DE69213421T2

DE69213421T2 - Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Faktor VII-Konzentrates mit einer hohen Reinheit

Info

Publication number: DE69213421T2
Application number: DE69213421T
Authority: DE
Inventors: Bernard Dazey; Sylvia Enfedaque-Morer; Mohamed Hamsany
Original assignee: AQUITAINE DEV TRANSF SANGUINE
Current assignee: AQUITAINE DEV TRANSF SANGUINE
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2012-12-02
Also published as: FR2684999B1; GR3021875T3; DE547932T1; JPH05345799A; DE69213421D1; ES2056782T3; EP0547932A1; JP2533050B2; GR930300094T1; ATE142255T1; DK0547932T3; FR2684999A1; US5344918A; ES2056782T1; EP0547932B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats von aktiviertem Faktor VII hoher Reinheit, weiches im wesentlichen frei von Vitamin K-abhängigen Faktoren und den Faktoren VIIIC und VIIICAg ist, sowie das durch dieses Verfahren erhaltene Produkt.
Der für die Herbeiführung der Hämostase bei Hämophilen mit zirkulierenden Antikörpern verantwortliche Koagulationsfaktor ist bekannt als aktivierter Faktor VII. Er ist in der Zusammensetzung von aktivierten Prothrombinkonzentraten, wie beispielsweise FEIBA oder AUTOPLEX , zu finden.
Verschiedene Literaturstellen, wie die WO-A-89112097, WO-A-83/00016, EP-A-0 225 160, US-A-4 637 932 und FR-A-2 622 108 haben die wirksame Rolle von Faktor VIIa nachgewiesen. Insbesondere im Dokument EP-B1-0 225 160 wird die Wirksamkeit von Faktor VIIa bei der Herbeiführung einer normalen Hämostase im Fall von Blutungsstörungen, die nicht durch einen Faktor VIII-Mangel oder durch Inhibitoren hervorgerufen werden, aufgezeigt.
Diese Literaturstellen sowie noch andere beschreiben verschiedene Techniken der Reinigung von Faktor VII und Faktor VIIa. Die eingesetzten Techniken sind jedoch sehr kompliziert und erfordern zahlreiche Schritte und sind schwierig bei der Anwendung in großtechnischem und medizinischem Rahmen oder mit hohen Kosten verbunden.
Beispielsweise beschreibt Pancham in der US-A4 637 932 ein Verfahren zur Reinigung von Faktoren VII und Faktoren VIIa aus einer wässerigen, Plasmaproteine enthaltenden Lösung durch Adsorption dieser Proteine auf einem Gel, welches bivalente Metalisalze mit einer Affinität für die sich an Calcium bindenden Proteine enthält, wie Tricalciumphosphat in Form von Hydroxyapatit der Firma Biorad , welches anschließend mit Hilfe eines Puffers desorbiert wird, der Salze enthält, welche die fixierten Proteine verschieben können.
Danach erfolgt eine zusätzliche Reinigung mittels Ionenaustausch-Chromatografie vom Typ DEAE (Diethylaminoethyl), wie beispielsweise unter der Handelsbezeichnung DEAE- Sephadex im Handel erhältlich, u.zw. gemäß dem in der US-A-3 717 708 beschriebenen Verfahren.
Das Dokument RESEARCH DISCLOSURE Bd. 269, September 1986, HAVANT GB, S. 564-565 enthält einen Artikel von Bjoem betreffend die Aktivierung des Koagulationsfaktors VII zu Faktor VIIa. Die beschriebene Methode besteht darin, daß eine selektive Adsorption von Faktor VII auf einer lonenaustauschersäule vom Typ DEAE- Sephadex, QAE-Sephadex oder Mono-Q von Pharmacia vorgenommen wird, um dessen Aktivierung zu bewerkstelligen. Es sei bemerkt, daß diese Methode nur dann sinnvoll erscheint, wenn von einem Faktor VII ausgegangen wird, der zuvor mittels klassischer Methoden gereinigt oder mittels gentechnischer Methoden erhalten wurde, wie auf Seite 564 ausgeführt.
Hingegen wird im Rahmen der Erfindung versucht, im Plasma vorhandenen nicht gereinigten Faktor VII zu aktivieren.
Das Dokument EP-A 0 346241 der Fondaüon Nationale de Transfusion Sanguine oder FNTS = WO-A-89/12097 = FR-A-2 632 524 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Faktor VIIa-reichen Fraktion unter Anwendung eines Schrittes zur Fixierung eines PPSB- Voreluats an Calcium nach der Zugabe eines Kallikrein-inhibitors, wie Aprotinin, wodurch ein Fremdprotein eingeführt wird, welches kontaminierenden Charakter haben kann. Der erste Aktivierungsschritt erfolgt mittels Tricalciumphosphat, für das der Faktor VII eine große Affinität zeigt, dann werden Desoprtionsschritte mit Salzen durchgeführt, die die an Calcium fixierten Proteine wieder abtrennen können, wie Mono- oder Dinatriumphosphat, und die Aktivierung des Faktors VII wird durch eine Aktivierung mit Kaolin oder Celit vervollständigt. Vor der Virusinaktivierung wird Antithrombin III zugegeben, um jegliche vorzeitige Ausfällung zu vermeiden (Spalte 5, Bsp. 2, Z. 31 bis 36). Schließlich wird eine Virusinaktivierung ausgeführt, und danach entfernt man die Inaktivierungsmittel mittels Chromatografie auf einer Q-Sepharose-Säule. Zuletzt gibt man wieder Albumin zu, um die Proteine zu stabilisieren (Bsp. 2, Spalte 5, Z. 4547). Somit ist dieses Verfahren kompliziert, erfordert während des Ablaufs die Überprüfung der Aktivierung und überdies die Zugabe von drei Fremdproteinen, nämlich Aprotinin, Antithrombin III und Albumin, was ein potentielles Kontaminationsrisiko darstellen kann. Schließlich enthält der erhaltene Faktor VII noch nicht zu vernachlässigende Mengen an weiteren Koagulationsfaktoren, wie aus der Tabelle in Spalte 6 hervorgeht, u.zw. insbesondere Faktor II, Faktor IX und Faktor X, was das Thrombogeneserisiko bezeugt.
Im Dokument US-A4 473 553, ZUFFI, wird zuerst von einer Cohn-Fraktion gesprochen, die durch eine oder mehrere Aussalzungen des Ausgangsplasmas mit Alkohol gebildet wird. Diese Cohn-Fraktion wird danach mit einer Mischung behandelt, welche zum Großteil Calciumchlorid mit einer geringen Menge eines polyanionischen Adsorptionsmittels, das Dextransulfat (Beispiel 1) oder Heparin (Beispiel 2) sein kann, enthält, um die Lipoproteine durch Ausfällung zu entfernen. In dieser Mischung hat das Dextransulfat keine nachweisbare aktivierende Wirkung. Die Aktivierung des Faktors VII findet zuletzt mit Hydroxyapatit statt.
Die Erfindung unterscheidet sich von diesem Dokument, indem sie unmittelbar Plasma verwendet, welches nur mit Dextransulfat-Kügelchen ohne Ausfällung von Lipoprotein in diesem Stadium direkt aktiviert wird, was das Verfahren in der Folge vereinfacht und einen sehr guten Aktivierungsgrad liefert.
Andererseits beschreiben Michalsky et al. in der FR-A-2 622 108 ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VII mittels Adsorptionschromatografie auf DEAE Sepharose mit anschließender Elution mittels einer Pufferlösung mit 0,18 bis 0,20 M NaCl, wodurch ein Faktor VII mit einer spezifischen Aktivität, die zwischen 0,8 und 1 liegt, erhalten wird, was einen sehr geringen Reinheitsgrad darstellt.
Schließlich ist im Artikel von Hedner und Kiesel in 3. Clin. (1983), 71, S 1836-1841 die Verwendung von menschlichem aktivierten Faktor VII bei der Behandlung zweier Patienten beschrieben, welche an Hämophilie A leiden, mit einem hohen Anteil an Inhibitoren. Bei ihrer Behandlung verwenden die Autoren als aktivierten Faktor VII einen Faktor VII, der mittels Ionenaustausch-Chromatografie gereinigt wurde (siehe 5. 1837, linke Spalte), u.zw. mit Hilfe einer DEAE-Sepharose -Saule unter Eluieren mit Pufferlösungen, die Calciumchlorid enthalten. Faktor VII wird durch den Einsatz von aktiviertem Faktor XII aktiviert, welcher seinerseits durch Aktivierung mit menschlichem Kallikrein in Gegenwart von Dextransulfat erhalten wird. Diese Vorgangsweise ist ebenfalls kompliziert und bedingt die Zuführ von exogenen Proteinen, nämlich von aktiviertem Faktor XII und Kallikrein, die am Ende des Reinigungsschrittes entfernt werden müssen, um einen aktivierten Faktor VII sehr hoher Reinheit zu erhalten.
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung liegt somit darin, das neue technische Problem zu lösen, welches in der Bereitstellung einer Lösung besteht, die die Herstellung von aktiviertem Faktor VII hoher Reinheit, der im wesentlichen frei von Vitamin K-abhängigen Faktoren und den Faktoren VIIIC und VIIICAg ist, gestattet.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht auch noch darin, dieses neue technische Problem durch den Einsatz einer Lösung zu überwinden, die keinen Einsatz von exogenen Proteinen zur Aktivierung von Faktor VII benötigt.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, das oben aufgezeigte neue technische Problem mit einer einfachen Lösung, insbesondere im Aktivierungsschritt des Faktors VII und ebenso in den eigentlichen Reinigungsschritten zu überwinden.
Zum ersten Mal wird das oben aufgezeigte technische Problem durch die vorliegende Erfindung auf eine einfache, relativ kostengünstige, in großtechnischem und medizinischem Maßstab anwendbare Weise gelöst, indem ein aktivierter Faktor VII hoher Reinheit geschaffen wird, welcher im wesentlichen frei von Vitamin K-abhängigen Faktoren und den Faktoren VIIIC und VIIICAg ist.
Daher schafft die vorliegende Erfindung gemaß einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats von hochreinem aktivierten Faktor VII, welches die Verwendung eines kryopräzipitatfreien Plasmas, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, sowie mindestens einen Reinigungsschritt durch mindestens eine Chromatografie auf einem Anionenaustauscherharz sowie einen Aktiverungsschritt des Faktors VII umfaßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß man zunächst die direkte Aktivierung des Faktors VII in dem von Kryopräzipitat befreiten Plasma ohne Zuführ von exogenen Proteinen durch die Verwendung von im Plasma unlöslichem Dextransulfat in Pulverform durchführt. Vorzugsweise wird das Dextransulfat in Form von Kügelchen verwendet. Die Größe der Kügelchen ist nicht kritisch, und man kann handelsübliche Dextransulfatkügelchen, wie die von Sigma unter der Referenz D5650 vertriebenen, verwenden. Es sei bemerkt, daß keinerlei Spezialbehandlung dieser Kügelchen vor deren Verwendung notwendig ist, was ebenfalls einen bedeutenden Vorteil der Erfindung darstellt.
Gemäß einem weiteren vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Schritt zur Aktivierung des Faktors VII vorzugsweise mit Dextransuifat in Kälte bei kontrollierter Temperatur, vorteilhafterweise im Bereich von 0ºC und +4ºC, durchgeführt, wodurch sich eine sehr gute Aktivierung des Faktors VII zu Faktor VIIa erzielen laßt.
Gemäß einem anderen vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemaßen Verfahrens erfolgt nach dem Aktivierungsschritt eine DEAE-Anionaustausch-Chromatografie des von Kryoprazipitat befreiten, den aktivierten Faktor VII sowie nicht aktivierten Faktor VII enthaltenden Plasmas derart, daß im wesentlichen alle Vitamin K-abhängigen Faktoren selektiv adsorbiert werden, d.h. in erster Linie umfassend den aktivierten Faktor VII, den nicht aktivierten Faktor VII, Faktor IX, Faktor X und Faktor II. Daher besteht das Ziel dieser selektiven Adsorption in der Entfernung eines bedeutenden Teils der unerwünschten Proteine, wie Albumin.
Gemaß einem noch anderen vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemaßen Verfahrens wird eine nicht selektive Desorption aller auf der DEAE-Ionenaustauschersäule adsorbierten Vitamin K-abhangigen Faktoren durchgeführt. Dazu kann man mit jeder dem Fachmann zur Durchführung dieser Desorption auf dieser Art von Gel wohlbekannten Elutions-Pufferlösung eluieren.
Danach wird das erhaltene Eluat, das sämtliche Vitamin K-abhängige Faktoren enthält, neuerlich über eine spezifische Anionenaustauschersäule vom quaternären Amintyp, vorzugsweise vom Typ Q-Sepharose Fast Flow von Pharmacia, welche in Form von zu etwa 6 % vernetzten Agarosekügelchen mit vorzugsweise einem kleinen C&sub1;-C&sub6;-Spacerarm vorliegt, derart geleitet, daß alle Vitamin K-abhängigen Faktoren selektiv adsorbiert werden.
Diese Adsorption der Vitamin K-abhängigen Faktoren auf dieser Säule auf spezifische Weise gestattet auch die Entfernung weiterer kontaminierender Proteine, wie α-Antitrypsin und Ceruloplasmin.
Diese selektive Adsorption auf einer Säule vom quaternären Amintyp stellt ein patentierbares Merkmal des Verfahrens unabhängig von der Aktivierung des Faktors VII dar. Dasselbe gilt für die selektive Desorption, auf die im folgenden eingegangen wird. Vorzugsweise ist die Lösung für die selektive Adsorption eine Pufferlösung mit 150 mM NaCl, 4 mM Trinatriumcitrat und pH 6.
Anschließend wird eine selektive Desorption des aktivierten Faktors VII und des nicht aktivierten Faktors VII durchgeführt, indem eine Elution der Säule mit einer Pufferlösung zur selektiven Desorption mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt wird:
NaCl .... 250 mM
Trinatriumcitrat .... 4 mM
pH 6
Das erhaltene Eluat, welches im wesentlichen aktivierten und nicht aktivierten Faktor VII in wassenger Form, im wesentlichen frei von anderen Vitamin K-abhängigen Faktoren enthält, wird danach einem Schritt zur Virusinaktivierung auf bekannte Weise unterzogen, beispielsweise durch den Einsatz einer Mischung von TNBP/Tween unter Einhaltung eines gegenseitigen Verhältnisses von 0,3 % TNBP und 1 % Tween, bezogen auf die Gesamtkonzentration der Lösung von aktiviertem Faktor VII/Faktor VII, vorzugsweise während 6 h bei 24ºC unter Rühren entsprechend dem im Dokument EP-A-0 131 740 bzw. US-A-4 540 573 beschriebenen Verfahren.
Nach der Inaktivierung ist es notwendig, die restliche Mischung der Inaktivatoren TNBP/Tween zu entfernen, und es wird neuerlich eine Adsorption auf der gleichen Q- Sepharose Fast Flow -Säule mit einer Pufferlösung durchgeführt, die die selektive Adsorption gestattet, namlich 150 mM NaCl, 4 mM Trinatriumcitrat und pH 6.
Auf diese Adsorption folgt anschließend die Desorption mit der gleichen Desorptionslösung (250 mM NaCl, 4 mM Trinatriumcitrat, pH 6), wodurch ein Eluat erhalten wird, welches den hochreinen aktivierten Faktor VII und den nicht aktivierten Faktor VII im wesentlichen frei von Vitamin K-abhängigen Faktoren sowie den Faktoren VIIIC und VIIICAg enthält.
Danach kann man dieses Eluat auch gegen einen Puffer diafiltrieren, der vorzugsweise für die Injektion beim Menschen kompatibel ist (wie ein Puffer aus 100 mM NaCl, 4 mM Trinatriumcitrat, 3 g/l Lysin, pH 7), welcher vorteilhafterweise auf einen Gehalt an aktiviertem Faktor VII von 5000 IU pro 20 ml-Fläschchen konzentriert und durch Filtration über einen Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm sterilfiltriert werden kann, worauf gewünschtenfalls eine Lyophilisierung vorgenommen werden kann.
Es sei bemerkt, daß es mit dem erfindungsgemaßen Verfahren möglich ist, nicht nur einen Faktor VII hoher Reinheit, sondern auch einen sehr hohen Aktivierungsgrad des Faktors VII zu erreichen.
Aus diesem Grund bedeutet der Ausdruck "aktivierter Faktor VII hoher Reinheit" in der Beschreibung und in den Ansprüchen, daß das Verhältnis von Faktor VIIa/Faktor VII höher als 5, vorzugsweise höher als 7 und noch bevorzugter etwa 10 ist, während die spezifische Aktivität des aktivierten Faktors VII über 200 IU/mg Protein beträgt. Die thrombogene Aktivität gemaß dem freien Thrombin-Test ist nach 6 h bei 37ºC negativ.
Unter die Erfindung fällt auch der durch das zuvor beschriebene Verfahren erhaltene aktivierte Faktor VII hoher Reinheit.
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen klar aus der folgenden erläuternden Beschreibung unter Bezugnahme auf zwei Herstellungsbeispiele hervor, welche einfach zur Illustration angeführt sind und den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. In diesen Beispielen verstehen sich, wenn nicht anders angegeben, die Prozentangaben als Gewichtsprozent.

Beispiel 1

5 l kryopräzipitatfreies Plasma, das auf 4ºC gehalten wird, werden auf einen Ionenstärke von < 140 mM NaCl eingestellt.
Chargenweise werden 0,1 g Dextransulfatkügelchen (Sigma D5650) pro Liter Plasma zugegeben. Nach 1 h Rühren bei 4ºC wird dekantiert und der Überstand gewonnen, um 90 min lang mit 0,5 g/l DEAE Sephadex A50 inkubiert zu werden. Nach dem Dekantieren wird das Gel, auf dem sämtliche Vitamin K-abhängigen Faktoren fixiert sind, mit 11 Puffer aus 4 mM Trinatriumcitrat, 140 mM NaCl, pH 7 gewaschen, wodurch u.a. Albumin entfernt werden kann. Die Vitamin K-abhängigen Faktoren werden danach mit dem gleichen Puffer, dessen Ionenstärke auf 500 mM NaCl erhöht wurde, gewaschen. Man gewinnt 500 ml Eluat 1.
Diese Eluat 1 wird diafiltriert und mit einer Kassette mit einer Durchlaßschwelle von 10 Kd gegen einen Puffer aus 4 mM Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 6, auf 250 mi konzentriert.
Diese Lösung wird auf einer Säule mit 9 cm Durchmesser, enthaltend 300 ml Q- Sepharose Fast Flow -Gel (Pharmacia) und mit demselben Puffer equilibriert, chromatografiert. 5 l dieses Puffers gestatten die Entfernung von α-Antitrypsin und Ceruloplasmin. Die Faktoren VII/VIIa werden spezifisch desorbiert, indem die Ionenstärke auf 250 mM NaCl erhöht wird, man erhält etwa 2 l Eluat II.
Das Eluat II wird anschließend 6 h lang bei 24ºC unter Rühren einem Virusinaktivierungsschritt mit einer derartigen TNBP/Tween-Mischung unterzogen, daß die Endkonzentration in der Faktor VII(VIIa-Lösung 0,3 % TNBP und 1 % Tween beträgt.
Nach der Inaktivierung wird die Lösung diafiltriert und auf 250 ml konzentriert, u.zw. gegen den Puffer, der zur Equilibrierung der zuvor genannten Q Sepharose Fast Flow -Säule gedient hat (4 mM Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 6). Die Lösung wird neuerlich über Q Sepharose Fast Flow chromatografiert, u.zw. mit 2 l Waschlösung, die identisch mit dem Equilibrierungspuffer ist, wodurch die Entfernung der Inaktivatorenmischung möglich wird, indem diese in die nicht zurückgehaltene Fraktion geleitet wird. Mit dem Puffer aus 4 mM Trinatriumcitrat, 250 mM NaCl, pH 6, werden die Faktoren VII/VIIa gegenüber den anderen Vitamin K-abhängigen Faktoren selektiv eluiert, um ein Eluat III zu erhalten. Dieses Eluat von 2 l wird danach gegen einen Puffer diafiltriert, der mit der Injektion beim Menschen kompatibel ist (4 mM Trinatriumcitrat, 100 mM NaCl, 3 g/l Lysin, pH 7), und auf einen Gehalt von 5000 IU Faktor VIIa pro 20 ml-Fläschchen konzentriert und dann lyophilisiert.
Die mit dem erfindungsgemaßen Verfahren im Rahmen von vier Pilotversuchen an jeweils 5 l kryopräzipitatfreiem Plasma sowie für Vergleichszwecke an einem Kontroll-Lot gemaß demselben Verfahren, aber unter Weglassung des Aktivierungsschritts mit Dextransulfat, erzielten Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Die Ergebnisse in Tabelle I sind in Internationalen Einheiten ausgedrückt. Die Bestimmungen erfolgten in verschiedenen Stadien des Verfahrens, wie dies für den Fachman bei Betrachtung der Tabelle I wohl klar ist. TABELLE I
*PDC = kryopräzipitatfreies Plasma
Q1 : 1. Adsorptions-Chromatografie auf Q Sepharose Fast Flow
Q2 : 2. Adsorptions-Chromatografie auf Q Sepharose Fast Flow
LYO: Lyophllisation.
Biologische Kenndaten des Faktor VIIa-Konzentrats nach der Rekonstitution mit 20 ml destilliertem Wasser:
VIIa : 172 ± 27 UI/ml
VII : 14,3 ± 1,4 UI/ml
VIIAg : 0,88 ± 0,22 UI/ml
VIIa/VII : 12 ± 2,5
Proteingehalt : 0,82 ± 0,07
AS VIIa : 208 ± 36
AS VII : 17,5 ± 1,6
II/IIa : < 0,1 UI/ml
IX/IXa : < 0,1 UI/ml
XI/Xa : < 0,1 UI/ml
VIIIC : < 0,1 UI/ml
VIIICAg : < 0,1 UI/ml
Die Dosierungen der Koagulationsfaktoren erfolgen durch zeitliche Messungen der Verkürzung der Koagulationszeit eines Mangelplasmas bei einem fehlenden Faktor. Dieser Faktor wird mit der Probe eingebracht.
Der Grad der Aktivierung des Faktors VII wird unter Verwendung von menschlichem Thromboplastin und Rinder-Thromboplastin gemaß der von Van Deijk et al., Haemostasis 13, 1983, beschriebenen Methode bestimmt.
Der aktivierte Faktor VII hat eine größere Affinität zu Rinder-Thromboplastin als der Faktor VII, während die Affinität für menschliches Thromboplastin bei beiden gleich ist. Der Aktivierungsgrad wird ausgedruckt durch das Verhältnis

Faktor VII mit Rinder-Thromboplastin

Faktor VII mit Human-Thromboplastin
Zum Vergleich ist dieses Verhältnis 1 in normalem Humanplasma.

Beispiel 2: Mit einer Großserie von 300 l Plasma erzielte Ergebnisse

Es wird vorgegangen, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß zu Beginn 300 l Plasma verwendet werden.
Die erzielten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II ausgedruckt. TABELLE II
PDC, Q1, Q2 und LYO: Bedeutungen siehe Tabelle I.
Biologische Kenndaten des Faktor VIIA-Konzentrats nach der Rekonstitution mit 20 ml destilliertem Wasser:
VIIa : 244 UI/ml
VII : 32,5 UI/ml
VIIa/VII : 7,5
Proteingehält : 1 g/l
AS VIIa : 244
AS VII : 32,5
II/IIa : < 0,1 UI/ml
IX/IXa : < 0,1 UI/ml
X/XA : < 0,1 UI/ml
VIIIC : < 0,1 UI/ml
VIIICAg : < 0,1 UI/ml
Aus den voranstehenden Beispielen und den die Ergebnisse aufzeigenden Tabellen ist daher ersichtlich, daß sich beim Kontroll-Lot ohne anfängliche Aktivierung das Verhältnis VII/VIIa nicht wesentlich verändert hat, well es nahe beim Ausgangsverhältnis von 1,5 von normalem Plasma liegt.
Weiters gestattet die Erfindung neben der Tatsache, ein sehr gutes Aktivierungsverhältnis zu erreichen, auch die Erzielung eines hervorragenden Reinheitsgrades des Faktors VII mittels eines äußerst einfachen, leicht durchführbaren Verfahrens mit sehr guter Reproduzierbarkeit.
Außerdem weist das erfindungsgemaße Produkt eine sehr schwache thrombogene Aktivität auf. Der freie Thrombin-Test (Europäische Pharmakopöe 2. Ausgabe, 554) ist nämlich nach 6 h bei 37ºC mit dem erfindungsgemäßen Produkt negativ, was ein bevorzugtes wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Produkts darstellt, wodurch sich dieses von den Produkten des Standes der Technik unterscheidet. Die mittels anderer Verfahren erhaltenen aktivierten Faktor VIL-Konzentrate sowie die aktivierten Prothrombinkonzentrate des Standes der Technik, wie beispielsweise FEIBA oder AUTOPLEX , haben nämlich vor 6 h eine positive thrombogene Aktivität.
Es sei auch bemerkt, daß das erfindungsgemäße Konzentrat an aktiviertem Faktor VII wegen seiner Reinheit nicht mit Antithrombin III behandelt wird und somit kein Risiko einer vorzeitigen Koagulation in sich birgt.
Außerdem erfordert das erfindungsgemäße Konzentrat an aktiviertem Faktor VII insbesondere in Hinblick auf die Lyophilisierung aufgrund seiner Reinheit für seine Stabilität nur den Einsatz von Lysin, wahrend die älteren Produkte zur Lyophilisierung den Einsatz von Albumin benötigten, weshalb die Kosten verringert werden und die Injektion eines für den Patienten unnötigen Proteins vermieden wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats an hochreinem aktiven Faktor VII, das die Verwendung eines vom Kryopräzipitat befreiten Plasmas, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, sowie mindestens einen Reinigungsschritt durch mindestens eine Chromatographie auf einem Anionenaustauscherzharz, sowie einen Aktivierungsschritt des Faktors VII umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst die direkte Aktivierung des Faktors VII in dem vom Kryopräzipitat befreiten Plasma ohne Zufuhr von exogenen Proteinen durch die Verwendung von in dem Plasma unlöslichem Dextransulfat in Pulverform durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Dextransulfat in Form von Kügelchen verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt zur Aktivierung des Faktors VII vorzugsweise mit Dextransulfat in der Kälte unter kontollierter Temperatur, vorteilhafterweise im Bereich von 0 bis +4 ºC, durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Aktivierungsschritt eine DEAE- Anionenaustauschchromatographie des vom Kryoprazipitat befreiten, den aktiven Faktor VII sowie den nicht aktiven Faktor VII enthaltenden Plasmas so ausführt, daß alle Vitamin K-abhängigen Faktoren selektiv adsorbiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nicht selektive Desorption aller auf der DEAE-Ionenaustauschersäule adsorbierten Vitamin K-abhängigen Faktoren durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene Eluat, das die Vitamin K-abhängigen Faktoren enthält, erneut durch eine spezifische Anionenaustauschersäule vom quartären Aminotyp, vorzugsweise vom Typ Q-Sepharose Fast Flow von PHARMACIA, das in Form von zu etwa 6% vernetzten Agarosekügelchen vorliegt und vorzugsweise einen kleinen C&sub1;-C&sub6;-Spacerarm enthält, so durchgeleitet wird, daß alle Vitamin K-abhängigen Faktoren selektiv adsorbiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend eine selektive Desorption des aktiven und nicht aktiven Faktors VII durchführt, indem eine Elution der Säule mit einer Pufferlösung zur selektiven Desorption mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt wird:

- NaCl 250 mM

- Tri-Na-citrat 4 mM

- pH 6

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene Eluat, das im wesentlichen den aktiven Faktor VII und den restlichen nicht aktiven Faktor VII in wäßriger, im wesentlichen von anderen Vitamin K-abhangigen Faktoren befreiter Form enthält, einen weiteren Schritt zur Inaktivierung von Viren durchläuft, beispielsweise durch 6-stündige Verwendung einer Mischung von TNBP/Tween bei 24ºC unter Rühren, wobei man einen relativen Anteil von 0,3 % TNBP und 1 % Tween im Verhältnis zur Gesamtkonzentration der Lösung von aktivem Faktor VII/Faktor VII einhält, wonach die Inaktivierungsmischung durch Adsorption auf der gleichen Säule mit der gleichen Pufferlösung beseitigt wird, wodurch die selektive Adsorption (NaCl 150 mM, Tri-Na-citrat 4 mM und pH 6) bei selektiver Desorption mit der gleichen selektiv desorbierenden Pufferlösung sichergestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Diafiltration gegen eine Pufferlösung, die vorzugsweise bei Injektion in Menschen verträglich ist, wie etwa eine Pufferlösung aus 100 mM NaCl, 4 mM Tri-Na-citrat, 3g/l Lysin und pH 7, durchgefährt wird.

10. Verfahren nach anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Konzentration auf einen Wert von 5000 IU des aktiven Faktors VII pro 20 ml-Kolben vorgenommen wird, indem man durch einen Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm sterilfiltriert und anschließend eine Lyophilisierung durchführt.