JP5270672B2 - 分析物の検出方法 - Google Patents
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Description
a)固相に固定化される可逆的結合パートナー1の調製(ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー2を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー1と2との結合により固定化される)、
b)生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
c)生物学的試料の分離、
d)分解緩衝液の添加(これは、可逆的結合パートナー1と2との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である)、及び
e)生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
a)固相に固定化される可逆的結合パートナー1の調製(ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー2を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー1と2との結合により固定化される)、
b)生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
c)生物学的試料の分離、
d)分解緩衝液の添加(これは、可逆的結合パートナー1と2との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である)、及び
e)生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
本発明の方法の好適な実施態様において、生物学的液体は未処理の全血試料である。
a)陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
b)Ca2+結合ペプチド/タンパク質と、ペプチド/タンパク質がCa2+に結合している時ペプチド/タンパク質が高親和性で結合する抗体、
c)オリゴヒスチジン(例えば、6His)とNi−NTA、
d)ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン。
ペプチド/タンパク質がCa2+に結合している時、高親和性でペプチド/タンパク質が結合するCa2+結合ペプチド/タンパク質及び抗体の例は、FLAG/MI系であり、ここで、Ca2+結合ペプチド/タンパク質はFLAG−ペプチドであり、抗体はM1抗体である。別の系では、Ca2+結合ペプチド/タンパク質はFLAG−ペプチドであり、及び抗体はM1抗体である。別の系では、Ca2+結合ペプチド/タンパク質はプロテインCペプチドであり、及び抗体はHPC4抗体である。
従って1つの例は、モノクローナル抗体M1(4E11としても記載される)といわゆるFLAGペプチドとの結合である。このペプチドはカルシウム2+に結合することができ、こうしてあるコンフォメーションを取る。このコンフォメーションのみがM1により効率的に結合される。カルシウム2+錯化剤(例えばEDTA)を加えることにより、カルシウム2+がペプチドから除去され、ペプチドは別のコンフォメーションを取り、これによりM1抗体は、ペプチドに対するその親和性を劇的に低下させる;米国特許第4,851,341号(11)。
このような結合対の別の同様の例は、ヒトプロテインCから得られ、カルシウム2+依存性の形を取るタンパク質と、モノクローナル抗体HPC4(12)である。
別の例は、イミダゾールの添加により特異的に不安定化することができるNi2+−NTA/6His系である(13)。
別の例は、その互いの結合がイオン強度を上げることにより不安定化することができる、陽性荷電又は陰性荷電ペプチドオリゴマー(例えば、オリゴ−Lys又はオリゴ−Asp)である。結合対として、イオン交換マトリックスに関連して荷電ペプチドオリゴマーが記載される;またこの結合はイオン強度を上げることにより不安定化される(14)〜(16)。
すなわち本発明の対象は、分析物バインダーが抗プロカルシトニン抗体である好適な実施態様における、本発明の方法である。
すなわち本発明の好適な対象は、分析物特異的バインダー、例えば抗PCT抗体の固定化のための可逆的結合系の適用である。
−多量の試料を使用でき、従って比較的多量の分析物を抽出でき、最終的に以後の測定法で高い分析アッセイ感度を達成できること、
−測定法の精度と正確度に有利な影響を与える測定法における以後の工程の、マトリックスへの非依存性。
結合パートナー2を用いる誘導体化以外に、免疫抽出抗体はさらにビオチン化される。サンドイッチ形成のための第2抗体が標識される(例えばコロイド金で)。すなわち試験ストリップ上の捕捉用物質は、ビオチンバインダー(例えば、アビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン)であろう。
・分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー2を介して、分析物バインダーが可逆的に結合される可逆的結合パートナー1が、その中に固定化された固相を含み、
・分解緩衝液を加えることにより可逆的結合パートナー1と2の間の結合が分解されるが、分解緩衝液を加えた時、分析物バインダーへの分析物の結合は任意であることを特徴とする、本発明の方法を実施するための装置である。
・固定化された可逆的結合パートナー1を有する固相、
・可逆的結合パートナー2に結合した分析物バインダーを含む複合体(ここで複合体は随時、可逆的結合パートナー1と2を固相に結合させることにより、すでに固定化型で存在してもよい)、
・可逆的結合パートナー1と2との結合を分解する分解緩衝液(しかしここで、分析物バインダーへの分析物の結合は任意である)、
を含んでなる、本発明の方法を実施するためのキットである。
・陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
・Ca2+結合ペプチド/タンパク質と、ペプチド/タンパク質がCa2+に結合している時ペプチド/タンパク質が高親和性で結合する抗体、
・オリゴヒスチジン(例えば6His)とNin−NTA、
・ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン、
の1つから選択される、可逆的結合パートナー1と2を含有する。
追加の工程の処理のための基礎として、まずPCT例中で検査される分析物が、固相に固定化された分析物特異的抗体を使用して、未処理のEDTA全血から抽出できるか、そして如何に有効に抽出できるかを試験した。全血試料の短時間のインキュベーション(5分)と分離後、結合したPCTを、第2の化学発光標識抗PCT抗体を用いて検出した。比較のために、緩衝液で希釈したPCT含有血清を同じ固相上で、しかしより長時間(2時間)インキュベートし、結合したPCTを希釈試料からの分離後、上記のように検出した。
免疫抽出を調べるために、BRAHMS PCT感受性LIAキットを使用した(BRAHMS Aktiengesellschaft,Hennigsdorf,Germany)。発光標識抗PCTトレーサー抗体Aを、操作説明書に従ってトレーサー復元緩衝液Bに溶解した。健常血液ドナーのEDTA全血に、スタンダードシリーズを以下の濃度で溶解した:c=0.007;0.014;0.036;0.171;0.383;1.73;7.99ng/ml。抗PCT抗体で被覆された試験管に、各300μlの全血スタンダードをピペットで取り、室温で5分間インキュベートした。次に試験管を5×1mlの洗浄液(8mMトリス、60mM NaCl、0.2%ツイーン20、pH7.5)で洗浄した。次に200μlの発光標識抗PCT抗体をピペットで取り、室温で2時間インキュベートした;試験管を5×1mlの洗浄液で再度洗浄した。試験管に結合した化学発光をルミノメーター(Berthold Company,BAD WILDBAD,GERMANY,LB952T;BRAHMS AGからの基礎試薬)で測定した。
上記したいくつかの可逆的結合系を、固相に可逆的に抗体(本例では抗PCT抗体)を結合させる適切性について調べた。この点で、抗体を様々な程度に誘導体化し(表1参照)、化学発光標識物で標識した。こうして、これらの抗体が各誘導体に応じて如何に固相に結合するか、そしてこれらが再度如何に分解されるかを調べた。表1の結果の要約は、ビオチン/アビジン系を除いたすべての調べた可逆的結合系が特異的かつ迅速に不安定化されることを示し、6His/Nin−NTA系には制限があるが、血液マトリックスにより障害されない。
1.MACN−化学発光標識抗体の製造
ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体を以下のように処理した:
3つの標識物を調製し、これらを、インキュベーション後に示差的に緩衝化した(下記参照)。
標識物2 100mMリン酸ナトリウム、
5mM EDTA pH6.9 SPDP活性化用 2.2参照
標識物3 PBS、10mM EDTA pH8.0 SMCC活性化用 2.3参照
タンパク質含量を比色法により測定した。標識抗体を分注して−20℃で保存した。
2.1.ビオチン化
MACN抗体をEZ−Link NHS−Chromogenic−Biotin(Pierce Company,Rockford,IL,USA,Art.No.21325)を用いて、1:10のモル比でビオチン化した。
それぞれ抗FLAG−タグM1抗体(Sigma Company,Deisenhofen,Germany,Art.No.F3040)及び抗ProtC−タグHPC4抗体(Roche Company,Nutley,NJ,USA,USA,Art No.11814516001)との結合のために、後者とMACN抗体をSPDP(N−スクシニミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート、Pierce Company,Rockford,IL,USA,Art.No.21857)とを、モル比1:7で活性化した(“SPDP Reagents Instructions”,Pierce,Rockford,IL,USAを参照)。
それぞれHis−タグペプチド「PRG12」(アミノ酸配列 RGSHHHHHHGGC(配列番号1)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1359.8)及びオリゴ−Aspペプチド「D14C」(アミノ酸配列 DDDDDDDDDDDDDDC(配列番号2)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1731.43)との結合のために、MACN抗体をSMCC(スクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート、Pierce Company,Rockford,IL,USA,Art.No.22360)と、モル比1:50で活性化した(“SMCC and Sulfo−SMCC Instructions”、Pierce,Rockford,IL,USAを参照)。
1.1.BSAとFLA−タグ/ProtC−タグとの結合
それぞれFLAG−タグペプチド「PDC12」(アミノ酸配列 DYKDDDDKGGGC(配列番号3)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1286.46)及びProtC−タグペプチドPEG15(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGKGGC(配列番号4)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1601.7)との結合のために、プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン(Sigma Company,Deisenhofen,Germany)をSMCC(スクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート、Pierce Company,Rockford,IL,USA,Art.No.22360)を用いて、モル比1:2で活性化した(“Instructions SMCC and Sulfo−SMCC ”、Pierce,Rockford,IL,USAを参照)。
オリゴ−Lysペプチド「K14C」(アミノ酸配列KKKKKKKKKKKKKKC(配列番号5)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1914.27)及びプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン(Sigma Company,Deisenhofen,Germany)をSMCCを用いて、モル比1:25で活性化した。
放射線照射したスターチューブ(Greiner Company,Frickenhausen,Germany)を、1.1.及び1.2.からの結合体、及びアビジン(Pierce Company,Rockford,IL,USA,Art.No.21121、蒸留水に溶解した)を用いて、以下のように被覆した。
Ni−NTAマイクロタイタープレート(Qiagen Company,Hilden,Germany,Art.No.1006387)を使用した。
4.1 MACN抗体結合体の結合
MACN抗体結合体を希釈緩衝液(表2を参照)を用いて1.5μg/mlの濃度にした。各300μlをピペットで、対応する固相中のいくつかの平行バッチに入れ、室温で一晩インキュベートした。試験管を5×1mlの洗浄緩衝液で、Ni−NTAマイクロタイタープレートを5×300μlの洗浄緩衝液で洗浄した(表2を参照)。
各1つのバッチで、結合したMACN−抗体結合体の量を測定した。
結合MACN−抗体結合体の追加のバッチで、各300μlの全血(表2を参照)をピペットで取り、10分間インキュベートした。試験管を5×1mlの洗浄緩衝液(表2参照)で、Ni−NTAマイクロタイタープレートを5×300μlの洗浄緩衝液で洗浄した。試験管に残ったMACN−抗体結合体の量をルミノメーター(BERTHOLD Company,BAD WILDBAD,GERMANY,LB952T;BRAHMS AGからの基礎試薬)で測定した。
結合したMACN−抗体結合体の追加のバッチで、各300μlの分解緩衝液(表2を参照)をピペットで取り、10分間又は30分間インキュベートした。試験管を5×1mlの洗浄緩衝液(表2参照)で、Ni−NTAマイクロタイタープレートを5×300μlの洗浄緩衝液で洗浄した。
分解剤
上記したように、0.01%ヘパリンを加えることにより結合の効率的な分解を行った(表1と関連する説明を参照)。別の分解剤としてNaClとKFも試験した。NaCl又はKFの濃度>0.8Mでは、結合の分解に対する0.01%ヘパリンと同等の作用があった。緩衝液組成の多くの他の変更態様も企図され、これらは結合を分解する(低分子量の他の塩、他の荷電オリゴマーもしくはポリマー、他のpH値)。これらの変更態様のすべては、本発明の範囲内の溶解剤として定義される。これらの変更態様は特に好適であると考えられ、これらは、一方ではオリゴ−Asp/オリゴ−Lys系の結合を効率的に不安定化するが、他方では、抗体と分析物の結合をできるだけ障害しないように残す。多くのイムノアッセイはヘパリンを試料マトリックスとして使用し、血漿中のヘパリンの濃度は典型的には0.01%であるため、0.01%濃度のヘパリンは好適な変更態様である。
オリゴ−Lys−BSA/オリゴ−Asp−分析物バインダーで被覆された固相に生物学的試料を加えると、試料からの目的の分析物が分析物特異的抗体に結合しないばかりでなく、イオン性相互作用を介して非特異的に固相の遊離リジン部分に結合するおそれがある。こういう場合は、以後(分解工程後)の分析物検出の正確度が障害されるであろう。そのような非特異的分析物結合が起きるか、そしてどの程度起きるかを、種々の合成ペプチド(これらはほぼ既知の天然の分析物と同一であり、従って天然の分析物の代表となる)を化学発光標識し、血漿マトリックスで希釈し、試験管(これはオリゴ−Lys−oBSAで被覆し、ここにオリゴ−Asp−抗PCT抗体を結合させた)中でインキュベートすることにより調べた。非特異的に結合したペプチドの検出部分はいつも、与えられたペプチドの7%未満であった。すなわち固相への非特異的分析物結合は問題ではない。
以下のペプチド(すべてJPT Company GmbH,Berlin,Germanyから)をMACNで標識した:
「PPL41」(アミノ酸配列PEVPPWTGEVSPAQRDGGALGGGGRGPWDSSDRSALLKSKL(配列番号6)、NT−proANPから得られる)、「PSW44」(アミノ酸配列SSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGKPSRERYVTHNRAHW(配列番号7)、プロエンドセリンから得られる)、「PAY33」(アミノ酸配列 ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY(配列番号8)、コペプチンから得られる)、「ペプチド45−92」(アミノ酸配列ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV(配列番号9)、プロアドレノメヅリンから得られる)。
オリゴ−Aspペプチド「D14C」(アミノ酸配列 DDDDDDDDDDDDDDC(配列番号2)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1731.43)の結合のために、ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体(「抗PCT抗体1」)を、SMCCを用いてモル比1:25で活性化した(“SMCC and Sulfo−SMCC Instructions”、Pierceを参照)。
抗カルシトニンヒツジ抗体+オリゴ−Asp結合体を分注して−20℃に保存した。
2.1.結合:BSA+オリゴ−Lys結合体
放射線照射したスターチューブ(Greiner Company,Frickenhausen,Germany)を、BSA−オリゴ−Lys結合体を用いて以下のように被覆した。
結合体を、PBS、0.5%プロテアーゼ不含遊離BSA(pH7.4)で667ng/mlの濃度に希釈した。この溶液300μlをピペットで各試験管に取り、22℃で1時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度300μlの0.5%ウシ血清アルブミン、2%のKarion FPで2時間飽和させ、次に吸引除去した。
MACNペプチドを血漿マトリックスで希釈した。各300μlをピペットで、オリゴ−Lys−BSA及びオリゴ−Asp−抗PCT抗体で被覆した試験管に入れ、室温で30分間インキュベートした。試験管を3×1mlのPBS(pH7.4)、0.5%プロテアーゼ不含BSAで洗浄した。試験管に結合した量ならびに使用したMACNペプチドの総活性を、ルミノメーター(BERTHOLD Company,BAD WILDBAD,GERMANY,LB9527;BRAHMS AGからの基礎試薬)で測定した。総活性に対する非特異結合の割合は以下の通りであった:
PPL41 3.1%
PAY33 6.5%
ペプチド45〜92 2.9%
PCT(プロカルシトニン)を、適切なモデル分析物として選択した。これは細菌感染症、特に宿主の全身性炎症反応(敗血症)を引き起こす重症の感染症のマーカーである(21)。PCT検出のためのサンドイッチイムノアッセイは、ペプチドのカルシトニン又はカタカルシン部分に対する抗体を使用する(22)、(23)。
固相として、高結合性ポリスチレンからなるマイクロタイタープレートを使用したが、これはオリゴ−Lys−BSAで被覆されており、ここに第1の抗PCT抗体が結合しており、これはあらかじめオリゴ−Aspとクリプテートで誘導体化されていた。次にPCT含有全血試料を短時間インキュベートし、PCTを固相中の試料から抽出した。固相を洗浄後、分解緩衝液を加え、短時間インキュベートした。アリコートを別の低結合性の黒いマイクロタイタープレートに移し、第2のシアニン標識抗PCT抗体を含有する溶液と混合した。短時間インキュベーション後、レーザー光を用いて励起後、TRACE法によりサンドイッチ形成を検出した。
A.1.1.BSA+オリゴ−Lys結合体の製造:上記参照
A.1.2.抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートモノMP+オリゴ−Asp結合体の製造
クリプテート1リン酸(“KMonoMP”,Cezanne Company,Nimes,France)で標識するために、ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体(「抗PCT抗体1」)をSPDP(N−スクシニミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート、Pierce Company,Rockford,IL,USA,Art.No.21857)を用いて、モル比1:4で活性化した(“SPDP Reagents Instructions”、Pierce,Rockford,IL,USAを参照)。
抗カルシトニンヒツジ抗体−KnomoMP+オリゴ−Asp結合体を分注して−20℃に保存した。
A.2.1.結合:BSA+オリゴ−Lys結合体
放射線照射したマイクロタイタープレート(Greiner Company,Frickenhausen,Germany)を、BSA+オリゴ−Lys結合体を用いて以下のように被覆した。
結合体を、PBS、0.5%プロテアーゼ不含遊離BSA(pH7.4)で667ng/mlの濃度に希釈した。この溶液300μlをピペットで各ウェルに取り、22℃で1時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各ウェルを再度300μlの0.5%ウシ血清アルブミン、2%のKarion FPで2時間飽和させ、次に吸引除去した。
モノクローナル抗カタカルシン抗体(「抗PCT抗体2」)を45%の(2−ヒドロキシ−プロピル)−β−シクロデキストリン(Aldrich Company,Seelze,Germany,Art.No.33,260−7)の存在下で、Cy5−NHC(Amersham Company,Art.No.PA15100)を用いて、モル比1:20で標識した(製品小冊子“Amersham CyDye Mono−Reactive NHS Esters”参照)。
各試料について10回測定で、後述のアッセイを行った。BSA+Lysと抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートMonoMP+D14C結合体で被覆したマイクロタイタープレートのウェルに、組換えPCT(InVivo GmbH,Hennigsdorf,Germany)とともに保存した、300μlのEDTA全血試料をピペットで取り、室温で15分間インキュベートした(試料のPCT濃度は、LIA感受性BRAHMS PCTアッセイ(BRAHMS AG,Hennigsdorf,Germany)を用いて、血漿から測定した)。次にこれを300μlのPBS(pH7.4)で2回、次に300μlの洗浄液(8mMトリス、60mM NaCl、0.2%ツイーン20、pH7.5)で2回洗浄した。次にこれを、300μlの分解緩衝液(PBS、pH7.4、0.6M KF、0.5%BSA、0.01%ヘパリン)で10分間インキュベートした。分解した免疫複合体から、100μlをTRACE測定に適したマイクロタイタープレート(Costar Half Area Plates,96ウェル、黒、ポリスチレン、Sigma/Aldrich Company,Seelze,Germany,Catalyst No.CLS3694−100EA)に移し、50μlの抗カタカルシンマウス抗体−Cy5−NHS結合体(PBS(pH7.4)、0.6M KF、0.5%BSA、0.01%ヘパリン中c=20μg/ml)とともに、室温で19分間インキュベートした。高性能時間分解蛍光マイクロプレートリーダーRUBYstar(BMG LABTTECH Company GmbH,Offenburg,Germany)を使用して、TRACEシグナルの測定(620nmと665nm)を行った。
フラッシュの回数 20
積分遅延[μS] 50
積分時間[μS] 400
インターバル時間[μS] 10
インターバルの回数 45
マルチプリケーター比 10,000
DeltaF=(比率pos−比率neg)/比率neg
この場合、比率negは、PCT陰性試料(すなわち、PCTを含有しないか又は検出できない試料)の比率を意味し、比率posは試験すべき試料(すなわち、PCT含有試料候補)の比率を意味する。各平均値は、個々の試料の10回測定から得られた。これらの値は標準濃度であり、すべての個々の試料の濃度はMultiCalc(Spline Fit)ソフトウェアを使用して求めた。各10回測定について変動係数を求めた。
固相として、あらかじめオリゴ−Aspとビオチンで誘導体化されていた、第1抗PCT抗体を結合したオリゴ−Lys−BSAで被覆されたポリスチレン試験管を使用した。次にPCT含有全血試料を短時間インキュベートし、この場合PCTを固相中の試料から免疫抽出した。固相を洗浄後、分解緩衝液(これは、コロイド金で標識された第2の抗PCT抗体を含有した)を加え、短時間インキュベートした。最後に、試験バンドとしてストレプトアビジンを噴霧した試験ストリップ上で、溶液の免疫クロマトグラフィーを行った。ビオチン化された第1抗PCT抗体及びPCTもそこに結合し、次にそこに結合した第2の金標識抗PCT抗体がストレプトアビジンに結合した。標識物の検出は反射測定により行った。
B.1.1.BSA+オリゴ−Lys結合体の製造:上記参照
B.1.2.ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体+オリゴ−Asp結合体の製造
ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体(「抗PCT抗体1」)をEZ−linkスルホ−NHS−LC−LC−ビオチン(“EZ−Link Sulfo−NHS−LC−LC−Biotin Instructions”、Pierce,Rockford,IL,USAを参照)とモル比1:10で混合した。1.6mgの抗体(PBS(pH7.4)中)を10mMのEZ−linkスルホ−NHS−LC−LC−ビオチン(蒸留水に新に溶解した)と混合し、室温で30分間インキュベートした。
B.2.1.結合:BSA+オリゴ−Lys結合体
放射線照射したスターチューブ(Greiner Company,Frickenhausen,Germany)を、BSA+オリゴ−Lys結合体を用いて以下のように被覆した。
結合体を10mMトリス、100mM NaCl(pH7.8)で希釈して6.67μg/mlの濃度にした。各試験管にこの溶液300μlをピペットで取り、22℃で20時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、300μlの0.5%ウシ血清アルブミン、2%のKarion FPで2時間飽和させ、再度吸引除去した。次にビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体+オリゴ−Asp結合体の結合を行った。
結合体を、PBS、0.5%プロテアーゼ不含遊離BSA(pH7.4)で667ng/mlの濃度に希釈した。この溶液300μlをピペットで各試験管に取り、22℃で1時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度300μlの0.5%ウシ血清アルブミン、2%のKarion FPで2時間飽和させ、次に吸引除去した。
この成分は、8sens biognostic Company GmbH,Berlin,Germanyから購入した。モノクローナル抗カタカルシン抗体をコロイド金(8sens biognostic Company GmbH,Berlin,Germany;Frensに従う:Frens,G.,Nature Physical Science,1973,241:20−22)に、Hermanson(http://www.amazon.de/Bioconjugate−Techniques−Greg−T−Hermanson/dp/0123423368)に記載のように結合させた。
この成分は8sens biognostic Company GmbH,Berlin,Germanyから購入した。MDIのニトロセルロース膜(Advanced Microdevices,Ambala,India)を、4μg/cmのストレプトアビジン(Pierce,Rockford,IL,USA)(試験ライン)ならびに2.5μg/cmの抗マウスIgG抗体(Scantibodies,Santee,CA,USA)(対照ライン)を用いて被覆した。Biodot Company,Irvine,CA,USAのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に50℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Millipore Company,Billerica,MA,USAのAP22を使用した。
すべての試料について10回測定で、後述のアッセイを行った。BSA+オリゴ−Lys及びビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体+D14C結合体で被覆した試験管に、組換えPCT(InVivo GmbH,Hennigsdorf,Germany)とともに保存した、300μlのEDTA全血試料をピペットで取り、室温で15分間インキュベートした(試料のPCT濃度は、LIA感受性BRAHMS PCTアッセイ(BRAHMS AG,Hennigsdorf,Germany)を用いて、血漿から測定した)。次にこれを300μlのPBS(pH7.4)で2回、次に300μlの洗浄液(8mMトリス、60mM NaCl、0.2%ツイーン20、pH7.5)で2回洗浄した。次にこれを、150μlの分解緩衝液(PBS、pH7.4、5%BSA、0.5%ツイーン20、0.01%ヘパリン)(これは、金標識抗カタカルシンモノクローナル抗体を含有した)を用いて、確認しながら10分間インキュベートした。低結合性マイクロタイタープレートのウェル中の150μlを、分解した免疫複合体から移した。次に、試験ストリップをウェルに挿入して、直接免疫クロマトグラフィーを行った。30分後、試験バンドの着色を、LRE Medical Company GmbH,Munich, Germanyの反射計を用いて測定した。
適用すべき全血試料の血球を保持するのに適した膜とともに、試料添加領域に試験ストリップを作成した。乾燥状態では、一方で第1ビオチン化抗PCT抗体を含有し、他方では第2のコロイド金標識抗PCT抗体を含有する多孔性クッション(「試料パッド」)を、この膜と試験ストリップとの間に取り付けた。試験バンドとして、ストレプトアビジンをストリップ上に噴霧した。試験ストリップをプラスチックカセット中に入れた。PCT含有全血試料を免疫クロマトグラフィーした。ビオチン化した第1抗PCT抗体従ってそこに結合したPCTも、及び次にそこに結合した第2の金標識抗PCT抗体も、ストレプトアビジンに結合する。標識の検出は反射測定により行った。
C.1.1.BSA+オリゴ−Lys結合体の製造:上記参照
C.1.2.ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体+オリゴ−Asp結合体の製造:上記参照
この成分は8sens biognostic Company GmbH,Berlin,Germanyから購入した。MDIのニトロセルロース膜(Advanced Microdevices,Ambala,India)を、4μg/cmのストレプトアビジン(Pierce,Rockford,IL,USA)(試験ライン)ならびに2.5μg/cmの抗マウスIgG抗体(Scantibodies,Santee,CA,USA)(対照ライン)を用いて被覆した。Biodot Company,Irvine,CA,USAのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に50℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Millipore Company,Billerica,MA,USAのAP22を使用した。全血検査の作成のために、8sens biognostic Companyの全血構成を使用した。一方では試料添加領域に、コロイド金に結合した抗カタカルシン抗体を、他方ではビオチン化+オリゴ−Asp誘導体化抗カタカルシン抗体を、2つの別々のパッドに固定化した。8sens biognostic Companyの標準的ハウジングをカセットとして使用した。
すべての試料について10回測定で、後述の免疫クロマトグラフィーを行った。組換えPCT(InVivo GmbH,Hennigsdorf,Germany)とともに保存した120μlのEDTA全血試料を、ピペットで試験ストリップに入れた(試料のPCT濃度は、LIA感受性BRAHMS PCTアッセイ(BRAHMS AG,Hennigsdorf,Germany)を用いて、血漿から測定した)。30分後、試験バンドの着色を、LRE Medical Company GmbH,Munich,Germanyの反射計を用いて測定した。
全血からの免疫抽出法と免疫クロマトグラフィーによる分析物検出のための別の例として、MR−proADM(中間領域プロアドレノメジュリン)分析のための試験系を開発した。MR−proADMは、血液中を循環する安定なペプチドであり、アドレノメジュリンの前駆体のタンパク質分解プロセシングから公知である(Struck,J.et al.:Peptides,2004 Aug;25(8):1369−72)。アドレノメジュリンは最も良く知られている内因性血管拡張物質の1つであり、無数の生物学的プロセスの制御、特に心血管系の制御に関与している(Beltowski,J.et al.:Pol J Pharmacol.2004 Jan−Feb;56(1):5−27)。MR−proADMの測定は、種々の病態の診断と予後の枠内で、信頼して測定することができない成熟アドレノメジュリンの代替マーカーとして有用であることがわかった。これらには、COPD(Stolz,D.et al.:Chest.2008 May 19[Epub印刷前])、肺炎(Christ−Cain,M.et al.:Crit Care.206;10(3):R96)、敗血症(Christ−Cain,M.et al.:Crit Care.2005;9(6):R816−24)、心筋梗塞(Khan,S.Q.et al.:J Am Coll Cardiol.2007 Apr 10;49(14):1525−32)、心不全(Gegenhuber,A.et al.:J Card Fail.2007 Feb;13(1):42−9)がある。
D.1.1.BSA+オリゴ−Lys結合体の製造:上記参照
D.1.2.抗「SPCD19」ヒツジ抗体ビオチン化+オリゴ−Asp結合体の製造
オリゴ−Aspペプチド「D14C」(アミノ酸配列 DDDDDDDDDDDDDDC(配列番号2)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=1731.43)との結合のために、ポリクローナル抗「SPCD19」(アミノ酸配列CRPQDMKGASRSPEDSSPD(配列番号10)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=2063)ヒツジ抗体を、SMCCを用いて比率1:25で活性化した(“SMCC and Sulfo−SMCC Instructions”、Pierce,Rockford,IL,USAを参照) 。
D.2.1.結合:BSA+オリゴ−Lys結合体
放射線照射したスターチューブ(Greiner Company,Frickenhausen,Germany)を、BSA−オリゴ−Lys結合体を用いて以下のように被覆した:
結合体を、PBS、0.5%プロテアーゼ不含遊離BSA(pH7.4)で667ng/mlの濃度に希釈した。この溶液300μlをピペットで各試験管に取り、22℃で1時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度300μlの0.5%ウシ血清アルブミン、2%のKarion FPで2時間飽和させ、次に吸引除去した。
モノクローナル抗「PSV11」抗体を使用した(PSV11はMR−proADMの部分配列を示す;アミノ酸配列CSSPDAARIRV(配列番号11)、JPT Company Berlin,Germany,M=1174)。抗体をコロイド金(BBI International Company,EM.GC 60nm)に、Hermanson(http://www.amazon.de/Bioconjugate−Techniques−Greg−T−Hermanson/dp/0123423368)に記載のように結合させた。
この成分は8sens biognostic Company GmbH,Berlin,Germanyから購入した。MDIのニトロセルロース膜(Advanced Microdevices,Ambala,India)を、4μg/cmのストレプトアビジン(Pierce,Rockford,IL,USA)(試験ライン)を用いて被覆した。Biodot Company,Irvine,CA,USAのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に50℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Millipore Company,Billerica,MA,USAのAP22を使用した。
すべての試料について10回測定で、後述のアッセイを行った。BSA+オリゴ−Lys及び抗ビオチン化「SPCD19」ヒツジ抗体+「D14C」結合体で被覆した試験管に、合成45〜92プロアドレノメジュリン(アミノ酸配列ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV(配列番号9)、JPT Company GmbH,Berlin,Germany,M=5115)とともに保存した、300μlのEDTA全血試料をピペットで取り、室温で15分間インキュベートした(試料のプロADM濃度は、proADM LIA BRAHMSアッセイ(BRAHMS AG,Hennigsdorf,Germany)を用いて、血漿から測定した。次にこれを1mlの洗浄液(8mMトリス、60mM NaCl、0.2%ツイーン20、pH7.5)で5回洗浄した。
Claims (15)
- 以下の方法工程:
a)固相に固定化される可逆的結合パートナー1を調製し、ここに、分析物バインダーにそれ自体が結合される可逆的結合パートナー2を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー1と2との結合により固定化され、
b)生物学的試料を添加し、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへ分析物を結合させ、
c)生物学的試料を分離し、
d)可逆的結合パートナー1と2との結合を壊す分解緩衝液を添加し、ここで、分析物は分析物バインダーに結合したままでもよく、又は結合したままでなくてもよく、ここで、該分解緩衝液は、検出に必要な別の標識成分である、サンドイッチイムノアッセイの実施のための第2の分析物バインダーを含有し、及び
e)生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中で分析物を検出するか、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物が欠失しているかどうかを測定する
ことを含む、生物学的試料からの分析物の検出方法。 - 生物学的液体が未処理の全血試料である、請求項1に記載の方法。
- 固定化された可逆的結合パートナー1が、直接又はキャリアータンパク質を用いて固定化される、請求項1又は2に記載の方法。
- 分析物バインダーが、可逆的結合パートナー2に共有結合される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 分析物バインダーが抗プロカルシトニン抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 可逆的結合パートナー1と2の結合対が、以下の結合対:
a)陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
b)Ca2+結合ペプチド/タンパク質と、ペプチド/タンパク質がCa2+に結合している時、後にペプチド/タンパク質に高親和性で結合する抗体、
c)オリゴヒスチジンとNi−NTA、
d)ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン
の1つから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - Ca2+結合ペプチド/タンパク質がFLAG(登録商標)−ペプチドであり、かつ抗体がM1(登録商標)抗体であるか、又はCa2+結合ペプチド/タンパク質がプロテインCペプチドであり、かつ抗体がHPC4抗体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 分析物バインダーが標識され、分解緩衝液が添加された後も、分析物検出のための標識物で標識されたままである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 標識分析物の検出は、TRACE法(登録商標)を使用するイムノアッセイにより行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 標識分析物の検出が、免疫クロマトグラフィーにより行われる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料が、未希釈のままで、かつ固相の被覆部分が生物学的試料と完全に接触するような容量で使用される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 試料の添加から検出までの時間が30分を超えず、方法は迅速検査法と見なされる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 以下:
a)固定化された可逆的結合パートナー1を有する固相、
b)可逆的結合パートナー2に結合した分析物バインダーを含む複合体、ここで、この複合体は、可逆的結合パートナー1と2を結合させることにより、すでに固相に固定化されていてもよい、
c)可逆的結合パートナー1と2との結合を壊す分解緩衝液、ここで、分析物と分析物バインダーとの結合は無傷のままであってもよく、該分解緩衝液は、検出に必要な別の標識成分である、サンドイッチイムノアッセイの実施のための第2の分析物バインダーを含有する
を含んでなる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキット。 - 分析物バインダーが抗PCT抗体である、請求項13に記載のキット。
- 可逆的結合パートナー1と2の結合対が、以下の結合対:
a)陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
b)Ca2+結合ペプチド/タンパク質と、ペプチド/タンパク質がCa2+に結合している時、後にペプチド/タンパク質に高親和性で結合する抗体、
c)オリゴヒスチジンとNi−NTA、
d)ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン
の1つから選択される、請求項13又は14に記載のキット。
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