JPS6131097A - 新規な高感度酵素的測定法 - Google Patents
新規な高感度酵素的測定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、被検液中の３β−ヒドロキシステロイドまた
は３−ケトステロイドの定葉におｈて、３β−ヒドロキ
システロイド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシ
ステロイド・オキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ （Ｐ） 、還元型ＮＡＤ
（Ｐ） 、酸素（０２）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ，
）の成分の関与する下記サイクリング反応ＣＩ） を形成せしめるように被検液中の成分とサイクリング反
応ＣＩ）を形成する成分とを反応せしめ、次込で反応に
よって生ずる検出できる賀化の偕を電縫してなるサイク
リング反応による１ｉｌＴ規な尚感吸酔素的測定法に関
する。
は３−ケトステロイドの定葉におｈて、３β−ヒドロキ
システロイド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシ
ステロイド・オキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ （Ｐ） 、還元型ＮＡＤ
（Ｐ） 、酸素（０２）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ，
）の成分の関与する下記サイクリング反応ＣＩ） を形成せしめるように被検液中の成分とサイクリング反
応ＣＩ）を形成する成分とを反応せしめ、次込で反応に
よって生ずる検出できる賀化の偕を電縫してなるサイク
リング反応による１ｉｌＴ規な尚感吸酔素的測定法に関
する。
従来より酵素的サイクリングとしては、ＮＡＤサイクリ
ング、ＮＡＤＰサイクリング、ＣｏＡサイクリングが知
られている。ＮＡＤサイクリングとしては、例えばエタ
ノールｔ−基質とし、ＮＡＤと共にアルコールデヒドロ
ゲナーゼを作用せしめ、還元型ＮＡＤを生成し、またこ
の還元型ＮＡＤ＃′ｉオキサル酢酸を基質としてリンゴ
酸デヒドロゲナーゼｔｈ用せしめてＮＡＤとなすことに
よりＮＡＤ−還元型ＮＡＤの市イクリング反応を形成せ
しめる方法がある〔日本生化学合軸、「生化学実験講座
」５巻、酵素研究法（上）第１２１−１３５頁、株式会
社東京化学同人、１９７５年８月発行、森昭胤編集、１
神経伝達物質測定法マニュアルＪ第１６５〜１７２頁、
医歯薬出版株式会社、１９７９年１）月発行〕。また上
記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代り九還元型ＮＡＤオ
キシダーゼを用いて酸素および還元型ＮＡＤを消費して
水分子およびＮＡＤを生成するサイクリングも知られて
いる〔理化学研究新編、［ライフサイエンスの現状と将
来」第３０〜３２頁、株式会社創造ライフサイエンス研
究会、１９８１年３月発行〕。さらに基質としてヒドロ
キシステロイドを用いてヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼを作用せしめ、ＮＡＤを還元型ＮＡＤとなし、
次いでこの還元型ＮＡＤけテトラゾリウム塩とジアホラ
ーゼなどの転位酵素の作用でホルマザンを形成しつつＮ
ＡＤとなすサイクリング〔特開昭５６−１４４０９６号
〕や、グルタチオンとデヒドロアスコルビン酸にグルタ
チオンデヒドロアスコルビン酸オキシドレダクターゼを
作用せしめてデヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸
となし、このアスコルビン酸はアスコルビン酸オキシダ
ーゼを用いて酸素を消費して水分子およびデヒドロアス
コルビン酸を生成するデヒドロアスコルビン酸−アスコ
ルビン酸のサイクリング反応も知られている〔特開昭５
６−１５１４９８号〕。
ング、ＮＡＤＰサイクリング、ＣｏＡサイクリングが知
られている。ＮＡＤサイクリングとしては、例えばエタ
ノールｔ−基質とし、ＮＡＤと共にアルコールデヒドロ
ゲナーゼを作用せしめ、還元型ＮＡＤを生成し、またこ
の還元型ＮＡＤ＃′ｉオキサル酢酸を基質としてリンゴ
酸デヒドロゲナーゼｔｈ用せしめてＮＡＤとなすことに
よりＮＡＤ−還元型ＮＡＤの市イクリング反応を形成せ
しめる方法がある〔日本生化学合軸、「生化学実験講座
」５巻、酵素研究法（上）第１２１−１３５頁、株式会
社東京化学同人、１９７５年８月発行、森昭胤編集、１
神経伝達物質測定法マニュアルＪ第１６５〜１７２頁、
医歯薬出版株式会社、１９７９年１）月発行〕。また上
記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代り九還元型ＮＡＤオ
キシダーゼを用いて酸素および還元型ＮＡＤを消費して
水分子およびＮＡＤを生成するサイクリングも知られて
いる〔理化学研究新編、［ライフサイエンスの現状と将
来」第３０〜３２頁、株式会社創造ライフサイエンス研
究会、１９８１年３月発行〕。さらに基質としてヒドロ
キシステロイドを用いてヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼを作用せしめ、ＮＡＤを還元型ＮＡＤとなし、
次いでこの還元型ＮＡＤけテトラゾリウム塩とジアホラ
ーゼなどの転位酵素の作用でホルマザンを形成しつつＮ
ＡＤとなすサイクリング〔特開昭５６−１４４０９６号
〕や、グルタチオンとデヒドロアスコルビン酸にグルタ
チオンデヒドロアスコルビン酸オキシドレダクターゼを
作用せしめてデヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸
となし、このアスコルビン酸はアスコルビン酸オキシダ
ーゼを用いて酸素を消費して水分子およびデヒドロアス
コルビン酸を生成するデヒドロアスコルビン酸−アスコ
ルビン酸のサイクリング反応も知られている〔特開昭５
６−１５１４９８号〕。
その他酸素を消費して過酸化水素を生成する還元型ＮＡ
Ｄオギシダーゼを用いるＮＡＤサイクリングも知られて
いる〔特開昭５６−７８５９９号〕。
Ｄオギシダーゼを用いるＮＡＤサイクリングも知られて
いる〔特開昭５６−７８５９９号〕。
このよう圧積々のサイクリング反応系が報告されている
が、最もよく汎用される過酸化水素を生成する還元型Ｎ
ＡＤオキシダーゼは、酵素自体の梢梨が困難であるよめ
、未だによ＜ＮＩ製されておらず、従って、測定ＶＣ便
用するＶＣＦｉ精度が悪く、ま走、ＮＡＤサイクリング
法では、過剰のＮＡＤをアルカリ性で熱処理して消去す
る工程が必須であり、その上、このときに用いたアルカ
リを中和せねばならない、と１ｎＩ）はん雑な操作が必
要であった。
が、最もよく汎用される過酸化水素を生成する還元型Ｎ
ＡＤオキシダーゼは、酵素自体の梢梨が困難であるよめ
、未だによ＜ＮＩ製されておらず、従って、測定ＶＣ便
用するＶＣＦｉ精度が悪く、ま走、ＮＡＤサイクリング
法では、過剰のＮＡＤをアルカリ性で熱処理して消去す
る工程が必須であり、その上、このときに用いたアルカ
リを中和せねばならない、と１ｎＩ）はん雑な操作が必
要であった。
ステロイドホルモンは、生体試料中の績度が低く、一般
的分光掌側だ法では直捨定曾することけ困難であ：）た
。この分野において、本発明に最もよく１丙連あるヒド
ロキシステロイドの測友法に関する先行技術として、前
鄭府開昭５６−１４４０９６号発明があるが、それけ３
−ヒドロキシステロイド゛デヒドロゲナーゼとＮＡＤ？
ｒ用い、生ずる還元型ＮＡＤを３４０ｎｍで比色に憤す
ゐ方法であり、測定感度が低いため、コレステロール’
ｋｌ’！いて、−その他の黴電の血清中のステロイドホ
ルモンなどの測定ｔ−ｔば一１ｋであった。
的分光掌側だ法では直捨定曾することけ困難であ：）た
。この分野において、本発明に最もよく１丙連あるヒド
ロキシステロイドの測友法に関する先行技術として、前
鄭府開昭５６−１４４０９６号発明があるが、それけ３
−ヒドロキシステロイド゛デヒドロゲナーゼとＮＡＤ？
ｒ用い、生ずる還元型ＮＡＤを３４０ｎｍで比色に憤す
ゐ方法であり、測定感度が低いため、コレステロール’
ｋｌ’！いて、−その他の黴電の血清中のステロイドホ
ルモンなどの測定ｔ−ｔば一１ｋであった。
本発明名らは、ヒドロキシステロイドおよびケトステロ
イドのｄｌ１）定に関して、サイクリング反応につ（へ
て柚々研究した結果、３β−ヒドロキシステロイドを基
質として０２を消費してＨ２Ｏ，および３−り“トステ
ロイドを生成する３β−ヒト１）キンスブロイドオ今シ
ダーゼを、りｊい、それに加ワエて、３−ケトステロイ
ドｔｌ−基質とし蔵元ちりＮＡＤ［Ｆ］を重置してＮＡ
Ｄ （Ｐ）および３β−ヒドロキシステロイトン：生成
する３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ？用
いる：；ｐ−ヒドロモジスフ １Ｊイド−３−ケトステ
ロイドのかしいヅイクリング反１３を見出し７ヒ。これ
らに用いられる各試薬ｉＬ安６１ｂかつ純度よく供し得
る上に、版化作用のあるｌｉ、Ｏ，と還元１用のある還
元型ＮＡＤが共存するｅこもかかわらず、良好にサイク
リング反応す２コＸ＋＋現なサイクリング反応である。
イドのｄｌ１）定に関して、サイクリング反応につ（へ
て柚々研究した結果、３β−ヒドロキシステロイドを基
質として０２を消費してＨ２Ｏ，および３−り“トステ
ロイドを生成する３β−ヒト１）キンスブロイドオ今シ
ダーゼを、りｊい、それに加ワエて、３−ケトステロイ
ドｔｌ−基質とし蔵元ちりＮＡＤ［Ｆ］を重置してＮＡ
Ｄ （Ｐ）および３β−ヒドロキシステロイトン：生成
する３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ？用
いる：；ｐ−ヒドロモジスフ １Ｊイド−３−ケトステ
ロイドのかしいヅイクリング反１３を見出し７ヒ。これ
らに用いられる各試薬ｉＬ安６１ｂかつ純度よく供し得
る上に、版化作用のあるｌｉ、Ｏ，と還元１用のある還
元型ＮＡＤが共存するｅこもかかわらず、良好にサイク
リング反応す２コＸ＋＋現なサイクリング反応である。
１）ζ仁リプイクリング反応ｒＣおいて、灰地に関Ｊシ
する３ ｌＴ−ヒドロ−？システロイド、３−ケトステ
ロイド、３／’−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＩ
）ＣＰ）、還元型ＮＡＩ）（Ｐ） 、Ｏ□およびＨ，Ｏ
，のうち、３を一ヒドロキシステロイドまたけ３−ケト
ステロイドを含有する被検液を用いて、被検液の１成分
以外の必要とする成分を用いて反応せしめることにより
、１分間当りｌＯプサイル以上のサイクリング反応を行
うこ七ができることを見出した。そして反応忙よって生
ずる検出できる変化の量全定前することＫより、被検液
中の成分を簡便かつ高感度にて正確に測定できることを
見出し本発明を完成した。
する３ ｌＴ−ヒドロ−？システロイド、３−ケトステ
ロイド、３／’−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＮＡＩ
）ＣＰ）、還元型ＮＡＩ）（Ｐ） 、Ｏ□およびＨ，Ｏ
，のうち、３を一ヒドロキシステロイドまたけ３−ケト
ステロイドを含有する被検液を用いて、被検液の１成分
以外の必要とする成分を用いて反応せしめることにより
、１分間当りｌＯプサイル以上のサイクリング反応を行
うこ七ができることを見出した。そして反応忙よって生
ずる検出できる変化の量全定前することＫより、被検液
中の成分を簡便かつ高感度にて正確に測定できることを
見出し本発明を完成した。
本発明は上記の知見に基すて完成されたものであって、
４１倹液中の３β−ヒドロキシステロイドまｆＣは３−
ケトステロイドの定電において、３β−ヒドロキシステ
ロ・イド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼ、３βヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）、還元型ＮＡＩ）（Ｐ）、Ｏ
□およびＨ，０，のの成分の関与する下記サイクリング
反応〔■〕を形成せしめるように被検液中の成分とサイ
クリング反応［Ｉ）を形成する成分とを反応せしめ、次
いで反応によって生ずる検出できる変化の量をＷ険する
ことを特徴とする新規な晶感度酵素的測足法である。
４１倹液中の３β−ヒドロキシステロイドまｆＣは３−
ケトステロイドの定電において、３β−ヒドロキシステ
ロ・イド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼ、３βヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）、還元型ＮＡＩ）（Ｐ）、Ｏ
□およびＨ，０，のの成分の関与する下記サイクリング
反応〔■〕を形成せしめるように被検液中の成分とサイ
クリング反応［Ｉ）を形成する成分とを反応せしめ、次
いで反応によって生ずる検出できる変化の量をＷ険する
ことを特徴とする新規な晶感度酵素的測足法である。
本発明の目的は、被検液中の３β−ヒドロキシステロイ
ドまたは３−ケトステロイドの？Ｓ感度酵素的測定法を
提供するにある。
ドまたは３−ケトステロイドの？Ｓ感度酵素的測定法を
提供するにある。
本発明の別の目的は、従来行われて−た補酵素サイクリ
ングを利用した被検液中の３β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイド測定におけるはん雑な前処理
操作をなくした、簡便かつ高感度の酵素的測定法を提供
するにある。
ングを利用した被検液中の３β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイド測定におけるはん雑な前処理
操作をなくした、簡便かつ高感度の酵素的測定法を提供
するにある。
本発明の被検液としては、３β−ヒドロキシステロイド
または３−ケトステロイドを含有するかまたはそのｌ成
分を遊離、生成する系が挙げられる。肴に被検液中の１
成分を遊離、生成する糸としては、種々のステロイドホ
ルモン、即ちｍ性動物のアンドロゲン、雌性動物のエス
トロゲンおよヒケスターゲン、両性を通じてのコルチコ
イドに大別される種々のステロイドホルモンの代謝系、
生合成系が挙られる。
または３−ケトステロイドを含有するかまたはそのｌ成
分を遊離、生成する系が挙げられる。肴に被検液中の１
成分を遊離、生成する糸としては、種々のステロイドホ
ルモン、即ちｍ性動物のアンドロゲン、雌性動物のエス
トロゲンおよヒケスターゲン、両性を通じてのコルチコ
イドに大別される種々のステロイドホルモンの代謝系、
生合成系が挙られる。
これらの系に関与する種々の酵Ｘ活性の測定やあるいは
これらの系において生成する３β−ヒドロキシステロイ
ドまたけ３−ケトステロイドが本発明の方法によって定
量される。
これらの系において生成する３β−ヒドロキシステロイ
ドまたけ３−ケトステロイドが本発明の方法によって定
量される。
本発明のｄｌ１）定法によって定量され得る３β−ヒド
ロキシステロイドおよび３−ケトステロイドの例を挙け
れば以下に示す通りである。
ロキシステロイドおよび３−ケトステロイドの例を挙け
れば以下に示す通りである。
３β−ヒドロキシステロイド：
（１） アンドロゲン；
プレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン、
デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステン−３β
、アンドａスタン−３β、１７β−ジオール、Δ−アン
ドａステロンー３β、１７α−ジオール、アントロスタ
ン−３β、１）β−ジオーＡ−１７−オン。
デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステン−３β
、アンドａスタン−３β、１７β−ジオール、Δ−アン
ドａステロンー３β、１７α−ジオール、アントロスタ
ン−３β、１）β−ジオーＡ−１７−オン。
（２） エストロゲン；
エストラジオ−ル、エストロン、エストリオール、エキ
リン、エキレニン、エチニルエストラジオール。
リン、エキレニン、エチニルエストラジオール。
３−ケトステロイド：
（１）アンドロゲン；
プロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、
テストステロン、アンドロステンジオン。
テストステロン、アンドロステンジオン。
（２） コルチコイド：
コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾン０
上記の定量すべき成分のいずれかｌ成分を含有する被検
液に３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、８β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、還元型ＮＡＤ
（Ｐ）を加えて反応を行えばよい。
液に３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、８β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、還元型ＮＡＤ
（Ｐ）を加えて反応を行えばよい。
定ｔされるべき３β−ヒドロキシステロイドまたは３−
ケトステロイドの基質濃度は、５ｎＭ〜３０μＭ１５〜
２０ｔｔｌ Ｋなるよりに調節すればよい。
ケトステロイドの基質濃度は、５ｎＭ〜３０μＭ１５〜
２０ｔｔｌ Ｋなるよりに調節すればよい。
反応温度は、式ＣＩ）で示されるサイクリング反応が円
滑に進行する温度であればよ゛く、通常好ましくは３７
℃である。反応時開け、基質濃度、酵素濃度、反応温度
によシ自から定るが、通常は１分以上好ましくは２〜１
０分間でよい。使用される３β−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼの例としては、シュードモナステスト
ステロニの産生ずるものが市販されている（シグマ社、
ｔＪ％Ｓ、Ａ）ので、それを用いればよく、使用前とし
ては一反応当シ０．０５ ｕ／ｄ以上、好ましくは２−
４ ｕ／ｄが使用される。
滑に進行する温度であればよ゛く、通常好ましくは３７
℃である。反応時開け、基質濃度、酵素濃度、反応温度
によシ自から定るが、通常は１分以上好ましくは２〜１
０分間でよい。使用される３β−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼの例としては、シュードモナステスト
ステロニの産生ずるものが市販されている（シグマ社、
ｔＪ％Ｓ、Ａ）ので、それを用いればよく、使用前とし
ては一反応当シ０．０５ ｕ／ｄ以上、好ましくは２−
４ ｕ／ｄが使用される。
３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼとしてａ、−
ｆｆＫコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，
６）として市販されている酵素でストレプトフッカス、
ブレビバクテリウム、シゾフィラム、フリネバクテリウ
ム、アースロバクテリウム、ノカルジア、ミコバクテリ
ウム属の細菌が産生ずる酵素で充分便用に耐えることが
できる。
ｆｆＫコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，
６）として市販されている酵素でストレプトフッカス、
ブレビバクテリウム、シゾフィラム、フリネバクテリウ
ム、アースロバクテリウム、ノカルジア、ミコバクテリ
ウム属の細菌が産生ずる酵素で充分便用に耐えることが
できる。
使用量としては、０．２ｕ／ｍ１以上、好ましくは１０
〜３０ｕ／ｌＬｔが適当である。反応に用いられる還元
型ＮＡＤ （Ｐ） としては、定量されてる基質に対し
て過剰量であればよく、通常０．１〜２．０ｍＭが好ま
しい。
〜３０ｕ／ｌＬｔが適当である。反応に用いられる還元
型ＮＡＤ （Ｐ） としては、定量されてる基質に対し
て過剰量であればよく、通常０．１〜２．０ｍＭが好ま
しい。
以上記した基質濃度、酵素濃度、その他反応に必要な成
分の鏝度量は適宜変更され得るものであって、特に限定
されるものでないことはいうまでもない。
分の鏝度量は適宜変更され得るものであって、特に限定
されるものでないことはいうまでもない。
本発明のサイクリング反応〔Ｉ）としては、紡記し走よ
うな各成分、即ち、３β−ヒドロキシステロイド、３−
ケトステロイド、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ、３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、
ＮＡＤ （Ｐ） 、還元＃ＩＮＡＤ （Ｐ） 、Ｏ，お
よびＨ，Ｏ□の成分の関与する下記反応式ＣＩ）で表わ
される。
うな各成分、即ち、３β−ヒドロキシステロイド、３−
ケトステロイド、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ、３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、
ＮＡＤ （Ｐ） 、還元＃ＩＮＡＤ （Ｐ） 、Ｏ，お
よびＨ，Ｏ□の成分の関与する下記反応式ＣＩ）で表わ
される。
この反応ＣＩ）について述べれば、１モル比の３β−ヒ
ドロキシステロイドを基質として１モル比の０１、通常
溶存酸素を消費して３β−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼの作用により１モル比の３−ケトステロイドおよ
び１モル比の１（、Ｏ，を生成する３β−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼ系反応を形成し、また生成した１
モル比の３−ケトステロイドは１モル比の還元型ＮＡＤ
（Ｐ）の存在下３β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼの作用によ、ｔｌ１モル比のＮＡＤ （Ｐ）お
よび１モル比の３β−ヒドロキシステロイドを生成する
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ系反応を
形成するが、生じ友３β−ヒドロキシステ田イドはさら
に上記３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ系反応
を生じ、かくして３β−ヒドロキシステロイド−３−ケ
トステロイドのサイクル反応を形成するのである。従っ
て、このサイクリング反応〔Ｉ〕は、３β−ヒドロキシ
ステロイド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ、還元型ＮＡＤ （Ｐ）とＯ３の６成分
で構成され得るものであるが、定量される基質である３
β−ヒドロキシステロイドと３−ケトステロイドはサイ
クリング反応ＣＩ）によっていずれかｌ成分を用いれば
他の成分が生成されるため、いずれかｌ成分を用りれば
よ＜、ｔｑその１成分が被検液中の１成分であってもよ
い。
ドロキシステロイドを基質として１モル比の０１、通常
溶存酸素を消費して３β−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼの作用により１モル比の３−ケトステロイドおよ
び１モル比の１（、Ｏ，を生成する３β−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼ系反応を形成し、また生成した１
モル比の３−ケトステロイドは１モル比の還元型ＮＡＤ
（Ｐ）の存在下３β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼの作用によ、ｔｌ１モル比のＮＡＤ （Ｐ）お
よび１モル比の３β−ヒドロキシステロイドを生成する
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ系反応を
形成するが、生じ友３β−ヒドロキシステ田イドはさら
に上記３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ系反応
を生じ、かくして３β−ヒドロキシステロイド−３−ケ
トステロイドのサイクル反応を形成するのである。従っ
て、このサイクリング反応〔Ｉ〕は、３β−ヒドロキシ
ステロイド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ、還元型ＮＡＤ （Ｐ）とＯ３の６成分
で構成され得るものであるが、定量される基質である３
β−ヒドロキシステロイドと３−ケトステロイドはサイ
クリング反応ＣＩ）によっていずれかｌ成分を用いれば
他の成分が生成されるため、いずれかｌ成分を用りれば
よ＜、ｔｑその１成分が被検液中の１成分であってもよ
い。
さらにこのサイクリング反応〔工〕におけるＨ、０．＆
還元型ＮＡＤを反応せしめてＮＡＤを生成するよシ高感
度な測定法となしてもよい。即ちサイクリング反応（Ｉ
）において、１分子のｆ（２０□と１分子の還元型ＮＡ
Ｄ′ｔ−消費して２分子の水（Ｈ８０）とｌｆｌ子のＮ
ＡＤを生成する反応を触媒する酵素であるＮＡＤベルオ
午シダシダーゼＣ，１゜１）、１．１ ） （Ｊ、ＢＬ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２２５，５５７ （１９５７）
］を組合せ用すてなるもので、下記反応（ｎ）にて表わ
される。
還元型ＮＡＤを反応せしめてＮＡＤを生成するよシ高感
度な測定法となしてもよい。即ちサイクリング反応（Ｉ
）において、１分子のｆ（２０□と１分子の還元型ＮＡ
Ｄ′ｔ−消費して２分子の水（Ｈ８０）とｌｆｌ子のＮ
ＡＤを生成する反応を触媒する酵素であるＮＡＤベルオ
午シダシダーゼＣ，１゜１）、１．１ ） （Ｊ、ＢＬ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２２５，５５７ （１９５７）
］を組合せ用すてなるもので、下記反応（ｎ）にて表わ
される。
ゼ
このサイクリング反応（ＩＩ）においては、サイクリン
グ反応ＣＩ）Ｋて生成したＨ２０□が、さらに還元型Ｎ
ＡＤ （Ｐ）とともに消費されてＮＡＤ（Ｐ）を生成す
るために１サイクリング反応（ＩＩ）の１サイクルにて
２分子の還元型ＮＡＤ （ｐ）の消費となり、サイクリ
ング反応〔Ｉ〕に比べて２倍の還元型ＮＡＤ （Ｐ）の
変化量となるので、より高感度に測定できる。
グ反応ＣＩ）Ｋて生成したＨ２０□が、さらに還元型Ｎ
ＡＤ （Ｐ）とともに消費されてＮＡＤ（Ｐ）を生成す
るために１サイクリング反応（ＩＩ）の１サイクルにて
２分子の還元型ＮＡＤ （ｐ）の消費となり、サイクリ
ング反応〔Ｉ〕に比べて２倍の還元型ＮＡＤ （Ｐ）の
変化量となるので、より高感度に測定できる。
さらＶｃま走、この還元型ＮＡＤ （Ｐ）を加える代り
ＫＮＡＤを反応液中に加え、このＮＡＤ（Ｐ）を基質と
する第２のデヒドロゲナーゼおよびそのデヒドロゲナー
ゼ用の基質化合物を加え、これらＮＡＤ （Ｆ） 、第
２のデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ用基質化合物
の各成分１に組合せて用いてＮＡＤのサイクリング反応
を行って還元型ＮＡＤ （Ｐ）を生成させてもよい。ま
た、さらに上記の成分を用りてサイクリング反応〔Ｉ）
ｔ−形成せしめ、反応によって生じたＮＡＤ （Ｐ）に
このＮＡＤ（Ｐ）のサイクリング反応を組合せて、下記
反応（ＩＩＩ）にて表される第２のサイクリング反応を
形成せしめてもよｈｏ 以下サイクリング反応ＣＩ）に基いて被検液中の１成分
〔→にて示す〕と、サイクリング反応ＣＩ）を形成する
成分〔口にて示す〕とについて更に詳しく述べる。
ＫＮＡＤを反応液中に加え、このＮＡＤ（Ｐ）を基質と
する第２のデヒドロゲナーゼおよびそのデヒドロゲナー
ゼ用の基質化合物を加え、これらＮＡＤ （Ｆ） 、第
２のデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ用基質化合物
の各成分１に組合せて用いてＮＡＤのサイクリング反応
を行って還元型ＮＡＤ （Ｐ）を生成させてもよい。ま
た、さらに上記の成分を用りてサイクリング反応〔Ｉ）
ｔ−形成せしめ、反応によって生じたＮＡＤ （Ｐ）に
このＮＡＤ（Ｐ）のサイクリング反応を組合せて、下記
反応（ＩＩＩ）にて表される第２のサイクリング反応を
形成せしめてもよｈｏ 以下サイクリング反応ＣＩ）に基いて被検液中の１成分
〔→にて示す〕と、サイクリング反応ＣＩ）を形成する
成分〔口にて示す〕とについて更に詳しく述べる。
ｉａＪ被検ｆｆ中の１成分が３β−ヒドロキシステロイ
ドである場合： このように３β−ヒドロキシステロイドｔ−含１、また
は遊離、生成する酵素反応系などの被検液中の１成分が
３β−ヒドロキシステロイドであルー１４合には、サイ
クリング反応（Ｉａ）を形成する成分として３β−ヒド
ロキシステロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ、０．および還元ＷＮＡＤ （
Ｐ）が用いられる。
ドである場合： このように３β−ヒドロキシステロイドｔ−含１、また
は遊離、生成する酵素反応系などの被検液中の１成分が
３β−ヒドロキシステロイドであルー１４合には、サイ
クリング反応（Ｉａ）を形成する成分として３β−ヒド
ロキシステロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ、０．および還元ＷＮＡＤ （
Ｐ）が用いられる。
このサイクリング反応（Ｉａ）ＶＣおいて、３β−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼは被検液中の３β−
しドロキシステｑイドを基質として、１分子の３β−ヒ
ドロキシステロイド上０２トｔ−消費して１分子のＨｌ
ｏ、と３−ケトステロイドを生成し、さらにこの３−ケ
トステロイドを基質として３β−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼは１分子の３−ケトステロイドと還元
型ＮＡＤ （Ｐ）を消費して１分子の３−ヒドロキシス
テロイドとＮＡＤ （Ｐ）を生成し、３−ヒドロキシス
テロイトートケトステロイドのサイクル反応を形成する
。
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼは被検液中の３β−
しドロキシステｑイドを基質として、１分子の３β−ヒ
ドロキシステロイド上０２トｔ−消費して１分子のＨｌ
ｏ、と３−ケトステロイドを生成し、さらにこの３−ケ
トステロイドを基質として３β−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼは１分子の３−ケトステロイドと還元
型ＮＡＤ （Ｐ）を消費して１分子の３−ヒドロキシス
テロイドとＮＡＤ （Ｐ）を生成し、３−ヒドロキシス
テロイトートケトステロイドのサイクル反応を形成する
。
反応にお−てｏ、Ｆｉ反応系における溶存酸素を利用す
ればよいので、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよ
び還元型ＮＡＤ （Ｐ）を測定のための試薬として過剰
量用いればよい。この被検液中の３β−ヒドロキシステ
ロイドの含有量は肴に限定されるものではないが、高凝
度の場合くけ適宜希釈して用すればよい。また用りられ
る３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼや３β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの使用量としては
特に限定されるものではなく、被検液中の３β−ヒドロ
キシステロイドの量に基いて適宜決定されるが、３β−
ヒドロ華システロイドの量と相対的に加減して用いれば
よいのであって、通常ｌテスト尚り８β−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼは０．２単位／Ｋ１以上、好まし
くｄｌＯ−３０単位／Ｍｌｉ度、３β−しドセキシステ
ロイドデヒドログナーゼは、Ｏ，ＯＳ単位／ｄ以上、好
ましくは２−４単位／Ｒ１である。さらに還元型ＮＡＤ
（Ｐ）の使用量としては被検液中の３β−ヒドロキシ
ステロイドの量と反応時間によるサイクリング数の種以
上の量を用いればよく、通常３β−ヒドロキシステロイ
ドの量に比べて大過剰の量が用いられ、例えば５０倍量
以上、好ましくはｌｏ。
ればよいので、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよ
び還元型ＮＡＤ （Ｐ）を測定のための試薬として過剰
量用いればよい。この被検液中の３β−ヒドロキシステ
ロイドの含有量は肴に限定されるものではないが、高凝
度の場合くけ適宜希釈して用すればよい。また用りられ
る３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼや３β−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの使用量としては
特に限定されるものではなく、被検液中の３β−ヒドロ
キシステロイドの量に基いて適宜決定されるが、３β−
ヒドロ華システロイドの量と相対的に加減して用いれば
よいのであって、通常ｌテスト尚り８β−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼは０．２単位／Ｋ１以上、好まし
くｄｌＯ−３０単位／Ｍｌｉ度、３β−しドセキシステ
ロイドデヒドログナーゼは、Ｏ，ＯＳ単位／ｄ以上、好
ましくは２−４単位／Ｒ１である。さらに還元型ＮＡＤ
（Ｐ）の使用量としては被検液中の３β−ヒドロキシ
ステロイドの量と反応時間によるサイクリング数の種以
上の量を用いればよく、通常３β−ヒドロキシステロイ
ドの量に比べて大過剰の量が用いられ、例えば５０倍量
以上、好ましくはｌｏ。
〜ｌ Ｏ，ＯＯＯ倍量用いる仁とがよいが、また、この
量以上用いることを何んら限定するものではない。さら
にこのサイクリング反応（Ｉａ）の後反応によって生ず
る検出で龜る変化の量としては、反応によって消費され
るＯ８の量、消費される還元型ＮＡＤ （Ｐ）の量や生
成されるＨ、Ｏ，の量が挙られる。さらにこのサイクリ
ング反応（Ｉ ａ ）Ｋおける生成成分であるＨｌｏ、
と消費される成分である還元型ＮＡＤ （Ｐ）を反応せ
しめて、前記反応〔ＩＩ）で示したごとく、より高感度
の測定を行ってもよい。即ち、このサイクリング反応（
Ｉａ）に、１分子Ｈ３０，と１分子の還元型ＮＡＤ （
Ｐ）を消費して２分子の水と１分子のＮＡＤ （Ｐ）ｔ
−生成する反応を触媒する酵素であるＮＡＤ （Ｐ）ペ
ルオキシダーゼを組合せ、サイクリング反応（Ｉａ）に
て生成したＨ、Ｏ，の量に対応して還元型ＮＡＤ （Ｐ
）と反応してＮＡＤ （Ｐ）を生成させるものでおる。
量以上用いることを何んら限定するものではない。さら
にこのサイクリング反応（Ｉａ）の後反応によって生ず
る検出で龜る変化の量としては、反応によって消費され
るＯ８の量、消費される還元型ＮＡＤ （Ｐ）の量や生
成されるＨ、Ｏ，の量が挙られる。さらにこのサイクリ
ング反応（Ｉ ａ ）Ｋおける生成成分であるＨｌｏ、
と消費される成分である還元型ＮＡＤ （Ｐ）を反応せ
しめて、前記反応〔ＩＩ）で示したごとく、より高感度
の測定を行ってもよい。即ち、このサイクリング反応（
Ｉａ）に、１分子Ｈ３０，と１分子の還元型ＮＡＤ （
Ｐ）を消費して２分子の水と１分子のＮＡＤ （Ｐ）ｔ
−生成する反応を触媒する酵素であるＮＡＤ （Ｐ）ペ
ルオキシダーゼを組合せ、サイクリング反応（Ｉａ）に
て生成したＨ、Ｏ，の量に対応して還元型ＮＡＤ （Ｐ
）と反応してＮＡＤ （Ｐ）を生成させるものでおる。
この反応においてＮＡＤ （Ｐ）ペルオキシダーゼは通
常１テスト当り０．５単位以上用いればよく、好ましく
は１〜２０単位程度用いればよい。まな反応によって生
ずる検出できる変化の量としては、反応によって消費さ
れる還元＊ＮＡＤ （Ｐ）の量にて測定することが望ま
しい。
常１テスト当り０．５単位以上用いればよく、好ましく
は１〜２０単位程度用いればよい。まな反応によって生
ずる検出できる変化の量としては、反応によって消費さ
れる還元＊ＮＡＤ （Ｐ）の量にて測定することが望ま
しい。
（ｂｌ 被検液中の！成分が３−ケトステロイドであ
このようＶｃ３−ケトステロイドを含有、または遊離、
生成する酵素反応系などの被検液中の１成分が３−ケト
ステロイドである場合、サイクリング反応〔より〕を形
成する成分としてＦｉ３β−ヒドロ中システロイドデヒ
ドμゲナーゼ、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ、０．および還元型ＮＡＤ （Ｐ）が用いられる。こ
のサイクリング反応（Ｉ ｂ ）において、被検液中の
３−ケトステロイドを基質として、１分子の３−ケトス
テロイドと還元！！ＮＡＤ （Ｐ）を消費して１分子の
ＮＡＤ（Ｐ）と３β−ヒドロキシステロイドを生成し、
さらにこの３β−ヒドロキシステロイドを基質トして３
β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼは、１分子の３
β−ヒドロキシステロイドと０８を消費して、１分子の
Ｈ２Ｏ２と３−ケトステロイドを生成する。かくして３
−ケトステロイド−３β−ヒドロキシステロイドのサイ
クル反応が形成される。
このようＶｃ３−ケトステロイドを含有、または遊離、
生成する酵素反応系などの被検液中の１成分が３−ケト
ステロイドである場合、サイクリング反応〔より〕を形
成する成分としてＦｉ３β−ヒドロ中システロイドデヒ
ドμゲナーゼ、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ、０．および還元型ＮＡＤ （Ｐ）が用いられる。こ
のサイクリング反応（Ｉ ｂ ）において、被検液中の
３−ケトステロイドを基質として、１分子の３−ケトス
テロイドと還元！！ＮＡＤ （Ｐ）を消費して１分子の
ＮＡＤ（Ｐ）と３β−ヒドロキシステロイドを生成し、
さらにこの３β−ヒドロキシステロイドを基質トして３
β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼは、１分子の３
β−ヒドロキシステロイドと０８を消費して、１分子の
Ｈ２Ｏ２と３−ケトステロイドを生成する。かくして３
−ケトステロイド−３β−ヒドロキシステロイドのサイ
クル反応が形成される。
この反応においてＯｔ溶存酸素の利用で足シるので、３
β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロ
中システロイドデａド「ゲナーゼおよび還元ｍＮＡＤ
（Ｐ） ｔ−測定のための試薬として過剰量用いればよ
い。ま虎用いられる３β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼおよび３β−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼの使用量としては特に限定されるものではなく、通
常前者においては０．０５単位／ｄ以上、後者において
は０゜２単位７４以上用いればよく、好ましくは３β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼｌθ〜３０単位
／ＩＩＩ程度、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼは２〜４単位／ｄ程度であり、ｔたこれ以上の酵素を
用りてもよい。さらに還元型ＮＡＤ（Ｐ）の使用量とし
ては被検液中の３−ケトステロイドの量と反応時間によ
るサイクリング数の種以上の量を用いればよく、通常３
−ケトステロイドの量に比べて大過剰の量が用いられ、
例えば５０倍量以上好ましくは１００〜１０．０００倍
量用いることがよｈｏさらにこのサイクリング反応（Ｉ
ｂ）の後反応によって生ずる検出できる変化の菫として
は、消費される０□の量、消費される還元型Ｎ＾Ｄ （
Ｐ）の量や生成されるｆ（！Ｏ□の量が挙られる。
β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロ
中システロイドデａド「ゲナーゼおよび還元ｍＮＡＤ
（Ｐ） ｔ−測定のための試薬として過剰量用いればよ
い。ま虎用いられる３β−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼおよび３β−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼの使用量としては特に限定されるものではなく、通
常前者においては０．０５単位／ｄ以上、後者において
は０゜２単位７４以上用いればよく、好ましくは３β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼｌθ〜３０単位
／ＩＩＩ程度、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼは２〜４単位／ｄ程度であり、ｔたこれ以上の酵素を
用りてもよい。さらに還元型ＮＡＤ（Ｐ）の使用量とし
ては被検液中の３−ケトステロイドの量と反応時間によ
るサイクリング数の種以上の量を用いればよく、通常３
−ケトステロイドの量に比べて大過剰の量が用いられ、
例えば５０倍量以上好ましくは１００〜１０．０００倍
量用いることがよｈｏさらにこのサイクリング反応（Ｉ
ｂ）の後反応によって生ずる検出できる変化の菫として
は、消費される０□の量、消費される還元型Ｎ＾Ｄ （
Ｐ）の量や生成されるｆ（！Ｏ□の量が挙られる。
さらにこのサイクリング反応（Ｉｂ）Ｉｃ、前記［ＩＩ
）で示したＮＡＤ （Ｐ）ペルオキシダーゼを用いて、
より高感度な測定法となしてもよ１０ 次に、前記反応式［ＩＩＩ）で示した第２のデヒドロゲ
ナーゼおよびその基質を使用する方法にりいて詳述する
。
）で示したＮＡＤ （Ｐ）ペルオキシダーゼを用いて、
より高感度な測定法となしてもよ１０ 次に、前記反応式［ＩＩＩ）で示した第２のデヒドロゲ
ナーゼおよびその基質を使用する方法にりいて詳述する
。
このようにサイクリング反応（■ａ）を形成するための
成分としては、３−ケトステロイドまたけ３β−ヒドロ
キシステロイドのいずれか一方、３β−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ、０．、ＮＡＤ （Ｐ）または還元型ＮＡ
Ｄ （Ｐ）のいずれか一方、第２のデヒドロゲナーゼ、
この第２のデヒドロゲナーゼ用基質化合物が用いられる
。このサイクリング反応ＣＩ［Ｉａ、）Ｋおし１て、第
２のデヒドロゲナーゼは１分子のＮＡＤ （Ｐ）と第２
のデヒドロゲナーゼ用基質化合物を消費して、１分子の
基質化合物の酸化物と還元型ＮＡＩ）（Ｐ）を生成し、
この還元型ＮＡＤ （Ｐ） ＦｉＮＡＤ （Ｐ）の生成
を伴う３−ケトステロイド−３β−ヒドロキシステロイ
ドのサイクル反応と共役するのである。
成分としては、３−ケトステロイドまたけ３β−ヒドロ
キシステロイドのいずれか一方、３β−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ、０．、ＮＡＤ （Ｐ）または還元型ＮＡ
Ｄ （Ｐ）のいずれか一方、第２のデヒドロゲナーゼ、
この第２のデヒドロゲナーゼ用基質化合物が用いられる
。このサイクリング反応ＣＩ［Ｉａ、）Ｋおし１て、第
２のデヒドロゲナーゼは１分子のＮＡＤ （Ｐ）と第２
のデヒドロゲナーゼ用基質化合物を消費して、１分子の
基質化合物の酸化物と還元型ＮＡＩ）（Ｐ）を生成し、
この還元型ＮＡＤ （Ｐ） ＦｉＮＡＤ （Ｐ）の生成
を伴う３−ケトステロイド−３β−ヒドロキシステロイ
ドのサイクル反応と共役するのである。
この生成した還元型ＮＡＤ （Ｐ）は、その１分子当夛
等モル此の３−ケトステロイドととも＃Ｃ３β−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼの作用をうけて１分子
のＮＡＤ （Ｐ）と３β−ヒドロキシステロイドを生成
し、ざらＶＣ３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ
の作用により、１分子の３β−ヒドロキシステロイドと
０□を消費して１分子のＨ２Ｏ，と３−ケトステロイド
を生成する。この反応においても０．は溶存酸素の利用
で足りるので、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ、３β−ヒト日キシステロイドデヒドロゲナーゼ、Ｎ
ＡＤ （Ｐ）［または還元型ＮＡＤ （Ｐ））、２２の
デヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲナーゼ用基質
化合物を測定のための試薬として過簿量用いればよｈｏ
さらにこのサイクリング反応（ｍａ）の後反応によって
生ずる検出できる変化ぐ量としては、消費される０、の
量ま走は生成され２Ｈ８０８の量が挙られる。
等モル此の３−ケトステロイドととも＃Ｃ３β−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼの作用をうけて１分子
のＮＡＤ （Ｐ）と３β−ヒドロキシステロイドを生成
し、ざらＶＣ３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ
の作用により、１分子の３β−ヒドロキシステロイドと
０□を消費して１分子のＨ２Ｏ，と３−ケトステロイド
を生成する。この反応においても０．は溶存酸素の利用
で足りるので、３β−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ、３β−ヒト日キシステロイドデヒドロゲナーゼ、Ｎ
ＡＤ （Ｐ）［または還元型ＮＡＤ （Ｐ））、２２の
デヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲナーゼ用基質
化合物を測定のための試薬として過簿量用いればよｈｏ
さらにこのサイクリング反応（ｍａ）の後反応によって
生ずる検出できる変化ぐ量としては、消費される０、の
量ま走は生成され２Ｈ８０８の量が挙られる。
またこのサイクリング反応〔■龜〕に用いＧ）する第２
のデヒドロゲナーゼとしては、このデヒ擾はゲナーゼ用
基質化合物とＮＡＤ （Ｐ）とを基乍としてその基質化
合物の酸化物および還元型ＮＡＤ （Ｐ） ｔ−生成す
る反応を触媒する酵素でられねよく、たとえば以下の反
応を触媒するデヒドロゲナーゼとこのデヒドロゲナーゼ
用基質化合物が９示される。
のデヒドロゲナーゼとしては、このデヒ擾はゲナーゼ用
基質化合物とＮＡＤ （Ｐ）とを基乍としてその基質化
合物の酸化物および還元型ＮＡＤ （Ｐ） ｔ−生成す
る反応を触媒する酵素でられねよく、たとえば以下の反
応を触媒するデヒドロゲナーゼとこのデヒドロゲナーゼ
用基質化合物が９示される。
ｌａｌ 第２のデヒドロゲナーゼがＤ−アシビニトー
ルデヒドロゲナーゼ（ＡＤａ＠ｅ：仄、ｌ。
ルデヒドロゲナーゼ（ＡＤａ＠ｅ：仄、ｌ。
１．１．１） ）であ）、デヒドロゲナーゼ用基質（を
合物がＤ−７ラビトールである組合せ反応：Ｅ
（ｂｌ 第２のデヒドロゲナーゼが２クテートデヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨｌＥＣ，１，１，１，２７） 、デ
１ ヒドロゲナーゼ用基質化合物がＬ−乳酸であ
る組合せ反応： 〉 （ｃｌ 第２のデヒドロゲナーゼがマレイドデヒドロ
ゲナーゼ（デカルボキシレイテインク）（Ｅ Ｃ１，１
，１，２８） 、デヒドロゲナーゼ用基質［化合物がＬ
−リンゴ酸である組合せ反応二〇〇□十還元型ＮＡＤ （ｄｌ 第２のデヒドロゲナーゼがグルコースデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，４７） 、デヒドロゲ
ナーゼ用基質化合物がグルコースである組合せ反応： 加ノーδ−ラクトン＋還元型ＮＡＤ ｔｅｌ 第２のデヒドロゲナーゼがホルメイトデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，２，１，２） 、デヒドロゲナ
ーゼ用基質化合物がギ酸である組合せ反応： （ｆｌ 第２のデヒドロゲナーゼがガラクトースデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ，ｔ、ｔ、ｘ、４８） 、デヒドロ
ゲナーゼ用基質化合物がＤ−ガラクトースである組合せ
反応： Ｄ−ガラクトース十ＮＡＤ□ ガラクトースデヒドロゲナーゼ ーーーー→Ｄ−ガラクトノーｒ−ラクトン十還元型ＮＡ
Ｄこれらのサイクリング反応（Ｉｎａ、）に用いられる
各試薬は被検液中の還元型ＮＡＤ （Ｐ）やＮＡＤ （
Ｐ）の量に比べて大過剰に用いることが好ましい。さら
にこのＮＡＤ （Ｐ）のサイクリング反応は、前記反応
の［Ｉａ）、（Ｉｂ）忙おいて用いられる還元型ＮＡＤ
（Ｐ）の代りに、ＮＡＤ （Ｐ）、第２のデヒドロゲ
ナーゼ、第２のデヒドロゲナーゼ用基質を用いて、還元
型ＮＡＤ （Ｐ）を生成する反応系としてサイクリング
反応［ＩＩ）を形成せしめるために利用してもよい。
合物がＤ−７ラビトールである組合せ反応：Ｅ
（ｂｌ 第２のデヒドロゲナーゼが２クテートデヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨｌＥＣ，１，１，１，２７） 、デ
１ ヒドロゲナーゼ用基質化合物がＬ−乳酸であ
る組合せ反応： 〉 （ｃｌ 第２のデヒドロゲナーゼがマレイドデヒドロ
ゲナーゼ（デカルボキシレイテインク）（Ｅ Ｃ１，１
，１，２８） 、デヒドロゲナーゼ用基質［化合物がＬ
−リンゴ酸である組合せ反応二〇〇□十還元型ＮＡＤ （ｄｌ 第２のデヒドロゲナーゼがグルコースデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，４７） 、デヒドロゲ
ナーゼ用基質化合物がグルコースである組合せ反応： 加ノーδ−ラクトン＋還元型ＮＡＤ ｔｅｌ 第２のデヒドロゲナーゼがホルメイトデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，２，１，２） 、デヒドロゲナ
ーゼ用基質化合物がギ酸である組合せ反応： （ｆｌ 第２のデヒドロゲナーゼがガラクトースデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ，ｔ、ｔ、ｘ、４８） 、デヒドロ
ゲナーゼ用基質化合物がＤ−ガラクトースである組合せ
反応： Ｄ−ガラクトース十ＮＡＤ□ ガラクトースデヒドロゲナーゼ ーーーー→Ｄ−ガラクトノーｒ−ラクトン十還元型ＮＡ
Ｄこれらのサイクリング反応（Ｉｎａ、）に用いられる
各試薬は被検液中の還元型ＮＡＤ （Ｐ）やＮＡＤ （
Ｐ）の量に比べて大過剰に用いることが好ましい。さら
にこのＮＡＤ （Ｐ）のサイクリング反応は、前記反応
の［Ｉａ）、（Ｉｂ）忙おいて用いられる還元型ＮＡＤ
（Ｐ）の代りに、ＮＡＤ （Ｐ）、第２のデヒドロゲ
ナーゼ、第２のデヒドロゲナーゼ用基質を用いて、還元
型ＮＡＤ （Ｐ）を生成する反応系としてサイクリング
反応［ＩＩ）を形成せしめるために利用してもよい。
次いで、３β−とドロキシステロイドまｆｃＦｉ３−ケ
トステロイドを含有する被検液またはその１成分を遊離
、生成する酵素反応系の被検液を対象として目的とする
成分を定量するのであるが、定量に当っては目的とする
成分と前記のサイクリング反応（Ｉａ）、［Ｉｂ）まｆ
ｔＦｉ〔■〕ないし［ｍａ）、またけ〔ａ〕の反応に基
いて行えばよい。
トステロイドを含有する被検液またはその１成分を遊離
、生成する酵素反応系の被検液を対象として目的とする
成分を定量するのであるが、定量に当っては目的とする
成分と前記のサイクリング反応（Ｉａ）、［Ｉｂ）まｆ
ｔＦｉ〔■〕ないし［ｍａ）、またけ〔ａ〕の反応に基
いて行えばよい。
また被検液中の成分の一定ｆＫ対して各す泰イクリング
反応はｌＯプサイル以上の反応を生ずることから、少な
くとも目的成分に比べてそのサイクル数以上のモル比に
相応した量の試楽を用いればよく、さらに極めて少量の
被検液本しくは希釈した被検液を用いればよい。またこ
の反応ｖｃ′Ｊ？ける媒体としては、用いる各酵素の活
性の安定なｐｆ（域のものであればよく、通常弱酸性な
いし弱アルカリ性、例えばｐＨ６，５〜８．５のリン酸
緩衝液、ト１）スーμｒ１赫Ｓ妨−イタｌゾール−ばＣ
１赫植液、ジメチルゲルタール酸−Ｎ＆ＯＨ緩衝液、ビ
ベスーＮａＯＨ緩衝液などが用いられる。さらに反応に
当っては、通常３７℃付近にて１分以上反応せしめれば
よい。このサイクリング反応〔Ｉ）は、用いる酵素の量
や血値によって異なるが、通常１分関轟り５０サイクル
以上の反応を行うもので、好ましくは１分間当シロ０サ
イクル以上の反応全行うような酵素量、その他の試薬を
用いればよい。
反応はｌＯプサイル以上の反応を生ずることから、少な
くとも目的成分に比べてそのサイクル数以上のモル比に
相応した量の試楽を用いればよく、さらに極めて少量の
被検液本しくは希釈した被検液を用いればよい。またこ
の反応ｖｃ′Ｊ？ける媒体としては、用いる各酵素の活
性の安定なｐｆ（域のものであればよく、通常弱酸性な
いし弱アルカリ性、例えばｐＨ６，５〜８．５のリン酸
緩衝液、ト１）スーμｒ１赫Ｓ妨−イタｌゾール−ばＣ
１赫植液、ジメチルゲルタール酸−Ｎ＆ＯＨ緩衝液、ビ
ベスーＮａＯＨ緩衝液などが用いられる。さらに反応に
当っては、通常３７℃付近にて１分以上反応せしめれば
よい。このサイクリング反応〔Ｉ）は、用いる酵素の量
や血値によって異なるが、通常１分関轟り５０サイクル
以上の反応を行うもので、好ましくは１分間当シロ０サ
イクル以上の反応全行うような酵素量、その他の試薬を
用いればよい。
このようにして反応せしめた後、次いで反応によって生
ずる検出できる変化の量を定量するのであるが、この検
出できる変化としては、サイクリング反応〔Ｉ〕の３β
−ヒドロキシステロイドまたは３−ケトステロイドの１
モル比の生成または消費の１回サイクル反応において、
モル比の成分を消費するか、または生成する成分が挙ら
れ、これらの成分としては、消費される０８、消費され
る還元型ＮＡＤ （Ｐ） 、生成されるＨ２Ｏ，の各成
分が挙られる。まず消費されるＯｌの量の定量に当って
は、通常酸素電極を用いる電気化学的変化の量として定
量すれはよい。を尺還元型ＮＡＤ （Ｐ）の消費量の定
量に当っては、あらかじめ用りた量の還元型ＮＡＤ （
Ｐ）から反応後に残存する還元型ＮＡＤ （Ｐ）の量の
差を求めること罠よってなされる。この反応後に残存す
る還元型ＮＡＤ （Ｐ）の量まなはあらかじめ用いた還
元型ＮＡＤ （Ｐ）の量の定量は、公知の種々の還元型
ＮＡＤ （Ｐ）の定量法が用いられる。この還元！ＮＡ
Ｄ （Ｐ）の定量法としては、例えば共存するＮＡＤ
（Ｐ）Ｋ％異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤ （Ｐ）
の脣異的吸収波長である吸収波長域の波長に基づいて吸
光度測定すればよい。ＮＡＤ （Ｐ） Ｆｉ２６０Ｈｍ
近辺ＫＩ￥１異的極大吸収波長を有し、還元型ＮＡＤＦ
ｉ２６０ｎｍおよび３４０ ｎｍ近辺に特異的極大吸収
波長を有することから、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の定量のた
めの轡異的吸収波長である吸収波長域としては３２０
ｎｍ〜３６０ ｎｍ近辺であり、好ましくは３４０ ｎ
ｍ 近辺である。この波長により残存する還元型ＮＡＤ
を吸光度値として定量される。さらに別の還元型ＮＡｉ
）（Ｐ）の定量法としては、還元型ＮＡＤ （Ｐ）の水
素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の発色に
よる方法が挙られる。この水素原子伝達系色原体として
は、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム
・クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリ
ル）−２，６−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・ブ
ロマイド、３．３’−（４，４−ビフエニリレン）−ビ
ス（２，５−ジフェニル轡２Ｈ−テトラゾリウム−クロ
ライド）、３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４
−ビフェニリレン）−ビス（２−（ｐ−ニトロフェニル
）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロライド
〕（別名二ニトロテトラゾリウム：ＮＴＢ） 、３．３
’−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフエニリレ
ン）−ビス〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２
Ｈ−テトラゾリウム魯クロライド〕、３．３’−（３，
３’−ジメトキシ−４，４１−ビフエニリレン）−ビス
（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロラ
イド）などのテトラゾリウム塩や２，６−シクロロフエ
ノールインドフエノールなどが用いラレる。それらのう
ち、好ましくは水溶性テトラゾリウム塩とジアホラーゼ
またはフェナジンメトサルフェートを組合せ用りて電子
伝達を良好にしたものを用いればより０この水素伝達系
色原体は還元型ＮＡＤ （Ｐ）の水素原子を受けて呈色
するホルマザン色素を形成するもので、このホルマザン
色素をその吸収波長域、例えば５００Ｈｍ〜５５０ｎｍ
における極大吸収波長域に基づいて吸光７ｆ＃１定
すればよい。さらに別の測定法としては、例えば還元型
ＮＡＤ ？ｐ）にレザズリンなどの螢光用試薬の共存下
ジアホラーゼを作用せしめて反応によって螢光する成分
の量を定量してもよい。ａｆ４に還元型ＮＡＤ （Ｐ）
ｔ一定量するに当っては、サイクリング反応ＣＩ）に
おいてＨ２Ｏ２の生成を伴うためにカタラーゼを用いて
Ｈ２Ｏ，ｅ分解、消去せしめることが好ましい。さらに
感度を向上させるためには、サイクリング反応ＣＩ）の
系にさらにＮＡＤペルオキシダーゼ（ＥＣ，１，１），
１，ｌ） ′ｆｃ作用させ、生じたＨｇｏｔを還元型Ｎ
ＡＤの減少に変え、２倍の感度で測定する前記［ＩＩ）
によってもよい。また生成する成分であるｆ（、Ｏ□の
定量に当っては、過酸化水素電極を用いる電気化学的変
化の量として定量するか、またはＨ２Ｏ，と反応して検
出で籾る生成物忙変化する指示薬組成物を用いて定量し
てもよい。この指示薬組成物としては、通常色調の変化
を可視にて生ずる呈色薬組成物、光照射によシ螢光を発
する螢光薬組成物や発色する発光薬組成物である分光光
学的手段によりその変化の量を定量し得る組織物が用−
られる。
ずる検出できる変化の量を定量するのであるが、この検
出できる変化としては、サイクリング反応〔Ｉ〕の３β
−ヒドロキシステロイドまたは３−ケトステロイドの１
モル比の生成または消費の１回サイクル反応において、
モル比の成分を消費するか、または生成する成分が挙ら
れ、これらの成分としては、消費される０８、消費され
る還元型ＮＡＤ （Ｐ） 、生成されるＨ２Ｏ，の各成
分が挙られる。まず消費されるＯｌの量の定量に当って
は、通常酸素電極を用いる電気化学的変化の量として定
量すれはよい。を尺還元型ＮＡＤ （Ｐ）の消費量の定
量に当っては、あらかじめ用りた量の還元型ＮＡＤ （
Ｐ）から反応後に残存する還元型ＮＡＤ （Ｐ）の量の
差を求めること罠よってなされる。この反応後に残存す
る還元型ＮＡＤ （Ｐ）の量まなはあらかじめ用いた還
元型ＮＡＤ （Ｐ）の量の定量は、公知の種々の還元型
ＮＡＤ （Ｐ）の定量法が用いられる。この還元！ＮＡ
Ｄ （Ｐ）の定量法としては、例えば共存するＮＡＤ
（Ｐ）Ｋ％異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤ （Ｐ）
の脣異的吸収波長である吸収波長域の波長に基づいて吸
光度測定すればよい。ＮＡＤ （Ｐ） Ｆｉ２６０Ｈｍ
近辺ＫＩ￥１異的極大吸収波長を有し、還元型ＮＡＤＦ
ｉ２６０ｎｍおよび３４０ ｎｍ近辺に特異的極大吸収
波長を有することから、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の定量のた
めの轡異的吸収波長である吸収波長域としては３２０
ｎｍ〜３６０ ｎｍ近辺であり、好ましくは３４０ ｎ
ｍ 近辺である。この波長により残存する還元型ＮＡＤ
を吸光度値として定量される。さらに別の還元型ＮＡｉ
）（Ｐ）の定量法としては、還元型ＮＡＤ （Ｐ）の水
素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の発色に
よる方法が挙られる。この水素原子伝達系色原体として
は、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム
・クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリ
ル）−２，６−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・ブ
ロマイド、３．３’−（４，４−ビフエニリレン）−ビ
ス（２，５−ジフェニル轡２Ｈ−テトラゾリウム−クロ
ライド）、３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４
−ビフェニリレン）−ビス（２−（ｐ−ニトロフェニル
）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロライド
〕（別名二ニトロテトラゾリウム：ＮＴＢ） 、３．３
’−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフエニリレ
ン）−ビス〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２
Ｈ−テトラゾリウム魯クロライド〕、３．３’−（３，
３’−ジメトキシ−４，４１−ビフエニリレン）−ビス
（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロラ
イド）などのテトラゾリウム塩や２，６−シクロロフエ
ノールインドフエノールなどが用いラレる。それらのう
ち、好ましくは水溶性テトラゾリウム塩とジアホラーゼ
またはフェナジンメトサルフェートを組合せ用りて電子
伝達を良好にしたものを用いればより０この水素伝達系
色原体は還元型ＮＡＤ （Ｐ）の水素原子を受けて呈色
するホルマザン色素を形成するもので、このホルマザン
色素をその吸収波長域、例えば５００Ｈｍ〜５５０ｎｍ
における極大吸収波長域に基づいて吸光７ｆ＃１定
すればよい。さらに別の測定法としては、例えば還元型
ＮＡＤ ？ｐ）にレザズリンなどの螢光用試薬の共存下
ジアホラーゼを作用せしめて反応によって螢光する成分
の量を定量してもよい。ａｆ４に還元型ＮＡＤ （Ｐ）
ｔ一定量するに当っては、サイクリング反応ＣＩ）に
おいてＨ２Ｏ２の生成を伴うためにカタラーゼを用いて
Ｈ２Ｏ，ｅ分解、消去せしめることが好ましい。さらに
感度を向上させるためには、サイクリング反応ＣＩ）の
系にさらにＮＡＤペルオキシダーゼ（ＥＣ，１，１），
１，ｌ） ′ｆｃ作用させ、生じたＨｇｏｔを還元型Ｎ
ＡＤの減少に変え、２倍の感度で測定する前記［ＩＩ）
によってもよい。また生成する成分であるｆ（、Ｏ□の
定量に当っては、過酸化水素電極を用いる電気化学的変
化の量として定量するか、またはＨ２Ｏ，と反応して検
出で籾る生成物忙変化する指示薬組成物を用いて定量し
てもよい。この指示薬組成物としては、通常色調の変化
を可視にて生ずる呈色薬組成物、光照射によシ螢光を発
する螢光薬組成物や発色する発光薬組成物である分光光
学的手段によりその変化の量を定量し得る組織物が用−
られる。
このように本発明は、３β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼと３β−とドロキシステロイド°オキシダ
ーゼを共役させて測定しようとする基質の３β−ヒドロ
キシステロイド−３−ケトステロイドサイクル反応によ
る機構液中の３β−ヒドロキシステロイドま九は３−ケ
トステロイドの新規な定量法であり、かつ１分間当りｌ
Ｏプサイル以上の高サイクル反応を行うために１従来技
術の１００〜１ｏｏｏ倍／１０分という極めて高感度に
て血中、尿中など被検液中の３β−ヒドロキシステロイ
ドまたは３−ケトステロイド成分を測定で数る優れた方
法である。
ドロゲナーゼと３β−とドロキシステロイド°オキシダ
ーゼを共役させて測定しようとする基質の３β−ヒドロ
キシステロイド−３−ケトステロイドサイクル反応によ
る機構液中の３β−ヒドロキシステロイドま九は３−ケ
トステロイドの新規な定量法であり、かつ１分間当りｌ
Ｏプサイル以上の高サイクル反応を行うために１従来技
術の１００〜１ｏｏｏ倍／１０分という極めて高感度に
て血中、尿中など被検液中の３β−ヒドロキシステロイ
ドまたは３−ケトステロイド成分を測定で数る優れた方
法である。
次−で本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何んら限定されるものではない。
明はこれらによって何んら限定されるものではない。
実施例 ｌ
下記の組成を有する反応液を用いた。
＊ ５０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）・３β
−ヒトａＳシステロイドオキシグーゼ（東洋醸造製、５
ｔｒａｐ ｔｏｍｙｃｅｇ ＳＦ、由来）２０単位／ｄ −３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔａＬｅｒｏｎｉ由米、Ｓ
ＩＧＭＡ社製由来単位／ν ａ １．５ ｍＭ還元型ＮＡＤ （ＮＡＤＨ，）・０．
ｌう６トリトンＸ−１００ 上記反応液０．５ ｉｔｌを小試験管にとり、３７℃に
加温しｆｅｉ、被検液として０．５．１Ｏ１）６，２０
４のプレグネノロンを含有する溶液ｌＯμｌを添加し、
３７℃にて正確に１０分間反応した。
−ヒトａＳシステロイドオキシグーゼ（東洋醸造製、５
ｔｒａｐ ｔｏｍｙｃｅｇ ＳＦ、由来）２０単位／ｄ −３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔａＬｅｒｏｎｉ由米、Ｓ
ＩＧＭＡ社製由来単位／ν ａ １．５ ｍＭ還元型ＮＡＤ （ＮＡＤＨ，）・０．
ｌう６トリトンＸ−１００ 上記反応液０．５ ｉｔｌを小試験管にとり、３７℃に
加温しｆｅｉ、被検液として０．５．１Ｏ１）６，２０
４のプレグネノロンを含有する溶液ｌＯμｌを添加し、
３７℃にて正確に１０分間反応した。
２−ｒデシル硫酸ナトリウム（Ｓｎ２）＃ｌ液２．５１
）１′ｆ：添加して反応を停止し、反応液の吸光度を３
４０ ｎｍ で測定しな。その結果は、第１＠に・−・
にて示す通シで極めて良好な定量性が得られた。なお、
このと色のサイクリング率は８０サイクル／分であり九
。また上記反応組成における還元型ＮＡＤの代りに、還
元型ＮＡＤ （Ｐ） ｔ−用いて、以下同様に行なった
結果、第１図にΔ−Δて示す通シ曳好な定量性が得られ
念。さらに上記の還元型ＮＡＤｔ用りる反応組成にＮ
Ａ Ｄ Ｈ，ペルオキシダーゼを９単位／ｄ添加した反
応液を用−て、同僚の反応操作を行りな結果は第１図に
０−ＯＫて示す通りで、２倍の吸光度の変化が得られた
。
）１′ｆ：添加して反応を停止し、反応液の吸光度を３
４０ ｎｍ で測定しな。その結果は、第１＠に・−・
にて示す通シで極めて良好な定量性が得られた。なお、
このと色のサイクリング率は８０サイクル／分であり九
。また上記反応組成における還元型ＮＡＤの代りに、還
元型ＮＡＤ （Ｐ） ｔ−用いて、以下同様に行なった
結果、第１図にΔ−Δて示す通シ曳好な定量性が得られ
念。さらに上記の還元型ＮＡＤｔ用りる反応組成にＮ
Ａ Ｄ Ｈ，ペルオキシダーゼを９単位／ｄ添加した反
応液を用−て、同僚の反応操作を行りな結果は第１図に
０−ＯＫて示す通りで、２倍の吸光度の変化が得られた
。
実施例 ２
下記の組成を有する反応液を用いた。
５５０ｍＭ リン酸緩衝液ｐ’Ｈ８，０・３β−ヒド
ロキシステロイドオキシダーゼ２０単位／― ＠３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４単位
／ｄ ・０．２ ｍＭ還元型ＮＡＤ （ＮＡＤＨ，）−０，１
％ ）！Ｊ）ｙＸ−１００上記反応液１．Ｏｄを
石英セル（１，０ｄ用）Ｋ加え、３７℃に設定した恒温
セルホルダーを有する分光光度計にセットした。次いで
これに、各々ｏ１５．１Ｏ１）６，２０，２５，ＩＩＭ
のプレグネノロンを含有する被検液ｌＯμノを添加した
後６３７℃で反応した。反応開始後２分から４分目の２
分間の吸光度変化ｔ−３４０ｎｍの波長で測定した。そ
の結果は第２図のＯ−０＃ｃて示す通シでプレグネノロ
ンの量と吸光度の闇に良好なｉｌｉ線関係が得られ、こ
のときのサイクリング＊Ｆｉ６５サイクル／分であった
。
ロキシステロイドオキシダーゼ２０単位／― ＠３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４単位
／ｄ ・０．２ ｍＭ還元型ＮＡＤ （ＮＡＤＨ，）−０，１
％ ）！Ｊ）ｙＸ−１００上記反応液１．Ｏｄを
石英セル（１，０ｄ用）Ｋ加え、３７℃に設定した恒温
セルホルダーを有する分光光度計にセットした。次いで
これに、各々ｏ１５．１Ｏ１）６，２０，２５，ＩＩＭ
のプレグネノロンを含有する被検液ｌＯμノを添加した
後６３７℃で反応した。反応開始後２分から４分目の２
分間の吸光度変化ｔ−３４０ｎｍの波長で測定した。そ
の結果は第２図のＯ−０＃ｃて示す通シでプレグネノロ
ンの量と吸光度の闇に良好なｉｌｉ線関係が得られ、こ
のときのサイクリング＊Ｆｉ６５サイクル／分であった
。
また同じ濃度になるようにプレグネノロンを添加した人
血清を用いて、以下同様に行った結果、第２図の・−・
に示す通り同様に良好な定量性が得られた。
血清を用いて、以下同様に行った結果、第２図の・−・
に示す通り同様に良好な定量性が得られた。
実施例 ３
実施例１に示した組成を有する反応液０．５ ＲＩＫＯ
１５，１Ｇ、１５．２０ｐＭのテストステｐンを含有す
る溶液ｌＯμ！を添加して、実施例１と同様の操作で反
応を行った。その結果は第３図に示ス通ルで、テストス
テロンにお−ても極めて良好な定量性が得られた。
１５，１Ｇ、１５．２０ｐＭのテストステｐンを含有す
る溶液ｌＯμ！を添加して、実施例１と同様の操作で反
応を行った。その結果は第３図に示ス通ルで、テストス
テロンにお−ても極めて良好な定量性が得られた。
実施例ｄ
実施例２に示した組成の反応液ＬＯｄをガルバニ−型酸
素電極を装着し喪反応檜に加え、３７℃に保温した。こ
れに各々０．５．１Ｏ１）５，２０βＭのプレグネノロ
ンを含有する溶液ｌＯμｌを添加して、１０分間３７℃
にて反応させたときの酸素消費量を測定した。その結果
は第４図に示す通りで、極めて高感度に測定できた。
素電極を装着し喪反応檜に加え、３７℃に保温した。こ
れに各々０．５．１Ｏ１）５，２０βＭのプレグネノロ
ンを含有する溶液ｌＯμｌを添加して、１０分間３７℃
にて反応させたときの酸素消費量を測定した。その結果
は第４図に示す通りで、極めて高感度に測定できた。
実施例５
実施例ＩＫ示した反応液に、被検液として０．５、工０
．１５．２０，２５μＭのプレグネノロン、アンドロス
テロン、デヒドロイソアンドロステロンまたはアンドロ
ステンジオン−３β、１７β−ジオンを含有°する溶液
２０μｊを添加し、実施例ＩＫ記したと同様の操作を行
って測定した。
．１５．２０，２５μＭのプレグネノロン、アンドロス
テロン、デヒドロイソアンドロステロンまたはアンドロ
ステンジオン−３β、１７β−ジオンを含有°する溶液
２０μｊを添加し、実施例ＩＫ記したと同様の操作を行
って測定した。
その結果は第５図に示す通りであった。
図中０−○＝プレグネノロン、・−・：アンドロステロ
ン、Δ−Δ：デヒドロイソアンドロステロン、ムーム：
アンドロステロン−３β、１７β−ジオールを示す。
ン、Δ−Δ：デヒドロイソアンドロステロン、ムーム：
アンドロステロン−３β、１７β−ジオールを示す。
実施例６
プレグネノロンｔ−ｏ、５．１Ｏ１）５，２０゜２５μ
Ｍの濃度になるようにへ崩清に添加して被検液とした。
Ｍの濃度になるようにへ崩清に添加して被検液とした。
この被検液２０μｌを実施例１に示した反応液に添加し
、その他は実施例１に示した方法で反応を行い、プレグ
ネノロンを測定した。
、その他は実施例１に示した方法で反応を行い、プレグ
ネノロンを測定した。
その結果は第６図に示す通りで良好な回収率が得られた
。
。
第１図および第２図は本発明方法によるプレグネノセン
の測定結果を示し、第３図は本発明方法によるテストス
テロンの測定結果を示し、第４図は本発明方法によるプ
レグネノロンの測定結果を示し、第５図は本発明方法に
よるプレグネノセン、アンドロステンジオン、デヒドロ
イソアンドロステロン、アンドロステロン−３β、１７
β−ジオールの測定結果を示し、第６図は本発明方法に
よるプレグネノロンの測定結果を示す。 手続補正書 − 昭和６０年１０月７日
の測定結果を示し、第３図は本発明方法によるテストス
テロンの測定結果を示し、第４図は本発明方法によるプ
レグネノロンの測定結果を示し、第５図は本発明方法に
よるプレグネノセン、アンドロステンジオン、デヒドロ
イソアンドロステロン、アンドロステロン−３β、１７
β−ジオールの測定結果を示し、第６図は本発明方法に
よるプレグネノロンの測定結果を示す。 手続補正書 − 昭和６０年１０月７日
Claims (9)
- （１）被検液中の３β−ヒドロキシステロイドまたは３
−ケトステロイドの定量において、３β−ヒドロキシス
テロイド、３−ケトステロイド、３β−ヒドロキシステ
ロイド・オキシダーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、
酸素（Ｏ＿２）および過酸化水素（Ｈ＿２Ｏ＿２）の成
分の関与する下記サイクリング反応〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 を形成せしめるように被検液中の成分とサイクリング反
応〔 I 〕を形成する成分とを反応せしめ、次いで反応
によつて生ずる検出できる変化の量を定量することを特
徴とする新規な高感度酵素的測定法。 - （２）サイクリング反応〔 I 〕において、１分子のＨ
＿２Ｏ＿２と１分子の還元型ＮＡＤを消費して２分子の
水分子と１分子のＮＡＤを生成する反応を触媒するＮＡ
Ｄペルオキシダーゼを作用せしめ、次いで反応によつて
生ずる検出できる変化の量を定量してなる特許請求の範
囲第１項記載の測定法。 - （３）検出できる変化の量が、還元型ＮＡＤ消費量であ
る特許請求の範囲第２項記載の測定法。 - （４）サイクリング反応〔 I 〕における生成ＮＡＤ（
Ｐ）において、ＮＡＤ（Ｐ）を基質とする第２のデヒド
ロゲナーゼおよびそのデヒドロゲナーゼ用基質化合物を
用いて生成ＮＡＤ（Ｐ）に作用せしめ、ＮＡＤ（Ｐ）を
還元型ＮＡＤ（Ｐ）にサイクリングせしめてなる第２サ
イクリング反応を形成せしめることを含む特許請求の範
囲第１項記載の測定法。 - （５）検出できる変化の量が、Ｏ＿２消費量である特許
請求の範囲第１項記載の測定法。 - （６）検出できる変化の量が、Ｈ＿２Ｏ＿２生成量であ
る特許請求の範囲第１項記載の測定法。 - （７）検出できる変化の量が、還元型ＮＡＤ（Ｐ）消費
量である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 - （８）３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが
、シュードモナス テストステロニ（Ｐｓｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｔｅｓｔｅｒｏｎｉ）が産生する酵素である特許
請求の範囲第１項記載の測定法。 - （９）３β−ヒドロキシステロイド・オキシダーゼが、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、
ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｕｍ）属、コ
リネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属また
はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属が
産生する酵素である特許請求の範囲第１項記載の測定法
。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15143884A JPS6131097A (ja) | 1984-07-23 | 1984-07-23 | 新規な高感度酵素的測定法 |
| DE3526334A DE3526334C2 (de) | 1984-07-23 | 1985-07-23 | Hochempfindlicher quantitativer enzymatischer Assay |
| FR8511228A FR2567906B1 (fr) | 1984-07-23 | 1985-07-23 | Procede de dosage enzymatique tres sensible |
| US06/757,953 US4791057A (en) | 1984-07-23 | 1985-07-23 | Highly sensitive enzymatic assay method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15143884A JPS6131097A (ja) | 1984-07-23 | 1984-07-23 | 新規な高感度酵素的測定法 |
Publications (2)
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|---|---|
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| JPH0542270B2 JPH0542270B2 (ja) | 1993-06-28 |
Family
ID=15518609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15143884A Granted JPS6131097A (ja) | 1984-07-23 | 1984-07-23 | 新規な高感度酵素的測定法 |
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