DD218189A1

DD218189A1 - Festphasen-immunoassay zur bestimmung von antigenen und antikoerpern an glasoberflaechen

Info

Publication number: DD218189A1
Application number: DD25384883A
Authority: DD
Inventors: Werner Schoessler; Christa Dittrich; Klaus Gulde
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1983-09-10
Filing date: 1983-09-10
Publication date: 1985-01-30

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen, Antikoerpern, Haptenen, Viren, Hormonen Pharmaka etc. Das Ziel der Erfindung ist es, billige Traegermaterialien zu verwenden, die wiederholt eingesetzt werden koennen. Aufgabe der Erfindung ist es, siliziumdioxidhaltige Materialien einzusetzen. Erfindungsgemaess erfolgt dies durch siliziumdioxidhaltige Formkoerper, deren Oberflaechen zwei- oder dreidimensional nutzbar sind. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.

Description

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Festphasen — Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern an Glasoberflächen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen Feslphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, Haptenen etc. an silmumdioxidhaltigen Formkörpern, vorzugsweise aus Glas unter wiederholtem Einsatz im (Enzym)-Immunoassay. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Immunoassays sind Verfahren zur spezifischen und sensitiven qualitativen und quantitativen Analyse eines Stoffes in einer Flüssigkeit unter Anwendung der für diesen Stoff spezifischen Antikörper. Derartige Verfahren haben in den letzten Jahren in der medizinischen Praxis große Bedeutung erlangt.

Unter den zahlreichen beschriebenen Varianten hat die sogenannte Festphasentechnik („solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden ist und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht, eine weite Verbreitung gefunden. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K. J.Catt und G.W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der adsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyrol angewandt (Übersicht: J.E.Herrmann in: Methods in Enzymology 73 11981] S.239). Nachteile dieses Verfahrens sind:

— Die Beladungsdichte an den Plastematerialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial und die zur Verfügung stehende Oberfläche limitiert.

— Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J.E.Herrmann et al.J.CIin.Microbiol.10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W.Schößler, G.Wegner: Z.med. Labordiagn.24 [1983] 3,177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.

— Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so daß sehr wertvolle und nur aufwändig zu präparierende Proteine verloren gehen.

— Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probezahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.

In der Patentanmeldung (WP GOI N/249992) wurde ein Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von zirkulierenden Immunkomplexen unter kovalenter Bindung des Proteins C1q an siliziumdioxidhaltige Materialien, vorzugsweise Glas, beschrieben.

Dieses Verfahren beruht auf der seit langem bekannten Tatsache, daß die OH-Gruppen auf SiO₂-Oberflächen als Angriffspunkte für chemische Agenzien, insbesondere Organosilanen mit unterschiedlichen Funktionellen Gruppen, zur Verfügung stehen. Während die silikofunktionelle Gruppe mit dem Glas reagiert, steht die organofunktionelle Gruppe den üblichen chemischen Reaktionen unter Verwendung von Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, Isothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen zur Verfügung, so daß diese Verbindungen als Brücke zwischen der anorganischen Matrix und der organischen/ biochemischen Verbindung fungieren.

In erwähnter Patentanmeldung (WP GO1 N/249992) konnte gezeigt werden, daß durch die kovalente Bindung des Proteins C1q an Glasoberflächen dieses durch Anwendung nicht denaturierender Medien wiederholt und reproduzierbar im Immunoassay eingesetzt werden kann. Allerdings wurde dieses Verfahren dadurch begünstigt, daß die Bindung zirkulierender Immunkomplexe oder von aggregiertem IgG an C1q vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen über den Fc-TeiI des Immunglobulins erfolgt und somit eine Abspaltung der gebundenen Immunreaktanden durch einfache Änderung der lonenstärke des Mediums erzielt werden konnte.

Wesentlich komplizierter stellen sich die Verhältnisse bei spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen dar, bei denen durch eine Vielzahl unterschiedlichster nichtkovalenter Wechselwirkungen beträchtliche Bindungsstärken erreicht werden. Derartige Antigen-Antikörper-Komplexe lassen sich oft nur unter Anwendung relativ drastischer Medien dissoziieren, wobei nicht selten einer oder beide Reaktionspartner denaturiert werden. So ist eine vollständige Dissoziation derartiger Komplexe nur im stark sauren (pH < 2,4) oder stark alkalischen (pH > 13) pH-Bereich zu erzielen, wobei die Dissoziationsgeschwindigkeit zwischen 1 h bis mehreren Tagen liegen kann. Es ist einleuchtend, daß derartige Dissoziationszeiten nicht nur die Gefahr von Proteindenaturierungen verstärken, sondern auch für eine Anwendung in der klinischen Praxis nicht praktikabel sind.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, allgemein zugänglich und billige Trägermaterialien unter Nutzung der kovalenten Bindung von Proteinen im Immunoassay einzusetzen, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, siliziumdioxidhaltige Trägermaterialien, vorzugsweise Glas, als feste Phase im Festphasen-Immunoassay einzusetzen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch siliziumdioxidhaltige Formkörper, deren Oberflächen /wi)i- odor dreidimensional nutzbar sind und die nach vorheriger an sich bekannter chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaflmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien mit Antigenen oder Antikörpern beladen werden und nach Ablauf der Immunreaktion die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende Reagenzien gespalten und die mit Antigenen bzw. Antikörpern beladenen Formkörper wieder im Immunoassay eingesetzt werden, gelöst. Die als feste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form. Besonders geeignet sind kugelförmige, planere oder zylindrische Körper, aber auch würfelförmige oder kegelförmige lassen sich verwenden. Das Volumen der Körper beträgt mindestens 0,1 cm³ und sollte 15cm³ nicht überschreiten. Bei planeren Glaskörpern ist weniger das Volumen als eine reproduzierbare, zur Verfügung stehende Fläche pro Probe von Bedeutung. Diese sollte 0,001 cm² nicht unter- und 5cm² nicht überschreiten. Die Formkörper sind kompakt oder hohl, wobei die Hohlräume geschlossen oder offen sind. Die Formkörper können als individuelle Matrix für jede Probe zur Verfügung stehen, jedoch auch mehrere Proben gleichzeitig aufnehmen, wobei durch geeignete Vorrichtungen ein Vermischen derselben vermieden werden muß. Das siliziumdioxidhaltige Material ist im wesentlichen Glas, wobei die Zusammensetzung unterschiedlich sein kann. Es muß nur gewährleistet sein, daß sich genügend Si-OH-Giuppen auf der Oberfläche befinden

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Die nicht denaturierenden Medien zur Dissoziation der Antigen-Antikörper-Komplexe können aus den verschiedensten Substanzen bestehen, die auf unterschiedliche Art und Weise die multifaktoriellen Bedingungen derartiger Antigen-Antikörper-Komplexe zu spalten in der Lage sind. Hierzu sind vor allem stark saure Puffer wie HCI-Glyzin-Puffer pH - 2,2-2,8, chaotrophische Ionen, wie MgCI₂, KSCN, NaJ sowie die Polarität des Puffers reduzierende Verbindungen wie Dioxan und Äthylenglykol zu rechnen.

Die Oberflächenmodifizierung dient dem Zweck der Schaffung von Bedingungen für das Eingehen kovalenter Bindungen mit dem jeweiligen Protein. Sie erfolgt durch sogenannte Silanhaftmittel der Struktur

-OR X-(CHj)_n-Si₁OR

wobei R Alkylreste und X reaktive Gruppen, wie Amino-. Diazo-, Carbonyl-, Carboxy-, tsocyano-, lsothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen u. ä. sind und dadurch hetero- oder homobifunktionelle Reagenzien wie Gluteraldehyd umgesetzt werden.

An die so aktivierte Glasoberfläche wird erfindungsgemäß der Antikörper bzw. das Antigen in der bekannten Art und Weise gebunden.

Wichtig für die praktische Durchführung das Assays ist hierbei, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Glaskörper leicht zu handhaben sind und eine hinreichend große und definierte Oberfläche besitzen. Die so mit dem Antikörper bzw. dem Antigen beladene Glasmatrix wird dann als feste Phase im (Enzymimmunoassay eingesetzt. Nach Ablauf der Immunreaktion werden die gebundenen Immunreaktanden durch die beschriebenen die Dissoziation herbeiführenden Agenzien abgeschalten, so daß das Kovalent gebundene Antigen bzw. der Antikörper für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfügung stehen. Besonders einfach gestaltet sich die Durchführung des Immunoassays auf planen Glasplatten, die analog kommerzieller Mikrotitrationsplatten ausreichend Platz für eine große Zahl von Proben liefern. Derartige Platten bieten sich besonders für Screening-Untersuchungen in der klinischen Routine an. Wichtig ist hierbei, daß die für die Antigen- oder Antikörper-Bindung zur Verfugung stehenden Flächen für alle Proben identisch ist, da nur dann ein quantitativer Vergleich derselben möglich ist. Von Bedeutung ist weiterhin, daß durch geeignete Maßnahmen ein Ineinanderlaufen der individuellen Proben ausgeschlossen wird. Beide Bedingungen werden auf einfache Art und Weise mit geeigneten Hydrophobierungsmitteln, wie Chlorsilane und Paraffine geschaffen, die die entsprechende Glasplatte in kleine, definierte Areale unterteilen und auf Grund ihrer Oberflächenspannung eine deutliche Abgrenzung der auf diese Areale aufzubringenden Flüssigkeiten bewirken. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:

— Durch die kovalente Bindung von Antigenen bzw. Antikörpern lassen sich wesentlich höhere Beladungsdichten erzielen. Diese führen ebenso wie die verbesserte sterische Zugänglichkeit des Proteins — bedingt durch den Spacer—zu einer höheren Empfindlichkeit im Immunoassay.

— Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Immunreaktanden während der notwendigen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert.

— Die unspezifische Bindung an Glas-Formkörpern ist vernachlässigbar gering.

— Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer erheblichen Reduzierung der Kosten in der klinischen Praxis. Einmal, da die als Einweggefäße benutzten Plastematerialien abgelöst werden und zum anderen, da sich die auf diesem Verfahren beruhenden Immunoassays leicht automatisieren lassen. Besonders augenfällig wird dies bei Verwendung von planen Glasplatten, bei denen die notwendigen Trenn- und Waschvorgänge durch einfaches Abspülen erzielt werden können. Aber auch bei Einsatz von Glaskörpern kann eine erhebliche Zeitersparnis dieser Vorgänge erreicht werden (siehe Beispiel 2 und 3).

— Durch die kovalente Bindung der Antigene bzw. Antikörper an die Glasoberfläche können diese unter Anwendung von geeigneten Dissoziationsreagenzien wiederholt im Immunoassay eingesetzt werden. Dadurch werden die mitunter sehr wertvollen und teuren Proteine eingespart, was wiederum die Kosten des Assays günstig beeinflußt.

— Durch die Immobilisierung der Antigene bzw. Antikörper an Glasmatrices ergeben sich neue Aspekte der Fertigung einfach zu handhabender und standardisierter Testkits für kommerzielle Hersteller derartiger Kits.

Im folgenden wird die Erfindung durch einige Beispiele erläutert. Beispiel 1

in kommerzielle Glasröhrchen (5,5mm χ 45mm) werden je 250μΙ einer 1%igen Lösung des Silanhaftmittels NB 1114 (Aminopropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) in Äthanol/Wasser (1:1) gegeben und 4 Stunden bei höheren Temperaturen (37⁰C bis 60"C) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer, pH7,4, werden je 200 μΙ 2%iges Gluteraldehyd in PBS-Puffer zugegeben und 2 h bei 37 ⁰C inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen werden die so aktivierten Röhrchen mit je 200μΙ humanem IgG in PBS-Puffer versetzt (50μΙ/ΓηΙ) und 4h bei Raumtemperatur bebrütet. Nach weiteren Waschvorgängen werden die eventuell noch freien Aldehydgruppen mit 0,2 m Lysinlösung blockiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer werden die Röhrchen mit 200μΙ eines Kaninchen-antihuman-lgG-Antiserums in einer Verdünnung von 1:100 für 4h bei 37"C inkubiert und anschließend wiederum mehrmals gewaschen. Anschließend werden die Röhrchen mit 200μΙ Konjugat (39ng/ml), bestehend auf einem Schaf-anti-Kaninchen-tgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und nach erneutem Waschen die Enzymaktivität mit 2,2 Azinodie (3-äthyl-benzthiazolin-sulfonat (6) (ABTS) und H₂O₂ und photometrische Messung bei 418nm bestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays werden die Röhrchen zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend in Mehrfachbesti'nmungen mit einer der folgenden Dissoziationsreagenzien für 1 h bei Raumtemperatur versetzt; 1) PBS-Puffer, 2 m an NaCI 5% Dioxan enthaltend, 2) ImKSCN, 3) 3m KSCN, 4) 4,5m MgCI,, 5} 1m NaJ, 6) HCI-Glyzin-Puffer pH 2,8. Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem IgG beladenen Röhrchen erneut im Enzymimmunoassay eingesetzt werden können

Zylinderförmige Formkörper aus Glas (Außei!durchmesser 6 mm, Innendurchmesser ca. 4mm, Höhe ca. 3mm) werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Silanhaftmitteln (NB 1115 (Glycidoxypropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) behandelt und anschließend mit Gluteraldehyd aktiviert und mit humanem Faktor VIII gebunden. Zur Ausführung des EIA werden diese

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Formkörper in kommerzielle Mikrotitrationsplatten, die 96 Proben a 300μΙ aufnehmen, gegeben und im folgenden nach zwischenzeitlichem Waschen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-anti-human-F Vlll-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, versetzt. Nach anschließendem Waschen wird die Enzymaktivität analog Beispiel 1 mit ABTS und H₂O₂ unter Verwendung einer Absaugküvette (Kombinat VEB Carl Zeiss JENA) bestimmt. Entsprechend Beispiel 1 wird das gebundene Konjugat mit einem der dort angeführten Oissoziationsreagenzien 1 )-6) abgespalten und ausgewaschen, so daß die mit F VIII beladenen Glas-Formkörper erneut in EIA eingesetzt werden können. Die Waschvorgänge erfolgen in dieser Variante durch Abdecken der Mikrotitrationsplatte mit einer geeigneten Vorrichtung, die die Glas-Formkörper in den Vertiefungen fixiert, und einfaches Umdrehen der Mikrotitrationsplatte. Dadurch vereinfacht sich der Waschprozeß im Vergleich zu Beispiel 1, bei dem jedes Röhrchen in der üblichen Art und Weise mittels Vakuum abgesaugt werden muß, erheblich, so daß größere Probenzahlen mit hoher Effektivität bestimmt werden können.

Beispiel 3

Glaskugeln von 5,5mm Durchmesser (mattiert F ~ 50 mm²) werden wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln, Gluteraldehyd und humanem F VIII aktiviert und beladen. Diese Glaskugeln werden in Polystyrol-Mikrotiter-Platten eingeführt und im folgenden der EIA zur Bestimmung von F Vlll-Antigen (W. Schößler et al. Acta biol. med. Germ.41 [1982] 263, W. Schößler et al. Acta biol. med.Germ.41 [1982] 695) in der beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Hierzu werden die Glaskugeln mit einom Inktibationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem in Überschuß vorhandenen Kaninchenanii human Faktor Vlll-Antikörper versetzt und 6h bei 37 C inkubiert. Nach erneutem Waschen analog dem Beispiel 2 werden 200/il eines Konjugates, bestehend aus einem Schaf-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, bestimmt. Die Abspaltung der gebundenen Antikörper erfolgte mit einem der in Beispiel 1 angeführten Dissoziationsreagenzien, so daß die mit F VIII beladenen Glaskugeln erneut im EIA eingesetzt werden können.

Beispiel 4

Plane Glasplatten werden durch Hydrophobierungsmittel wie Chlorsilane oder Paraffin in konstante Areale von ca. 1 cm² Fläche unterteilt. Diese werden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln und Gluteraldehyd aktiviert und mit einem Anti-human-Faktor Vlll-Antikörper vom Kaninchen beladen. Nach Ausführung der erforderlichen Waschvorgänge, die durch einfaches Abspülen der Glasplatte realisiert werden, erfolgt eine Inkubation mit einem geeigneten Volumen (25 bis 50μΙ) Faktor-Vlll-Antigen enthaltendem Probenmaterial und nach erneutem Waschen die Zugabe eines Kaninchen-anti-human-F VIII-Antikörpers gekoppelt an das Enzym Meerrettichperoxydase und Bestimmung der Enzymaktivität analog Beispiel 3.

Claims

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Erfindungsansprüche:

1. Feslphasen-Immunoassay zur immunologischen Bestimmung von Aniigenen, Anukörpern, Haptenen, Viren, Hormonen, Pharmaka etc. auf der Grundlage siliziumdioxidhaltiger Materialien als feste Phase, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phase siliziumdioxidhaltige Formkörper, deren Oberflächen zwei- oder dreidimensional nutzbar sind, eingesetzt werden, die nach vorheriger an sich bekannter chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaftmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien mit Antigenen wie Faktor Vlll-Antigen oder anderen Plasmaproteinen, Antikörpern wie anti-Faktor Vlll-Antikörpern oder Antikörpern gegen Antigene. Haptene, Viren, Bakterien etc., humanem Immunglobulin oder anderen Serumproteinen bzw. Haptenen beladen werden und nach Ablauf der Immunreaktion die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende Reagenzien gespalten und die mit den oben genannten Antigenen, Antikörpern bzw. Haptenen beladenen Formkörper wieder im Immunoassay eingesetzt werden.
2. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Immunoassay eingesetzten dreidimensional nutzbaren Formkörper halbkugelförmige, kugelförmige, zylinderförmige, würfelförmige oder kegelförmige Gestalt haben, daß sie sowohl Kompakt- als auch Hohlkörper sind, daß die Halbkörper offen oder geschlossen sind und daß das Volumen der Formkörper 0,1 bis 15cm³ beträgt.

Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweidimensional nutzbaren Formkörper planare SiO₂-haltige Körper sind, deren Oberfläche in regelmäßige sich einander abwechselnde hydrophobe und hydrophile Bezirke oimjoißilt ist, woboi die bydropbilon Bewirkt; oino Größi) von 0,001 bis bein⁷ besitzen.

Ί \ ostphasen-lmmunoassay nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die hydrophoben Be/irko durch Hydrophobierungsmittel wie Chlorsilane oder Paraffine erzeugt werden.
5. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das geformte siliziumdioxidhaltige Material Glas ist.
6. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als die Dissoziation herbeiführende Reagenzien stark saure Puffer und Lösungen, alkalische Puffer und Lösungen, chaotrophische Ionen, depolarisierende Reagenzien, elektrostatische und Wasserstoffbrückenbindungen beeinflussende Substanzen sowie Haptene verwendet werden.