DE3807756A1 - Analysentrockenelement fuer einen immunoassay - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element des Trockentyps, welches im folgenden der Einfachheit halber als Analysentrockenelement bezeichnet wird, das für einen Immunoassay geeignet ist, bei dem eine Antigen-Antikörper- Reaktion verwendet wird.

In der Vergangenheit wurde ein analytisches Verfahren ent­ wickelt, bei dem ein Analysentrockenelement verwendet wird (beispielsweise US-PS 42 92 272, japanische Patente KOKAI 49-53 888 und 59-1 02 388). Im allgemeinen wird bei einem Analysentrockenelement ein Analyt, wie eine in einer Körperflüssigkeit enthaltene biochemische Substanz, mit einem Reagens bzw. mit Reagentien, die in das Analysenele­ ment eingearbeitet sind, umgesetzt. Die Menge eines beson­ deren Reaktionsproduktes oder der nichtumgesetzten Komponen­ te wird durch Messung der Färbung, Verfärbung, Flureszenz, Emission oder einer ähnlichen Eigenschaft optisch, wie durch Spektrophotometrie, bestimmt, wobei der Analytgehalt festgestellt wird. unter Verwendung eines Analysentrocken­ elements kann eine besondere Komponente, wie eine bioche­ misch-aktive Substanz, in einer Flüssigkeitsprobe einfach, schnell und genau analysiert werden.

In der US-PS 44 59 358 und den japanischen Patenten KOKAI 49-53 888 und 59-1 02 388 wird ein Immunoassay beschrieben, bei dem ein Analysentrockenelement verwendet wird.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion auf dem Gebiet der Immuno­ logie ist eine, bei der ein Antikörper oder Antigen spe­ zifisch mit dem entsprechenden Antigen oder Antikörper reagiert, und sie wird vielfach für die Diagnose einer Autoimmunkrankheit, dem Nachweis einer Spurenkomponente in einem lebenden Körper und ähnlichen Verfahren verwendet. Da jedoch das Verfahren, bei dem eine Antigen-Antikörper- Reaktion verwendet wird, Geschicklichkeit bei den Durch­ führungen verlangt, besteht ein Bedarf für die Entwicklung eines Verfahrens, bei dem die Messung durch einfache Maß­ nahmen erfolgen kann und wo ein genaues Ergebnis beim klinischen Test erhalten wird.

Das Verfahren zur Bestimmung eines Antigens, das in dem japanischen Patent KOKAI 59-77 356 (1984) beschrieben wird, ist ein typisches Verfahren, bei dem ein Mehrschichten- Analysenelement verwendet wird. Dieses Analysenelement be­ steht aus einer Ausbreitungsschicht, die ein mit einem fluoreszierenden Material markiertes Antigen enthält, einer Trennschicht, die aus einem porösen Medium besteht, und einer Reaktionsschicht, welche einen immobilisierten Anti­ körper enthält. Die Menge an Antigen wird in diesem Element durch Messung der Abnahme der Fluoreszenzintensität unter Verwendung der konkurrierenden Antigen-Antikörper-Reaktio­ nen zwischen dem Antigen in der Probenlösung und dem mar­ kierten Antigen bestimmt.

Es ist ein weiteres Immunoassayverfahren mit relativ hoher Empfindlichkeit, nämlich Enzymimmunoassay (EIA), bekannt. Ein typischer EIA ist die konkurrierende Reaktion in fester Phase, bei dem das Antigen, das gemessen werden soll, und ein enzymmarkiertes Antigen oder sein Derivat konkurrie­ rend mit dem immobilisierten Antikörper reagieren kann und wo eine bindungsfreie (B/F) Trennung durchgeführt wird und die Aktivität entweder des an den Antikörper gebunde­ nen Enzyms oder des freien Enzyms gemessen wird, um die Menge an Antigen zu bestimmen, die gemessen werden soll. Zur Beseitigung der B/F-Trennung ist ein Enzym erforder­ lich, dessen Aktivität durch Bindung an den Antikörper er­ höht oder erniedrigt wird.

Damit diese Meßsysteme wirksam arbeiten, sind zwei Kompo­ nenten, das mit Enzym markierte Antigen oder sein Derivat und der immobilisierte Antikörper in einem Fall oder der mit dem Enzym markierte Antikörper oder sein Derivat und ein immobilisiertes Antigen im anderen Fall, erforderlich. Bei beiden Fällen müssen diese beiden Komponenten getrennt werden, so daß sie vor der Messung nicht miteinander rea­ gieren. Bei den meisten bekannten Analysentrockenelemen­ ten konnte keine zufriedenstellende analytische Empfind­ lichkeit wegen dem niedrigen Signal/Hintergrundverhältnis, das durch ungenügende Trennung der beiden Komponenten auf­ trat, erhalten werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Analysentrockenelement für den Immunoassay zur Verfügung zu stellen, welches eine hohe analytische Empfindlichkeit und Genauigkeit aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Analysentrockenelement für den Immunoassay, das integriert mindestens zwei wasser­ permeable Schichten, die die Komponenten, welche bei der Antigen-Antikörper-Reaktion teilnehmen, enthalten und wo­ von eine der Schichten eine poröse Schicht ist und die andere der Schichten eine Reagensschicht ist, wobei die Reagensschicht an der gegenüberliegenden Seite der Proben­ empfangsseite der porösen Schicht angebracht ist, wobei eine der Komponenten, die an der Antigen-Antikörper-Reak­ tion teilnimmt, ein markiertes Antigen ist, die andere der Komponenten ein Antikörper für das markierte Antigen und das nichtmarkierte Antigen ist, wobei der Antikörper in die poröse Schicht und das markierte Antigen in die Reagensschicht eingearbeitet sind.

Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Analysentrockenelements für den Immunoassay mit hoher analytischer Empfindlichkeit zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her­ stellung eines Analysentrockenelements, das integriert min­ destens zwei wasserpermeable Schichten aufweist, die die Komponenten, die bei der Antigen-Antikörper-Reaktion teil­ nehmen, enthält, wobei eine der Schichten eine poröse Schicht ist, die andere eine poröse oder nichtporöse Rea­ gensschicht ist, die Reagensschicht an der gegenüberliegen­ den Seite der Probenaufnahmeseite der porösen Schicht an­ geordnet ist, eine der Komponenten, die bei der Antigen- Antikörper-Reaktion teilnimmt, ein markiertes Antigen ist, die andere der Komponenten ein Antikörper für das markier­ te Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• (1) eine Reagensschicht, die das markierte Antigen enthält, bildet,
• (2) eine poröse Schicht auf die Reagensschicht auf­ bringt und
• (3) auf die poröse Schicht eine Masse aufbringt, wel­ che den Antikörper enthält und das markierte Antigen in der Reagensschicht nicht wesentlich auflöst oder solubili­ siert, wobei die Aufbringung durch Beschichtung oder Im­ bibition bzw. Imprägnierung erfolgt.

Die obige Aufgabe der Erfindung wurde bevorzugt durch ein Verfahren zur Herstellung des Elements gelöst, welches folgende Stufen umfaßt:

• (1′) Herstellung einer Reagensschicht, welche ein markier­ tes Antigen und als Bindemittel (Matrix) ein hydro­ philes Polymeres enthält;
• (2′) Anwendung der porösen Schicht auf die Reagensschicht; und
• (3′) Anwendung auf die poröse Schicht einer Masse, welche den Antikörper und ein Lösungsmittel enthält, welches die Reagensschicht nicht im wesentlichen anquillt.

Die obige Aufgabe kann alternativ gemäß einem Verfahren zur Herstellung des Elements gelöst werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• (1′′) eine das markierte Antigen enthaltende Reagensschicht bildet;,
• (2′′) auf einen porösen Film eine flüssige Masse aufbringt, die den Antikörper, gelöst oder solubilisiert in einem Lösungsmittel, welches verdampft werden kann, enthält; und
• (3′′) den porösen Film, der den Antikörper enthält, auf die Reagensschicht laminiert.

Die Stufe (3′′) wird bevorzugt nach dem Trocknen des porösen Films durchgeführt.

Anhand der beigefügten Zeichnung wird die Erfindung erläu­ tert.

Fig. 1 zeigt die Eichkurven für T₄ (Thyroxin), die man unter Verwendung des erfindungsgemäßen Elements und eines Vergleichsanalysenelements erhält.

Die Komponenten, die an einer Antigen-Antikörper-Reaktion teilnehmen, sind das markierte Antigen, der Antikörper für das markierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen. Das markierte Antigen kann mit dem Antikörper reagieren und ihn binden und ist im allgemeinen das gleiche Antigen wie das nichtmarkierte Antigen.

Die Markierungssubstanz kann ein fluoreszierendes Material, lumineszierendes Material, Enzym sein, oder man kann ande­ re Markierungen verwenden, wie man sie für Immunoassays einsetzt.

Beispiele für fluoreszierende Materialien sind die fluores­ zierenden Materialien mit einer Aminogruppe, wie 1-Amino­ stilben, 2-Aminonaphthalin, p,p′-Diaminostilben, 2-Amino­ acridin, p,p′-Diaminobenzophenonimine, Bis-3-aminpyridinium­ salze und Indole,und fluoreszierende Phenole, wie 7-Hydroxy­ coumaline, 3,6-Dihydroxyxanthene, Tetracyclin und Salicyl­ säureester. Ein Beispiel für ein fluoreszierendes Material is Fluorescein.

Beispiele für lumineszierende Materialien sind chemilumi­ neszierende Materialien, wie 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin­ dione, beispielsweise Luminol und 2,4,5-Triphenylimidazole.

Als Markierung bzw. Label können verschiedene Enzyme ver­ wendet werden. Geeignete Enzyme werden unter Beachtung der Aktivität, der Stabilität, dem Einfluß der Bindungsaktivi­ tät, der Anwesenheit eines einfachen Meßverfahrens für die Enzymaktivität ausgewählt. Beispiele für Enzyme werden in Tabelle 1 und Tabelle 2 des japanischen Patents KOHYO 56-5 00 901 beschrieben, und repräsentative Enzyme sind Glucoseoxidase (GOD), β-D-Galactosidase, Peroxidase (POD), alkalische Phosphatase (ALP), α-Amylase, Luciferase etc.

Das Bindungsverfahren der Markierungssubstanz an das Anti­ gen kann ein an sich bekanntes Verfahren sein, und die Einzelheiten werden beispielsweise in "Koso-Meneki Sokutei- Ho (Enzyme Immunoassay) (2. Aufl.)" (Ishikawa et al., 1982), "Rinsho Kensa Gÿutsu Zensho 4, Meneki Kassei Kensa (Clinical Assay Technique Complete Book 4 Immune Serum Assay)", Seite 97 bis 102 (Herausg. Kawai, Igaku-Shorin, 1977), Biochem. Biophys. Res. Commun., 74, 538 (1977), Clinica Chimica Acta, 83, 161 (1973) etc. beschrieben.

Die Beispiele für die markierten Antigene werden ebenfalls in den obigen Literaturstellen beschrieben. Spezifische Beispiele sind fluorescein-isocyanatgebundenes Thyroxin (FITC-T₄). GOD-gebundenes humanes lmmunoglobulin (IgG), ALP-gebundenes IgG, POD-markiertes α-Fetoprotein und ähn­ liche.

Der Antikörper reagiert und bindet das oben erwähnte mar­ kierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen. Das nicht­ markierte Antigen ist normalerweise das Antigen, das be­ stimmt werden soll und welches in einer Probe enthalten ist. Die reaktive Stelle des Antikörpers für die obigen beiden Antigene kann gleich oder voneinander unterschied­ lich sein. Das bedeutet, wenn mindestens eines der obigen Antigene zwei oder mehrere antigene Determinanten auf­ weist, kann der Antikörper an verschiedenen Stellen reagie­ ren. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. Er kann ebenfalls ein Pepsin-Digestionsprodukt eines Anti­ körpers, wie F (ab′)₂ oder Fab′ sein.

Das erfindungsgemäße analytische Element kann andere Rea­ gentien für den Fluoroimmunoassay, EIA oder ähnliche ent­ halten. Solche Reagentien sind Farbstoffe, Puffer etc.

Die Puffer, die für das erfindungsgemäße analytische Ele­ ment geeignet sind, sind Carbonatpuffer, Boratpuffer und Phosphatpuffer, Good′s Puffer (Biochemistry, Bd. 5, Nr. 2, S. 467 bis 477, 1966) und ähnliche. Ein solcher Puffer kann unter Bezugnahme auf "Tanpakushitsu Koso no Kiso-Jikken- Ho (Fundamental Experimental Method of Proteins, Enzymes)" (Horio et al., Nanko-Do, 1981), die obige Biochemistry- Literaturstelle oder nach ähnlichen Gesichtspunkten aus­ gewählt werden.

Das analytische Element kann ebenfalls übliche Zusatzstoffe für bekannte analytische Elemente, wie oberflächenaktive Mittel und Teilchen, welche das Licht reflektieren, ent­ halten.

Das erfindungsgemäße analytische Element enthält mindestens zwei wasserpermeable Schichten, die miteinander integriert sind und wovon eine eine poröse Schicht und die andere eine Reagensschicht ist.

Die poröse Schicht enthält den zuvor erwähnten Antikörper für das markierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen, und sie enthält im wesentlichen nicht das zuvor erwähnte markierte Antigen. Im allgemeinen enthält die Schicht im wesentlichen die gesamte Menge des obigen Antikörpers. Die poröse Schicht kann als alleroberste Schicht vorhanden sein, oder sie kann zwischen der allerobersten wasserper­ meablen Schicht und der Reagensschicht angeordnet sein. Die poröse Schicht kann eine Ausbreitungsschicht mit einer Meßwirkung oder andere Schichten sein. Die Meßwirkung ist die, daß eine Flüssigkeitsprobe, die auf die Ausbreitungs­ schicht als Fleck aufgetragen wurde, sich in einer be­ stimmten Menge pro Einheitsfläche ohne ungleiche Vertei­ lung von irgendeiner der Komponenten in Seitenrichtungen verteilt. Die poröse Schicht kann aus einem faserförmigen Material oder einem nichtfaserförmigen Material bestehen und umfaßt gewebte Flächengebilde, wie einfache gewebte Materialien, und gestrickte bzw. gewirkte Flächengebilde bzw. Textilmaterialien, wie Trikotmaterial, hergestellt aus natürlichen, synthetischen oder semisynthetischen Fa­ sern, nichtgewebte Textilmaterialien bzw. Flächengebilde, Filterpapiere, Glasfaser-Filterpapiere, Membranfilter, die aus Celluloseacetat oder ähnlichen Materialien bestehen, verbundene Materialien aus anorganischen oder organischen Teilchen etc. Geeignete poröse Schichten einschließlich der faserförmigen Schichten werden in der US-PS 42 92 272 und EP-01 62 302 A beschrieben, und die porösen Schichten werden in den japanischen Patenten KOKAI 49-53 888, 58­ 70 163, 61-4 959, 62-1 16 258, 62-1 38 756, 62-1 38 757 und 62­ 1 38 758 beschrieben, und die gewebten bzw. gewirkten Textil­ materialien und die gestrickten Textilmaterialien sind besonders bevorzugt. Die gewebten bzw. gewirkten Textilma­ terialien können mit Glühentladung, wie in der britischen Patentschrift 20 87 074 A beschrieben, behandelt werden. Außerdem kann die Ausbreitungsschicht ein hydrophi­ les Polymeres oder ein oberflächenaktives Mittel enthalten, wie es in der EP-01 62 302 A und den japanischen Patentan­ meldungen 61-1 22 875, 61-1 22 876 und 61-1 43 754 beschrieben wird, damit die Ausbreitungsfläche, die Ausbreitungsge­ schwindigkeit und ähnliche Faktoren reguliert werden.

Die Reagensschicht enthält das zuvor erwähnte markierte Antigen, und sie enthält im wesentlichen nicht den Anti­ körper für das markierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen. Im allgemeinen enthält diese Schicht im wesent­ lichen die Gesamtmenge des markierten Antigens, welche in das analytische Element eingearbeitet ist. Die Reagens­ schicht ist an der entgegengesetzten Seite zu der Proben­ empfangsseite der porösen Schicht angebracht, und sie ist mit der porösen Schicht direkt oder über eine oder mehre­ re Schichten integriert. Die Reagensschicht kann eine einheitliche Schicht sein, welche ein hydrophiles Polyme­ res als Bindemittel, wie Gelatine, ihre Derivate, phthala­ tisierte Gelatine, Cellulosederivate, wie Hydroxyethyl­ cellulose, Agarose, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, und Copolymere von Acrylamid oder Methacrylamid und verschiede­ ne Vinylmonomere enthält. Die Reagensschicht kann ebenfalls aus einem porösen Material, wie in den japanischen Patenten KOKAI 58-70 163, 61-4 959, 62-1 16 258, 62-1 38 756, 62-1 38 757 und 62-1 38 758 beschrieben, bestehen. Wenn die Markierungs­ substanz bzw. die Labelsubstanz ein Enzym ist, können in die Reagensschicht ein Substrat des Enzyms, ein Oxidations­ mittel, ein Kupplungsmittel, ein Puffer etc. eingearbeitet sein. Unter den obigen ist das Substrat wesentlich.

Eine oder mehrere Schichten können zwischen der porösen Schicht und der Reagensschicht vorhanden sein. Beispiele einer solchen Zwischenschicht sind eine Bindungsschicht, eine Lichtabschirmungsschicht und eine Filterschicht. Weiterhin kann jede der zuvor erwähnten porösen Schichten der Reagensschicht aus zwei oder mehr Schichten bestehen.

Die Bindungsschicht ist vorgesehen, damit die poröse Schicht an ihr haftet, und sie besteht bevorzugt aus einem hydrophilen Polymer, welches die poröse Schicht festklebt, während sie in einem nassen bzw. gequollenen Zustand des Polymeren ist. Beispiele für ein solches hydrophiles Poly­ meres sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid und Stärke. Die Bindungsschicht kann ebenfalls auf der zuvor erwähnten Reagensschicht, einer anderen Reagensschicht, einer Lichtabschirmungsschicht, einer Filterschicht, einer Wasserabsorptionsschicht, einer Registrierschicht oder einer ähnlichen Schicht vorhanden sein.

Die Lichtabschirmungs- bzw. Blockierungsschicht schirmt die Farbe der Probe, die auf die Ausbreitungsschicht aufge­ tragen wird, insbesondere die rote Farbe des Hämoglobins, wenn die Probe Gesamtblut ist, ab, wenn eine optisch nach­ weisbare Änderung, wie eine Verfärbung oder Entfärbung, die in der Reagensschicht, einer anderen Reagensschicht, einer Registrierschicht oder ähnlichen Schicht auftritt, durch Reflexionsphotometrie von der lichtdurchlässigen Trägerseite aus gemessen wird. Zusätzlich wirkt sie eben­ falls als Lichtreflexionsschicht oder als Hintergrund­ schicht. Die Lichtabschirmungsschicht ist bevorzugt die wasserpermeable Schicht, die aus einem hydrophilen Polyme­ ren als Bindemittel (Matrix) besteht, worin die Lichtre­ flexionsteilchen, wie Titandioxid oder Bariumsulfat, di­ spergiert sind. Bevorzugte hydrophile Polymere sind Gela­ tine, Gelatinederivate, Polyacrylamid und ähnliche. Die Lichtreflexionsteilchen können in die Ausbreitungsschicht, die Reagensschicht, eine Regristrierschicht oder ähnliche Schicht eingearbeitet werden, zusätzlich oder anstatt sie in die Lichtabschirmungsschicht einzuarbeiten.

Die folgenden Ausführungsformen sind für das erfindungsge­ mäße Analysenelement, welches einen lichtdurchlässigen wasserimpermeablen Träger enthält, besonders geeignet:

• (1) Die poröse Ausbreitungsschicht, die Reagensschicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge überein­ ander angeordnet.
• (2) Die poröse Ausbreitungsschicht, die Reagensschicht, eine Registrierschicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet.
• (3) Die Ausbreitungsschicht, eine Lichtreflexionsschicht, die Reagensschicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet.
• (4) Die Ausbreitungsschicht, eine Lichtreflexionsschicht, die Reagensschicht, eine Registrierschicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge übereinander an­ geordnet.
• (5) Die poröse Ausbreitungsschicht, die Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine Registrierschicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge überein­ ander angeordnet.
• (6) Die Ausbreitungsschicht, eine erste Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine zweite Reagens­ schicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet. Eine oder beide der obigen Reagensschichten enthalten das markierte Antigen.
• (7) Die Ausbreitungsschicht, eine erste Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine zweite Reagens­ schicht, eine Registrierschicht und der Träger sind in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet. Eine oder beide der obigen Reagensschichten enthalten das markierte Antigen.

Bei den obigen Ausführungsformen (1) bis (5) kann die Rea­ gensschicht aus zwei oder mehreren Schichten bestehen. Eine Wasserabsorptionsschicht kann zwischen der Reagens­ schicht oder der Registrierschicht und dem Träger vorge­ sehen sein. Bei den Ausführungsformen (1) bis (3) und (6) kann eine Filterschicht zwischen der Reagensschicht und der Registrierschicht oder der Ausbreitungsschicht vorge­ sehen sein. Bei den obigen Ausführungsformen (3) bis (7) kann eine Filterschicht ebenfalls zwischen der Lichtre­ flexionsschicht und der Registrierschicht, der Ausbreitungs­ schicht und der Reagensschicht, der Reagensschicht und der Registrierschicht oder der Ausbreitungsschicht und der Reagensschicht vorgesehen sein. Wenn die Reagensschicht aus zwei oder mehreren Schichten besteht, kann eine Filter­ schicht ebenfalls zwischen ihnen vorhanden sein.

Bei dem Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Analysenelements kann das markierte Antigen in der Beschich­ tungslösung gelöst oder suspendiert sein, wobei diese Lösung unter Bildung der Reagensschicht aufgebracht wird.

Damit andererseits die Effusion des Antikörpers in die Reagensschicht verhindert wird, hat die Anmelderin verschie­ dene Möglichkeiten untersucht und gefunden, daß eine wirk­ same Möglichkeit die Anwendung einer Lösung oder Suspension des Antikörpers, gelöst oder suspendiert in einem organi­ schen Lösungsmittel, welches das markierte Antigen nicht löst und nicht solubilisiert, auf die poröse Schicht ist. Bevorzugte organische Lösungsmittel, welche die Reagens­ schicht, die aus hydrophilen Polymeren, wie Gelatine, Aga­ rose usw. besteht, nicht quellen, sind Alkohole, wie Ethanol und Methanol, Ketone, wie Aceton, und Ether, wie Ethylcellosolve. Die Lösung oder Suspension enthält bevor­ zugt alle Komponenten, die in die poröse Schicht eingear­ beitet werden, und die Beschichtungsmenge jeder Komponente kann gleich sein wie bei den bekannten integralen multi­ schichtigen Analysenelementen. Der Antikörper kann zuerst in die poröse Schicht eingearbeitet werden, gegebenenfalls zusammen mit anderen Komponenten, und die poröse Schicht kann dann an die Schicht unter ihr, wie an die Reagens­ schicht, laminiert werden. In diesem Fall kann das Lösungs­ mittel der Beschichtungslösung Wasser sein. Das obige or­ ganische Lösungsmittel oder die wäßrige Lösung oder Sus­ pension kann auf dem porösen Träger nach an sich bekannten Verfahren angewendet werden, oder dieser kann damit im­ prägniert werden, wie durch Eintauchbeschichtung, Beschich­ tung mit einem Rakel, Beschichtung mit einem Speisetrich­ ter oder Vorhangbeschichtung.

Beispiel (1) Synthese von Thyroxin, welches mit Fluorescein mar­ kiert ist

Das mit Fluorescein markierte Thyroxin (FITC-T₄) wurde ent­ sprechend dem Verfahren, wie es in dem japanischen Patent KOKAI 59-1 70 768 beschrieben wird, synthetisiert.

(2) Herstellung einer Antithyroxin-Antiserum-Suspension

Das folgende Gemisch wird in einer Homogenisierungsvorrich­ tung während 1 Stunde unter Bildung einer Antithyroxin- Antiserum-Suspension homogenisiert.

Antithyroxin-Antiserum
(als lyophilisiertes Pulver)1 ml Nonylphenoxypolyethoxyethanol
(n = 15)0,2 ml Aceton100 g

(3) Herstellung eines vielschichtigen Blattes

Als Träger wird ein farbloser transparenter glatter Film aus Polyethylenterephthalat (PET), der 180 µm dick ist, verwendet, auf den eine Gelatine-Unterschicht aufgebracht ist. Die folgende wäßrige Lösung wird auf den Träger auf­ gebracht, so daß seine Trockendicke 2 µm beträgt, und getrocknet, wobei man eine Reagensschicht erhält.

Gelatine10 g FITC-T₄120 µg Formalin0,2 g Wasser190 g

Die Gelatine wird auf die obige Reagensschicht bis zu ei­ ner Trockendicke von etwa 2 µm unter Bildung einer Bin­ dungsschicht aufgebracht.

Die obige Bindungsschicht wird mit 30 g/m² Wasser befeuch­ tet. Ein Trikottextiltuch, welches durch Verstricken von 50D PET-gesponnenem Garn unter Verwendung von 36 Gauge her­ gestellt wurde, wird aufgepreßt, so daß es laminiert, und anschließend wird getrocknet, wobei man die Ausbreitungs­ schicht erhält.

Danach wird die folgende Beschichtungslösung auf die Aus­ breitungsschicht in einer Menge von 120 ml/m² aufgetragen, und nach dem Trocknen erhält man ein integrales vielschich­ tiges analytisches Element für die Messung von Thyroxin.

Antithyroxin-Antiserum-Suspension5 ml Polyvinylpyrrolidon25 g Nonylphenoxypolyethoxyethanol
(n = 15)0,2 mg Methylalkohol500 ml

Andererseits wird ein integrales vielschichtiges Ver­ gleichs-Analysenelement für die Messung von T₄ auf gleiche Weise wie oben beschrieben hergestellt, ausgenommen, daß in der obigen Beschichtungslösung 500 ml Methylalkohol durch 500 ml Wasser ersetzt wurden.

(4) Messung von Thyroxin

Ein Serum wird mit Aktivkohle behandelt, wobei ein thyroxin(T₄)freies Serum erhalten wird. T₄ wird zu diesem T₄-freien Serum unter Herstellung der Sera für die Eichung zugegeben, wobei diese T₄ in unterschiedlichen Konzentra­ tionen enthalten. Je 5 µl von wäßrigem 0,1M Blocker′s-Rea­ gens-(Natriumdodecylnaphthalinsulfonat)-Lösung und 5 µl von 0,3M Glucin-NaCl-NaOH-Pufferlösung werden zu jedem Serum für die Eichung zugegeben. Das Gemisch wird auf die ent­ sprechenden analytischen Elemente getropft und bei 25°C während 30 Minuten gehalten. Das analytische Element wird mit einer Lichtquelle mit einer Erregungswellenlänge von 495 nm bestrahlt, und die reflektierte Fluoreszenz bei der Wellenlänge von 525 nm wird von der PET-Filmseite aus unter Verwendung eines Fluorophotometers ("Fluorophotometer 650-10(s)", Hitachi Ltd.) gemessen. Die so erhaltenen Eich­ kurven sind in Fig. 1 dargestellt. In der Zeichnung bedeu­ tet die ausgezogene Linie die Ergebnisse, die man unter Verwendung des erfindungsgemäßen analytischen Elements er­ hält, und die gestrichelte Linie zeigt die Ergebnisse an, die man unter Verwendung des Vergleichs-Analysenelements erhält. Wie aus der Zeichnung folgt, ist das erfindungsge­ mäße Analysenelement wesentlich empfindlicher als das Vergleichs-Analysenelement.

Claims (11)

1. Analysentrockenelement für einen Immunoassay mit mindestens zwei integrierten wasserpermeablen Schichten, wovon eine der Schichten eine poröse Schicht und die an­ dere der Schichten eine Reagensschicht ist, die Reagens­ schicht an der gegenüberliegenden Seite der Proben­ empfangsseite der porösen Schicht angebracht ist, die wasserpermeablen Schichten die Komponenten enthalten, die an einer Antigen-Antikörper-Reaktion teilnehmen, wobei eine der Komponenten, die an der Antigen-Antikörper-Reak­ tion teilnimmt, ein markiertes Antigen ist und die andere der Komponenten ein Antikörper für das markierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen ist, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die poröse Schicht den Antikörper, aber nicht das markierte Antigen enthält und daß die Reagensschicht das markierte Antigen, aber nicht den Antikörper enthält.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtmarkierte An­ tigen das Antigen ist, welches bestimmt werden soll.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine Ausbreitungsschicht ist.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungs- bzw. Labelsubstanz für das markierte Antigen eine Verbindung aus der Gruppe fluoreszierendes Material, lumines­ zierendes Material, ein Enzym, Enzymaktivator, Enzymin­ hibitor und Coenzym ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Analysentrockenele­ ments für einen Immunoassay mit mindestens zwei integrier­ ten wasserpermeablen Schichten, wovon eine der Schichten eine poröse Schicht ist, die andere der Schichten eine Reagensschicht ist, die Reagensschicht an der gegenüber­ liegenden Seite der Probenaufnahmeseite der porösen Schicht angebracht ist, die wasserpermeablen Schichten die Komponenten enthalten, die an einer Antigen-Antikörper- Reaktion teilnehmen, wobei eine der Komponenten, die in der Antigen-Antikörper-Reaktion teilnimmt, ein markiertes Antigen ist und die andere der Komponenten ein Antikörper für das markierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen ist, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Reagensschicht, welche das markierte Antigen enthält, gebildet wird,
eine poröse Schicht auf die Reagensschicht aufge­ bracht wird und
auf die poröse Schicht eine Masse durch Beschichten oder Eintauchen aufgebracht wird, die den Antikörper ent­ hält und das markierte Antigen in der Reagensschicht nicht wesentlich auflöst oder solubilisiert.

6. Verfahren zur Herstellung eines Analysentrockenele­ ments für einen Immunoassay mit mindestens zwei integrier­ ten wasserpermeablen Schichten, wobei eine der Schichten eine poröse Schicht ist und die andere der Schichten eine Reagensschicht ist, die Reagensschicht an der entgegen­ gesetzten Seite der Probenempfangsseite der porösen Schicht angebracht ist, die wasserpermeablen Schichten die Komponenten enthalten, welche an der Antigen-Antikör­ per-Reaktion teilnehmen, wobei eine der Komponenten, die an der Antigen-Antikörper-Reaktion teilnimmt, ein mar­ kiertes Antigen ist und die andere der Komponenten ein Antikörper für das markierte Antigen und ein nichtmarkier­ tes Antigen ist, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Reagensschicht gebildet wird, welche ein mar­ kiertes Antigen und als Bindemittel (Matrix) ein hydrophi­ les Polymeres enthält,
auf die Reagensschicht eine poröse Schicht angewendet wird und
auf die poröse Schicht eine Masse aufgebracht wird, welche den Antikörper und ein Lösungsmittel, welches im wesentlichen die Reagensschicht nicht quillt, enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die poröse Schicht eine Ausbrei­ tungsschicht ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Lösungsmittel ein Lösungsmittel aus der Gruppe Alkohol, Keton und Ether ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Analysentrockenele­ ments für einen Immunoassay mit mindestens zwei integrier­ ten wasserpermeablen Schichten, wovon eine der Schichten eine poröse Schicht ist, die andere der Schichten eine Reagensschicht ist, die Reagensschicht an der gegenüber­ liegenden Seite der Probenempfangsseite der porösen Schicht angebracht ist, die wasserpermeablen Schichten die Komponenten enthalten, die an der Antigen-Antikörper- Reaktion teilnehmen, wobei eine der Komponenten, die an der Antigen-Antikörper-Reaktion teilnimmt, ein markiertes Antigen ist und die andere der Komponenten ein Antikörper für das markierte Antigen und ein nichtmarkiertes Antigen ist, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Reagensschicht gebildet wird, die das markierte Antigen enthält,
auf einen porösen Film eine flüssige Masse aufge­ bracht wird, die den Antikörper, gelöst oder solubilisiert in einem Lösungsmittel, welches verdampft werden kann, ent­ hält und
der poröse Film, der den Antikörper enthält, auf die Reagensschicht laminiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die poröse Schicht eine Ausbrei­ tungsschicht ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe Alkohol, Keton und Ether.