorosamente combinadas pelos processos padrao, tal como num agitador de casca dupla, para assegurar homogeneidade.

Sera, claro esta, obvio para os especialistas da arte que os niveis usados do composto aqui descrito variam sob circunstâncias diferentes. A medicaçao continua de baixo nivel, durante o periodo de crescimento, isto é, durante as primeiras 6 a 12 semanas para os frangos, é uma medida profiláctica efectiva. No tratamento de infecçoes estabecidas, podem ser necessários niveis superiores para ultrapassar a infecçao. 0 nivel usado na raçao estará geralmente na gama de 15 a 120 ppm. Quando administrado na agua de beber, o nivel que será fornecido paraca mesma dose diária de medicaçao, i.e., 15 a 120 ppm, factorizado pela relaçao ponderai do consumo diário medio para o consumo diário médio de agua.

presente invento é ilustrado pelos exemplos seguintes. No entanto, devera compreender-se que o invento nao está limitado aos detalhes específicos destes exem pios.

EXEMPLO 1

A - Preparaçao de Inoculum

Preparamos um meio aquoso estéril tendo a composição seguinte.

Ingrediente Gramas/litro

Cerelose	10,0
Amido de milho	5,0
Licor de infusão de milho	5,0
NZ Amina YTT*	5,0
Cloreto de cobalto	0,002

* (Marca registada para a digestão enzimática da caseina, Humko Sheffield Chemical Co. Inc.)

Apos o pH ter sido ajustado a 7,0, o meio foi distribuido (800 ml) em frascos Fernbach de 2800 ml, tamponados com algodao/tapados com papel e esterilizados por autoclave durante 60 minutos a 121°C (15 p.s.i.). Após arrefecimento, o meio foi inoculado com uma suspensão celular vegetativa a partir de um plano inclinado de FD-28454 (ATCC 53674.) Os frascos foram agitados a 28°C num agitador rotativo tendo um deslocamento de 1 1/2 a 2 1/2 polegadas e 150 a 200 ciclos

por minuto durante 6 dias.

b - Fermentação e Isolamento de UK-61689

Um frasco Fernbach contendo 800 ml da cultura de crescimento foi usado para inocular um vaso de 14 litros de fermentação contendo 8 litros de meio esteril da composição seguinte ao qual juntamos 4 ml de agente silicone anti-espuma:

Ingrediente Gramas/litro

Cerelose 45,0

Farinha de soja 10,0

Licor de Infusão de milho 15,0

Farinha de sangue 5,0

Farinha de milho 5,0

MnSO^. f^O 0,1. „

MgS0₄.7H₂0 0,1

COC1₂.6H₂O 0,002

Carbonato de cálcio 3,0 pH ajustado a 6,9 - 7,0

A fermentação foi efectuada a 30°C com agitaçao a 500 revoluções por minuto e aeraçao a 0,75 volumes de ar por volume de caldo por minuto e até se produzir activi-29-

dade substancial. 0 UK-61689/UK-58852 no caldo e fluxos de recuperação foi visualizado usando lamelas de crmatografia de camada fina de silica gel desenvolvidas com um sistema formado por 9:1 cloroformio: metanol. As lamelas foram atomizadas com reagentevanilina (6 g de vanilina em 100 ml de etanol e 3% de H^SO^ concentrado) e aquecidas a 100°C durante 5 minutos. UK-61689 aparece como uma mancha vermelho-azulada. Alternativamente, a lamela foi sobreposta com agar semeado com B. subtilis à qual juntamos 0,4 ml de uma solução a 5% de cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio, e incubamos a 37°C, durante 16 horas para visualizar o antibiótico como uma area incolor contra um fundo vermelho.

Todo o caldo é a seguir extraido com metilisobutil cetona e o solvente concentrado para obtermos

14,4 g de residuo. Este material foi cromatografado numa coluna de enchimento de 6 x 100 cm com silica gel G de grau de coluna (70-230 mesh, woelm) em acetato de etil. A coluna foi desenvolvida com acetato de etil a um caudal de /V20 ml/min.. Tomamos fracçoes de 10 ml cada.

As fracçoes foram examinadas por cromatografia de camada fina sobre lamelas de silica gel GF Analtech desenvolvidas com 9 CHCl^il MeoH e visualizadas por atonri zaçao com reagente vanilina e aquecimento

Juntamos as fracçoes contendo o antibiótico UK-61689 (volume total aproximadamente 200 ml) e agitamos com t-Jl g de Darco G60 durante 15 minutos. Após remoção do carbono por filtraçao, o filtrado (acetato de etil) foi la. vado com fosfato de sódio dibásico, 5% de tampao ajustado a pH 10,0 com NaOH IN. Após separaçao, a camada de acetato de \ etil foi seca sobre sulfato de sodio anidro e a seguir evapo-30-

rada sob vacuo. 0 oleo viscoso que resta apos evaporaçao foi dissolvido num pequeno volume de heptano após o que ocorreu a cristalizaçao. Os cristais foram recolhidos por filtraçao e secos sob vácuo originando 1,4 g de antibiótico UK-61689 como o sal de sódio; m.p. 167°C; C^NMR (CDCl^) em ppm:

179.16, 107.54, 103.21, 97.80, 97.01, 87.02, 84.65, 84.28,

82.39,	82.10,	80.92,	80.28,	79.96,	77.62,	77.11,	76.60,	74.91,
74.65,	73.15,	70.19,	67.74,	66.94,	59.07,	56.84,	45.49,	39.92,
39.00,	36.55,	33.88,	33.79,	33.63,	33.51,	33.21,	32.51,	32.33,
30.63,	27.64,	26.98,	26.91,	26.16,	23.25,	18.43,	17.53,	17.00,
12.13,	11.05,	10.47.

As fracções contendo UK-58852 juntaram-se, trataram-se com /v?2g de Darco G60 como acima, e a seguir concentramos. 0 residuo e suspenso em hexano e tratado descontinuamente com silica gel num funil filtro. 0 absorvente e lavado com hexano, e a seguir eluido com clorofórmio e acetato de etil. A fracçao acetato de etil é concentrada, o residuo cromatografado sobre silica e o produto cristalizado a partir de heptano para obtermos o antibiótico UK-58852, como um solido branco.

EXEMPLO 2

Seguimos o procedimento do Exemplo 1 mas usando FD-28499 (ATCC 53664) em lugar de FD-28454 (ATCC 53674). HPLC do extracto de metil isobutil cetona do caldo glo. bal originou UK-61689 substancialmente livre (<1%) de UK-58852. 0 seu comportamento TLC foi idêntico ao assinalado no Exemplo

para UK-61689.

A forma acida de UK-61689 ó preparada por agitaçao de uma solução de clorofórmio do sal de sódio com um volume igual de água e baixando o pH a 3,0 com ácido fosfórico. As fases foram a seguir separadas e o clorofórmio evaporado sob vácuo para obtermos o Antibiótico UK-61689 como o áci do livre.

EXEMPLO 3

FD-28474 (ATCC 53665) foi fermentado de acordo com o processo do Exemplo 1 excepto que o meio de fermentação nao continha infusão de licor de milho ou farinha de sangue. Juntamos o conjunto dos caldos de quatro de tais fermentações e filtramos. 0 filtrado e o micólio foram cada um extraido com metil isobutil cetona (3 x 200 ml). Juntamos os extractos e concentramos sob pressão reduzida num óleo (18,5 g). 0 oleo foi processado em acetona (200 ml) e a solução dividida em dois volumes iguais (I e II).

pH do volume I foi ajustado a 12 por adiçao de hidroxido de sodio aquoso (20%). A solução alcalina foi a seguir filtrada e concentrada num óleo sob pressão reduzida. Juntamos acetona (10 ml), heptano (79 ml) e agua (39 ml) ao óleo para obtermos cristais castanho escuros. 0 repalpamento dos cristais em heptano originou cristais castanho claro (2g) compreendendo 75% de UK-61689 e 5% de UK-58852 por ensaiò HPLC.

-32\\

Ο volume 2 foi concentrado num óleo sob pressão reduzida e o óleo dissolvido em acetato de etil (100 ml). Foi a seguir submetido a cromatografia de coluna sobre silica gel (500 g) usando acetato de etil como agente eluente. Juntamos as fracções ricas em UK-61689 e concentramos num oleo foi processado em acetona (10 ml)-heptano (110 ml) e os cristais resultantes de UK-61689 filtrados e secos (l,2g). 0 UK-58852 nao foi recuperado.

Claims (8)

1. l^â.- Processo para a produção do composto UK-61,689 tendo a fórmula (I) caracterizado por compreender a fermentação de Actinomadura roseorufa tendo as caracteristicas identificadoras de ATCC 53665; ATCC 53674 ou de ATCC 53664 num meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos, sob condiçoes de fermentação aerobica submersa até se acumular numa quantidade substancial do referido composto no caldo total.
2. 2-.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se recuperar o referido compoq to.
3. 3^a.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o composto de formula (I) ser recuperado, a partir do caldo de fermentação, em associaçao com micélio.
4. 4^a.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender a cultura de Actinomadura roseorufa ATCC 53665 ou ATCC 53674.
5. 5^a.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender a cultura de Actinomadura roseorufa ATCC 53664.
6. 6^a.- Processo para a produção de uma composição anticoccidica caracterizado por compreender a recuperação de UK-61689 em associaçao com micélio produzido num processo de acordo com a reivindicação 1.
7. 7^a.- Processo para a produção de uma nova estirpe pertencente ao genero Actinomadura, caracteri

   -35zado por a referida estirpe ser obtida por mutaçao de Actinomadura roseorufa ATCC 53666, cuja estirpe quando fermentada num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte disponível de carbono, azoto, e sais inorgânicos sob condiçoes aerobicas, produz UK-61689.
8. 8^â.- Processo para a produção de uma nova estirpe pertencente ao género Actinomadura caracterizado por a referida estirpe ser obtida por mutaçao de Actinomadura roseorufa ATCC 53665, cuja estirpe quando fermentada num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte disponível de carbono, azoto e sais inorgânicos sob condiçoes aerobicas, produz UK-61689, substancialmente livre de UK-58852.