DE3686313T2 - Anti-immuntoxine gegen menschlichen eierstockkrebs und verfahren zu deren verwendung. - Google Patents

Anti-immuntoxine gegen menschlichen eierstockkrebs und verfahren zu deren verwendung.

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DE3686313T2 DE8686309516T DE3686313T DE3686313T2 DE 3686313 T2 DE3686313 T2 DE 3686313T2 DE 8686309516 T DE8686309516 T DE 8686309516T DE 3686313 T DE3686313 T DE 3686313T DE 3686313 T2 DE3686313 T2 DE 3686313T2
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Description

  • Die Erfindung liegt auf dei Gebiet der Immunologie und Krebsdiagnose und -therapie. Insbesondere verwendet sie gegen menschlichen Eierstockkrebs aktive monoclonale Maus- Antikörper und betrifft aus diesen Antikörpern hergestellte Immunchemikalien.
  • Unter den bei amerikanischen Frauen auftretenden, bösartigen gynäkologischen Krankheiten stellt Eierstockkrebs die häufigste Todesursache dar. Die bösartige Krankheit bleibt während praktisch des gesamten klinischen Verlaufs auf die Bauchhöhle beschränkt. Der Tumor streut in kennzeichnender Weise in der gesamten Bauchhöhle, wodurch Ascites und Tumorherde auf den zahlreichen peritonealen Oberflächen entstehen. Die Krankheit kann chirurgisch nicht wirksam geheilt werden, und Chemotherapie ist zunehmend die wichtigste Behandlung. Da Eierstocktumore üblicherweise in der Bauchhöhle verbleiben, können chemotherapeutische Wirkstoffe systematisch durch intravenöse Injektion oder direkte Infusion in die Bauchhöhle verabreicht werden, wobei der Blutkreislauf als Weg für eine anfängliche Einwirkung des chemotherapeutischen Wirkstoffs auf den Tumor umgangen wird.
  • Über die Verwendung monoclonaler Antikörper gegen Antigene, die mit krebsartigen Eierstockgeweben verbundenen sind, ist nur in begrenztem Umfang berichtet worden. Über einen mit Pseudomonas-Exotoxin verbundenen Antikörper gegen einen menschlichen Transferrin-Rezeptor ist berichtet worden, daß er eine cytotoxische Aktivität in bestimmten menschlichen Eierstockzellinien aufweist. Pirker et al., "Anti-transferrin receptor antibody linked to Pseudomonas exotoxin; a model immunotoxin in human ovarian carcinoma cell lines", Cancer Res. 45 (1985), 751-757. Die Bindung von Transferrin an den Transferrin-Rezeptor verhindernde monoclonale Antikörper gegen Transferrin sind Gegenstand des US-Patentes 4,434,156. Erfindungsgemäße monoclonale Antikörper gegen Transferrin unterscheiden sich von den im US-Patent 4,434,156 beschriebenen. Obgleich der erfindungsgemäße Antikörper gegen Transferrin den Transferrin-Rezeptor bindet, verhindert er nicht die Bindung von Transferrin an den Transferrin-Rezeptor. Schlom et al., US-Patent 4,522,918, beschreiben ein Verfahren zur Herstellung monoclonaler Antikörper gegen bestimmte menschliche Brustkrebstumore, bei dem lösliche Extrakte aus menschlichem Brustkrebs verwendet werden.
  • EP-A 0 153 114 zählt eine Anzahl besonders brustkrebsspezifischer monoclonaler Antikörper auf und betrifft derartige Antikörper enthaltende Immunotoxinkonjugate. In ähnlicher Weise beschreiben auch Bjorn et al., Cancer Research 45 (März 1985), 1214-1221, brustkrebsspezifische Antikörper, einschließlich einiger Antikörper, auf die hier Bezug genommen wird. Bjorn et al. beschreibt jedoch nicht die Bindungsfähigkeit solcher Antikörper an Eierstockkrebsgewebe.
  • Ein Hauptaspekt der Erfindung ist ein Immunotoxin, das einen cytotoxischen Teil und einen menschliches Eierstockkrebsgewebe bindenden monoclonalen Antikörper enthält, der aus HB 10797, HB 10790, HB 10791, HB 10800, HB 10801, HB 10793, HB 8692 und HB 10813 erhältlich ist,
  • wobei das Immunotoxin mindestens eine der nachfolgenden Fähigkeiten aufweist:
  • eine Cytotoxizität-ID&sub5;&sub0; von etwa 10 nM oder weniger gegen menschliche Eierstockkrebszellen; Verzögerung der Wachstumsrate von Tumoren, die aus menschlichen Eierstockkrebszellen bestehen, die von einem Säuger getragen werden, wenn der Säuger mit Immunotoxin behandelt wird; oder
  • Verlängerung der Überlebenszeit eines Säugers, der einen aus menschlichen Eierstockkrebszellen bestehenden Tumor trägt, wenn der Säuger mit Immunotoxin behandelt wird.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Formulierung zur Verzögerung des Wachstums von Tumoren, die aus menschlichen Eierstockkrebszellen bestehen, oder zum Abtöten von menschlichen Eierstockkrebszellen, die ein für einen solchen Zweck formuliertes Immunotoxin der Erfindung enthalten.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein wie vorstehend definiertes Immunotoxin zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit.
  • Zur Erfindung gehört auch die Verwendung eines Immunotoxins, das einen cytotoxischen Teil und einen monoclonalen Antikörper enthält, der aus HB 10785, HB 10797, HB 10787, HB 10790, HB 10791, HB 10800, HB 10801, HB 10794, HB 10793, HB 10804, HB 10810, HB 10812, HB 8692 und HB 10813 erhältlich ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verzögerung des Wachstums eines Tumors, der aus menschlichen Eierstockkrebszellen besteht, oder zum Abtöten von menschlichen Eierstockkrebszellen.
  • Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorstehend definierten Immunotoxins, das eine Konjugation oder Verknüpfung eines monoclonalen Antikörpers und eines wie vorstehend definierten cytotoxischen Teils umfaßt.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "monoclonaler Antikörper" eine Antikörperzusammensetzung, die eine homogene Antikörperpopulation aufweist. Er ist weder im Hinblick auf die Quelle des Antikörpers noch auf die Art, in der er hergestellt wird, begrenzt.
  • Wie hier im Hinblick auf beispielhaft aufgeführte monoclonale Maus-Antikörper gegen menschlichen Eierstockkrebs verwendet, sind funktionell äquivalente Antikörper monoclonale Antikörper, die: (a) dasselbe Antigen oder Epitop wie ein beispielhaft aufgeführter monoclonaler Antikörper binden, wie durch Immunpräzipitation oder Sandwich-Test festgestellt wird; (b) Gefrierschnitte menschlichen Eierstockkrebsgewebes binden; (c) eine Selektivität, die gleich oder weniger als 0,11 ist, aufweisen; (d) einen G- oder M-Isotyp aufweisen und (e) falls mit einem cytotoxischen Anteil konjugiert, ein Immunotoxin bilden, das (i) das Überleben eines menschliche Eierstockkrebszellen tragenden Säugers verlängert, sobald es einem derartigen Säuger verabreicht wird oder (ii) das Wachstum von menschlichen Eierstockzellen in einem solche Zellen tragenden Säuger verzögert, sobald es einem derartigen Säuger verabreicht wird oder (iii) für menschliche Eierstockkrebszellen cytotoxisch ist, sobald derartige Zellen mit dem Immunotoxin in Kontakt gebracht werden.
  • Wie vorstehend beschrieben, sind für funktionell äquivalente Antikörper fünf Kriterien erforderlich. Das erste dieser Kriterien, die Bindung an dasselbe Antigen oder Epitop wie ein beispielhaft aufgeführter monoclonaler Antikörper, kann durch Experimente, die eine Kreuzblockierung eines beispielhaft aufgeführten monoclonalen Antikörpers durch den funktionell äquivalenten monoclonalen Antikörper zeigen, veranschaulicht werden. Die Kreuzblockierung tritt als Folge einer Antikörperbindung an dasselbe Epitop auf einem Antigen auf wie das, an das einer der beispielhaft aufgeführten Antikörper gebunden ist, oder als Folge einer Antikörperbindung an ein anderes Epitop, das so nahe auf demselben Antigen gelegen ist, daß die Bindung eines Antikörpers an ein Epitop die Bindung eines Antikörpers an das zweite Epitop blockiert. Die Kreuzblockierung stellt so eines der Kriterien dar, über die festgestellt werden kann, daß ein funktionell äquivalenter monoclonaler Antikörper dasselbe Antigen oder Epitop bindet wie ein beispielhaft aufgeführter monoclonaler Antikörper.
  • Die sogenannten Sandwich-Tests stellen ein weiteres Verfahren dar, um festzustellen, ob ein Antikörper dasselbe Antigen oder Epitop bindet. In diesen Tests wird ein erster monoclonaler Antikörper an einen Träger gebunden, zum Beispiel die Oberfläche einer Titerplattenvertiefung. Nach einer Behandlung zur Verhinderung einer nicht-spezifischen Bindung, wird zu dem gebundenen Antikörper ein stark solubilisiertes Antigenpräparat zugesetzt. Im Anschluß daran wird ein zweiter, eine nachweisbare Markierung, zum Beispiel einen fluoreszierende Farbstoff, aufweisender Antikörper zugegeben. Wenn der zweite Antikörper das Antigen bindet, wird eine andere Epitopspezifität oder mehrere Kopien desselben Epitops auf demselben Antigen angezeigt. Wenn der zweite Antikörper nicht bindet, werden entweder die gleiche Epitopspezifität oder eine andere Antigenspezifität angezeigt. Die Ergebnisse sowohl der Kreuzblockierung als auch des Sandwich-Tests werden durch eine zweite Serie von Tests, wie Immunpräzipitation oder Western-Blotting, näher bestimmt, wodurch gezeigt werden soll, daß das von beiden Antikörpern gebundene Antigen dasselbe Molekulargewicht aufweist.
  • Die erfindungsgemäßen Immunotoxine sind Konjugate des Antigen-bindenden Teils des monoclonalen Antikörpers und eines cytotoxischen Anteils. Der cytotoxische Teil des Immunotoxins kann ein cytotoxischer Arzneistoff oder ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, Pilz- oder pflanzlichen Ursprungs oder eine enzymatisch aktive Polypeptidkette oder ein Fragment ("A-Kette") eines derartigen Toxins sein. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon werden bevorzugt und als Beispiele dienen das Diphtherietoxin A-Fragment, nicht-bindende aktive Fragmente des Diphtherietoxins, Exotoxin A (von Pseudomonas aeruginosa), die Ricin A-Kette, Abrin A-Kette, Modeccin A- Kette, Alphasarcin, bestimmte Aleurites fordii-Proteine, bestimmte Dianthin-Proteine, Phytolacca americana-Proteine (PAP, PAPII und PAP-S), Momordica charantia Inhibitor, Curcin, Crotin, Saponaria officinalis Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin und Enomycin. Ricin A- Kette, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A und PAP werden bevorzugt.
  • Konjugate können mit einer Vielzahl von bifunktionellen, an Proteine kuppelnden Wirkstoffen hergestellt werden. Beispiele solcher Reagenzien sind N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate der Imidoester wie Dimethyladipimidat.HCL, aktive Ester wie Disuccinimidylsuberat, Aldehyde wie Glutaraldehyd, Bisazido- Verbindungen wie bis (p-Diazoniumbenzoyl)-ethylendiamin, Diisocyanate wie Toluyl-2,6-diisocyanat und doppelaktive fluorierte Verbindungen wie 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol.
  • Das enzymatisch aktive Polypeptid der erfindungsgemäßen Immunotoxine kann rekombinant hergestellt werden. Die rekombinant hergestellte Ricintoxin A-Kette (rRTA) kann entsprechend den in PCT W085/03508 beschriebenen, am 15. August 1985 veröffentlichten Verfahren, hergestellt werden. Die rekombinant hergestellte Diphtherietoxin A-Kette und nicht-bindende aktive Fragmente davon werden auch in der am 15. August 1985 veröffentlichten PCT W085/03508 beschrieben.
  • Die Konjugate werden üblicherweise bei der Verwendung zur in vitro Abtötung von menschlichen Eierstockkrebszellen für diagnostische Zwecke in einer Konzentration von mindestens etwa 10 nM zum Kulturmedium der Zellen zugesetzt. Für die in vitro Verwendung sind Formulierung und Art der Verabreichung nicht kritisch. Üblicherweise werden wäßrige, mit dem Kultur- oder Perfusionsmedium verträgliche Formulierungen verwendet. Die Cytotoxizität kann in einem Clon-Test mit üblichen Techniken wie Farbstoffausschließung oder Hemmung der Koloniebildung abgelesen werden, um das Vorhandensein eines Eierstockkrebstumors, der gegen Behandlung mit dem interessierenden Immunotoxin empfindlich ist, festzustellen.
  • Bei der in vivo Verwendung zur Therapie werden Immunotoxine dem Patienten in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht (d.h. Mengen, die das Wachsen der Tumorlast des Patienten beseitigt oder verringert oder verzögert). Sie werden normalerweise parenteral, vorzugsweise intraperitoneal (IP), verabreicht. Die Dosis und der Dosierungsplan werden von der Natur des Krebses (primär oder metastatisch) und seiner Population, den Eigenschaften des bestimmten Immunotoxins, z.B. seinem therapeutischen Index, dem Patienten und der Vorgeschichte des Patienten abhängen. Die Menge des verabreichten (IP) Immunotoxins wird üblicherweise im Bereich zwischen etwa 0,01 und etwa 100 mg/kg und vorzugsweise zwischen 0,01 mg/kg und 10 mg/kg des Patientengewichts liegen.
  • Zur parenteralen Verabreichung werden die Immunotoxine in Form injizierbarer Einheitsdosierungen (Lösung, Suspension, Emulsion) in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen, parenteralen Vehikel formuliert. Derartige Vehikel sind ihrem Wesen nach nichttoxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele für derartige Vehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und 5%iges menschliches Serumalbumin. Nichtwäßrige Vehikel, wie feste Öle und Ethyloleate, können ebenfalls verwendet werden. Liposomen kommen als Träger in Frage. Das Vehikel kann geringfügige Mengen an Zusätzen enthalten, wie Stoffe, die die Isotonie und chemische Stabilität steigern, z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Das Immunotoxin wird üblicherweise in solchen Vehikeln in Konzentrationen von etwa 0,01 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
  • Cytotoxische, radioaktive Pharmazeutika zur Behandlung von Eierstockkrebs können durch Konjugation von emittierenden Isotopen (z.B. Y, Pr) mit starkem linearem Energietransfer (LET) an die Antikörper hergestellt werden. Der Begriff "cytotoxischer Teil" wie er hier verwendet wird, soll derartige Isotope einschließen.
  • Die Antikörper produzierenden Fusionspartner, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Hybridomen verwendet werden, werden durch Immunisierung von Mäusen mit lebenden menschlichen Brustkrebszellen oder daraus hergestellten Membranextrakten erzeugt. Die Mäuse werden mit einer immunogenen Menge von Zellen oder Extrakt intraperitoneal geimpft und anschließend mit ähnlichen Mengen des Immunogens nachgeimpft. Einige Tage nach der letzten Wiederholungsimpfung werden die Milzen aus den immunisierten Mäusen gesammelt, und daraus wird zur Verwendung bei der Fusion eine Zellsuspension hergestellt.
  • Hybridome werden aus den Splenozyten und einem Mäusetumorpartner mit der üblichen somatischen Zell- Hybridisierungs-Technik von Köhler, G. und Milstein, C., Nature 256 (1975), 495-497, so wie modifiziert von Buck, D.W. et al., In Vitro 18 (1982), 377-381, hergestellt. Erhältliche Maus-Myelomlinien, wie jene vom Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, können bei der Hybridisierung verwendet werden. Grundsätzlich besteht die Technik darin, die Tumorzellen und Splenozyten mit einem Fusionsmittel wie Polyethylenglycol zu verschmelzen. Nach der Fusion werden die Zellen von dem Fusionsmedium abgetrennt und in einem selektiven Kulturmedium, wie einem HAT-Medium, gezüchtet, um nichthybride elterliche Zellen zu beseitigen. Falls erwünscht, werden die Hybridome vermehrt und die Überstände mit üblichen immunologischen Testverfahren (z.B. Radio- Immuntest, Enzym-Immuntest oder Immun-Fluoreszenztest) mit dem immunisierenden Mittel (Brustkrebszellen oder Membranextrakte) als Antigen auf eine Aktivität gegen menschlichen Brustkrebs untersucht. Positive Clone werden weiter charakterisiert, um festzustellen, ob sie die Kriterien der erfindungsgemäßen Antikörper erfüllen.
  • Derartige Antikörper herstellende Hybridome können mit bekannten Verfahren in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Vorzugsweise werden die Hybridome als Ascites in Mäusen gehalten. Die monoclonalen Antikörper können, falls erwünscht, aus dem Kulturmedium oder den Körperflüssigkeiten, je nachdem durch übliche Reinigungsverfahren für Immunglobuline, wie Ammoniumsulfat- Fällung, Gel-Elektrophorese, Dialyse, Chromatographie und Ultrafiltration, isoliert werden.
  • Die wichtigen Eigenschaften der monoclonalen Antikörper sind (1) ihre Immunglobulinklasse, (2) ihre Fähigkeit, menschliches Eierstockkrebsgewebe zu binden, (3) ihre Selektivität wie hier nachstehend näher bestimmt wird, (4) ihre Nützlichkeit bei der Herstellung von gegen menschlichen Eierstockkrebs wirksamen Immunotoxinen, die entweder cytotoxisch für menschliche Eierstockkrebszellen sind, oder das Überleben von menschliche Eierstockkrebszellen tragenden Säugern verlängern, oder das Wachstum von menschlichen Eierstockkrebszellen in derartige Zellen tragenden Tieren verzögert. Die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Immunotoxine nützlichen monoclonalen Antikörper wurden anfänglich als monoclonale Antikörper innerhalb einer Gruppe von gegen Brustkrebs gerichteten monoclonalen Antikörpern identifiziert.
  • Für die Auswahl der erfindungsgemäßen Antikörper wurden anfänglich etwa 22000 wachsende Hybridomkulturen mit den/der immunisierenden Brusttumormembranen oder -zellinie, einem Spektrum von sieben normalen Gewebemembranen, einer Fibroblast-Zellinie und einem Gefrierschnitt aus Brusttumor abgesucht. Mit neoplastischen Materialien, nicht aber mit den normalen Materialien reagierende Clone wurden bei diesem anfänglichen Absuchen identifiziert und für Isotypisierung und zusätzliches Absuchen auf Selektivität und Wirkungsbreite ausgewählt. Für das zusätzliche Absuchen wurden herangezogen: Sechzehn normale Gewebeschnitte, fünf normale Blutzelltypen, elf Schnitte aus Neoplasmen außerhalb des Brustbereichs, einundzwanzig Brustkrebsschnitte und vierzehn Brustkrebszellinien. Beim zusätzlichen Absuchen band eine Anzahl von monoclonalen Antikörpern die Gewebeschnitte des Eierstockkarzinoms stark, band aber anscheinend nicht an normale Eierstockgewebeschnitte.
  • Für die Zwecke dieser Patentanmeldung werden Spezifität und Selektivität austauschbar verwendet und definiert als die Summe der Anzahl der bei sechzehn Gefrierschnitten aus normalem Gewebe eingefärbten Substrukturen und der Anzahl der gebundenen Blutzelltypen, dividiert durch die Summe der Gesamtanzahl der von einem beliebigen monoclonalen Antikörper in all den Geweben gebundenen Substrukturen, die mit monoclonalen Antikörpern getestet wurden, und fünf getesteten Blutzelltypen. 123 Substrukturen und fünf Blutzelltypen wurden in den Tests gezählt. Antikörper erschienen als geeignete Kandidaten für Zwecke im Hinblick auf Eierstockkrebsimmunotoxine, wenn sie eine Selektivität von gleich 0,11 oder weniger aufweisen und an menschliche Eierstockkrebsgewebe banden.
  • Bei von einem der Hybridome hergestellten Antikörpern wurde festgestellt, daß sie ein 200 K Dalton Antigen erkennen. Antikörper von zwei der Hybridome banden an ein 42 K Dalton Antigen. Vier banden an eine oder mehrere Mucine von hohem Molekulargewicht (HMW) und zwei banden an Transferrinrezeptoren in Form eines 95 K Dalton Antigens. Zwei banden an dasselbe Epitop eines 55 K Dalton Antigens. Sämtliche hier erwähnten Antigengewichte wurden durch Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren bestimmt.
  • Weitere Einzelheiten der Charakterisierung dieser Antikörper werden in den nachstehenden Beispielen bereitgestellt.
  • Die höchst wichtigen, erfindungsgemäßen immunchemischen Derivate sind Konjugate von monoclonalen Antikörpern und einem cytotoxischen Wirkstoff.
  • Frisches nachoperatives menschliches Brustkrebsgewebe und eine Vielzahl von normalen Geweben wurden verwendet, um Membranextrakte durch Homogenisierung und Zentrifugierung über einen diskontinuierlichen Rohrzuckergradienten herzustellen. Menschliche Brustkrebszellinien wurden von der Breast Cancer Task Force, der American Type Culture Collection (ATCC) und von Dr. Jorgen Fogh am Memorial Sloan Kettering erhalten. Die Zellen wurden wie von der Breast Cancer Task Force, der ATCC und Dr. Fogh empfohlen gehalten und passagiert. Fünf Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden zu Immunisierungszwecken intraperitoneal entweder mit 100 ug Protein (Lowry-Test) enthaltenden Membranextrakten oder mit zehn Millionen lebenden Brustkrebszellen geimpft. Die Mäuse wurden in identischer Weise zweimal in monatlichen Abständen nachimmunisiert. Drei Tage nach der letzten Wiederholungsimpfung wurden die Milzen zum Zweck der Zellfusion entfernt.
  • Somatische Zellhybride wurden nach dem Verfahren von Buck, D. W. et al., vorstehend, unter Verwendung der Maus- Myelom-Zellinie Sp-2/0/Ag14 hergestellt. Sämtliche Hybridom- Zellinien wurden durch begrenzende Verdünnung geclont. Für eine Hälfte der Fusionen wurden Splenozyten von Mäusen, die mit Brustkrebsmembranextrakten immunisiert waren, verwendet, und für die andere Hälfte wurden Splenozyten von Mäusen, die mit lebenden Brustkrebszellinien immunisiert waren, verwendet. Dreiundachtzigtausendvierhundertvierundzwanzig Vertiefungen wurden von jenen Fusionen geschaffen, von denen 22459 Wachstum von Hybridomzellen zeigten.
  • Der Überstand der Hybridome wurde auf reagierende Antikörper mit entweder einem Festphasen-Enzym-gebundenen- Immunadsorptions-Test (ELISA) mit dem zur Immunisierung verwendeten Brustkrebsmembranextrakt oder einem indirekten Immunfluoreszenz-Test mit der zur Immunisierung verwendeten Brustkrebszellinie getestet. Für den Festphasen-Membran- ELISA wurden 40 ul von 0,1 mg/ml Brustkrebsmembranprotein bei 4ºC 12 Stunden lang in Mikrotiter-Vertiefungen aus Polyvinylchlorid (PVC) gegeben. Der Extrakt wurde abgesaugt, und die Vertiefungen wurden mit phosphatgepufferter, 1%iges Rinderserum-Albumin (BSA) enthaltender Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Vertiefungen wurden anschließend mit 45 ul einer 1:10 Verdünnung eines Überstandes von Hybridomen inkubiert. Das Verdünnungsmittel bestand aus Medien mit 25 mM eines Puffers, 10%igem Rinderserum und 0,1%igem Natriumazid. Die Vertiefungen wurden nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wiederum gewaschen und 45 Minuten lang bei 37ºC mit einer 1:200 Verdünnung von mit Peroxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG inkubiert. Das Verdünnungsmittel war PBS. Die Vertiefungen wurden anschließend mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 200 ul 1,2-Azin-di(3- ethylbenzthiazolinsulfonsäure) in einem 0,1 M Natriumcitrat- Puffer, pH-Wert 4,2, umgesetzt. Die optische Dichte wurde bei 405 nm auf einem "Micro ELISA Reader" gemessen. Für jedes Experiment wurde eine positive Kontrolle, anti-beta-2- Microglobulin (5 ug/ml), mit normalen menschlichen Nierenmembranen umgesetzt. Diese ergab eine optische Dichte von 1,0 + 0,1 (Standardabweichung). Der Hintergrund betrug 0 ± 0,1 optische Dichte-Einheiten (O.D.), wobei Medien ohne monoclonale Maus-Antikörper verwendet wurden. Vertiefungen, die eine Reaktion größer als 0,7 O.D. auf Membranextrakt von Brustkrebs zeigten, wurden aufgehoben.
  • Für den indirekten Immunfluoreszenz-Zellinien-Test wurden 100000 Brustkrebszellen der immunisierenden Zellinie über Nacht mit geeigneten Medien in jede Kammer eines Satzes von acht Kammern enthaltenden Objektträgern gegeben. In ähnlicher Weise wurden 100000 Fibroblastenzellen der Zellinie CC95 über Nacht in kammerartigen Vertiefungen von Objektträgern inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 % BSA enthaltendem PBS gewaschen. Sowohl die Brustkrebs als auch die Fibroblasten enthaltenden Vertiefungen wurden bei 4ºC 30 Minuten lang mit 1:10 Verdünnungen von Hybridomüberständen inkubiert. Die Zellen wurden wiederum gewaschen und bei 4ºC 30 Minuten lang mit einer 1:50 Verdünnung von mit Fluorescein-Isothiocyanat-(FITC) konjugiertem Ziegen- F(ab')&sub2;-Anti-Maus-Ig inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, in 1,5%igem Formaldehyd in PBS fünf Minuten lang immobilisiert, die Kammern entfernt und mit PBS gespült. Die Objektträger wurden anschließend in eine Polyvinyl-Alkohol, Glycerol, Puffer und ein Konservierungsmittel enthaltende Zusammensetzung eingebracht und mit einem Fluoreszenz- Mikroskop untersucht. Vertiefungen mit Hybridomen, die eine starke Fluoreszenzbindung an Brustkrebszellen, aber keine Fluoreszenzbindung an Fibroblasten zeigten, wurden aufbewahrt. Fünftausendeinhundertsechsundfünfzig Vertiefungen mit Hybridomen zeigten beim anfänglichen Absuchen eine Brustkrebsreaktivität.
  • Überstände von den 5156 positiven Vertiefungen wurden anschließend über Festphasen-ELISA mit sieben normalen Gewebemembranextrakten (Leber, Lunge, Dickdarm, Magen, Niere, Mandel und Milz) getestet. Jeder Überstand, der einen ELISA O.D. größer als 0,3 ergab, wurde verworfen. Eintausendeinhundertundeiner der Überstände erwiesen sich gegenüber den normalen Gewebeextrakten als nicht-reagierend.
  • Die 1101 Überstände der Hybridome wurden auf Gefrierschnitten von menschlichen Brustkrebsgeweben getestet. Schnitte von sechs Micron wurden an den Objektträger befestigt, bei 4ºC 10 Minuten lang in Aceton immobilisiert, bei Raumtemperatur 10 Minuten lang getrocknet, mit PBS gewaschen, mit Pferdeserum blockiert und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang mit 100 ul unverdünntem Überstand von Hybridomen inkubiert. Die Objektträger wurden mit PBS gewaschen und schließlich bei 37ºC 20 Minuten lang mit einer 1:50 Verdünnung von mit Peroxidase konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-Ig inkubiert, nochmals mit PBS gewaschen und schließlich bei 37ºC 7,5 Minuten lang mit 0,5 mg/ml Diaminobenzidin in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,2, der 0,01%iges Wasserstoffperoxid enthielt, inkubiert. Die Objektträger wurden mit Hematoxylin eingefärbt, dehydriert und in ein 35,9 % Methyl/n-Butylmethacrylat Copolymer, 7,1 % Butylbenzylphthalat und 0,3 % 2,6-Ditert-butyl-p-cresol enthaltendes Medium eingebracht. Einhundertvierundzwanzig Vertiefungen ergaben eine selektive Bindung an Brustkrebs und wurden geclont.
  • Immunglobulin-Klasse und -Unterklasse der monoclonalen Brustkrebs-selektiven Antikörper wurden über einen Immunpunkt-Test bestimmt, der im wesentlichen derselbe, wie der bei McDougal et al., J. Immunol. Meth. 63 (1983), 281-290 beschriebene ist. Antikörper wurden ebenfalls intern durch vier Stunden lange Züchtung von 2-3 x 10&sup6; Hybridomen in einem 0,2 uCi ³&sup5;S-Methionin enthaltenden Methionin-freien Medium markiert. ³&sup5;S-markierte Antikörper wurden mit immobilisierten Staphylococcus-A-Zellen, oder mit immobilisierten Staphylococcus-A-Zellen, die vorher mit Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin beschichtet worden waren, einer Immunpräzipitation unterzogen, und die Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE analysiert, um die Mobilität der leichten und schweren Kette der Antikörper, das Fehlen von zusätzlichen Ketten und die Fähigkeit eines jeden Antikörpers, Staphylococcen Protein-A zu binden, festzustellen.
  • Die Antikörper wurden in vivo vermehrt. Balb/c oder F1 (C57B/6 x Balb/c)-Mäuse wurden mit 0,5 ml Pristan intraperitoneal (ip) vorbereitet und nach 10-14 Tagen mit einer Million Hybridome in der log-Phase in PBS geimpft. Ascites-Flüssigkeit bewahrte man bei -70ºC auf, und taute sie vor der weiteren Reinigung auf, und filtrierte sie durch eine 0,8 Micron Filtereinheit.
  • Einige IgG-Antikörper, die Staphylococcen-Protein-A banden, wurden durch Affinitäts-Chromatographie über Protein-A-Chromatographieharz, das entweder Agarose, Dextran und/oder Acrylamid enthielt, mit einer pH-Stufengradient- Elution gereinigt. Die Protein-A nicht-bindenden IgG- Antikörper wurden bei 0ºC durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer 40%igen Sättigung oder durch Bindung an DEAE oder Affigel (Biorad, Richmond, Kalifornien) ausgefällt. In einer anderen Ausführungsform wurden die IgG-Antikörper chromatographisch unter Verwendung einer Sephacryl S-200 Säule und anschließend DEAE-Cellulose, wie beschrieben, gereinigt. Die Niederschläge wurden in PBS wieder gelöst, gegen 20 mM Tris, pH-Wert 7,2, dialysiert und über eine 1,6 x 50 cm Säule aus Diethylaminoethyl-Cellulose (DEAE) chromatographiert, wobei die Elution bei 4ºC durch einen 1,5 Liter 0-600 mM NaCl Gradienten bei einer Durchflußrate von 1 ml/Min. erfolgte. In jedem Fall wurden die Fraktionen der Säule durch SDS-PAGE überprüft und die reinsten Antikörper- Fraktionen vereinigt, auf 1-3 mg/ml konzentriert, gegen PBS/0,02%igem NaN&sub3; dialysiert und bei 4ºC aufbewahrt.
  • IgM-Antikörper wurden durch Gel-Filtrationsmaterial über eine 2,6 x 40 cm Säule aus Sephacryl S-300 oder durch eine andere Gelfiltration an einem Agarose, Dextran und/oder Acrylamid enthaltenden Harz, gereinigt, wobei die Elution bei Raumtemperatur durch PBS/0,01% Natriumazid bei einer Durchflußrate von 1 ml/Min. erfolgte.
  • Um ihre Selektivität einzuschätzen wurden die gereinigten Antikörper durch eine Immun-Peroxidase-Schnitt- Färbung von sechzehn normalen Gewebeschnitten, und durch Immunfluoreszenz-Zellsortierung bei fünf Blutzelltypen getestet. Die Immunperoxidase-Färbung wurde wie vorstehend durchgeführt, mit der Ausnahme, daß bekannte Verdünnungen von gereinigten Antikörpern in PBS im Bereich von 1-40 ug/ml an Stelle von Hybridomüberständen verwendet wurden. Die reinen Antikörper wurden, um die eine starke Immunperoxidasefärbung auf Brustkrebsschnitten ergebende Minimalkonzentration zu finden, zuerst titriert und anschließend in der Konzentration für die Tests mit normalem Gewebe verwendet. Kein normales Eierstockgewebe zeigte eine nachweisbare Bindung.
  • Periphere Blutzellen (Plättchen, Lymphocyten, rote Blutkörperchen, Granulocyten und Monocyten) wurden durch Zentrifugation unter Verwendung eines Mediums aufbereitet, das Monocyten von polymorphkernigen Leukocyten trennt. Die Zellen wurden bei 4ºC 30 Minuten lang mit Antikörpern in der wie vorstehend bestimmten optimalen Konzentration umgesetzt, gewaschen, bei 4ºC 30 Minuten lang mit einer 1:50 Verdünnung von mit Fluorescein-Isothiocyanat konjugiertem Ziegen-Anti- Maus-Ig umgesetzt, wiederum gewaschen und in einem Zellsortierer untersucht. Der Waschpuffer und die Verdünnungsmittel bestanden aus PBS mit 1 % Gelatine und 0,02 % Natriumazid. Den Zellsortierer rüstete man mit einer 76 Micron Tropfspitze und einem Ein-Watt-Argon-Ionen-Laser von 488 nm aus. Eine 80 mm konfokale Linse wurde zu Fokussierungszwecken auf der optischen Bank montiert. Andere verwendete Filter waren ein 515 nm Interferenzfilter und ein 515 nm Absorptionsfilter (für gestreutes Laserlicht) sowie ein neutrales Dichtefilter von 1,5 für das in einem Winkel ausfallende Streulicht. Umrißzeichnungen des log Fluorescein-Fluoreszenz aufgetragen gegen das in einem Winkel ausfallenden Streulichts wurden zur Probenanalyse verwendet.
  • Über die Bindungsverhaltensweisen der für die erfindungsgemäßen Immunotoxine nützlichen Antikörper auf normalen Gewebeschnitten wird nachstehend in Tabelle 1 berichtet. Die folgenden Abkürzungen werden zur Bezeichnung von Strukturen verwendet, an die Antikörper binden: Ac, Acini; G, Drüsen; T, Tubuli; D, Gänge; L, Lumen; W, Schweißdrüsen; E, Epithelgewebe; S, Talgdrüsen; Gr, Granulocyten; Mk, Megakaryocyten; M, Makrophage; Ly, Lymphocyten; Bl, Basalmembran; Fe, Fokales Epithelgewebe; A, Lungenepithelzellen; B, Bowmansche Kapsel; Mu, Muskel; I, Inseln; X, Ganglien/Nerven; V, Blutgefäße; und H, Haarfollikel. Die Selektivität wurde wie hier vorstehend beschrieben quantifiziert. Über das Bindungsverhalten der Antikörper gegenüber peripheren Blutzellen wird in Tabelle 2 berichtet. Die Selektivität der monoclonalen Antikörper wird in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 1 BINDUNG VON EIERSTOCK-MAK AN NORMALES GEWEBE MAK PANKREAS ESOPHAGUS LUNGE NIERE DICKDARM MAGEN GEHIRN MANDEL LEBER HERZ EIERSTOCK HAUT KNOCHENMARK Gebärmutter BLASE NORMALE BRUST TABELLE 2 BINDUNGEN VON EIERSTOCK-MAK AN BLUTZELLEN MAK PLÄTTCHEN LYMPHOCYTEN GRANULOCYTEN MONOCYTEN TABELLE 3 GEWEBESELEKTIVITÄT VON EIERSTOCK-MAK MAK GEBUNDENE BLUTZELLEN GEBUNDEDE SUBSTRUKTUREN VON NORMALEN GEWEBE/SUBSTRUKTUREN VON NORMALEN GEWEBE UND BLUTZELLEN SELEKTIVITÄT
  • Man testete die Antikörper durch Immunperoxidase- Färbung auf elf bösartigen Krebszellgeweben, die nicht der Brust entstammten. Über die Ergebnisse mit den Antikörpern wird nachstehend in Tabelle 4 berichtet. TABELLE 4 BINDUNGEN VON EIERSTOCK-MAK AN NICHT-BRUSTKREBS MAK DICKDARM LUNGE PROSTATA PANKREAS Gebärmutter LYMPHON MAGEN BLASE ESOPHAGUS MYELOM EIERSTOCK
  • Einige der Antikörper wurden jodiert und auf Bindung an MCF-7, CAMA1, SKBR3 oder ZR7530 Zellen getestet. Die Antikörper wurden mit ¹²&sup5;J unter Verwendung von Chloramin-T oder Jodogen mit einer spezifischen Aktivität von etwa 5- 10 uCi/ug markiert. Um die immunradiochemische Reinheit festzustellen, wurden 100000 cpm von zweien der markierten Antikörper in 0,5 ml fötalem Kälberserum nacheinander bei 0ºC 15 Minuten lang mit fünf Aliquots von Zielzellen (üblicherweise 4000000 Zellen pro Aliquot) absorbiert und nach jeder Absorption die verbleibende Radioaktivität im Überstand bestimmt.
  • Zum Zweck von Messungen der Assoziationskonstanten wurden bekannte Konzentrationen von markierten und nichtmarkierten monoclonalen Antikörpern 15 Minuten lang mit Zielzellen in fötalem Kälberserum auf Eis inkubiert. Aliquots des Zell/Antikörper-Gemisches wurden anschließend in einem Gammazähler gezählt oder durch "Microfold"- Filterplatten (V&P Scientific) filtriert und die Filter ausgezählt. Wegen der ungebundenen, in der Flüssigkeit auf dem Filter zurückgehaltenen Antikörper wurden parallel dazu dieselben Antikörperkonzentrationen, aber keine Zellen enthaltende Kontrollen durchgeführt. Assoziationskonstanten und Kopienzahl der Antigene pro Zielzelle werden aus den Ergebnissen der Affinitätstests errechnet, und es wird nachstehend in Tabelle 5 über sie berichtet. TABELLE 5 AFFINTÄT UND KOPIENZAHL DER ANTIGENE DER EIERSTOCK-MAK MAK ZELLINIE
  • Um die durch die monoclonalen Antikörper erkannten Antigene zu identifizieren, wurde eine Immunpräzipitation der Antigene dem nachfolgenden Verfahren entsprechend durchgeführt. Kugeln aus Polystyrol mit einem Durchmesser von 8 mm (Precision Plastic Ball Co.) wurden mit 10%iger rauchender Salpetersäure in Eisessig überschichtet und in einem 50ºC warmen Wasserbad drei Stunden lang inkubiert. Im Anschluß an die Säurebehandlung wurden die Kugeln dreimal mit destilliertem Wasser gespült, mit 1 % Natriumdithionit in 0,1 M NaOH überschichtet und drei Stunden lang in einem 50ºC warmen Wasserbad inkubiert. Die Kugeln wurden wiederum dreimal mit destilliertem Wasser gespült, mit 0,1%igem 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), 0,2%iger Korksäure (in Dimethylformamid gelöster Korksäure) überschichtet und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert.
  • Die Kugeln wurden dreimal mit destilliertem Wasser gespült und zur Identifizierung markiert.
  • Gereinigte monoclonale Antikörper wurden auf 0,2 mg/ml in 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure-Puffer verdünnt, und die zuvor behandelten und markierten Polystyrolkugeln wurden in einzelne Röhrchen gegeben und mit 450 Microlitern an verdünntem Antikörper und 50 Microlitern an frischem 1%igem EDAC beschichtet. Die Röhrchen wurden verschlossen und bei 25ºC 24 Stunden lang inkubiert. Im Anschluß an diese Inkubation wurden die Kugeln zweimal mit PBS gespült und entweder frisch verwendet oder vor der Verwendung mehrere Tage lang bei 4ºC gelagert.
  • Frisch markierte Extrakte von Zielzellen wurden aus menschlichen, mit ¹²&sup5;J markierten Brustkrebszellinien nach dem Lactoperoxidase-Verfahren von Marchalonis, J., "An Enzymic Method for the Trace Iodination of Immunglobulins and other Proteins", Biochem. J. 113 (1969), 299-305 oder mit ³&sup5;S durch Wachstum in ³&sup5;S Methionin hergestellt. Die markierten Zellen wurden in Löslichkeitspuffer (1 % (Vol./Vol.) Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5) gelöst. Vier Teile des markierten Extrakts wurden in einem Behälter mit einem 50 mg/ml Rinderserum-Albumin enthaltenden Teil Löslichkeitspuffer vermischt, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml BSA zu erhalten. Die mit monoclonalen Antikörpern beschichteten Kugeln wurden in das Gefäß gegeben und unter Schütteln vier Stunden lang auf Eis inkubiert. Markiertes Antigen wurde aus dem Gefäß abpipettiert und die Kugeln wurden viermal mit Löslichkeitspuffer gespült. Die Kugeln wurden anschließend entfernt, in einzelne Röhrchen mit 100 Microlitern Laemmli- SDS-Gel-Probenpuffer gegeben und in kochendem Wasser drei Minuten lang inkubiert. Die Kugeln wurden entfernt und die Proben mit geeigneten Standards auf einem SDS-Gel einer Elektrophorese unterworfen.
  • Immunpräzipitations-Tests mit den Antikörpern zeigten an, daß acht von ihnen (2G3, 120H7, 200F9, 204F4, 245E7, 369F10, 788G6 und 871E3) Mucine mit hohem Molekulargewicht (HMW) binden. Zwei (260F9 und 266B2) binden dasselbe Epitop eines 55 Kd-Glycoprotein-Antigens. Zwei (317G5 und 650E2) binden ein 42 Kd-Antigen. Zwei Antikörper (451C3 und 454A12) banden Transferrin-Rezeptoren in der Form eines 95 Kd- Antigens. Weder 451C3 noch 454A12 blockierten die Bindung von Transferrin an den Rezeptor. Die Eigenschaften der Antigen-Bindung der getesteten monoclonalen Antikörper werden in Tabelle 6 zusammengefaßt. TABELLE 6 DURCH MONOCLONALE EIERSTOCK-ANTIKÖRPER ERKANNTE ANTIGENE MAK ANTIGEN
  • Der Antikörper-Isotyp wurde wie folgt bestimmt: Ein Gitter aus 5 mm-Quadraten wird leicht mit einem Bleistift auf ein Blatt aus Nitrocellulose gezeichnet und 1 ml- Tröpfchen von Antiisotyp-Seren (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, Kaninchen Anti-Maus κ, λ, α, γ1, γ2a, γ2b, γ3 und u Ketten-Seren) werden so aufgetragen, daß jede Reihe von Quadraten einen Tupf en von jedem Reagens für schwere und leichte Ketten erhält. Das Blatt wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang in einer feuchten Kammer inkubiert, schnell in 1 % (Gew./Vol.) enthaltendem PBS-BSA gespült und über Nacht bei 4ºC in PBS-BSA stehengelassen. Die Streifen werden mit einer Schere auseinandergeschnitten und können bei 4ºC in 0,02 % Natriumazid enthaltendem PBS- BSA gelagert werden. In einer anderen Ausführungsform können die Streifen an der Luft getrocknet und bei 4ºC in trockenem Zustand gelagert werden. Eine Reihe von 3 ml Hybridomkulturüberstand oder von mit PBS-BSA verdünntem Überstand enthaltenden kleinen Röhrchen wird hergestellt. 1:10 Verdünnungen sind im allgemeinen erfolgversprechend; und einige Überstände können bis zu 1:200 verdünnt werden. Ein Streifen aus Nitrocellulose wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang in jedem Röhrchen inkubiert. Die Streifen werden dreimal in PBS-BSA gespült und bei Raumtemperatur eine Stunde lang in verdünnter Kaninchen Anti-Maus-Meerrettich Peroxidase inkubiert. Die Streifen werden zweimal in PBS-BSA und zweimal in Tris-Puffer gespült. Die Streifen werden in Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid enthaltenden Tris- Puffer gegeben, bis sich (gewöhnlich 3-4 Minuten) auf den Anti-Isotyp-Tupfen genügend Farbe entwickelt hat. Die Antikörper-Isotypen werden in Tabelle 7 gezeigt. TABELLE 7 ISOTYPEN VON MONOCLONALEN EIERSTOCK-ANTIKÖRPERN MAK ISOTYP
  • Die Antikörper wurden mit SPDP behandelt, wie beschrieben bei Bjorn et al., "Evaluation of Monoclonal Antibodies for the Development of Breast Cancer Immunotoxins," Cancer Res. 45 (1985), 1214-1221 und Carlsson, J. et al., Biochem. J. 173 (1978), 723-737 oder mit Iminothiolan (IT) und wurden an die Ricintoxin A-Kette (RTA) konjugiert, um die beanspruchten Immunotoxine herzustellen.
  • SPDP (20 mM in Ethanol) wurde in einem 20-fachen molaren Überschuß zu den Antikörpern hinzugefügt, und im Anschluß an eine 30 Min. lange Inkubation bei Raumtemperatur wurde das nicht umgesetzte SPDP durch Dialyse gegen PBS entfernt. Das Ausmaß der Derivatisierung stellte man durch Messung der Freisetzung von Pyridin-2-thion bei 343 nm nach Reduktion mit Dithiothreit (DTT) fest. In Abhängigkeit vom Antikörper wurden (pro Antikörpermolekül) drei bis acht Lysin-Aminosäuregruppen in Pyridyldisulfid-Derivate umgewandelt.
  • Die SPDP-behandelten Antikörper wurden mit RTA konjugiert. Unmittelbar vor der Konjugation wurde das RTA mit 50 mM DTT reduziert, anschließend über eine Säule von Chromatographieharz, das Agarose, Dextran und/oder Acrylamid enthielt, entsalzt, um das DTT vom Protein zu entfernen. Reduziertes RTA wurde in einem drei- bis fünffachen molaren Überschuß zu den Pyridyldisulfid-Antikörpern zugegeben. Ein übliches Reaktionsgemisch (1 ml) bestand aus 7 uM Antikörpern und 30 uM RTA. Die Umsetzung erfolgte bei 4ºC über Nacht. Das Ausmaß der Konjugation von RTA an Antikörper wurde spektrophotometrisch durch Messung der Freisetzung von Pyridin-2-thion festgestellt. Im Durchschnitt enthielten die Konjugate zwei oder drei RTA-Moleküle pro Antikörpermolekül. Dies wurde durch nicht-reduzierende SDS-PAGE-Gele (7,5 %) bestätigt, die auch zeigten, daß die übliche Konjugatpräparation 10 %-30 % freie Antikörper enthielt.
  • Das Konjugatgemisch wurde über eine HPLC-Säule, die nach Molekülgröße ausschließt, chromatographiert, um Konjugate von restlichem, nicht umgesetzten RTA zu trennen. Die Säule wurde mit 0,1 M Natriumsulfat/0,02 M Natriumphosphat, pH-Wert 6,8, äquilibriert. Ein Konjugatgemisch (0,7 ml) wurde injiziert und anschließend bei einer Durchflußrate von 1 ml/Min. (Raumtemperatur) chromatographiert. Fraktionen von 0,5 ml wurden gesammelt und die Peak-Konjugatfraktionen wurden vereinigt und vor dem Cytotoxizitätstest steril filtriert.
  • Etwa 30 mg/ml Antikörper in 0,10 M Na-Phosphat, 0,001 M Na-EDTA, pH-Wert 8,0, (nachstehend als P-EDTA-Puffer bezeichnet) wird mit 1 mM 5,5'-Dithiobis-(2- nitrobenzoesäure) (DTNB) bei Raumtemperatur etwa 15 Minuten lang umgesetzt und anschließend in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Zu dieser Lösung wird ausreichend IT hinzugefügt, um einen Durchschnitt von 2,5 IT Moleküle/Antikörpermolekül zu erhalten, und die erhaltene Lösung wird bei 0-5ºC gegen drei 100-fache Überschußvolumina an P-EDTA Puffer dialysiert.
  • Das normalerweise in 1 mM DTT enthaltendem P-EDTA aufbewahrte RTA wird bis zu einer Konzentration zwischen 10 und 15 mg/ml ultrafiltriert und bei 0-5ºC gegen drei 100- fache Überschußvolumina an P-EDTA dialysiert. Ausreichend RTA wird zu den derivatisierten Antikörpern zugesetzt, um einen Durchschnitt von 1,0-1,2 an freien Thiolen auf dem RTA pro blockiertem Thiol auf den derivatisierten Antikörpern zu erhalten. Dieses Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Std. lang inkubiert.
  • Das Kopplungsreaktionsgemisch wird auf eine Säule aus einem chromatographischen Harz aufgetragen, das auf einer an einen festen Träger kovalent gebundenen blauen Farbe (Trysacrylblau) beruht. Anschließend wird das Gemisch mit P- EDTA bei Raumtemperatur eluiert. Die Säule ist so bemessen, daß sie etwa 2 ml an Bettvolumen pro mg Ausgangsantikörpern enthält. Nachdem ein anfänglicher Peak von nichtkonjugierten Antikörpern aus der Säule eluiert worden ist, wird zu 1 M NaCl enthaltenden P-EDTA als Eluierungsmittel gewechselt. Immunkonjugate und nicht-umgesetztes RTA werden mit diesem Puffer als ein sehr scharfer Peak eluiert, der vereinigt wird und bei 0-5ºC gegen ein 10-faches Überschußvolumen an 0,15 M Na-Phosphat, pH-Wert 7,1, (nachstehend als pi-Puffer bezeichnet) dialysiert. Das dialysierte Protein wird bei 0-5ºC auf eine Säule aus einem nach Molekülgröße ausschließenden Gel aufgetragen und mit einem Puffer bei einer Durchflußrate von 6 cm/Std. eluiert. Die Säule ist so bemessen, daß sie mindestens 25 ml Bettvolumen/ml aufgetragenen Proteins enthält. Das Immunkonjugat wird als ein einzelner Peak eluiert, kurz nach dem ausgeschlossenen Volumen, das über die Basislinie von den folgenden Peaks von dimerisiertem und monomeren RTA getrennt ist. Der vereinigte Peak des Immunkonjugats wird bis zu einer Endkonzentration von 5,0 mg/ml bei 35 psi ultrafiltriert und steril filtriert.
  • Die Erfindung wird im Licht der nachfolgenden erläuternden Beispiele besser verstanden werden.
    • Beispiel I
  • Weibliche, athymische zwischen 16 und 22 Gramm wiegende Nacktmäuse (Nu/Nu, Stamm Balb/c) wurden verwendet. NIH:OVCAR-3 Ascites-Zellen wurden aus Trägermäusen erhalten. Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in PBS im Verhältnis von etwa 1 Volumen an Zellen pro 2 Volumina an PBS resuspendiert. Die Zellzahl wurde durch Zählung in einem Hämocytometer bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch einen Trypanblau-Farbausschluß festgestellt. Jedes Tier wurde am Tag Null intraperitoneal mit 5 x 10&sup7; lebensfähigen Zellen geimpft. Das Immunotoxin wurde den Tieren an den Tagen 4, 7 und 10 injiziert. Das Immunotoxin wurde für gewöhnlich in 0,1 ml PBS verabreicht. Kontrolltiere wurden mit 0,1 ml PBS nach demselben Plan geimpft. Fünf Tiere wurden für jede Dosierung eines jeden getesteten Immunotoxins und für die Kontrollen verwendet. Die Tiere wurden täglich beobachtet. Die Wirksamkeit wurde in jedem Experiment durch ein Anwachsen der Überlebenszeit relativ zu den Kontrollen festgestellt oder durch eine geringere Unterleibsschwellung, die bei behandelten Tieren auf eine Verzögerung beim Anwachsen der Tumorlast im Vergleich mit den dieselbe Überlebens zeit aufweisenden Kontrollen zurückzuführen ist.
  • Über die Ergebnisse wird in Tabelle 8 berichtet. In Tabelle 8 und den nachfolgenden Tabellen wird "Schwellungs- Index" wie folgt definiert: 0 = keine Unterleibsaufblähung; 1 = kaum sichtbare Unterleibsaufblähung; 2 = mäßige Unterleibsaufblähung; 3 = starke Unterleibsaufblähung. TABELLE 8 Experiment A Testmaterial Dosierung #Überlebende Tiere Schwellungsindex Durchschnittliche Lebensdauer PBS Kontrollen Experiment B Testmaterial Dosierung #Überlebende Tiere (85.Tag) Schwellungsindex Durchscnittliche Lebensdauer
    • Beispiel II
  • Im nachfolgenden Beispiel wurde das Experiment im wesentlichen wie im vorherigen Beispiel beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Tiere an den Tagen 4, 6 und 8 geimpft wurden. Dieses Beispiel zeigt, daß die Anti-Tumor-Wirkung des Immunotoxins 454A12-IT-rRTA blockiert wird, wenn die Tumor-tragenden Tiere mit einem Überschuß des monoclonalen Antikörpers 454A12, von dem das Immunotoxin abstammt, behandelt werden. MOPC21, ein für menschlichen Eierstockkrebs nicht-spezifischer Antikörper, weist keine entsprechende blockierende Wirkung auf, wenn er im Überschuß mit 454A12-IT-rRTA verabreicht wird. Tabelle 9 Testmaterial Dosierung (ug)# #Überlebende Tiere (69.Tag) Schwellungsindex Durchschnittliche Lebensdauer (in Tagen)
    • Beispiel III
  • Das folgende Beispiel zeigt die in vitro Cytotoxizität von Immunkonjugaten für mehrere Eierstockkrebszellinien.
  • NIH:OVCAR-2, -3, -4 und -5 sind Isolate des bösartigen Ascites von Patienten mit Eierstockkarzinomen. Diese Zellinien sind zuvor in den nachfolgenden Quellen beschrieben worden, die hier durch Verweis enthalten sind. Hamilton et al., "Characterization of Human Ovarian Carcinoma Cell Lines (NIH:OVCAR-3) with Androgen and Estrogen Receptors", Cancer Res. 43 (1983), 5379-5389. Hamilton et al., "Experimental Model Systems of Ovarian Cancer: Applications to the Design and Evaluation of New Treatment Approaches", Seminars in Oncology 11 (1985), 285- 298. Die Eierstockkrebszellinie A1847 wurde von S. Aaronson (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland) erhalten. Die Eierstockzellen wurden in RPMI Medium 1640, 10%igem fötalem Rinderserum, 10 ug/ml Insulin und Penicillin- Streptomycin gezüchtet. KB Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10%igem Kälberserum, Glutamin und Penicillin-Streptomycin gezüchtet. Medien für Gewebekulturen, Seren, Glutamin und Antibiotika wurden von Grand Island Biological Col, Grand Island, NY, käuflich erworben, und Insulin wurde von Elanco Products Company, Indianapolis, IN, erhalten. Für Proteinsynthese-Hemmungs- Tests wurden die Zellen einen Tag vor der Verwendung mit 2 x 10&sup5; Zellen/35 mm-Flachschale ausplattiert. Vor der Zugabe von Immunotoxinen wurden die Zellen zweimal mit Rinderserum- Albumin (2 mg/ml) enthaltendem DMEM (DMEM-BSA) gewaschen. Die aufgezählten Immunotoxine wurden wie hier vorstehend beschrieben durch Iminothiolan-Derivatisierung und Konjugation an RTA hergestellt.
  • Die Hemmung der Proteinsynthese wurde zur Messung der Immunotoxin-Aktivität verwendet. Die Zellen wurden bei 37ºC 24 Stunden lang mit verschiedene Konzentrationen an Immunotoxine enthaltendem DMEM-BSA inkubiert und anschließend auf Einbau von [³H]-Leucin (New England Nuclear, Boston, MA; spezifische Aktivität 140,8 Ci/mMol) in TCA-unlösliches Material getestet, wie bei Pirker et al., "Anti-Transferrin Receptor Antibody Linked to Pseudomonas Exotoxin: A Model Immunotoxin in Human Ovarian Carcinoma Cell Lines", Cancer 45 (1985), 751-757, beschrieben. Durchschnittswerte von Duplikaten wurden als ein Prozentsatz von Kontrollen derselben Zellinie, die keine Immunotoxine erhalten hat, ausgedrückt. Immunkonjugate, die eine 50%ige Hemmung der Proteinsynthese im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (ID&sub5;&sub0;) von 10 nM oder weniger ergaben, wurden als wirksam angesehen. Die ID&sub5;&sub0; der getesteten Immunkonjugate werden nachstehend in Tabelle 10 aufgeführt. Tabelle 10 IN VITRO CYTOTOXTZITÄT Konjugat
    • Beispiel IV
  • Die in dem unmittelbar vorausgehenden Beispiel beschriebenen Immunkonjugate wurden gegen NIH:OVCAR-3 Zellen getestet. Die Zellen wurden im RPM1 Medium 1640, in 10 % fötalem Rinderserum, 10 ug/ml Insulin und Penicillin- Streptomycin gehalten. Die Zellen entfernte man durch milde Trypsinverdauung oder Zugabe von Versene aus den Kulturflaschen. Die Zellkonzentration wurde eingestellt. 4 x 10&sup5; NIH:OVCAR-3 Zellen wurden in 1 ml Medium suspendiert und in 8 ml Glasgefäße (ICN) gegeben, worauf eine Zugabe von Konjugatverdünnungen (in Rinderserum-Albumin enthaltendem PBS, 100 ug/ml) folgte. Nach einer zweiundzwanzigstündigen Inkubation bei 37ºC wurde das Medium abgesaugt, die einzelligen Schichten wurden mit PBS gewaschen und 0,5 ml Methionin-freies, mit 0,5 uCi L-[³&sup5;S]-Methionin (Amersham; 1400 Ci/mmol) versetztes Medium wurden zugesetzt. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37ºC wurde das Medium abgesaugt, und die einzelligen Schichten wurden zweimal mit Methionin (1 mg/ml) enthaltender, 10%iger Trichloressigsäure gewaschen. Die Zellen wurden getrocknet, die Scintillationsflüssigkeit wurde hinzugegeben und die Radioaktivität in einem Packard CL/D Flüssigkeitsscintillationszähler gemessen.
  • Die Hemmung der Proteinsynthese wurde für jedes Gefäß als der Einbau von mit TCA ausfällbaren ³&sup5;S-Zerfällen berechnet. Durchschnittswerte wurden als Prozentsatz der Kontrollen von derselben, keine Immunotoxine erhaltenden Zellinie ausgedrückt. ID&sub5;&sub0;-Werte bestimmte man wie in dem unmittelbar vorangehenden Beispiel. Über die Ergebnisse wird in der nachfolgenden Tabelle 11 berichtet. Tabelle 11 In Vitro Cytotoxizität gegen OVCAR-3 CONJUGAT
    • Beispiel V
  • Dieses Beispiel zeigt die Cytotoxizität von Immunkonjugaten, die die vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper und das Pseudomonas-Exotoxin enthalten.
  • Das Pseudomonas-Exotoxin (PE) war ein Geschenk von Dr. S. Leppla (Ft. Detrick, Frederick, MD). PE kann ebenso vom Schweiz. Serum- und Impfinstitut, Bern, Schweiz, käuflich erworben werden. PE-Konjugate wurden durch Modifizierung eines Verfahrens, auf das zuvor Bezug genommen wurde, konstruiert und gereinigt. Pirker et al., (1985). PE (30 nmol) wurde bei 37ºC 1 Std. lang mit 5000 nmol 2- Iminothiolan-HCl (Pierce Chemical Co., Rockfort, IL) und 500 nmol NAD&spplus; 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0), der 1 mM EGTA enthielt, umgesetzt. Das derivatisierte PE wurde anschließend unter Verwendung von HPLC von den Reaktionspartnern abgetrennt und durch Zugabe von 5,5'- Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) bis zur Endkonzentration von 1 mM aktiviert. Antikörper (40-50 nmol) wurden bei 37ºC 1 Std. lang mit 100-200 nmol 2-Iminothiolan- HCI in 0,75 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0), der 1 mM EGTA enthielt, inkubiert. Die Antikörper wurden mit dem aktivierten PE umgesetzt und die Konjugate, wie beschrieben, unter Verwendung von HPLC gereinigt. Pirker et al. (1985). Ein Peak, der ein eins-zu-eins Konjugat des PE mit dem Antikörper enthielt, wurde gewonnen und für sämtliche nachfolgend beschriebenen Untersuchungen verwendet.
  • Die Hemmung der Proteinsynthese und die ID&sub5;&sub0;-Werte wurden, wie vorstehend in Beispiel IV beschrieben, bestimmt, mit der Ausnahme, daß die Zellen 12 Stunden lang mit Immunotoxin inkubiert wurden. Die Ergebnisse von repräsentativen Protein-Hemmungs-Tests werden gezeigt und die Durchschnitts-ID&sub5;&sub0;-Werte sämtlicher Experimente werden in Tabelle 12 bereitgestellt. ID&sub5;&sub0;-Werte werden in der Tabelle in ng/ml und (nM) angegeben. Tabelle 12 ID&sub5;&sub0;-Werte in ng/ml (nM) der Protein-Synthesehemmunga Zellen a Wenn nicht anders erwähnt, stellen diese Werte Durchschnittswerte von mindestens zwei Experimenten dar. b Ergebnisse eines Experiments. c Nicht-spezifische Toxizität.
  • Proben der Hybridome, die die monoclonalen Antikörper herstellen, aus denen die erfindungsgemäßen Immunotoxine stammen, sind bei der American Type Culture Collection unter den nachfolgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt worden: ATCC Hybridomzewelle Hinterlegungs-Nr.
  • Diese Hinterlegungen erfolgten gemäß dem Budapester Vertrag und werden in Übereinstimmung mit dessen Bestimmungen erhalten und zugänglich gemacht.

Claims (10)

1. Immunotoxin, enthaltend einen cytotoxischen Teil und einen menschliches Eierstockkrebsgewebe bindenden monoclonalen Antikörper, der aus HB 10797, HB 10791, HB 10800, HB 10801, HB 10793, HB 8692 oder HB 10813 erhältlich ist, wobei das Immunotoxin mindestens eine der nachfolgenden Fähigkeiten aufweist:
eine Cytotoxitäts-ID&sub5;&sub0; von etwa 10 nM oder weniger gegen menschliche Eierstockkrebszellen; Verzögerung der Wachstumsrate von Tumoren, die aus menschlichen Eierstockkrebszellen bestehen, die von einem Säuger getragen werden, wenn der Säuger mit dem Immunotoxin behandelt wird; oder Verlängerung der Überlebenszeit eines Säugers, der einen aus menschlichen Eierstockkrebszellen bestehenden Tumor trägt, wenn der Säuger mit dem Immunotoxin behandelt wird.
2. Immunotoxin nach Anspruch 1, wobei unter die menschlichen Eierstockkrebszellen mindestens eine aus der Gruppe OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5 und A1847 fällt.
3. Immunotoxin nach Anspruch 1 oder 2, wobei der toxische Teil ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder Pilz-Ursprungs ist.
4. Immunotoxin nach Anspruch 3, wobei der toxische Teil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Ricintoxin A-Kette, Phytolacca americana-Proteinen, dem Diphtherietoxin A-Fragment, nicht-bindenden aktiven Fragmenten des Diphtherietoxin A-Fragments und Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A.
5. Immunotoxin nach Anspruch 4, wobei die Ricintoxin A- Kette eine rekombinante Ricintoxin A-Kette ist.
6. Formulierung zur Verzögerung des Wachstums von Tumoren, die aus menschlichen Eierstockkrebszellen bestehen, oder zum Abtöten von menschlichen Eierstockkrebszellen, enthaltend ein Immunotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das für eine solche Verwendung formuliert ist.
7. Formulierung nach Anspruch 6, enthaltend ein Immunotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und ein Verdünnungsmittel, einen Träger oder einen Exzipienten, das (der) für die parenterale Verabreichung geeignet ist.
8. Immunotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit.
9. Verwendung eines Immunotoxins, das einen cytotoxischen Teil und einen monoclonalen Antikörper enthält, der aus HB 10785, HB 10797, HB 10787, HB10790, HB 10791, HB 10800, HB 10801, HB 10794, HB 10793, HB 10804, HB 10810, HB 10812, HB 8692 oder HB 10813 erhältlich ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verzögerung des Wachstums eines Tumors, der aus menschlichen Eierstockkrebszellen besteht, oder zum Abtöten von menschlichen Eierstockkrebszellen.
10. Verfahren zur Herstellung eines Immunotoxins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei man einen monoclonalen Antikörper und einen cytotoxischen Teil nach Anspruch 1 konjugiert oder verbindet.
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