DE3853740T2

DE3853740T2 - Bifunktionelle Antikörperkonstruktionen und Verfahren zur selektiven Tötung von Zellbeständen.

Info

Publication number: DE3853740T2
Application number: DE3853740T
Authority: DE
Inventors: Walter A Blattler; John M Lambert; Stuart F Schlossman; Charles F Scott
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1987-06-10
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2008-06-02
Also published as: ATE122238T1; EP0294703A2; EP0294703A3; JPS643128A; EP0294703B1; DE3853740D1; ES2073394T3

Description

Die Erfindung betrifft neue Antikörperkonstrukte und ihre Verwendung zur selektiven Zerstörung von Zellpopulationen. Tnsbesondere betrifft die Erfindung neue bifunktionale Antikörperkonstrukte, ausgewählt aus heterodimeren Antikörperkonjugaten (im folgenden manchmal als "Antikörper-Heterodimere" bezeichnet), die eine duale Bindungsspezifität sowohl zu aktivierten Lymphocyten als auch Zelloberflächenmolekülen aufweisen, und die Erfindung betrifft die Verwendung zur Zerstörung spezifischer Zielzellen, einschließlich Tumorzellen oder anderer erkrankter Zellen, durch Rekrutieren aktivierter Lymphocyten, wie aktivierter T-Zellen und natürlicher Killerzellen, für den selektiven Angriff auf die Zielzellen mittels der neuen Antikörperkonstrukte.
Die Verwendung aktivierter Populationen von Lymphoidzellen zur Lyse oder Abtötung von Tumorzieizellen bei der Therapie von Neoplasie hat sich seit kurzem zum Objekt intensiver Forschungen entwickelt (Staerz W.D. und Bevan M.J., Immunol. Today 7:241-245 (1986)). Insbesondere Populationen von peripheren Lymphocyten, aktiviert durch das T-Zellen abgeleitete Glycoprotein, Interleukin-2 (IL-2), das heißt, Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK-Zellen), wurden erfolgreich zur Behandlung von Tumoren in vivo in Tiermodellen eingesetzt (Mazumler A. und Rosenberg S.A. J. Exp. Med. 159, 495-507 (1984)) und sie wurden seit jüngster Zeit zur Behandlung von humanen Tumoren, die resistent gegenüber standardtherapeutischen Maßnahmen sind, eingesetzt (Rosenberg S.A. et al, NEJM 316, 889-897 (1987)). Diese Behandlungsform ist jedoch eingeschränkt durch die Toxizität von IL-2, das in äußerst großen Dosen gegeben werden muß, um wirksam zu sein (Rosenberg S.A., et al, NEJM 316, 889-897 (1987)). Daher hat sich die Aufmerksamkeit auf potentiell weniger toxische Maßnahmen in der in vitro- und in vivo-Aktivierung dieser Zellen verschoben, während jedoch das Konzept der Verwendung aktivierter lymphoider Zellen zur Behandlung bösartiger Tumore von großem Interesse bleibt.
Lymphoidzellen exprimieren eine Vielzahl zellinienspezifischer Oberflächenantigene, von denen einige direkt an der Aktivierung dieser Zellen für eine cytolytische Funktion beteiligt sind (Reinherz E.L., Meuer S.C. und Schlossman S.E., Immunol. Rev. 74, 83-112 (1983)). Bislang wurde gezeigt, daß zwei Hauptoberflächenstrukturen auf Lymphoidzellen an dieser cytolytischen Aktivierung beteiligt sind, nämlich der T-Zellen-Antigenrezeptor/T3- Komplex (TCR-T3) und T11 Molekül, ebenfalls als E-Rosett- Rezeptor bekannt (Meuer S.C., et al, Cell 36, 897-906 (1984) und Oettgen H.C. und Terhorst C., Human Immunol. 18, 187-204 (1987)). TCR-T3 wird auf allen reifen cytolytischen T-Zellen (CTL) exprimiert, und auf ein paar "natürlichen Killerzellen" (NK-Zellen), und T11 wird sowohl auf CTL und NK-Zellen exprimiert (Reinherz E.L., et al, Immunol. Rev. 74, 83-112 (1986); Schmidt R. et al, J. Exp. Med. 164, 351- 356 (1986)). Insbesondere wurden gezeigt, daß bestimmte Antikörper gegen den TCR-T3-Komplex oder gegen T11 das Abtöten durch CTL oder NK-Zellen induzieren und/oder verstärken (Spitz H., et al, Eur. J. Immunol. 15, 85-91 (1985); Siliciano R.F. et al, Nature 317, 428-429 (1985)). Ferner wurde in jüngster Zeit gefunden, daß humane CTL zur Abtötung irrelevanter humaner Tumorziele induziert werden können (d.h. ein beliebiges humanes Ziel, nicht nur solche Zellen, für die die CTL normalerweise spezifisch sind) durch Inkubieren dieser CTL und Zielzellen in vitro in Gegenwart von bifunktionalen Hybridantikörpern oder heterodimeren Antikörperkonjugaten, die T3 oder den T- Zellenrezeptor (TCR) und eine Oberflächen-Determinante auf dem Tumor erkennen (Perez P. et al, Nature 315, 354-356 (1985); Staerz et al, Nature 314, 628-631 (1985) und PNAS 83, 53-57 (1986); Liu et al PNAS 82, 8648-8652 (1985)). Vermutlich erlaubt der Hybridantikörper oder das heterodimere Antikörperkonjugat den engen Zellkontakt zwischen der T-Zelle und der Tumorzielzelle durch einen Brückeneffekt durch den bifunktionalen Hybridantikörper oder das heterodimere Antikörperkonjugat, wobei ein Ende des Hybridantikörpers oder ein Antikörper des heterodimeren Antikörperkonjugats an die Tumorzellen bindet, und das andere Ende des Hybridantikörpers oder der andere Antikörper des heterodimeren Antikörperkonjugats an den TCR-T3-Komplex bindet und die CTL aktiviert. Während diese Strategie vielversprechend in vitro erscheint, könnte die in vivo Infusion solcher Hybridantikörper oder heterodimerer Antikörperkonjugate durch die Tatsache kompliziert werden, daß enorme Mengen an nichtaktivierten, normalen T-Zellen im Körper T3 exprimieren. Diese Zellen wurden mit den aktivierten T-Zellen um die Bindung an den Hybridantikörper oder das heterodimere Antikörperkonjugat konkurrieren. Ferner würde der Anti- T3/Tumorantikörperhybrid und die Konjugate die Mehrzahl der NK-Zellen nicht aktivieren, die T3 negativ sind.
WO-A-88/08716 beschreibt ein Antigen, bezeichnet 2H1, und Antikörper dagegen, bezeichnet als Anti-2H1. Ferner sind diese Antikörper in der Lage, die T-Zellen-Aktivierung oder die Proliferationsbindung an nichtaktivierte T-Zellen synergistisch mit einem zweiten Signal zu induzieren.
Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82, 8648 (1985) beschreiben Heteroantikörper, worin einer der monoklonalen Antikörper gegen T3 gerichtet ist, ein Antigen, das auf allen T-Zellen gefunden wird (aktivierten oder nichtaktivierten). Diese Heteroantikörper plus T-Zellen sind zur Abtötung von Zielzellen in der Lage, an die der zweite monoklonale Antikörper bindet.
Meuer et al, Cell 36, 897 (1984) beschreibt das T11-System als einen alternativen Weg der T-Zellenaktivierung, indem er die T-Zellen-Proliferation bei der Bindung von Anti- T11&sub2;- und Anti-T11&sub3;-Antikörper an T-Zellen zeigt.
Eine Aufgabe der Erfindung ist demnach, Antikörperkonstrukte zur selektiven Zerstörung von Zellpopulationen bei Verwendung dieser Antikörperkonstrukte zur Verfügung zu stellen, wobei nichtaktivierte normale T- Zellen im Körper nicht mit den aktivierten T-Zellen um die Bindung an die Antikörperkonstrukte konkurrieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung dieser Antikörperkonstrukte zur selektiven Zerstörung von Zellpopulationen, wobei die Mehrheit von sowohl den CTL- Zellen wie auch den NK-Zellen aktiviert werden.
Gegenstand der Erfindung gemäß Anspruch 1 ist ein bifunktionales heterodimeres Antikörperkonjugat, welches (a) einen Anti-Zielzellen-Antikörper umfaßt, der an (b) eine Antilymphocyt-Antikörperkomponente gebunden ist, wobei der Antilymphocyt-Antikörper spezifisch für aktivierte Lymphocyten ist, und nicht an normale nichtaktivierte Lymphocyten bindet.
Ausführungsformen dieses Antikörperkonjugats sind Gegenstand der Ansprüche 2, 3 und 4.
Ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen heterodimeren Antikörperkonjugats, wie beansprucht in den Ansprüchen 5 bis 12.
Die Abbildung zeigt Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs(FACS)-Muster, die die Bindung von Jr, Anti- T11&sub2;, Anti-T11&sub3; und den Konjugaten J5-Anti-T11&sub2; und J5- Anti-T11&sub3; an CALLA-exprimierenden und T11&sub2;/T11&sub3; - exprimierenden Zellen wiedergibt: Namalwa-Zellen (Gruppen a bis h) oder REX-Zellen (Gruppen i bis p) inkubiert mit keinem Antikörper (a, i), J5 (b, j), Anti-T11&sub2; (c, k), Anti-T11&sub3; (d, l) , Anti-T3 (e, m), J5-Anti-T11&sub2; (f, n) , J5- Anti-T11&sub3; (g, o) oder J5-Anti-T3 (h, p).
Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung einen alternativen Aktivierungsweg unter Verwendung des T11-Moleküls zur Verfügung, der mehrere Vorteile gegenüber dem oben beschriebenen bekannten TCR-T3-Aktivierungsweg bietet. Zunächst liegen T11-Moleküle auf allen NK-Zellen, wie auch den CTL-Zellen vor, und die geeigneten Anti-T11-Antikörper oder T11-Bindungsstelle als Teil eines heterodimeren Antikörperkonjugats können beide Populationen von Lymphoidzellen für die Lyse von Tumorzielen rekrutieren.
Zweitens wird das Epitop des T11-Moleküls, dessen Expression zur Aktivierung erforderlich ist, im nichtaktivierten Ruhezustand, im Gegensatz zu TCR-T3 nicht exprimiert. Diese sogenannte "T11&sub3;"-Epitop wird nur auf T11 positiven Zellen nach Aktivierung mit Mitogen, Antigen, Lymphokinen oder anderen Antikörpern, wie Anti-T11&sub2; (Meuer S.C. et al, Cell 36, 897-906 (1984)), Anti-T3 und Anti-2H1 exprimiert.
Die erfindungsgemäßen neuen bifunktionalen Antikörperkonstrukte können verwendet werden, um aktivierte Lymphocyten nur auf Zielzellen, wie Tumorzellen, zu richten. Dieses wird erreicht durch Bindung z.B. von Tumorzellen in vitro oder in vivo an die Lymphocytspezifischen/Tumorzell-spezifischen bifunktionalen Antikörperkonstrukte, wobei die Lymphocyt-spezifische Komponente ein Antikörper ist, der spezifisch für aktivierte Lymphocyten ist. Solche Antikörper umfassen z.B. den Anti-T11&sub3;-Antikörper, die Anti-TAC-Antikörper, die spezifisch für den IL2-Rezeptor sind, den Anti-Ta&sub1;- Antikörper, den Anti-T10-Antikörper, der spezifisch für das T10-Molekül ist, und die Antitransferrin- Rezeptorantikörper, die spezifisch für den Transferrin- Rezeptor sind (Meuer, S.C. et al, Cell 36, 897-906 (1984); Fox, D.N. et al, J. Imm. 133, 1250-1256 (1984); Hercendt, T. et al, Huxa. Immunol. 3, 247-259 (1981); und Robb, R.J. et al, J. Exp. Med. 160, 1126-1146 (1984)). Bei dieser Strategie bindet das Lymphocyt-spezifische/Zielzellenspezifische Antikörperkonstrukt an die Zieltumorzellen in vito oder in vivo nach Infusion in den Körper. Nachdem das Antikörperkonstrukt an die Zielzellen gebunden hat, können Lymphocyten in vivo oder ex vivo auf eine Vielzahl von Arten aktiviert werden, jedoch bevorzugt durch Behandlung der Lymphocyten mit der Kombination der Antikörper Anti- T11&sub2; und Anti-T11&sub3;, die sowohl T-Zellen wie NK-Zellen aktivieren. Diese aktivierten Lymphocyten umschließen dann die mit dem Antikörperkonstrukt mit einem Anti-Lymphocyt- Antikörper, der spezifisch für die aktivierten Lymphocyten ist, bedeckten Zielzellen, binden an das Antikörperkonstrukt, welches die Lymphocyten in Kontakt mit den Zielzellen bringt, und die gebundenen aktivierten Lymphocyten lysieren die Zielzellen.
a Diese Anmeldung offenbart die Herstellung einer Vielzahl von Antikörperkonstrukten von Anti-T11&sub3; mit Antitumor- Antikörpern. Es wurde nun gefunden, daß diese Konstrukte aktivierte T-Zellen exprimierende Zellen zur Abtötung von Tumorzielzellen veranlassen. Ferner aktivieren diese Konstrukte T11-exprimierende Zellen unter Abtötung von Tumorzielzellen, wenn die T11-exprimierenden Zellen auch Anti-T11&sub2; binden können. Auch wird die Herstellung von Kontrukten von Anti-T11&sub2; mit Antitumor-Antikörpern offenbart. Es wurde gefunden, daß diese Antikörperkonstrukte T11-exprimierende Zellen zur Abtötung von Tumorzielzellen aktivieren, wenn die T11-exprimierenden Zellen auch Anti-T11&sub3; binden.

Die bifunktionalen Antikörperkonstrukte und ihre Herstellung

Die erfindungsgemäßen bifunktionalen Antikörperkonstrukte sind
heterodimere Antikörperkonjugate.
Der Begriff "bifunktional" wird verwendet um anzuzeigen, daß die Konstrukte zwei verschiedene Bindungsspezifitäten haben. Dieser Begriff betrifft nicht die tatsächliche Anzahl von Bindungsstellen, da zum Beispiel ein heterodimeres Antikörperkonjugat normalerweise vier Bindungsstellen haben würde - zwei, die für die Zielzellen spezifisch sind, und zwei, die für die aktivierten Lymphocyten spezifisch sind.
Insbesondere umfassen erfindungsgemäß die bifunktionalen heterodimeren Antikörperkonjugate zwei miteinander verbundene Antikörper, wobei ein Antikörper für die Zielzellen spezifisch ist, und der andere Antikörper für die aktivierten Lymphocyten spezifisch ist.
Der Begriff "Zielzelle" wie hierin verwendet, bedeutet jede Zelle, einschließlich Tumorzellen oder andere erkrankte Zellen, z.B. durch Viren infizierte Zellen, durch Parasiten infizierte Zellen, usw., die abgetötet oder lysiert werden sollen.
Spezifische Beispiele von Zielzellen, die verwendet werden können, umfassen Tumorzellen, insbesondere seßhafte Tumorzellen, Virus infizierte Zellen, Parasiten infizierte Zellen, Autoimmunzellen, d.h. Zellen, die Autoantikörper produzieren, und aktivierte Zellen, d.h. solche, die bei der Transplantatabstoßung oder Transplantat/Wirtserkrankung beteiligt sind.
Der Begriff "Lymphocyt", wie hierin verwendet, bedeutet eine mononukleare Zelle, die im Blutkreislauf zirkuliert, und in Lymphknoten, Milz und den lymphatischen Geweben gefunden wird, die einen Nukleus mit einem darin dicht gepackten Chromatin und einen kleinen Cytoplasmarand nach Färbung nach Wright zeigt, und die ein Potential für eine cytolytische Funktion hat, d.h. Zielzellen lysieren kann.
Beispiele von geeigneten Lymphocyten umfassen CTL (CDB+ oder CD4+), NK-Zellen (CD2+), und T-Helferzellen (CD4+).
Auch bedeutet der Begriff "aktivierter Lymphocyt", wie hier verwendet, einen Lymphocyten, dessen cytolytische Funktion durch eine Vielzahl von Maßnahmen angeschaltet wurde, von denen einige im folgenden beschrieben sind.
Die für die Zielzellen spezifischen Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und sind von w beliebigem Isotyp: IgM, IgG, IgG2a, IgG2b, IgG&sub3;, IgG&sub4;, IgA, IGE und IGD. Ferner sollten die Antikörper human, aus Maus, Ratte, Hamster oder von einer beliebigen Säugerart stammen.
Die für die Zielzellen spezifischen Antikörper können nach üblichen Verfahren wie folgt hergestellt und gereinigt werden.
Zunächst werden Mäuse, Ratten, Hamster oder ein beliebiger anderer Säuger, einschließlich dem Menschen, mit dem betreffenden Antigen immunisiert, z.B. den intakten Zielzellen, einschließlich dem Menschen, mit dem betreffenden Antigen immunisiert, z.B. den intakten Zielzellen, aus den Zielzellen isolierten Antigenen, gesamten Viren, abgeschwächten gesamten Viren und viralen Proteinen, wie viralen Hüllproteinen. In den meisten Fällen werden die gesamten Zielzellen für die Immunisierung verwendet. Die für die Immunisierung verwendeten Antigene werden isoliert und nach üblichen Verfahren gereinigt, siehe z.B. R.I. Mishell in "Selected Methods in Cellular Immunology" (B.B. Mishell & S.M. Shiigi, Herausgeber) San Francisco, (1980), Seiten 28-65. Alternativ werden Menschen vor ihrer Immunität durch einen serologischen Test identifiziert. Solche, von denen serologisch gezeigt werden kann, daß sie die betreffenden Antikörper produzieren, d.h. Antilymphocyt-Antikörper, wie Patienten mit systemischen Lupus-Erythematosus oder anderen Autoimmunkrankheiten, oder solche, die Antitumor-Antikörper produzieren, werden ausgewählt.
Anschließend wird eine B-Zellen-Quelle (Milz, peripheres Blut, Lymphknoten, usw.) aus den immunisierten Tieren oder den vorimmunen Menschen entnommen und entweder mit einem Murinmyelome oder einem geeigneten humanen Myeloma, wie vz.B. NS-1 (P3/NS1/1-Ag4-1) (Kohler, G. et al, Eur. J. Imm. 6: 292-295 (1976) -- (ATCC Nr. TIB 18)) oder SP2/O (SP2/O- Ag14) (M. Shulman et al, Nature 276: 269-270 (1978) -- (ATCC Nr. CRL 1581)) nach üblichen Verfahren fusioniert, wie z.B. der Polyethylenglykol (PEG)-Technik, z.B. nach Oi und Hertzenberg in "Selected Methods in Cellular Immunology" (Mishell, B.B. & Shiigi S.M. Herausgeber) San Francisco, (1980) Seiten 351-368. Die fusionierten Zellen werden kann kultiviert, gescreened und geklont, jeweils nach üblichen Verfahren, wie z.B. bei Oi und Hertzenberg, wie oben erwähnt, beschrieben, unter Erhalt eines immortalisierten Klons, der den Antikörper der Wahl herstellt.
Die konventionellen Techniken der in vitro Immunisierung können ebenfalls verwendet werden (R.A. Luben et al, Mol. Immunol. 17: 635-639 (1980) und Hengartner H. et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 92-99 (1978)).
Nach Isolieren der betreffenden Klone können die monoklonalten Antikörper durch Hybridoma-Zellen produziert werden, die als Ascites-Tumore in Balb/c oder nackten Mäusen, oder in vitro unter Verwendung konventioneller großmaßstäblicher Zellenkulturtechniken gezogen werden werden. Die Antikörper können aus der Ascites-Flüssigkeit unter Anwendung einer Vielzahl an Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat-Precipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Gelfiltration (Parham et al, J. Immunol. Methods 53: 133-173 (1982)), Ionenaustausch- Chromatographie auf an Cibacron-Blue-Farbstoff gekoppelten Harzen (Bruck et al, J. Immunol. Methods 53: 313-319 (1982) und Bruck et al, Methods in Enzymology 121: 587-596 (1986)), Chromatographie auf Hydroxylapatit-Säulen (Stanker et al, J. Immunol. Methods 76: 157-169 (1985) und Juarez- Salinas eta al, Methods in Enzymol. 121: 615-622 (1986)) und Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von immobilisiertem Protein A aus Staphylococcus aureus (Coding, J. Immunol. Methods 39: 285-308 (1980)) gereinigt werden. Die Reinheit der Antikörper kann durch isoelektrofokussierende Gel-Elektrophorese abgeschätzt werden (Goldmacher et al, J. Immunol. 136: 320-325 (1986)).
Spezifische Beispiele von Antikörper, die an die Zielzellen binden, sind im folgenden Beispiel 1 beschrieben.
Die Herstellung und Reinigung von für die Zielzellen spezifischer polyklonalen Antikörpern kann nach konventionellen im Stand der Technik bekannten Techniken erfolgen.
Die gegen die aktivierten Lymphocyten spezifischen Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein, und sind von jedem beliebigen Isotyp, wie oben für die Antikörper, die spezifisch für die Zielzellen sind, beschrieben. Ferner sollten die für die aktivierten Lymphocyten spezifischen Antikörper, wie die für die Zielzellen spezifischen Antikörper, aus einer Säugerart stammen.
Die für die aktivierten Lymphocyten spezifischen Antikörper können wie folgt hergestellt und gereinigt werden.
Die Antikörper werden durch Immunisierung von Mäusen mit humanen Lymphoidzellen und durch Herstellung immortalisierter Antikörper produzierender Klone, wie oben für die Herstellung von Antikörpern gegen Zielzellen beschrieben, hergestellt. Die humanen Lymphoidzellen werden aus dem peripheren Blut von einem geeigneten humanen Spender gewonnden. Die betreffenden Klone werden z.B. durch FACS (Fluorescent-Activated Cell Sorter)-Analyse der Überstände der Klone auf den relevanten Zellen identifiziert. Man läßt dann die Klcne in einem geeigneten Mausstamm wachsen, und große Mengen der Antikörper können aus den Hybridoma-Zellen, die als bösartige Ascites-Tumore wachsen, hergestellt werden. Die Antikörper können auch in vitro in großen Mengen nach Standardverfahren hergestellt werden, wie z.B. durch Wachsen von Hybridoma-Zellen in einer Hohlfaser-Apparatur oder in Rcllflaschen. Dieses sind gut bekannte handelsübliche Verfahren, und die notwendige Ausrüstung kann handelsüblich zusammen mit geeigneten Gebrauchsanweisungen für die Verwendung erworben werden.
Die monoklonalen Antikörper können durch die oben beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
Spezifische Beispiele für zwei solcher Antikörper, das sind Anti-T11&sub3; und Anti-T11&sub2;, sind in Beispiel 1 beschrieben.
Die Herstellung und Reinigung von gegen aktivierte Lymphocyten spezifische polyklonale Antikörper kann nach üblichen im Stand der Technik bekannten Verfahren ausgeführt werden.
Ferner gibt es bereits mehrere geeignete, gegen aktivierte Lymphocyten spezifische Antikörper, und sie sind öffentlich erhältlich, einschließlich der Hybridomas, die Anti-T11&sub2; (Murin IgC2a) und Anti-T11&sub3; (Murin IgG&sub3;) produzieren, welches monoklonale Antikörper sind, die an verschiedene Epitope des T11-Moleküls, das auf der Oberfläche reifer T- Zellen gefunden wird, binden (Meuer, S.C., et al, Cell 36: 897-906 (1984)); Antitransferrin-Rezeptor-Antikörper; und Anti-TAC-Antikörper. Anti-T1&sub2; und Anti-T11&sub3; sind handelsüblich erhältlich von Immunogen Inc., Cambridge, MA. Antigransferrin-Rezeptor-Antikörper ist erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC Nr. HB21). Ein Hybridom, das Anti-TAC-Antikörper produziert, ist handelsüblich von Becton Dickinson, Mountain View, CA erhältlich.
Es ist bevorzugt, daß Anti-T11&sub3; ein Antilymphocyt- Antikörper ist.
Diese öffentlich zugänglichen Antikörper können hergestellt werden (falls mittels Hybridoma zur Verfügung gestellt) und (falls notwendig) nach den oben beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen heterodimeren Antikörperkonjugate können die beiden verschiedenen Antikörper miteinander unter Verwendung üblicher Verfahren zur chemischen Vernetzung von Proteinen, wie z.B. bei Peters et al, Annual Review Biochein. 46: 523-551 (1977); Ji, Methods Enzymol. 91: 580-609 (1983); Blattler et al, Biochemistry 24: 1517-1524 (1985) und den darin erwähnten Verweisen verbunden werden.
Viele dieser Vernetzungsmittel sind handelsüblich erhältlich, z.B. Pierce Chemical Company, Rockford, IL, Sigma Chem. Co., St. Louis, NO, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN und Pharmacia, Uppsala, Sweden. Vorzugsweise werden die beiden verschiedenen Antikörper mit heterobifunktionalen Vernetzungsmitteln modifiziert, die komplementäre reaktive Gruppen einführen, z.B. Maleinimidogruppen und Sulfhydrylgruppen, und dann werden die verschiedenen modifizierten Antikörper anschließend durch Reaktion der komplementären Gruppen vernetzt, welches nur das Hterodimer in hoher Ausbeute, wie im folgenden Schema 1 dargestellt, liefert. SCHEMA 1
In Schema 1 wird Antikörper 1 mit 2-Iminothiolan modifiziert, das mit den Aminogruppen, die auf allen Proteinen gefunden werden, unter Einführung von Sulfhydrylgruppen in den Antikörper reagiert (Traut et al, Biochemistry 12: 3266-3275 (1973); Lambert et al, Biochemistry 17: 5406-5416 (1978)). Sulfhydrylgruppen können in die Antikörper unter Verwendung einer Vielzahl anderer Reagenzien, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat (Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) und durch milde Reduktion mit Reduktionsmitteln durch z.B. Behandlung der Antikörper mit 2-Mercaptoethanol (2-20 mM) oder Dithiothreitol (1-2 mM) für eine kurze Zeit (15-40 min.) bei 400 oder Raumtemperatur und anschließender Gel- Filtration oder Dialyse unter Entfernung des Überschusses an Reduktionsmittel, eingeführt werden.
In Schema 1 ist der Antikörper 2 mit Succinimidyl-4-(N- maleinimidomethyl(cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) modifiziert, das mit den Aminogruppen, die auf allen Proteinen gefunden werden, unter Einführung von Maleinimidogruppen in den Antikörper reagiert (z.B. Lambert et al, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985)). Maleinimidogruppen können auch in Proteine unter Verwendung anderer heterobifunktionaler Reagenzien eingeführt werden, z.B. m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester und Succinimidyl-4(p-maleinimidophenyl)butyrat sind zwei Verbindungen, die handelsüblich von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, erhältlich sind, Maleinimidohexanoyl-N- hydroxy-succinimidester ist handelsüblich von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN erhältlich, und s. Blattler et al, Eiochemistry 24: 1517-1524 (1985). Andere Gruppen, z.B. α-Chlor-, α-Brom- oder α-Jod-carbonyl- Funktionen reagieren auch mit den Sulfhydrylgruppen, und solche Gruppen können in Antikörper 2 anstelle der Maleinimidogruppen eingeführt werden, um die wirksame Verknüpfung von Antiköper 1 mit Antikörper 2 zu ermöglichen. Zum Beispiel kann Antikörper 2 mit N- Succinylimidyljodacetat unter Einführung von Jodacetylgruppen in den Antikörper modifiziert werden. 2- Pyridyldithiogruppen können auch mit freien Sulhydrylgruppen reagieren, und solche Gruppen können auch in Antikörper 2 durch Umsetzen mit N-Succinylimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionat z.B. eingeführt werden. In diesem Fall führt die Vernetzungsreaktion zwischen Antikörper 1 und Antikörper 2 zu einer Bindung, die eine Disulfidbrücke enthält (s. Lambert et al, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985)).
Sulfhydrylgruppen können entweder in Antikörper 1 oder Antikörper 2 eingeführt werden, und die Gruppen, die mit den Sulfhydrylgruppen reagieren, wie Maleinimidogruppen, können entweder in Antikörper 2 oder Antikörper 1 zu einer effizienten Bildung einer Vernetzung zwischen Antikörper 1 und Antikörper 2 eingeführt werden.
Sulfhydrylgruppen können in beide Antikörper eingeführt werden, die anschließend unter Bildung von Disulfidbrücken oxidiert werden, einige davon können Antikörper 1 und Antikörper 2 verknüpfen. Sulfhydrylgruppen, die in beide Antikörper eingeführt sind, können ebenfalls durch bifunktionale Alkyldihalide oder bifunktionale Bismaleinimide, wie N,N-O-Phenylendimaleinimid und Bismaleinimidohexan verknüpft werden.
Ein weiteres Verfahren, durch eine Antikörper 1 -- Antikörper 2 -Vernetzung gebildet werden kann, ist die Konjugierung von einem der Antikörper an Biotin unter Verwendung von handelsüblich erhältlichen Biotinderivaten, die mit den Proteinen reagieren, wie N- Hydroxysuccinimidobiotin oder Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), und unter Konjugierung des zweiten Antikörpers an Avidin oder Streptavidin unter Verwendung beliebiger Verknüpfungsverfahren zur Verknüpfung zweier Proteine, die oben zusammengefaßt sind, oder siehe Lambert et al, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985), z. B. Avidin und Streptavidin binden an Biotin, und daher bildet Antikörper 1, der Biotin enthält, und Antikörper 2, der an Avidin oder Streptavidin vernetzt ist, Komplexe, die beide Antikörper enthalten, wenn die beiden so modifizierten Antikörper miteinander vermischt werden.
Die so synthetisierten bifunktionalen Antikörperkonstrukte werden zur weiteren Verwendung wie folgt gereinigt.
Heterodimere Antikörperkonjugate können durch Gel- Filtration gereinigt werden. Andere übliche Verfahren können ebenfalls verwendet werden, einschließlich insbesondere der Hydroxylapatit-Chromatographie (Juarez- Salinas et al, Meth. Enzymology 121: 615-622 (1986)).
Das folgende Beispiel 3 beschreibt in Einzelheiten ein Verfahren zur Reinigung spezifischer heterodimerer Antikörperkonjugate. Das Verfahren kann für die Reinigung solcher Konjugate eingesetzt werden.
Die Fähigkeit der heterodimeren Antffikörperkonjugate zur Bindung an entsprechende Zellen kann wie folgt bestimmt werden.
Zellinien, die das Oberflächenantigen für eine Komponente des Heterodimers exprimieren, aber nicht für die andere Komponente, werden verwendet. Die Zellen werden mit dem Dimer bei einer Konzentration X, z.B. 50 ug/ml, oder mit freiem Antikörper bei einer Konzentration 1/2 X, z.B. 25 ug/ml, für ca. 30 min. auf Eis inkubiert. Dann werden die Zellen zweimal gewaschen und min einer geeigneten Verdünnung von Ziege/Antimaus- oder Kaninchen/Antimaus- Immunglobulin, das an eine geeignete Markierung, wie einem Fluorescinisothiocyanat (FITC) konjugiert ist, für ca. 30 min. auf Eis gefärbt. Die Zellen werden anschließend wiederum gewaschen und auf Fluoreszenz-Intensität in einem Cytofluorographen gemessen. Heterodimere Antikörperkonjugate, falls sie voll funktional sind, ergeben bei diesem Test die gleiche Fluoreszenz- Intensitätsverteilung wie freie Antikörper, was darauf hinweist, daß diese Konjugate gleichermaßen gut an das relevante Antigen auf der Zelle binden.

Aktivierung von Lymphocyten

Lymphocyten können entweder in vivo oder ex vivo aktiviert werden. Falls die Behandlung der Zielzellen in vivo ist, und die Lymphocyten ex vivo aktiviert werden, werden die Lymphocyten in dem Körper nach der Aktivierung wieder infusiert.
In vivo Aktivierung von Lymphocyten wird erreicht durch Infusion von aktivierenden Antikörpern, z.B. Anti-T11&sub2;, Anti-T3 (erhältlich von Ortho Pharmaceuticals, Raritan, NJ unter dem Namen OKT-3) oder Anti-2H1, mehrere Stunden vor der Infusion des bifunktionalen Antikörperkonstrukts.
In vivo Aktivierung von Lymphocyten kann erfolgen durch:
(1) Induzieren der Expression von T11&sub3; durch Infusion von Anti-T11&sub2;, Anti-2H1 (eine Anti-2H1 produzierendes Hybridom wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, Hinterlegungsnummer ATCC HB 9399 hinterlegt) oder Anti-T3; oder
(2) Induzieren der Expression von T11&sub3;, wie oben beschrieben, und Aktivierung durch Lymphokine, wie IL-2, BSF-1 und γ-IFN.
Bevorzugte Substanzen umfassen die aktivierenden Antikörper Anti-T11&sub2;, Anti-T3 und Anti-2H1.
Ex vivo Aktivierung von Lymphocyten kann mehrere Tage vor der Infusion des bifunktionalen Antikörperkonstrukts erfolgen.
Ex vivo Aktivierung von Lymphocyten erfolgt durch Inkubation von peripheren Blutlymphocyten (PBL's), die aus dem Blut durch Cytophorese unter Verwendung üblicher medizinischer Vorrichtungen entnommen wurden, mit IL-2, Anti-T11&sub2;, Anti-T3 oder Anti-2H1. Die Inkubation erfolgt bei 0,5 x 106 Zellen/ml mit löslichem Anti-T11&sub2; oder Anti- 2H1 bei, z.B. 10 ug/ml (1 ug/ml bis 100 ug/ml), oder IL-2 bei, z.B. 10-1000 U/ml, oder Anti-T3, das auf Platten anhaftet oder an Perlen gebunden ist, z.B. bei 10 ug/ml (1 ug/ml bis 100 ug/ml) in z.B. RPMI 1640- Medium, das mit 10 %igem humanem AB-Serum ergänzt wurde, bei 37ºC und einer Atmosphäre von 100 % Luftfeuchtigkeit und 5-10 % CO&sub2;.
Substanzen, die zur Aktiverung von Lymphocyten ex vivo verwendet werden, können, umfassen IL-2, Anti-T11&sub2;, Anti-T3 und Anti-2H1.
Bevorzugte Substanzen umfassen Anti-T11&sub2;, Anti-T3 und Anti- 2H1, und besonders bevorzugt ist Anti-T11&sub2;.
Die Fähigkeit von Substanzen zur AkLivierung von Lymphocyten in vivo kann durch Infusion der aktivierenden Substanz in den Patienten, wie z.B. die oben erwähnten Antikörper, anschließendem Entnehmen von Blut, Isolieren der PBLs und Testen z.B. auf T11&sub3; -Expression und Fähigkeit zur Abtötung mit dem geeigneten entsprechenden bifunktionalen Antikörperkonstrukt bestimmt werden. Spezifische Testbedingungen können leicht durch den Fachmann ermittelt werden.
Die Fähigkeit der Substanzen zur Aktivierung von Lymphocyten ex vivo kann z.B. durch die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von Killerzellen nach drei Tagen bei in vitro Kultur mit den oben beschriebenen aktivierenden Reagenzien bestimmt werden. Die Killerzellfunktion wird durch Überwachen der Fähigkeit aktivierender PPL's zur Abtötung der Zielzellen unter Verwendung eines der bifunktionalen Antikörperkonstrukte der vorliegenden Erfindung oder durch Überwachung der Lectin-vermittelten Lyse nach konventionellen Verfahren gemessen.
Die Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform erläutert, jedoch soll die Erfindung als nicht darauf beschränkt ausgelegt werden. In dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das heterodimere Antikörperkonjugat Anti-T11&sub3; als die Antilymphocyt-Antikörperkomponente und einen Antitumor- Zellantikörper als die Antizielzellen-Antikörperkomponente. Nach dieser Ausführungsform kann das Anti- Tl11&sub3;/Antitumorzell-Antikörperkonjugat vor der Infusion der aktivierten Zellen ohne die Besorgnis, daß das Konjugat an eine große Anzahl von nichtaktivierten T11-exprimierenden Zellen, die in vivo zirkulieren, bindet, infusiert werden. Daher erlaubt die sehr geringe Expression des T11&sub3;-Epitops auf diesen zirkulierenden normalen nichtaktivierten T- Zellen, daß das Anti-T11&sub3;-Antitumor-Antikörperkonjugat effektiv an die Zieltumorzellen in vivo bindet. Wenn aktivierte Lymphocyten anschließend infusiert werden, verbinden sich die aktivierten Lymphocyten gezielt spezifisch mit den Tumorzellen, die mit dem Anti-T11&sub3;- Antitumorzell-Antikörperkonjugat bedeckt sind.
Bei einer Strategie können z.B. T-Zellen ex vivo mit Anti- T11&sub2; behandelt werden, das das Anti-T11&sub3;-Epitop auf der Oberfläche der T-Zellen exponiert. Nach Rückinfusion in den Wirtskörper binden die Anti-T11&sub2; beschichteten Zellen an die Tumorzellen, die mit Anti-T11&sub3; heterodimerem Antikörperkonjugat bedeckt sind. Die Zellen werden daher durch Binden von Anti-T11&sub2; und Anti-T11&sub3; aktiviert und sind in engem Zellkontakt mit den Zieltumorzellen über die heterodimere Antikörperkonjugatbrücke, welches den aktivierten Lymphoidzellen ermöglicht, die Zielzellen abzutöten.
Im folgenden Beispiel 5 wurden die Zielzellen mit einem heterodimeren Antikörperkonjugat von Anti-T11&sub3; und mit einem Antitumor-Antikörper, der spezifisch für die Zielzellen ist, bedeckt. Wenn diese bedeckten Zielzellen mit aktivierten T11-exprimierenden Zellen vermischt wurden, wurden die Zielzellen und die T11-exprimierenden Zellen zusammen in einem engen Zell-Zell-Kontakt über das heterodimere Antikörperkonjugat verbunden, welches eine Brücke zwischen den Zellen ausbildete. Der enge Zell-Zell- Kontakt, der aus der Antikörperbrücke herrührte, erlaubte den aktivierten T11-exprimierenden Zellen die Lyse der Zielzellen.

In vivo Behandlungsmethode

Erfindungsgemäß können die bifunktionalen Antikörperkonstrukte einem Patienten als intravenöse Infusion in normaler Kochsalzlösung mit normalem humanem Albumin als Proteinträgerzusatz verabreicht werden.
Die Menge des verabreichten bifunktionalen Antikörperkonstrukts variiert mit dem Alter, Körpergewicht und der Tumorlast, ist jedoch im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
Es wurde gezeigt, daß intravenöses IL-2 Killerzellen in vivo aktiviert (S.A. Rosenberg et al, J. Exp. Med. 161: 1169-1188 (1985)), und daß dieses Verfahren verwendet werden kann, um aktivierte cytolytische Lymphocyten zu erhalten. In vivo Aktivierung von Lymphocyten sollte ebenfalls fortschreiten, wie für die oben unter dem Abschnitt mit der Überschrift "Aktiverung von Lymphocyten" beschrieben.
Für die ex vivo Aktivierung von Lymphocyten werden Lymphocyten aus dem Patienten, wie oben beschrieben, entnommen und wie oben beschrieben aktiviert. Die aktivierten Lymphocyten werden dann dem Körper durch kontinuierliche intravenöse Infusion mit einer geeigneten Geschwindigkeit zurückgegeben, z.B. mit 108 Zellen/Stunde in einem Volumen von 50 ml/h.
Beispiele von Indikationen, die gemäß dem in vivo Verfahren behandelt werden können, umfassen bösartige Tumore von jedem Typ, einschließlich z.B. Lungenkrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Krebs der Niere und der lymphatischen Organe, Autoimmunerkrankungen, wie z.B. systemischer Lupus, rheumatoide Arthritis und Multiple Sklerose; Transplantat-Abstoßungen, wie renale Transplantat-Abstoßung, Herztransplantat-Abstoßung, Lebertransplantat-Abstoßung, Lungentransplantat-Abstoßung und Knochenmarktransplantat-Abstoßung, Transplantat vs. Wirtserkrankung; virale Infektionen, wie die CMV-Infektion, HTLV-Infektion, AIDS, usw. und parasitäre Infektionen, z.B. Giardiasis, Amöbiasis, Shistosomiasis, usw.

In vitro Behandlungsmethode

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in vitro durchgeführt werden.
Beispiele von Indikationen, die nach dem in vitro Verfahren behandelt werden können, umfassen Knochenmark- Transplantate, Autologe oder Allogene.
Die in vitro Behandlung kann wie folgt durchgeführt werden.
PBL wird aus dem Patienten entnommen, wie oben beschrieben aktiviert (mit IL-2 und/oder Anti-T11&sub2;, Anti-T3, Anti-2H1) für mehrere Tage. Knochenmark, das die betreffenden Zellen enthält, z.B. Tumorzellen, wird mit den aktivierten Zellen mit E/T-Verhältnissen (Effektorzelle/Zielzelle) von 20:1 ibs 1:1 mit dem geeigneten bifunktionalen Antikörperkonstrukt für 4 bis 18 Stunden vermischt. Nach dieser Zeit werden die Knochenmarkzellen mit Medium, das Serum enthält, gewaschen, und dem Patienten z.B. durch Infusion nach bekannten Verfahren zurückgegeben.

BEISPIELE

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben, die jedoch nicht einschränkend sein sollen.
Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentangaben Verhältnisangaben usw. auf das Gewicht bezogen.

In den Beispielen beschriebene monoklonale Antikörper.

Die Hybridoma-Zellinien, die die Antikörper Anti-T11&sub2;, Anti-T11&sub3;, JS und Anti-B4 produzieren, wurden wie in den angegebenen Druckschriften offenbart, hergestellt.
Anti-T11&sub2; und Anti-T11&sub3; sind monoklonale Antikörper, die an verschiedene Epitope des T11-Moleküls, das auf der Oberfläche reifer T-Zellen gefunden wird, binden (Meuer S.C. et al, Cell 36: 897-906 (1984))
J5 ist ein Murin IgC2a, das für das Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen (CALLA) spezifisch ist (Ritz J. et al, Nature 282: 583-585 (1980)).
Anti-B4 ist ein Murin IgG&sub1;, das für das B4-Antigen spezifisch ist, das auf B4-Zellen und bösartigen Zellen vom B-Zellen-Ursprung gefunden wird (Nadler L.M. et al, J. Immunol. 131: 244-250 (1983)).
Die Hybridoma-Zellinien, die diese Antikörper produzieren, wurden als Ascites-Tumore in Balb/C-Mäusen gezüchtet. Wahlweise können J5 und Anti-B4 handelsüblich von Cultor Immunology, Hialeah, FL, erhalten werden. Anti-T11&sub2;- und Anti-T11&sub3;-Antikörper können handelsüblich von ImmunoGen Inc., Cambridge, MA erhalten werden.

BEISPIEL 1

Reinigung der Antikörper

Alle Reinigungsschritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Der J5-Antikörper wurde aus der Ascites-Flüssigkeit unter Anwendung üblicher Verfahren gereinigt (Goldmacher et al, J. Immunol. 136: 320-325 (1986); Lambert et al, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985)) unter Verwendung von Affinitäts-Chromatographie auf einer Säule von Protein A- Sepharose CL-4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Der an die Säule gebundene Antikörper wurde mit 0,1 M Essigsäure, die NaCl (0,15 M) enthielt, eluiert. Die Antikörper-haltigen Fraktionen wurden sofort durch Zugabe eines Zehntel Volumens von 1,0 M NaHCO&sub3; neutralisiert und wurden dann gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend Glycin (50 mM) und NaN&sub3; (0,4 mM) für eine weitere Reinigung durch Ionenaustausch-Chromatographie auf einer CM-Cellulosesäule (CM52; Whatman Chemical Separations, Clifton, N.J.), die mit dem selben Puffer equilibriert worden war, dialysiert. Die Säule (30 ml Bettvolumen für 120 mg Protein) wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 100 mM) entwickelt und J5 eluierte als einzelner Peak. Der gereinigte Antikörper wurde schließlich gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend NaCl (145 mM), dialysiert und dann durch Filtration (0,22/um Millex-GV-Membran, Millipore Corp., Bedford, MA oder 0,2 um Uniflo Membranen, Schleicher & Schuell, Keene, NH) sterilisiert und bei einer Konzentration von ca. 5 mg/ml bei -70ºC gelagert.
Anti-T11&sub2; wurde nach einem ähnlichen Verfahren gereinigt, mit Ausnahme, daß die verwendeten CM-Cellulosesäulen im zweiten Reinigungsschritt für diesen Antikörper mit einem linearen Gradienten von 0 bis 300 mM NaCl in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend Glycin (50 mM) und NaN&sub3; (0,4 mM) entwickelt wurden.
Anti-B4 wurde in drei Schritten bei 4ºC gereinigt. Zunächst wurde Ascites-Flüssigkeit mit 2 Volumen an 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend NaCl (145 mM) verdünnt, und anschließend wurde festes (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in kleinen Mengen zu der kontinuierlich gerührten Lösung über 45 min. zugegeben. Die Suspension wurde eine Stunde gerührt. Das präzipitierte Protein wurde durch Zentrifugation gewonnen und anschließend aufgelöst (in 50 ml für Protein von 50 ml Ascites-Flüssigkeit) in 0,1 M Tris.HCl-Puffer, pH 8,9, enthaltend NaCl (3,0 M) und gegen 100 Volumen des ph 8,9 Puffers 8 Stunden dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf eine Affinitätssäule von Protein A-Sepharose CL-48 aufgegeben, die mit dem pH 8,9 Puffer equilibriert worden war, und anschließend wurde die Säule mit ph 8,9 Puffer gewaschen, bis die Absorption des Eluats nahe 0 war. Der Anti-B4-Antikörper wurde dann von der Säule mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend Natriumacetat (50 mM) und NaCl (150 mM) eluiert. Die Antikörper enthaltenden Fraktionen wurden für die entgültige Reinigung durch Gelfiltration durch eine Sepharose 5-300 -Säule konzentriert (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), die in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend NaCl (145 mM) equilibriert worden war. Der gereinigte Antikörper wurde sterilisiert und wie für J5 beschrieben (oben) gelagert.
Anti-T11&sub3; wurde durch Ammoniumsulfat-Fällung und Affinitätschromatographie auf protein-A-Sepharose CL-48 unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie bei Anti-B4 gereinigt, mit Ausnahme, daß der Antikörper von der Protein-A-Sepharose CL-48-Säule mit 0,1 M Essigsäure, enthaltend NaCl (0,15 M), Sammeln der Fraktionen direkt in Röhrchen, die 1,0 M NaHCO&sub3; enthielten (ein Zehntel Fraktionsvolumen), eluiert wurde. Die Antikörper-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und erschöpfend gegen 40 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend NaCl (0,58 M) dialysiert. Der gereinigte Antikörper wurde durch Filtration sterilisiert und bei einer Konzentration von ca. 5 mg/ml bei -70ºC gelagert.

BEISPIEL 2

Chemische Konjugation von J5 oder Anti-B4 an Anti-T11&sub2; oder Anti-T11&sub3;

Der J5-Antikörper (2 mg/ml) in 60 mM Triethanolamin.HCl- Puffer, ph 8,0, enthaltend EDTA (1 mM) und NaCl (100 mM) wurde entgast und anschließend mit 1-Iminothiolan (0,13 mM) 90 min. bei 0ºC unter Stickstoffatmosphäre behandelt. Stocklösungen von 2-Iminothiolan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden wie von Lambert et al beschrieben, hergestellt, Biochemistry, 17: 5406-5416 (1978) . Die Reaktion wurde durch Gelfiltration bei 400 durch eine Säule von Sephadex G-25 (superfine) abgebrochen, die mit 5 mM Bistris-Acetatpuffer, pH 5,8, enthaltend NaCl (50 mM) und EDTA (1 mM) equilibriert war. Auf diese Weise in den J5- Antikörper eingeführte Sulfhydrylgruppen wurden spektralphotometrisch nach dem Verfahren von Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 28: 70-77 (1959)) quantifiziert: Es wurden ca. 0,7 Sulfhydrylgruppen pro Molekül J5 durch dieses hier beschriebene Verfahren eingeführt. Anti-B4-Antikörper wurde auf genau dieselbe Weise wie J5- Antikörper modifiziert, mit Ausnahme, daß die bei der 90 minütigen Inkubation bei 0ºC verwendete 2-Iminothiolan- Konzentration 0,26 mM war.
Maleinimidogruppen wurden in die Antikörper Anti-T11&sub2; und Anti-T11&sub3; unter Verwendung des gleichen Verfahrens eingeführt. Die Antikörper (1 mg/ml) in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend EDTA (1 mM) wurden mit Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) 30 min. bei 30ºC unter Verwendung einer Reagenzkonzentration für jeden Antikörper eingeführt, was zu der Einführung von 1,0 Maleinimidogruppen pro Molekül führte: 20/uM für Anti-T11&sub2; und 10 uM für Anti-T11&sub3;. Das Reagenz wurde von einer frischhergestellten 10 uM Stocklösung in trockenem Dioxan zugegeben. Die Reaktionen wurden durch Gelfiltration bei 4ºC durch Sephadex G-25 (superfein)-Säulen abgebrochen, die mit pH 7,0 Puffer equilibriert waren. Das Maß des Einbaus der Maleinimidogruppen wurde durch einen Test gemessen, der radioaktiv markiertes Cystein, wie von Lambert et al beschrieben, verwendete, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985).
J5 oder Anti-B4 (0,5 bis 1,0 mg/ml), enthaltend eingeführte Sulfydrylgruppen, in 5 mM Bistris-Acetatpuffer, pH 5,8, enthaltend NaCl (50 mM) und EDTA (1 mM), wurde mit einem gleichen Gewicht an Antikörper (0,5 bis 1,0 ug/ml Anti-T11&sub2; oder Anti-T11&sub3;) enthaltend eingeführte Maleinimidogruppen in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend EDTA (1 mM) vermischt. Der pH der Mischung wurde auf 7,0 durch Zugabe von 0,5 M Triethanolamin.HCl, pH 8,0, eingestellt, und die Mischung wurde dann unter Stickstoff 16 Stunden bei 400 inkubiert. Dann wurde 2-Mercaptoethanol zur endgültigen Konzentration von 2,5/uM unter Blockierung der übrigen Maleinimidogruppen zugegeben, und nach 30 min. Inkubation bei 400 wurde Jodacetamid (2 mM) zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 60 min. fortgesetzt, um alle freien Sulfhydrylgruppen zu blockieren.

BEISPIEL 3

Reinigung von heterodimeren Antikörperkonjugaten

Die Konjugations-Reaktionsmischung wurde einer Gelfiltration unter Verwendung einer Bio-Gel -A-1,5 m (fein)-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) (95 cm x 2,6 cm pro 10 ml Probenvolumen), die mit 10 mM HEPES.NaOH-Puffer, pH 7,6, enthaltend NaCl (3M) equilibriert war. Unter diesen Bedingungen wurden Antikörper-Antikörperdimere (Mr = 320.000) vollständig aus den Aggregaten von hohem Mr und von monomeren IgG-Antikörpern (Mr=160.000) abgetrennt. Proben von Fraktionen, die aus der Säule eluierten, wurden durch Polyacrylamid/Dodecylsulfat-Gelelektrophorese auf Gelstreifen (145 mm x 90 mm x 0,75 mm), die mit einem Acrylamidgradienten gegossen wurden, (5-10 Gew./Volumen) analysiert. Die Gele wurden unter nichtreduzierenden Bedingungen unter Verwendung de Laemmli-Verfahrens, Nature 227:690-685 (1970); Lambert et al, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985) entwickelt. Fraktionen, die gereinigtes Antikörper-Antikörper-Heterodimer enthielten, wurden gesammelt, auf ca. 0,5 mg/ml unter Verwendung einer CX-30 eintauchbaren Membran (Millipore Corp., Bedford, MA) konzentriert und schließlich gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend NaCl (145 mM) dialysiert. Die Proben wurden bei -70ºC eingefroren gelagert.

BEISPIEL 4

Bewertung der Bindung für heterodimere Antikörperkonjugate: Analyse durch Fluoreszenz-aktiviertes zellsorting

Die Fähigkeit von J5-Anti-T11&sub3; und J5-Anti-T11&sub2; - Konjugaten zur Bindung an CALLA-exprimierende und T11&sub2;/T11&sub3;-exprimierende Zellen wurde bewertet. Die verwendete Zellinie war Namalwa, eine CALLA+ -, B4+ -, T11- Burkitt-Lymphomalinie, erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, MD , mit der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1432 (Int. J. Cancer 12: 396-40 (1973)) und REX, einer TR1+ CALLA+/- Erwachsenen T-Zellen-Leukämie-Zellinie als ein Beispiel für eine T11&sub3;- und T11&sub2;-positive Zellinie. Es kann jedoch jede solche Zellinie oder auch aktivierte periphere Blutlymphocyten aus jedem gesunden menschlichen Spender anstelle von REX verwendet werden.
Die Konjugate oder die äquivalente Menge an unmodifiziertem Antikörper, d.h. J5, Anti-B4, Anti-T11&sub2; oder Anti-T11&sub3;) wurden mit 1 x 10&sup6; Zellen in einem Volumen von 50 ul 30 min. auf Eis inkubiert, zweimal mit 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), enthaltend 1 % Rinder-Serumalbumin (RSA) gewaschen. Die Zellen wurden dann mit einer 1:25 Verdünnung von Ziege-Antimaus-Ig-Fluorescinisothiocyanat (GAMG-FITC) in einem Volumen von 25/ul auf Eis inkubiert, zweimal mit HBSS.1% RSA gewaschen, und schließlich wurden die Zellen nach ihrer Fluoreszenz in einem Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (Epice IV) analysiert. Die Figur zeigt die für J5, Anti-T11&sub2;, Anti-T11&sub3; und die Konjugate J5-Anti-T11&sub2; und J5-Anti-T11&sub3; erhaltenen Muster.
Insbesondere zeigt die Figur ein FACS-Analyse von heterodimeren Konjugaten, worin Namalwa-Zellen (Gruppen a bis h) oder REX-Zellen (Gruppen i bis p) mit keinem Antikörper (a,i), J5 (b, j), Anti-T11&sub2; (c, k), Anti-T11&sub3; (d, l), Anti-T (e, m), J5-Anti-T11&sub2; (f, n), J5-Anti-T11&sub3; (g, o) oder J5-Anti-T3 (h, p) inkubiert wurden.
Aus dieser Figur geht hervor, daß jede Antikörper- Komponente in dem heterodimeren Konjugat dieselbe Bindungsaktivität und Spezifität wie der freie Antikörper beibehalten hat.

BEISPIEL 5

Aktivierung von peripheren Blutlymphocyten (PBL) durch Anti-T11&sub2;/Anti-T11&sub3;-enthaltende Konjugate

Zusätzlich zur Fähigkeit zur Bindung von Zellen, die relevante Antigene exprimieren, muß gezeigt werden, daß die Anti-T11&sub2;/Anti-T11&sub3;-Konjugate funktionale Eigenschaften haben, d.h. sie müssen T11 + PBL unter geeigneten Bedingungen aktivieren. Es ist bekannt, daß die Kombination von Anti-T11&sub2; und Anti-T11&sub3;- Antikörper PBL zur Proliferation aktivieren kann (Meuer S.C. et al, Cell 36: 897-906 (1984)). Daher wurde die funktionale Integrität der erfindungsgemäßen Konjugate durch Inkubieren von PBL in Gegenwart von J5-Anti-T11&sub3;-Konjugat und Anti-T11&sub2; oder in Gegenwart von J5-Anti-T11&sub2; und Anti-T11&sub3; und Messen der Proliferation von Schaf-Erythrocyt-rosettiertem PBL durch Einbau von ³H-Thymidin gemessen. Insbesondere wurden 5 x 10&sup4; PBL 72 Stunden auf Mikrotiterplatten mit flachem Boden in Gegenwart der in Tabelle 1 angegebenen Reagenzien inkubiert, und wurden mit 1 uCi Thymidin für mindestens 18 Stunden gepulst. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Aktiverung von humanen PBL durch heterodinere Konjugate von J5 und Anti-T11&sub2; oder Anti-T11&sub3; In vitro Zugabe ¹ Counts pro Minute ± Standard-Abweichung ² Con A = Concanavalin A
Aus den Ergebnissen in obiger Tabelle 1 geht hervor, daß sowohl J5-Anti-T11&sub2;- und J5-Anti-T11&sub3; -Konjugate funktionale T11&sub2;- und T11&sub3;-Antikörper enthalten, da sie in der Lage sind, PBL in Gegenwart von geeignetem freien Antikörper zu aktivieren.

BEISPIEL 6

Lyse eines CALLA+ -Tumors durch humane CTL in Gegenwart von J5-Anti-T11&sub3;- und J5-Anti-T11&sub2; -Konjugaten

Der Klon TB1-6 (erhalten von Dr. Chikao Morimoto), ein repräsentatives Beispiel für einen humanen CTL-Klon, der für die EBV-transformierte humane B-Zellinie spezifisch ist, CM-EBV, wurde als Effektor cytolytische Zelle in diesem Beispiel verwendet. Der CTL-Klon wurde 4 Stunden mit CALLA+ -Tumor Namalwa, ATCC Nr. CRL 1432, Int. J. Cancer 12: 396-408 (1973) inkubiert, die der Klon normalerweise nicht lysiert, oder in Gegenwart von CALLA-Tumor OVCAR, erhältlich von der American Type Culture Collection, ATCC Nr. HTB161, Canc. Res. 44: 5286-5290 (1984) in Gegenwart einer Endkonzentration von 10 ug/ml J5-Anti-T11&sub3; oder J5- Anti-T11-&sub2; oder den anderen Reagenzien, wie in der folgenden Tabelle 2 gezeigt, entweder bei 1 x 10&sup5; Effektor cytolytische Zellen (TBI-6) oder 0,5 x 10&sup5; T-Zellen inkubiert, und 5 x 10³ &sup5;¹Cr-markierte Namalwa-Zielzellen wurden in Platten mit V-Boden in einem Endvolumen von 200 ul in einem Medium aus RPMI 1640 mit 10 % FCS und 100 ug/ml Streptomycin und 100 Einheitn/ml Penicillin inkubiert. Nach vier Stunden wurden die Überstände gesammelt, und die prozentspezifische Lyse nach Standardverfahren berechnet (Siliciano R.F. et al, Nature 317: 428-429 (1985)).
Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Heterodimere Konjugate von Anti-T11&sub2; oder Anti-T11&sub3; und J5 steuern die Lyse von CALLA+ -Zielzellen durch einen humanen CTL-Klon Ziel In vitro Zugabe % spezifische Freisetzung Namalwa
Aus Tabelle 2 geht hervor, daß entweder J5-Anti-T11&sub3;- oder J5-Anti-T11&sub2;-Konjugat in Gegenwart von reziproken Anti-T11- Antikörper (d.h. Anti-T11&sub2; und Anti-T11&sub3;) die TBI-6 dazu veranlassen kann, den CALLA+ -Tumor Nawalwa, aber nicht den CALLA-Tumor OVCAR zu lysieren.

Claims

1. Bifunktionales heterodimeres Antikörperkonjugat, umfassend (a) ein Anti-Zielzellen- Antikörperkomponente, verbunden an (b) eine Antilymphocyt-Antikörperkomponente, worin die Antilymphocyt-Antikörperkomponente spezifisch für aktivierte Lymphocyten ist, und nicht an normale, nichtaktivierte Lymphocyten bindet.

2. Bifunktionales heterodimeres Antikörperkonjugat nach Anspruch 1, wordin die Antilymphocyt-Antikörperkomponente (b) ein Anti-T11&sub3;- Antikörper ist.

3. Bifunktionales heterodimeres Antikörperkonjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin die Antizielzellen-Antikörperkomponente (a) ausgewählt ist aus einem Antitumorzell-Antikörper, einem Antikörper gegen eine Virus-infizierte Zelle, einem Antikörper gegen eine parasitär infizierte Zelle, einem Antikörper gegen eine Autoimmunzelle, einem Antikörper gegen aktivierte Zellen, die Transplantatabstoßung bewirken, und einem Antikörper gegen aktivierte Zellen, die Transplantat/Wlrtskrankheit verursachen.

4. Bifunktionales heterodimeres Antikörperkonjugat nach Anspruch 1, worin die Antikörperkomponenten (a) und (b) des heterodimeren Antikörperkonjugats durch Vernetzung komplimentär reaktiver Gruppen verbunden sind.

5. In vitro Verwendung eines heterodimeren Antikörperkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(1) Binden des bifunktionalen heterodimeren Antikörperkonjugats durch (a) die Antizielzellen- Antikörperkomponente an die Zielzellen;

(2) Aktivieren von Lymphocyten; und

(3) Binden der aktivierten Lymphocyten an (b) die Antilymphocyt-Antikörperkomponente;

worin die Schritte (1), (2) und (3) gleichzeitig in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden können, mit der Maßgabe, daß Schritt (2) immer gleichzeitig mit oder vor Schritt (3) durchgeführt wird.

6. Verwendung eines bifunktionalen heterodimeren Antikörperkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, das zur selektiven Zerstörung von Zielzellpopulationen geeeignet ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin die Zielzellen in vitro zerstört werden.

8. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Lymphocyten mit einem Vertreter, ausgewählt aus Antikörpern, Mitogenen, Antigenen und Lymphokinen aktiviert werden.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin die Lymphocyten mit einem oder mehreren Antikörpern aktiviert werden.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin die Lymphocyten mit einem oder mehreren Antikörpern, ausgewählt aus Anti-T11&sub2;, Anti-T3 und Anti-2H1 aktiviert werden.

11. Verwendung nach Anspruch 8, worin die Lymphocyten mit einer Mischung von Anti-T11&sub2;- und Anti- T11&sub3;-Antikörpern aktiviert werden.

12. Verwendung nach Anspruch 8, worin die Antilymphocyt-Antikörperkomponente (b) des bifunktionalen heterodimeren Antikörperkonjugats ein Anti-T11&sub3;-Antikörper ist, und die Lymphocyten mit Anti-T11&sub2; aktiviert werden.