DE69329280T2

DE69329280T2 - Testvorrichtung und verfahren zur durchführung von blutgerinnungstests

Info

Publication number: DE69329280T2
Application number: DE69329280T
Authority: DE
Inventors: Stephen E. Zweig
Original assignee: Avocet Medical Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1992-04-27
Filing date: 1993-04-14
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: US5418143A; ES2151509T3; AU4287593A; GR3034647T3; JPH07506429A; JP3368279B2; CA2133983C; EP0638127A4; DK0638127T3; WO1993022453A1; EP0638127A1; DE69329280D1; EP0638127B1; CA2133983A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Testen von Blutkoagulation und insbesondere eine Testvorrichtung, welche die für einen derartigen Assay notwendigen Reagenzien umfaßt, und Verfahren, welche auf der Erzeugung eines fluoreszierenden oder anderen sichtbaren Signals aus der Testvorrichtung beruhen.
Blutkoagulationstests können für eine Reihe von Zwecken durchgeführt werden, einschließlich der Bestimmung der Blutungsneigung von Patienten, die einem chirurgischen Eingriff unterzogen werden, und der Überwachung von Patienten, die eine gerinnungshemmende Therapie zur Verhinderung von Thromben durchmachen. Derzeit wird eine Reihe von Koagulationstests verwendet. Einer der gebräuchlichsten ist der "Prothrombin-Zeit" (PT, prothrombin time) Test, der auf der Induktion des extrinsischen Koagulationswegs beruht, und ein anderer ist der "aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (APTT, activated partial thromboplastin time) Test, der auf der Induktion des intrinsischen Koagulationswegs beruht. Sowohl der extrinsische als auch der intrinsische Koagulationsweg führen zur Erzeugung von Thrombin, was ein proteolytisches Enzym ist, das die Überführung von Fibrinogen zu Fibrin katalysiert. Eine derartige Überführung ist eine essentielle Funktion im Gerinnungsmechanismus. Die Thrombin-Erzeugung kann günstig überwacht werden durch Aussetzen einer Blutprobe eines Patienten einem synthetischen Thrombinsubstrat-Peptid, das abspaltbar an ein Reportermolekül gebunden ist, welches durch Thrombinspaltung aktiviert wird. Das Reportermolekül erzeugt eine beobachtbare Veränderung, wie etwa eine Farbproduktion oder Fluoreszenz, und die Thrombinaktivität (die ein Maß für das Blutkoagulationsvermögen ist) wird mittel optischer Mittel bewertet.
Bisher waren derartige Blutkoagulationstests eher kompliziert, wobei eine Durchführung im allgemeinen auf klinische Labors beschränkt war. Obwohl eine derartige zentralisierte Testdurchführung für Chirurgiepatienten angemessen sein kann, ist das Aufsuchen einer Praxis oder Klinik auf regelmäßiger Basis zur Überwachung einer gerinnungshemmenden Therapie weniger akzeptabel. Somit ist der Bedarf für einen günstigen und praktischen Koagulationsübervvachungstest, der zu Hause durchgeführt werden kann, offensichtlich.
Die technischen Herausforderungen bei der Entwicklung eines Koagulationstests, der einfach genug ist um von den Patienten selbst durchgeführt zu werden, sind jedoch erheblich. Der Test muß extrem einfach, kostengünstig, unempfindlich sein und eine Verwendung mit stark variierenden Gesamtblutvolumina erlauben. Eine Blutentnahme ist in einer häuslichen Umgebung im allgemeinen auf die "Fingerstick" Methode beschränkt (wobei ein Finger durch eine kleine Nadel, die auf einer Vorrichtung unter Federspannung befestigt ist, angestochen wird), die relativ unkontrollierte Gesamtblutvolumina von im allgemeinen von 5 bis 30 ul erzeugt. Zusätzlich wäre es wünschenswert, wenn der Blutkoagulationstest bei Raumtemperaturen durchgeführt werden könnte, wodurch die Notwendigkeit für komplizierte Temperatursteuervorrichtungen beseitigt würde.
Für andere chemische Substanzen wie etwa Cholesterol und Glucose sind Bluttests für den Hausgebrauch erfolgreich entwickelt worden. Unter den gebräuchlichsten Vorrichtungen für den Hausgebrauch sind "Teststreifen", umfassend eine Schicht aus absorbierendem Material mit geeignet imprägnierten Bereichen um eine gewünschte Analyse durchzuführen. Beispielsweise beruht ein Teststreifen zur Durchführung einer Blutglucoseanalyse, erhältlich von Lifescan, Inc., Milpitas, Kalifornien, auf dem Auftragen eines Bluttropfens auf eine Polyamidmembran mit imprägnierten Reagenzien, die in Reaktion auf die Glucosekonzentration im aufgetragenen Blut eine farberzeugende Reaktion hervorrufen. Für die Messung des Blutkoagulationsvermögens sind keine entsprechenden Testvorrichtungen entwickelt worden. Obwohl bestimmte Testvorrichtungen zur Koagulationsmessung vorgeschlagen worden sind, verwenden sogar die einfachsten davon mehrere Schichten, auf die zuvor abgemessene Blutvolumina aufgetragen werden müssen. Diese Tests werden im allgemeinen in einer klinischen Umgebung durchgeführt.
Die Natur der Blutkoagulationswege macht das Leistungsvermögen von Teststreifen für Koagulationsassays mit einer einzigen Schicht problematisch. Die Blutkoagulation umfaßt eine Reihe komplizierter und ungenügend verstandener enzymatischer Reaktionen, die gegenüber Oberfläche-Grenzfläche Wirkungen empfindlich sind. Zusätzlich kann ein Kontakt von Blut mit bestimmten Materialien die zur Induktion der Koagulationswege erforderlichen Enzyme inaktivieren. Somit haben die meisten bisherigen Koagulationsassays Behälter mit minimaler Oberfläche verwendet um die Wahrscheinlichkeit einer unbeabsichtigten Aktivierung oder Inhibition des Koagulationswegs zu verringern. Im Gegensatz dazu werden Teststreifenassays im allgemeinen in hochgradig porösen Materialien mit sehr großen Oberflächen durchgeführt. Derartige Teststreifenmembranen wären somit im allgemeinen zur Verwendung in Blutkoagulationstests kontraindiziert.
Aus den vorstehenden Gründen wäre es wünschenswert, vereinfachte Testvorrichtungen und Methoden zur Messung des Koagulationsvermögens eines Patienten bereitzustellen. Die Testvorrichtungen und -methoden sollten ausreichend einfach und zuverlässig sein um eine Durchführung der Tests durch Laien, insbesondere die Patienten selbst, zu Hause zu ermöglichen. Bevorzugt sollten die Tests nur einen einzigen Schritt erfordern, wie etwa das Auftragen eines Bluttropfens auf eine Testvorrichtung, gefolgt von automatisierter Auslesung der Testergebnisse. Der Test sollte gegenüber Variationen der Blutprobenvolumina unempfindlich sein und sollte bei minimaler oder keiner Temperatursteuerung leistungsfähig sein. Insbesondere wäre es wünschenswert, Testvorrichtungen und -methoden bereitzustellen, die einen porösen Membranteststreifen verwenden, wobei der Teststreifen im wesentlichen keine Wirkung auf den zu messenden Blutkoagulationsweg hat.

2. Beschreibung des bekannten Standes der Technik

Zur Verwendung in Koagulationsassays geeignete Thrombinsubstrate sind in den US-Patenten Nrn. 3,884,896 und 4,640,893 beschrieben. Thromboplastin in Tablettenform mit verbesserter Stabilität aufgrund von Calciumabtrennung ist in US- Patent Nr. 4,755,461 beschrieben. Ein Trockenreagenz, bestehend aus Thromboplastin und einem Thrombinsubstrat, welches für Koagulationstests in Flüssigphase geeignet ist, ist in US-Patent Nr. 4,458,015 beschrieben.
In US-Patent Nr. 4,935,346 ist ein Assaysystem zur Glucosemessung in Blut beschrieben, welches aus einer inerten porösen Matrix besteht, die mit Reagenzien imprägniert ist, welche eine lichtabsorbierende Reaktion erzeugen. Auf einer Seite der Matrix wird eine Blutprobe aufgebracht und das Reflexionsvermögen auf der gegenüberliegenden Seite gemessen. Die in diesem System verwendete Membran neigt zum Aufbrechen (Lyse) von roten Zellen. Dies führt zu einem Eindringen hoher Haemoglobinkonzentrationen in das Innere der Membran, und auf der gegenüberliegenden Seite der Matrix können hohe Haemoglobinkonzentrationen beobachtet werden. Das Patent '346 lehrt, daß für Analyten wie etwa Glucose diese Wirkung überwunden werden kann, indem eine besondere Chemie eingesetzt wird, welche ein optisches Signal mit spektralen Eigenschaften erzeugt, welche von dem dominierenden Spektrum dieses freigesetzten Haemoglobins unterschieden werden können, und die Ergebnisse mit zweifach-Wellenlängen Optik ausgelesen werden, die gegen das Haemoglobin-Spektrum korrigiert. Ein derartiger Ansatz würde für die sehr delikate und Haemoglobin-empfindliche Thrombinsubstrat-Koagulationschemie nicht funktionieren. Ein anderes Assaysystem, das zur Messung von Blutglucose, Cholesterin und Harnstoff geeignet ist, ist in US-Patent Nr. 4,774,192 beschrieben. Die erforderlichen Reagenzien sind in einer Struktur wie etwa einer porösen Membran oder einer absorbierenden Folie imprägniert, die eine asymmetrische Membran sein kann. Das Patent '192 schlägt auch die Verwendung von Fließsteuermitteln zur Steuerung der Probenverteilung in der Struktur vor.
Die US-Patente Nrn. 4,861,712, 4,910,510 und 5,059,525 beschreiben mehrschichtige Testvorrichtungen, die zur Überwachung der Blutkoagulation geeignet sind. Das Patent '712 beschreibt eine komplizierte Struktur, die aus einem faserförmigen Material besteht, und ein wasserlösliches nicht-ionisches Polymer, welches das faserförmige Material überzieht und imprägniert. Diese Struktur kann Thromboplastin und ein nachweisbares Thrombinsubstrat enthalten und ist zur Überwachung einer Reihe von Blutkoagulationsparametern einschließlich der Prothrombin-Zeit geeignet.
Das Patent '525 beschreibt ein kompliziertes Trockenreagenz für Blutkoagulationstests, das ein Trägermaterial enthält, und darin getrocknet: eine gegenüber Prothrombin (oder den Faktoren VII-X) reaktive Protease, ein farberzeugendes Proteasesubstrat, einen Puffer und einen zweiten Koagulationsfaktor. Die Aufnahme einer Protease in das Trockenreagenz ist nützlich zur Durchführung von Assays auf Koagulationsfaktoren wie etwa Faktor X, die zunächst durch proteolytische Spaltung aktiviert werden müssen, bevor ihre enzymatische Aktivität gemessen werden kann.
US-Patent Nr. 4,756,884 beschriebt eine Kapillarflußvorrichtung zur Messung von charakteristischen Bluteigenschaften einschließlich der Prothrombin-Zeit.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Testvorrichtungen und -methoden zur Durchführung von Blutkoagulationsassays unter Verwendung vereinfachter Protokolle und Formate bereitgestellt. Die Testvorrichtungen umfassen eine permeable Membran, die mit einem Koagulationsinitiator imprägniert ist, welcher fähig ist, entweder einen extrinsischen oder intrinsischen Koagulationsweg zu initiieren, und ein Substrat, das bei Aktivierung einer vorab ausgewählten Komponente des Koagulationswegs, der initiiert worden ist, ein nachweisbares Signal erzeugt. Die Membran ist derart ausgewählt, so daß sie für Blutzellen nicht lysierend ist, und daß sie fähig ist, diese intakten roten Zellen von mindestens dem Bereich des Membraninneren unmittelbar unterhalb der optischen Betrachtungsoberflächenseite der Membran, welcher der Probenauftragungsseite gegenüber liegt, auszuschließen. Zusätzlich muß die Membran im wesentlichen frei von Beeinflussung von Initiation und Fortsetzung des Koagulationswegs sein, insbesondere frei von Oberflächenwechselwirkung(en) mit Enzymen und anderen Komponenten des Wegs, die zu Inaktivierung oder Fehlaktivierung des Wegs führen können. Derartige Membranen können aus Materialien zusammengesetzt sein, die an sich frei von derartigen Oberflächen (Wechselwirkungen) sind, oder sie können aus anderen Materialien zusammengesetzt sein, die mit Proteinen oder anderen Substanzen überzogen oder blockiert sind, welche die unerwünschte(n) Oberflächenwechselwirkung(en) verringern. Eine bevorzugte Membran ist aus Polysulfon zusammengesetzt, insbesondere ist sie eine asymmetrische Polysulfonmembran.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Blutvolumen auf eine Seite der permeablen Membran aufgetragen, wo es in der Gegenwart des Koagulationsinitiators und Substrats in das Membraninnere absorbiert wird. Eine Blutkoagulation wird somit initiiert, und die Erzeugung der vorab ausgewählten Komponente des Koagulationswegs verursacht eine Aktivierung des Substrats, wobei das nachweisbare Signal, üblicherweise auf der gegenüberliegenden Seite der Membran, erzeugt wird. Die Porenabmessungen der Membran sind derart ausgewählt, daß die roten Blutzellen (Erythrozyten) der Probe an oder in Nähe der Auftragungsseite gehalten werden und nicht in den Bereich des Inneren eindringen, welcher direkt unterhalb der Beobachtungsseite der Membran liegt, wo sie die Erzeugung des nachweisbaren Signals beeinträchtigen könnten. Darüberhinaus ist das Absorptionsvolumen der Membran derart ausgewählt, daß es ein relativ geringes Volumen des abgetrennten Blutplasmas aufnimmt, wobei das überschüssige Gesamtblut auf der Auftrageoberfläche bleibt. Auf diese Weise kann die Testvorrichtung sogar an sehr kleine Testvolumina angepaßt sein, und die tatsächliche, auf die Testvorrichtung aufgetragene Menge an Blutprobe ist unkritisch.
Die Testergebnisse werden typischerweise von einem automatisierten Detektor oder Testsystem ausgelesen, der bzw. das bei einem fluoreszierenden nachweisbaren Signal typischerweise ein Fluorometer umfaßt. Der automatisierte Detektor wird üblicherweise Steuerschalttechnik umfassen, die eine Zeitmeßvorrichtung umfaßt, um den Nachweis zu einem geeigneten Testzeitpunkt oder über einen geeigneten Testzeitraum zu ermöglichen, und Mittel zur Berechnung des Koagulations"werts". Üblicherweise wird die Steuerschalttechnik ein Temperatursteuermittel zum Halten der Probe bei einer vorbestimmten Temperatur umfassen. Alternativ kann der automatisierte Detektor Temperatur-kompensiert sein, wobei der ursprünglich ermittelte Koagulations"Wert" nach oben oder unten eingestellt wird, um Variationen der Probentemperatur zu kompensieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines Beispiels einer Ausführungsform einer Testvorrichtung, welche gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung konstruiert worden ist.
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm eines Testsystems, das zur Auslesung von Ergebnissen aus der Testvorrichtung bei Verwendung in einem Blutkoagulationstest geeignet ist, der gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
Fig. 3 ist das Ergebnis eines Experiments unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Testvorrichtung und des in Fig. 2 gezeigten Testsystems. In diesem Experiment wurde eine Gesamtblutprobe mit einer normalen Prothrombin-Zeit mit einer Gesamtblutprobe mit einer geringfügig verlängerten Prothrombin-Zeit und einer Gesamtblutprobe mit einer stark verlängerten Prothrombin-Zeit verglichen.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Die erfindungsgemäßen Testvorrichtungen umfassen eine poröse Membran, die in einer Form vorliegt, welche zum Auftragen von Blut, typischerweise in kleinen Volumina von 3 ul bis 50 ul, üblicherweise von 5 ul bis 30 ul, und zum Nachweis eines sichtbaren Signals auf der Membranoberfläche, typischerweise auf einer gegenüberliegenden Seite der Membran, geeignet ist. Die Membran kann zu einem Blatt, einem Streifen, einer Scheibe, einem Band (Rolle) oder dergleichen geformt sein, und eine einzelne Membran kann für einen oder mehrere Tests verwendet werden. Bei Verwendung für mehrere Tests werden die Blutproben typischerweise entweder gleichzeitig oder nacheinander punktweise auf verschiedene Stellen aufgetragen. Die Membran wird typischerweise sehr dünn sein, üblicherweise eine Schichtdicke von 0,1 mm bis 0,3 mm aufweisen, um das Blutplasmavolumen, das zum Erreichen von Sättigung erforderlich ist, zu begrenzen. Überschüssiges Blut wird auf der Membranoberfläche, auf die es aufgetragen worden ist, gehalten, wobei nur ein gewünschtes Plasmavolumen, typischerweise im Bereich von 0,5 ul bis 2 ul, in das Membraninnere eindringt. Nachdem die Membran oder ein ausgewählter Bereich davon gesättigt worden ist, werden die Blutproteine und Testreagenzien relativ langsam diffundieren, wobei die Durchführung des Testprotokolls, wie nachstehend ausführlich beschrieben, ermöglicht wird.
Eine Beispielstestvorrichtung 10, die gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung konstruiert ist, ist in Fig. 1 gezeigt. Die Testvorrichtung 10 umfaßt eine poröse Membranstruktur 12, welche auf einer Trägerstruktur 14, typischerweise einem Handgriff, um Handhabung der Testvorrichtung durch den Benutzer zu ermöglichen, befestigt ist. Die Testvorrichtung 10 wird verwendet, indem ein nicht- gemessener Bluttropfen auf eine Auftrageseite 16 der porösen Membran 12 aufgetragen wird. Mindestens ein Teil des Blutplasmas wird in die Membran 12 absorbiert und infolge von Koagulation, welche wie nachstehend beschrieben innerhalb der Membran initiiert wird, wird ein nachweisbares Signal auf einer Indikatorseite 18 der Membran erzeugt, wobei die Indikatorseite typischerweise der Auftrageseite 16 gegenüberliegt. Das auf der Indikatorseite 18 erzeugte nachweisbare Signal wird durch den Handgriff 14 sichtbar sein, wobei der Handgriff transparent ist, mit einer geeigneten Sichtöffnung (nicht gezeigt) oder dergleichen. Beobachtung des nachweisbaren Signals gestattet kontinuierliche Bewertung der Koagulationsreaktion und Bestimmung des Koagulationsvermögens der Blutprobe.
Die poröse Membranstruktur 12 wird aus einem hydrophilen (saugfähigen) nicht- schwellfähigen Polymermatrix-Material mit Porenabmessungen, welche den Eintritt von Blutplasma und Proteinen gestatten, während Blutzellen, insbesondere rote Blutzellen (Erythrozyten) ausgeschlossen werden, zusammengesetzt sein. Die Membran sollte aus einem einzigen, kontinuierlichen Polymermaterial mit einer schaumartigen Struktur, bestehend aus einem verschlungenem Netzwerk von Kanälen mit Weiten in der Größenordnung von Mikrometern (um), zusammengesetzt sein. Das verschlungene Kanalnetzwerk ist in dem Sinne "dicht gepackt", daß das "Leervolumen", das von dem Leerraum der Kanäle eingenommen wird, einen erheblichen Anteil des Membrangesamtvolumens ausmacht, typischerweise 10% oder darüber. Da die gesamte Reaktionschemie und die nachfolgende Signalerzeugung im Leervolumen stattfindet, ist zur Erzeugung eines starken Signals ein hohes Leervolumen erwünscht. Ein verschlungenes Kanalnetzwerk ist gegenüber geraden und direkten Poren (wie etwa den kurzen, direkten Poren, die mit Nucleopore-Membranen erhalten werden) bevorzugt, da größere mittlere Kanallängen tendentiell eine zunehmende Isolation zwischen der Membranzone, in der die Reaktionschemie abläuft, und der überschüssigen, auf der Membranoberfläche verbleibenden Probe, erzeugen. Dies trägt dazu bei, das System unempfindlicher gegenüber Variationen des aufgetragenen Probenvolumes zu machen.
Wie nachstehend ausführlich diskutiert, wird die poröse Membranstruktur 12 mit Reagenzien imprägniert werden, die notwendig sind um in Blutplasma, welches in das Innere der porösen Matrix eindringt, eine Koagulation zu induzieren und ein nachweisbares Signal als einen Hinweis auf das Koagulationsvermögen des Blutes zu erzeugen. Es ist für die vorliegende Erfindung besonders kritisch, daß das Polymermatrix-Material der porösen Membran 12 im wesentlichen frei von Beeinflussung des Koagulationswegs ist, der induziert wird. Insbesondere sollte das Polymermatrix-Material frei sein von Oberflächeneffekten, Wechselwirkungen und Artefakten, welche Koagulation induzieren oder Komponenten des initiierten Wegs, wie etwa Enzyme, inaktivieren könnten. Eine unbeabsichtigte Initiierung eines Koagulationswegs könnte zu falsch positiven Bestimmungen führen, während Enzyminaktivierung zu falsch negativen Bestimmungen führen könnte. Es ist daher von Bedeutung, daß das Polymermatrix-Material keine fördernde oder beeinträchtigende Wirkung auf die innerhalb der Membran stattfindenden Koagulationsreaktionen hat.
Die nachfolgenden Kriterien können für die Bestimmung verwendet werden, ob eine Membran zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Testvorrichtungen und -verfahren akzeptabel ist:
A: Die Membran muß eine Porengeometrie und -größenverteilung aufweisen, welche ein Durchdringen von roten Blutzellen zur gegenüberliegenden Seite der Membran ausschließen.
B: Die Membran muß hydrophil sein (oder behandelt sein, so daß sie hydrophil ist), so daß Plasma aus einer Blutprobe innerhalb weniger Sekunden, bevorzugt innerhalb 1-2 Sekunden durch die Membran wandern kann.
C: Die Membran muß entweder mit Blutzellen kompatibel sein (oder behandelt sein, so daß sie mit Blutzellen kompatibel wird), so daß Gesamtblut, das auf die Membran aufgetragen wird, nicht lysiert. Weiterhin muß die Membran eine ausreichende Fähigkeit zur Abtrennung von Blutzellen aus Plasma aufweisen, so daß nur Plasma, das frei von roten Zellen und Haemoglobin ist, zu der Membranseite gegenüber der Probenauftrageseite durchdringt. Diese Fähigkeit, von roten Zellen freies und Haemoglobin freies Plasma zu erzeugen, muß über einen geeigneten Bereich von Haematokritwerten, mindestens über einen Haematokrit-Bereich von 30 bis 55% bestehen.
D: Die Membran muß ausreichend koagulationsneutral sein (oder behandelt sein, so daß sie koagulationsneutral wird), so daß der Ablauf eines extrinsischen (oder intrinsischen) Koagulationswegs möglich ist. Dies kann experimentell bestimmt werden durch Permeation der Membran mit einem Reaktionsgemisch (im experimentellen Abschnitt beschrieben), Trocknen und danach Reaktivieren mit einer Probe Gesamtblut oder Plasma. Viele Membranen (Dominic-Hunter Asypor, Pall Corporation Biodyne "C", etc.) löschen die extrinsischen (oder intrinsischen) Koagulationswege vollkommen aus. Die Membran muß ausreichend koagulationsneutral sein, so daß ermöglicht wird, daß sowohl normales Plasma als auch Plasma, das an einem Faktor des extrinsischen Koagulationswegs (oder intrinsischen Koagulationswegs) defizient ist, erfolgreich reagiert und klinisch genaue Ergebnisse erzeugt.
E: Die Membran muß Volumentoleranz bereitstellen (oder behandelt sein, so daß sie Volumentoleranz bereitstellt), so daß sie bei Behandlung mit variierenden Gesamtblutvolumina in einem Mengenbereich von grob etwa 5 bis 30 Mikrolitern im wesentlichen ähnliche Ergebnisse liefert.
F: Die optischen Eigenschaften der Membran müssen mit den im Assay verwendeten Beobachtungswellenlängen kompatibel sein. Beispielsweise darf die intrinsische Fluoreszenz der Membran die Fluoreszenz des in der Reaktion verwendeten Thrombinsubstrats nicht dominieren.
G: Die Membran muß im nassen und trockenen Zustand ausreichend dimensionsstabil sein, um normaler Verarbeitung während der Herstellung standzuhalten, und um Abfälschung von Testergebnissen während des Reaktionsverlaufs zu vermeiden.
Wie im experimentellen Abschnitt ausführlicher diskutiert werden wird, erfüllen sehr wenige Membrantypen all diese Kriterien. Als ein Beispiel bestehen Polyamidmembranen, wie etwa die Pall Corporation Biodyne "A", "B" und "C" Serien, Test C nicht. Negativ geladene Polyamidmembranen, wie etwa Biodyne "C", bestehen sowohl Test C als auch D nicht. Asymmetrische Porenmembranen auf Cellulose-Basis, wie etwa die von Dominic-Hunter hergestellte Asypor-Serie, bestehen Test D nicht. Glasfaser-Filtermaterialien, wie etwa Schleicher & Schuell 34G, bestehen Test E nicht. Ein unbehandelter Membrantyp, von dem festgestellt wurde, daß er all diese Kriterien erfüllt, ist eine asymmetrische Polysulfonmembran, wie etwa die asymmetrische Polysulfonmembran BTS-25 0,45 um, erhältlich von Filterite/Memtech. Unter Verwendung der vorstehenden Kriterien könnten jedoch andere geeignete Membranen identifiziert werden.
Eine Vielzahl anderer Membranmaterialien kann ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die Membranen werden behandelt, so daß sie bestimmte der vorstehend angegebenen Kriterien erfüllen. Wenn beispielsweise eine Verwendung mit Plasmaproben anstatt mit Gesamtblutproben erwünscht ist, können Polyamide blockiert werden, wobei Koagulationsneutralität wie vorstehend definiert verbessert wird. Typischerweise kann ein solches Blockieren durch Präinkubation der Membran mit einer geeigneten Proteinlösung vor oder gleichzeitig mit dem Einbringen der restlichen Reagenzien erreicht werden.
Die Porenabmessungen der Polymermatrix werden derart ausgewählt, so daß sie die Absorption des Blutplasmas und von Proteinen aus der aufgetragenen Blutprobe ermöglichen, während die zellulären Blutkomponenten, insbesondere die roten Blutzellen, von denen festgestellt wurde, daß sie die Chemie für den Nachweis von Koagulation stören, ausgeschlossen werden. Porenabmessungen der Matrix werden im allgemeinen im Bereich von 0,05 um bis 5 um liegen, typischerweise im Bereich von 0,1 um bis 1,0 um liegen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Porenabmessungen asymmetrisch angeordnet, wobei größere Poren an der Auftrageseite 16 der Membranstruktur 12 angeordnet sind und kleinere Poren an der Indikatorseite 18 angeordnet sind. Eine derartige asymmetrische Porengrößenverteilung ist günstig, da sie die Gegenwart größerer Poren auf der Grenzfläche, auf der das Blut aufgetragen wird, gestattet, was ein schnelles Eindringen des Blutes in die Membran erleichtert. Kleinere Poren auf der gegenüberliegenden Seite der Membran trennen jedoch rote Zellen von Plasma ab und präsentieren der optischen Nachweisvorrichtung ein von roten Blutzellen und Haemoglobin freies Plasma. Bevorzugt liegen die Porenabmessungen auf der Auftrageseite 16 der Membranstruktur 12 im Bereich von 2 um bis 50 um, und liegen auf der Indikatorseite 18 im Bereich von 0,1 um bis 1,0 um.
Das Polymermatrix-Material ist nicht schwellfähig. Das bedeutet, daß sich die Matrix bei Aussetzen einer wässrigen Lösung, wie etwa Blutplasma, üblicherweise nicht wesentlich verformt und somit ihre ursprüngliche Gestalt und Größe beibehält. Typischerweise beträgt die Volumenänderung der porösen Membranstruktur 12 bei Aussetzen an Blutplasma oder anderen wässrigen Medien kleiner 20%, bevorzugt kleiner 10%.
Ein besonders bevorzugtes Polymermatrix-Material, das all die vorstehenden Erfordernisse erfüllt, ist ein 0,45 um asymmetrisches Polysulfonmembran-Material, das von Filterite-Memtec, Memtec America, 9690 Deeveco Road, Ste. 7, Timomium, MD 21093, erhältlich ist. Das bevorzugte Material ist Katalognummer BTS-25 Medium.
Chemische Reagenzien, die für die Durchführung der Blutkoagulationsassays der vorliegenden Erfindung notwendig sind, werden in das gerade beschriebene Polymermatrix-Material imprägniert. Notwendige Reagenzien umfassen einen Koagulationsinitiator, der ein vorbestimmtes Ereignis oder Stadium in entweder einem extrinsischen oder intrinsischen Koagulationsweg initiiert, und ein Substrat, das durch eine in einem späteren Stadium des Koagulationswegs erzeugte Komponente aktiviert wird. Es wird auch ein Puffer bereitgestellt werden, um den Test-pH innerhalb eines mit dem Koagulationsweg kompatiblen Bereichs zu halten, und optionale Reagenzien umfassen Fließsteuermittel, welche eine chromatographische Auftrennung von Blutproteinen, die in die Membran eindringen, vermindern, Cofaktoren, welche die chemischen Reaktionen des Koagulationswegs aufrecht halten oder verstärken, Stabilitätsverbesserer und Pigmente, welche die optischen Eigenschaften der Testvorrichtung verstärken. Typischerweise werden diese Reagenzien in einer oder mehreren wässrigen Lösungen (die weiterhin das bzw. die vorstehend beschriebenen Mittel zum Blockieren der Membran enthalten können) kombiniert, die auf das gesamte Polymermatrix-Material oder einen Abschnitt davon aufgetragen werden. Das Matrixmaterial kann danach getrocknet oder lyophilisiert werden (und gegebenenfalls auf dem Handgriff 14 befestigt werden), wobei eine Testvorrichtung mit den Reagenzien nicht-kovalent darin adsorbiert gebildet wird. Manchmal kann es möglich sein, mindestens manche der Reagenzien kovalent zu binden, obwohl eine kovalente Bindung üblicherweise nicht notwendig sein wird.
Die derart hergestellte Testvorrichtung kann sofort verwendet werden oder für eine spätere Verwendung gelagert werden. Die absorbierten Reagenzien werden rekonstituiert durch Auftragen der Blutprobe, was ein Eindringen von Blutplasma in das Innere der porösen Membranmatrix und eine Benetzung der Reagenzien verursacht.
Es kann eine Vielzahl geeigneter Koagulationsinitiatoren verwendet werden. Diese Initiatoren lösen den Koagulationsweg an Standardpunkten, die üblicherweise für medizinische Tests verwendet werden, aus. Beispielsweise wird der Initiator für den extrinsischen Koagulationsweg mit Faktor VII und Calcium kombinieren, wobei Faktor X aktiviert wird. Der Initiator für den intrinsischen Koagulationsweg wird Faktor XII aktivieren, der wiederum Faktor XI aktiviert. Geeignete Initiatoren für den extrinsischen Koagulationsweg sind in der Technik gut bekannt und umfassen Thromboplastin und dergleichen. Geeignete Initiatoren für den intrinsischen Koagulationsweg sind in der Technik ebenfalls gut bekannt und umfassen Ellagsäure, Kaolin, Siliziumoxid und dergleichen. Eine Beschreibung dieser und anderer Initiatoren findet sich in Laboratory Evaluation of Hemostasis and Thrombosis (dritte Auflage), 1983, Marjorie S. Sirridge und Reaner Shannon, Lea & Febiger, Philadelphia, und Hemosfasis and Thrombosis, a conceptual approach (zweite Auflage), 1983, Jack Hirsh und Elizabeth Brain, Churchill Livingstone, New York.
Der ausgewählte Koagulationsinitiator wird in einer ausreichenden Menge auf die Matrix aufgebracht um in dem erwarteten Blutplasmavolumen Koagulation zu initiieren. Beispielsweise wird eine geeignete Menge an Thromboplastin ausreichend sein um bei Rekonstitution im Blutplasma eine Konzentration im Bereich von 100 mg/l bis 10 g/l bereitzustellen.
Geeignete Substrate zur Überwachung der Koagulationsreaktion umfassen bestimmte derivatisierte Peptide, die durch das Thrombin, das sowohl im extrinsischen als auch im intrinsischen Koagulationsweg als Schlußereignis erzeugt wird, aktiviert werden. Die Peptide sind abspaltbar an ein Reportermolekül gebunden, wie etwa ein farberzeugendes, chemilumineszentes oder Fluoreszenz-erzeugendes Molekül. Thrombin ist fähig, das Peptid zu erkennen, den spaltbaren Linker zu spalten und eine Veränderung der optischen Eigenschaften des Reportermoleküls zu erzeugen, welche ein nachweisbares Signal wie etwa eine Farbänderung, Lichtemission oder Fluoreszenz zur Folge hat. Zahlreiche geeignete Thrombinsubstratpeptide sind in den US-Patenten Nrn. 3,884,896, 4,070,245 und 4,169,051 beschrieben.
Diese Substratpeptide haben im allgemeinen (aber nicht immer) die Form B-X-Y-Arg- NH-R, worin B eine Blockiergruppe ist, X-Y ein Dipeptid ist (häufig Val-Pro, Gly-Pro, Phe-Val, etc.), und R ein Reportermolekül ist, das über eine hydrolisierbare NH- Bindung an das Peptid gebunden ist. Typischerweise ändert R dessen optischen Zustand nachdem die NH-Bindung durch Thrombin hydrolisiert worden ist. Ein Beispiel für ein Substratpeptid ist N-t-Boc-Val-Pro-Arg, das an ein 7-Amido-4- methylcumarin-Reportermolekül gebunden ist. Dieses Substrat ist von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, kommerziell erhältlich.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung Fluoreszenz-erzeugender Moleküle, wie etwa 7-Amido-4-methylcumann, Rhodamin 110, Aminochinolinen, Aminonaphthalinen, Benzofurazanen, Akridinen und dergleichen. Das Polymermatrix-Material der in der vorliegenden Erfindung verwendeten porösen Membranen ist typischerweise sehr dünn, üblicherweise im Bereich von 0,1 bis 0,3 mm, wie vorstehend beschrieben, was bei Verwendung vieler farberzeugender Substrate einen unzureichenden optischen Weg definiert um ein klares Farbsignal bereitzustellen. Um die Farbe, die sich entwickelt hat, auf ein zum Nachweis ausreichendes Niveau zu erhöhen, ist es bei farberzeugenden Substraten häufig notwendig, die Konzentration des Substrats innerhalb der Membran auf unphysiologische Werte zu erhöhen. Derart hohe Substratkonzentrationen, typischerweise von 10&supmin;&sup4; M und darüber, sind signifikant höher als die Konzentration des normalen Fibrinogensubstrats für Thrombin, und neigen dazu, die Koagulationswege zu stören. Zusätzlich benötigen derart hohe Substratkonzentrationen einen erheblichen Zeitraum für eine vollständige Umsetzung durch das Thrombinenzym. Diese Wirkungen verschlechtern tendentiell den klinischen Nutzen des Assays. Diese Wirkungen können vermieden werden, und bessere Ergebnisse können erhalten werden, indem man Substratkonzentrationen unterhalb 10&supmin;&sup4; M verwendet. Es wurde herausgefunden, daß bei Verwendung fluoreszierender Reportermoleküle mit Substratkonzentrationen unterhalb 10&supmin;&sup4; M, typischerweise von lediglich 10&supmin;&sup5; M und darunter, starke Signale erhalten werden können.
Innerhalb des Polymermatrix-Materials wird ein Puffer imprägniert werden, um einen pH-Wert bereitzustellen, welcher mit dem Koagulationsweg kompatibel ist. Besonders geeignet sind Tris-Puffer mit einem pH-Wert, der in Abhängigkeit von der Matrix von etwa 7 bis 8 variiert. Für das bevorzugte asymmetrische Polysulfon- Membranmaterial und den extrinsischen Weg ist ein Puffer, der den pH-Wert bei etwa 7,5 hält, bevorzugt.
Koagulationscofaktoren wie etwa Calcium können verwendet werden um den Koagulationsweg aufrecht zu halten. Insbesondere kann es notwendig sein, Calcium wie etwa in der Form von Calciumchlorid zu verwenden, wenn Blutproben getestet werden, die zuvor einer gerinnungshemmenden Behandlung mit einem Calciumchelator unterzogen worden waren. Falls Calcium erforderlich sein sollte, können die Stabilitätseigenschaften des Reagenzes verbessert werden, indem es von dem Thromboplastin innerhalb der Membran isoliert wird, entweder durch physikalische Abtrennung oder durch Mikroeinkapselung.
Fließsteuermittel können ebenfalls innerhalb der Membran imprägniert sein um die Viskosität des Blutplasmas zu erhöhen und eine chromatographische Auftrennung der Reaktionskomponenten zu begrenzen. Geeignete Fließsteuermittel umfassen Polymere mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Hydroxypropylcellulose, Polyvinylalkohol und dergleichen. Zusätzlich kann der Einbau von Pigmenten innerhalb der Matrix die Emission von Fluoreszenzlicht verstärken. Geeignete Pigmente umfassen kleine, lichtstreuende Teilchen eines Materials, das den Koagulationsweg nicht stört. Es wurde herausgefunden, daß ein geeignetes Pigment aus Styrol-Acryl Copolymerteilchen zusammengesetzt ist, erhältlich von Rohm & Haas Company, Philadelphia, PA, unter der Handelsbezeichnung RopaqueTM OP-84.
Beispielhafte Mengen der verschiedenen Reagenzien, die in einem Abschnitt des Polymermatrix-Materials imprägniert sind, welcher für die Durchführung eines einzigen Prothrombin-Zeit Assays vorgesehen ist, sind wie folgt. Einbau von Reagenzien
Bei Verwendung wird eine Blutprobe mit einem Volumen von etwa 5 bis 30 ul, die typischerweise mittels einer Fingerstickvorrichtung erhalten wurde, auf die Auftrageseite 16 der porösen Membranstruktur 12 aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wird die Testvorrichtung 10 in ein automatisiertes Nachweis- oder Testsystem 20 (Fig. 2) zum Auslesen der Ergebnisse des Koagulationsassays eingebracht werden. Ein zur Verwendung mit einer fluoreszierenden Testvorrichtung 10 geeignetes Testsystem 20 umfaßt eine Lichtquelle 21, ein Filterelement 24 und einen Lichtdetektor 26. Die Lichtquelle 21 erzeugt Licht 22 einer geeigneten Anregungswellenlänge, um im aktivierten fluoreszierenden Reportermolekül des Substrats Fluoreszenz zu induzieren. Fluoreszenz resultiert in emittiertem Licht 23, welches durch Filter 24 hindurch geht, der für ein geeignetes, bei der Emissionswellenlänge zentriertes Band selektiv ist, wobei das durch den Filter hindurch gegangene Licht 25 von Detektor 26 detektiert wird. Für die offenbarten Beispiele unter Verwendung von 4-Amido-7-methylcumarin als dem Reportermolekül beträgt die Anregungswellenlänge typischerweise 365 nm, während die Detektionswellenlänge 450 nm beträgt. Alternative fluoreszierende Reportermoleküle mit längeren Anregungs- und Emissionswellenlängen sind jedoch möglich. Im allgemeinen sind längere Wellenlängen bevorzugt, da die Kosten der Lichtquelle niedriger sind und die Detektionseffizienz verbessert werden kann. Das Testsystem 20 umfaßt weiterhin Steuerschalttechnik 28, welche die von Detektor 26 über den Zeitraum detektierte Lichtmenge analysiert, gemäß einem gewünschten Koagulationstestprotokoll, wie etwa dem Prothrombin-Test (PT), dem aktivierten partiellen Thromboplastin-Test (APTT) und dergleichen. Üblicherweise wird die Steuerschalttechnik 28 eine Zeitmeßvorrichtung umfassen, welche manuell, oder infolge eines besonderen Ereignisses, wie etwa dem Auftragen von Blut auf die Membran 12, in Gang gesetzt werden kann. Gegebenenfalls kann die Steuerschalttechnik mit einer Fähigkeit zur Temperaturmessung ausgestattet sein, so daß Temperaturvariationen bei der Interpretation der Testergebnisse berücksichtigt werden können. Alternativ könnte das Testsystem 20 eine Temperatursteuerkammer umfassen, wobei das Blut bei einer bestimmten Temperatur, typischerweise 37ºC gehalten wird. Wenn eine Temperatursteuerkammer verwendet wird, ist es vorteilhaft, die Reagenzmembran auf einem transparenten Substratmaterial zu befestigen und dieses Substrat vor dem Auftragen der Probe auf die gewünschte Testtemperatur vorzuäquilibrieren. Dies erleichtert ein rasches Äquilibrieren der aufgetragenen Probe auf die gewünschte Temperatur. Gegebenenfalls kann eine Abdecklage auf die Oberseite der Probe gegeben werden um eine rasche Temperaturstabilisierung weiter zu erleichtern. Die Steuerschalttechnik wird weiter Rechenmittel wie etwa einen Mikroprozessor zur Berechnung des Koagulations"werts" des Blutes umfassen. Es sind eine Reihe von Algorithmen zur Berechnung einer Prothrombin-Zeit oder eines anderen Koagulationswerts möglich. Das Folgende ist ein Beispiel, das für einen Prothrombin-Zeit Test mit einer Dauer von vier Minuten optimiert ist, welcher für einen Betrieb bei Raumtemperatur (23ºC) ausgelegt ist, bei der Reaktionszeiten langsamer sind. Fluoreszenzdaten werden in einem Zeitintervall von 10 Sekunden gesammelt, d. h. F(0), F(10), F(20), ... F(240). Diese Matrix F(t) wird danach zur Korrektur von Unterschieden hinsichtlich der Hintergrundfluoreszenz und der Intensität zwischen verschiedenen Reagenzienchargen normalisiert. Der normalisierte Wert F'(t) wird wie folgt berechnet:
F'(t) = F(t) - F(20)/F(240) - F(20) (1)
Danach wird der Wert t, bei dem F'(t) zuerst 50% Maximum erreicht, durch lineare Interpolation zwischen den F'(t) Zeitpunkten bestimmt. Dieser wird mit T&sub5;&sub0; bezeichnet. Schließlich wird die Prothrombin-Zeit PT durch eine einfache Anpassung bestimmt
PT = IT²&sub5;&sub0; + nT&sub5;&sub0; + m (2)
wobei l, n und m experimentell bestimmt werden.
Wenn die Reaktion in einem Zustand konstanter Temperatur durchgeführt wird, ist keine Temperaturkorrektur erforderlich. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, wird die Temperatur des Reagenzes durch ein in der Nähe befestigtes Thermoelement bestimmt und die PT-Zeit entsprechend angepaßt. Es sind auch eine Reihe von Temperaturanpassungsalgorithmen möglich. Ein relativ einfacher ist:
PT&sub3;&sub7; = PTUmgebung - a(37-tempUmgebung) PT²Umgebung - b(37-tempumgebung)PTUmgebung - c(37-tem Pumgebung) (3)
worin TUmgebung die Temperatur des Reagenzstreifens (gemessen in Grad Celsius) ist, PT&sub3;&sub7; die Temperatur-kompensierte Prothrombin-Zeit (angepaßt an eine Referenztemperatur von 37ºC) ist, und PTUmgebung das aus Gleichung (2) erhaltene PT-Ergebnis ist. Die Parameter a, b und c werden experimentell bestimmt. Ausgeklügeltere Temperaturkorrekturen sind ebenfalls möglich. Polynomanpassungen höherer Ordnung können nach Wunsch sowohl in Gleichung (2) als auch (3) verwendet werden. Alternativ können die Koeffizienten in Gleichung (2) Temperatur-kompensiert werden.
Die nachfolgenden Beispiele werden zur Erläuterung, nicht als Einschränkung angegeben.

Experimenteller Teil

Allgemeine Methodik

Fluoreszenzaktivität wurde überwacht durch Beobachten der reagierten Membranen in einer Dunkelkammer, die mit einer 750 uW/cm² (bei 15 cm) langwelligen (365 nm) Ultraviolettlampe in einem Abstand von 30 cm von der Probe beleuchtet wurde. Alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur (23ºC) durchgeführt. Reaktionskinetiken wurden überwacht durch Abphotographieren der Proben zu definierten Zeitintervallen unter Verwendung einer Minolta Maxxum 5000 SLR 35 mm Kamera, die mit einem 50 mm Objektiv ausgestattet war. Zur Photographie wurde ASA 400 Kodak Gold Farbnegativfilm verwendet, der 1 oder 2 Sekunden bei Blende 5,6 belichtet wurde. Zur Kontrastverbesserung wurden manche Aufnahmen unter Verwendung eines Corion Corporation S40-450-R 450 nm Filters (40 nm Bandbreite) geschossen. Der Filter gestattet den Durchlaß der 460 nm Fluoreszenzemission des 7-Amido-4- methylcumarin Fluorophors, während fremde Wellenlängen verringert werden. Zeitmessung wurde manuell mit einer Stoppuhr durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben wurden alle Reagenzien von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erhalten. Instrumentierte Beobachtungen wurden unter Verwendung eines Prototyp-Instruments durchgeführt. Der optische Block verwendete einen Siemens BPW-34B Photodetektor, der unterhalb eines Corion Corporation S25-450-A 450 Nanometer Filters mit einer Bandbreite von 25 Nanometern befestigt war. Direkt oberhalb des Filters war ein Edmund Scientific 10 mm · 10 mm R32,601 Strahlteilungsprismawürfel befestigt. Das Reagenz wurde auf die Oberseite des Strahlteilers gegeben und von unten unter Verwendung von UV-Licht mit einer Wellenlänge von 365 nm beleuchtet. Die Ausgabe aus dem Photodetektor wurde durch einen Meßverstärker verstärkt (beschrieben auf Seite 89 des IC Users Casebook, 1988, von Joseph Car, Howard Samms & Company), mittels eines 12 Bit Analog-Digital-Wandlers digitalisiert, und auf einem IBM-kompatiblen Personal Computer aufgezeichnet. Temperatursteuerung (soweit durchgeführt) wurde durchgeführt unter Verwendung eines Fisher Model 147 Isotemp Trockenbades.
Mit Reagenzien durchtränkte Membranen wurden hergestellt durch Zugabe von flüssigem Reagenziengemisch zu der Membran in ausreichender Menge um einen exponierten Membranabschnitt vollständig zu sättigen. Überschüssiges Flüssigreagenz wurde danach entfernt und die gesättigte Membran 30 Minuten bei etwa 50ºC unter einem Heißluftgebläse luftgetrocknet. Die getrockneten Membranen wurden bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in einem luftdichten Behälter mit Silikagel-Trockenmittel gelagert.
Anfängliche Experimente zielten auf den Koagulationsneutralitätstest ab (Kriterium D, vorstehend diskutiert). Diese Studien verwendeten nur Plasma und wurden getestet unter Verwendung von 15 ul Proben Sigma C-7916 Level I Koagulationskontrolle (aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit und Prothrombin-Zeit innerhalb normaler Grenzen), Sigma C-8916 Level II Koagulationskontrolle (leicht erhöhte Werte für aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit und Prothrombin-Zeit), oder Sigma C-9916 Level III Koagulationskontrolle (stark erhöhte Werte für aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit und Prothrombin-Zeit). Spätere Experimente verwendeten zusätzlich zu den Plasma-Kontrollen Gesamtblut. Die Gesamtblutproben waren entweder frische, aus Fingerstick-Proben erhaltene Proben, die nicht gerinnungshemmend behandelt worden waren, oder mit Citrat gerinnungshemmend behandeltes venöses Blut, das unter 8 Stunden alt war und bis zur Verwendung gekühlt gehalten worden war. Das in diesen Experimenten verwendete Thromboplastin war Sigma T-0263 Kaninchenhirn-Thromboplastin in einer Konzentration von 20 mg/ml. Das verwendete Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin) war Sigma A-3294, Protease-freies Fraktion V Pulver. Das Thrombin-Substrat war N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumann, erhalten von Sigma. Die verwendete Hydroxypropylcellulose war Klucel®EF, erhalten von Aqualon Corporation.

Beispiel 1: Wirkung verschiedener Membranen auf die Prothrombin-Zeit Reaktion

Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
1200 ul 0,2 M Tris-Puffer, pH 8,3
600 ul Thromboplastin
100 ul 100 mM CaCl&sub2;
100 mg BSA
100 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg = 7-amido-4-methylcumarin
Aliquots (100 ul) des Reagenziengemisches wurden auf punktförmig fünf verschiedene Membranen wie folgt aufgetragen:
Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne "B" (Polyamid, derivatisiert mit quaternärem Ammonium)
Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne "C" (Polyamid, derivatisiert mit Carboxy) Dominic-Hunter 0,8 um Asypor asymmetrische Cellulosemembran
Whatman 3 MM Filterpapier
Schleicher & Schuell 593 Filterpapier
Whatman GF/C Glasfaser-Filterpapier
Die beschichteten Membranen wurden mit Kontrolle I Serum getestet, 10 Minuten reagieren gelassen und visuell beurteilt. Die Ergebnisse waren:

Membran Reaktion

Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne "B" + (heller Ring)
Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne "C" - (keine Reaktion)
Dominic-Hunter Asypor -
Whatman 3 MM Filterpapier -
Schleicher & Schuell 593 Filterpapier -
Whatman GF/C Glasfaser-Filterpapier + (heller Ring)
Das Whatman GF/C Glasfaser-Filterpapier diente als eine positive Kontrolle, da Glasfasermaterialien bekanntermaßen mit bestimmten Koagulationswegen kompatibel sind. Die Ergebnisse zeigten, daß viele Membranen unter diesen Bedingungen mit dem extrinsischen Koagulationsweg nicht kompatibel sind. Die Ergebnisse zeigten auch, daß die Fluoreszenzintensität auf den reaktiven Membranen in einem dünnen Ring konzentriert war, der mit der Lösungsmittelfront der aufgetragenen Probe zusammenfällt. Dies deutete darauf hin, daß unter diesen Bedingungen eine erhebliche Chromatographie des Thrombinsubstrats stattfindet. Dies ist unerwünscht, da eine ungleichförmige Fluoreszenzverteilung eine Interpretation von Reaktionskinetiken schwieriger macht.

Beispiel 2: Wirkung verschiedener Fließsteuermittef

Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
2000 ul 0,2 M Tris-Puffer, pH 8,3
1 ml Thromboplastin
150 ul 100 mM CaCl&sub2;
150 mg BSA
150 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Das Gemisch wurde in drei 1 ml Aliquots aufgeteilt. Zum ersten Aliquot wurde nichts zugegeben. Zum zweiten Aliquot wurden 50 mg Dextran mit hohem Molekulargewicht (Sigma D-5501, Molekulargewicht 5.000.000-40.000.000) zugegeben und zum dritten Aliquot wurden 50 mg Aqualon Klucel®EF (Hydroxypropylcellulose) zugegeben. Die drei Aliquots wurden gemischt bis sie vollständig aufgelöst waren und punktförmig auf 1,2 Micron Pall Corporation Biodyne B Membranen aufgetragen.
Die beschichteten Membranen wurden mit Kontrolle I Serum getestet und visuell beurteilt. Die Ergebnisse nach 10 Minuten waren:

Fließsteuermittel Reaktion

keines + (heller Ring)
Dextran - (keine Reaktion)
Klucel®EF + (heller gleichförmiger Kreis)
In der Abwesenheit eines Fließsteuermittels migrierte das Fluoreszenzsubstrat weiterhin mit der Lösungsmittelfront, wie zuvor. Im Gegensatz dazu inhibierte die Dextranzugabe die Prothrombin-Zeit Reaktion. Die Klucel®EF (Hydroxypropylcellulose) verdickte jedoch das Reaktionsgemisch genügend um eine Chromatographie zu vermindern, ohne die Reaktion zu inhibieren. Das Ergebnis war ein gleichförmigeres Fluoreszenzsignal. Als ein Ergebnis dieses Experiments wurde Klucel®EF routinemäßig zu der Formulierung zugegeben. Dieses Experiment veranschaulichte auch, wie wichtig es ist, ein koagulationsneutrales Polymer zu verwenden.

Beispiel 3: Wirkung von Calcium und Thromboplastin auf die Prothrombin- Zeit Reaktion

Eine Sorge war, daß die scheinbare "Prothrombin-Zeit" Reaktion, die in den vorangehenden Experimenten beobachtet worden war, tatsächlich irgendein nicht- physiologischer "Artefakt" war. Um zu sehen, ob die beobachtete Reaktion tatsächlich eine echte Prothrombin-Zeit Reaktion war, wurde ein Experiment durchgeführt um zu sehen, ob die Reaktion Calcium und Thromboplastin benötigte, um abzulaufen. Zusätzlich wurde die Fähigkeit der Reaktion getestet, zwischen einem normalen Kontrollplasma und einem abnormalen Kontrollplasma mit verlängerter PT-Zeit zu unterscheiden. Dazu wurde eine Reihe verschiedener Membran-Testfälle mit und ohne Calcium und Thromboplastin hergestellt.
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
2 ml 0,2 M Tris-Puffer, pH 8,3
150 mg BSA
150 mg Klucel®EF
150 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Das Gemisch wurde in zwei 1 ml Aliquots aufgeteilt. Zu einem Aliquot wurden 0,5 ml Thromboplastinlösung zugegeben und zum anderen wurden 0,5 ml 0,2 M Tris-Puffer, pH 8,3, zugegeben. Dies waren die (+1-) Thromboplastin-Testfälle.
Jeder Testfall wurde weiter in zwei zusätzliche Untertestfälle unterteilt. Einer davon hatte Calcium und einer davon hatte EDTA (das Calcium bindet). Dies wurde durchgeführt indem jeder Testfall in zwei 0,5 ml Proben aufgeteilt wurde. Der (+) Calcium-Testfall erhielt 25 ul 100 mM Calciumchlorid. Der (-) Calcium-Testfall erhielt 25 ul 100 mM Na&sub2;EDTA. Insgesamt wurden vier endgültige Testfälle erhalten. Diese waren:
(+) Thromboplastin (+) CaCl&sub2;
(+) Thromboplastin (+) EDTA
(-) Thromboplastin (+) CaCl&sub2;
(-) Thromboplastin (+) EDTA
Proben jeder Lösung wurden punktförmig auf Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne B aufgetragen und getrocknet. Danach wurden alle vier Fälle gleichzeitig mit Kontrolle I und Kontrolle II Plasma getestet und beobachtet. Nur beim (+) Thromboplastin (+) CaCl&sub2; Testfall mit der Kontrolle I Probe (normale PT-Zeit) entwickelte sich eine starke Fluoreszenz. Alle anderen Testfälle waren negativ.
Dieses Experiment zeigte, daß die beobachtete Reaktion zum Ablaufen sowohl Calcium als auch Thromboplastin benötigte, und fähig war, ein Plasma mit normaler Prothrombin-Zeit von einem Plasma mit abnormaler Prothrombin-Zeit zu unterscheiden, was einen guten Beweis liefert, daß das System eine Prothrombin- Zeit Reaktion im physiologischen Sinne ausführte.

Beispiel 4: Reagenzienkinetik mit Serum mit normaler und abnormaler Prothrombin-Zeit

Andere Experimente (nicht gezeigt) zeigten, daß der pH-Wert des Reagenziengemisches einen Einfluß auf die relative Empfindlichkeit des Systems gegenüber Proben mit verlängerten Prothrombin-Zeiten hatte. Im allgemeinen neigte ein pH-Wert nahe 7,5 zu einer größeren Empfindlichkeit, Proben mit verlängerten Prothrombin-Zeiten nachzuweisen. Für nachfolgende Experimente wurde der pH- Wert des Reaktionscocktails somit auf 7,5 geändert.
In dem nachfolgenden Experiment wurde die relative Fluoreszenzintensität zwischen Kontrolle I und Kontrolle II Plasma durch Zeitverlauf-Photographie überwacht:
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
1200 ul 0,2 M Tris-Puffer, pH 7,5
600 ul Thromboplastin
100 ul 100 mM CaCl&sub2;
100 mg BSA
100 mg Klucel®EF
100 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Das Reagenz wurde wie üblich punktförmig auf Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne B aufgetragen. Die getrockneten Membranen wurden danach mit Kontrolle I und Kontrolle II Plasma getestet und jede Minute abphotographiert. Die Ergebnisse waren:
Diese Ergebnisse waren wiederum damit konsistent, daß auf der Reagenzienmembran eine Prothrombin-Zeit Reaktion im physiologischen Sinne stattfand. Wie erwartet betrug die Zeitdauer, bis in der abnormalen (Kontrolle II) Probe das Fluoreszenzsignal auftrat, etwa das doppelte der normalen Probe.

Beispiel 5: Wirkung einer Proteinvorbehandlung auf die Prothrombin-Zeit Reaktion

Die in den vorangegangenen Experimenten erhaltenen Prothrombin-Zeit Reaktionen waren unannehmbar lange. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die langen Reaktionszeiträume durch eine Inaktivierung labiler Koagulationsfaktoren auf der Membran verursacht sein könnten. Weiterhin wurde die Hypothese aufgestellt, daß diese Inaktivierung durch Zugabe eines koagulationskompatiblen Proteins im Überschuß zu dem System blockiert werden könnte.
Um diese Hypothese zu testen, wurde eine "Blockierlösung", enthaltend 0,05 M Tris, pH 7,5 und 2% Protease-freies Rinderserumalbumin (BSA) hergestellt, und Membranproben wurden entweder 12 Stunden bei Raumtemperatur mit dieser Lösung behandelt, gefolgt von Lufttrocknen, oder wurden unbehandelt belassen.
Die folgenden Membranen wurden vorbehandelt:
Pall Corporation 1,2 Micron Biodyne "B"
Gelman Supor 800
Filterite/Memtec 0,45 Micron asymmetrisches Polysulfon
Dominic-Hunter 0,8 Micron Asypor
Schleicher & Schuell 34 G Glasfaser-Filterpapier
In diesem Experiment und in allen nachfolgenden Experimenten wurde die BSA- Komponente des Reaktionscocktails gegenüber den vorangegangenen Fällen verdoppelt, auf Basis der Beobachtung, daß BSA eine Schutzwirkung auf die Koagulationsfaktoren ausübte.
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
1200 ul Tris-Puffer, pH 7,5
600 ul Thromboplastin
200 ul 100 mM CaCl&sub2;
200 mg Protease-freies BSA
100 mg Klucel®EF
100 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Proben dieser Membranen und die entsprechenden unbehandelten Membranen wurden an einem Testgestell befestigt und mit dem Reagenziengemisch saturiert und wie üblich luftgetrocknet.
Die Proben wurden danach Level I und II Koagulationskontrollen ausgesetzt und getestet. Reaktionszeiträume waren beträchtlich verringert. Die Wirkung der Vorbehandlung war für die Level II Kontrolle (verlängerte PT-Zeit) am stärksten ausgeprägt. Die Level I Kontrollen (nicht gezeigt) waren entsprechend schneller (typischerweise 2 Minuten für alle Proben in dieser Reihe) und wurden durch die Gegenwart oder Abwesenheit der Vorbehandlung nicht merklich beeinflußt.
Es ist zu bemerken, daß das Weglassen von Thromboplastin aus dem Reaktionsgemisch bei allen Proben das Auftreten eines Signals verhinderte. Ergebnisse (Level II Kontrolle)
Es ist zu bemerken, daß in Abwesenheit einer Vorbehandlung Biodyne B für bis zu 6 Minuten gegenüber Level II Kontrolle im wesentlichen unreaktiv war. Im Gegensatz dazu erhöhte die Vorbehandlung die Empfindlichkeit von Biodyne B gegenüber Level II Kontrolle, so daß nunmehr bei 4 Minuten eine nachweisbare Reaktion stattfand.
Asymmetrisches Polysulfon zeigte jedoch überragende Koagulationsneutralität. Dies wird durch eine raschere Level II PT-Reaktion gezeigt, was darauf hinweist, daß an diesem Membransubstrat geringere Inaktivierung von Koagulationsfaktoren stattgefunden hat. Die bereits vor einer Vorbehandlung gute Koagulationsneutralität dieser Membran war nach Vorbehandlung nicht meßbar verändert.
Die Membranen wurden auch mit einer Gesamtblutprobe, die eine normale Prothrombin-Zeit hatte, getestet. Die Ergebnisse waren:
Die Ergebnisse zeigen, daß obwohl die Biodyne "B" und Supor-800 Membranen mit normalem Level I Koagulationskontrollplasma ein gutes Signal ergaben, sie mit Gesamtblut überhaupt kein Fluoreszenzsignal ergaben. Im Gegensatz dazu ergab asymmetrisches Polysulfon weiterhin ein Signal. Bei einem späteren Zeitpunkt (10 Minuten) ergab auch Schleicher & Schuell 34 G, ein Glasfasermaterial, das rote Zellen von Plasma abfiltriert, mit Gesamtblut ein positives Signal. Somit war von den getesteten Materialien asymmetrisches Polysulfon für Gesamtblut-Assays das beste.

Beispiel 6: Wirkung von Hydroxypropylcellulose (ein Fließsteuermittel) auf die Prothrombin-Zeit Reaktion an asymmetrischem Polysulfon

Es wurde die Wirkung von Hydroxypropylcellulose auf asymmetrisches Polysulfon getestet.
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
1200 ul Tris-Puffer, pH 7,5
600 ul Thromboplastin
200 ul CaCl&sub2;
200 mg BSA
Das Gemisch wurde in zwei 1 ml Aliquots aufgeteilt. Zu einem wurden 50 mg Klucel®EF zugegeben und zu dem anderen wurde nichts zugegeben. Nachdem das Klucel®EF sich aufgelöst hatte, wurden zu beiden Proben 50 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val- Pro-Arg-7-amido-4-methylcumann zugegeben.
Jeder Testfall wurde auf eine Probe einer 0,45 Micron asymmetrischen Polysulfonmembran auf die offene Porenseite aufgetragen. Überschüssige Probe wurde entfernt und die Membranen wie üblich luftgetrocknet.
Alle vier Testfälle wurden danach gleichzeitig mit Kontrolle I, Kontrolle II und Kontrolle III Plasma getestet. Die Testfälle wurden danach wie üblich beobachtet. Ergebnisse:
Obwohl die Kinetiken und die Fluoreszenzintensität der zwei Testfälle sehr ähnlich waren, zeigten die (-) Klucel®EF Testfälle eine Tendenz, zunächst Farbe in einem Ring an der Lösungsmittelfront zu entwickeln und später eine gleichmäßige Färbung über die Probe zu entwickeln. Im Gegensatz dazu entwickelten die (+) Klucel®EF Testfälle von Beginn an eine gleichmäßige Färbung ohne die Tendenz, einen Ring zu bilden. Klucel®EF wurde somit in der Formulierung beibehalten um Chromatographieeffekte zu verringern.

Beispiel 7: Prothrombin-Zeit "Teststreifen"

Diese Experiment zeigte, daß eine einschichtige Zusammensetzung hergestellt werden konnte, welche normale Kontrolle (Level I) von leicht abnormaler Kontrolle (Level II), von stark abnormaler Kontrolle (Level III) unterscheiden konnte, und daß diese einschichtige Zusammensetzung auch unter Verwendung eines kleinen Tropfens Gesamtblut funktionieren konnte. Das Experiment zeigte weiterhin, daß diese Reaktion, um zu funktionieren, Thromboplastin benötigen würde.
Dieses Experiment verwendete wieder die von Filterite/Memtec Corporation erhaltene 0,45 Micron Porengröße asymmetrische Polysulfonmembran. Zur Verbesserung von Biokompatibilität war die Membran durch Aussetzen einer Lösung von 2% Protease-freiem Rinderserumalbumin in 0,05 M Tris-Puffer bei pH 7,5 während 12 Stunden, gefolgt von Lufttrocknen, vorbehandelt worden.
Obwohl die asymmetrischen Membranen mit Gesamtblut ein positives Fluoreszenzsignal ergaben, war die Intensität des Signals immer noch geringer als die von ausschließlich Serum. Um zu sehen, ob Pigmente das Gesamtblutsignal weiter verstärken könnten, untersuchte dieses Experiment auch die Wirkung eines Zusatzes von Ropaque® zu der Membran, was ein Pigment ist, das aus kleinen, hohlen Styrol/Acryl Polymerteilchen mit einer Größe von 0,5 Mikrometern zusammengesetzt ist, hergestellt von Rohm & Haas Corporation.
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
800 ul 0,2 M Tris-Puffer, pH 7,5
200 ul 100 mM CaCl&sub2;
200 mg BSA
100 mg Klucel®EF
100 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Das Gemisch wurde in zwei 550 ul Aliquots aufgeteilt. Zu einem wurden 300 ul Thromboplastin zugegeben, 300 ul H&sub2;O wurden zum anderen zugegeben. Dies waren die +/- Thromboplastin Testproben. Jedes Aliquot wurde wiederum in zwei 400 ul Aliquots aufgeteilt. Ein Aliquot erhielt 100 ul einer 50% Ropaque® Suspension, und das andere Aliquot erhielt 100 ul H&sub2;O. Dies waren die +/- Ropaque® Testfälle.
Insgesamt wurden vier endgültige Testfälle erhalten. Diese waren:
(+) Thromboplastin (+) Ropaque®
(+) Thromboplastin (-) Ropaque®
(-) Thromboplastin (+) Ropaque®
(-) Thromboplastin (-) Ropaque
Jeder Testfall wurde auf eine Probe einer 0,45 Micron asymmetrischen Polysulfonmembran auf die offene Porenseite aufgetragen. Überschüssige Probe wurde entfernt und die Membranen wie üblich luftgetrocknet.
Alle vier Testfälle wurden danach gleichzeitig mit Kontrolle I, Kontrolle II und Kontrolle III Plasma sowie einer Probe von normalem Gesamtblut getestet. Die Testfälle wurden danach wie üblich beobachtet. In den (+) Thromboplastin Testfällen entwickelte sich Fluoreszenz gemäß der nachfolgenden Tabelle: (+) Thromboplastin Testfall: (-) Thromboplastin Testfall:
In keinem der (-) Thromboplastin Testfälle entwickelte sich Fluoreszenz, was darauf hindeutet, das Thromboplastin für diese Reaktion notwendig ist.
Die (+) Ropaque® Testfälle ergaben im allgemeinen ein stärkeres Fluoreszenzsignal als die (-) Ropaque® Testfälle, und zeigten zusätzlich eine Tendenz, eine gleichmäßigere Fluoreszenzverteilung zu ergeben. Ropaque® erschien somit vorteilhaft.

Beispiel 8: Wirkung von Calcium

Zu dem vorhergehenden Experiment wurde ein Parallelexperiment durchgeführt um die Wirkung von Calcium auf die Prothrombin-Zeit Reaktion zu untersuchen, und um zu bestätigen, daß das Ropaque® das Fluoreszenzsignal mit Gesamtblut konsistent verstärkte.
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
800 ul 0,2 M Tris, pH 7,5
600 ul Thromboplastin
200 mg BSA
100 mg Klucel®EF
100 mg 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Aufgeteilt in zwei 0,75 Milliliter Aliquots. Zum einen 100 ul 100 mM CaCl&sub2; zugegeben, zum anderen 100 ul H&sub2;O. Jedes Aliquot wurde weiter in zwei 0,4 Milliliter Aliquots aufgeteilt. Zu einem wurden 100 ul einer 50% Ropaque® Suspension zugegeben und zu dem anderen wurden 100 ul H&sub2;O zugegeben. Insgesamt wurden vier Testfälle erhalten. Diese waren:
(+) CaCl&sub2; (+) Ropaque®
(+) CaCl&sub2; (-) Ropaque®
(-) CaCl&sub2; (+) Ropaque®
(-) CaCl&sub2; (-) Ropaque®
Jeder Testfall wurde auf eine Probe einer 0,45 Micron asymmetrischen Polysulfonmembran auf die offene Porenseite aufgetragen. Überschüssige Probe wurde entfernt und die Membranen wie üblich luftgetrocknet.
Alle vier Testfälle wurden danach gleichzeitig mit Kontrolle I, Kontrolle II und Kontrolle III Plasma sowie einer Probe von normalem Gesamtblut getestet. Die Testfälle wurden danach wie üblich beobachtet. (+) CaCl&sub2; Testfall: (-) CaCl&sub2; Testfall:
Ein wichtiger Unterschied zwischen dem (-) CaCl&sub2; Testfall in diesem Experiment und dem (-) Thromboplastin Testfall im vorangegangenen Experiment ist zu bemerken. Obwohl mit Gesamtblut beim (-) Thromboplastin Testfall keine Reaktion erhalten worden war, wurde beim (-) CaCl&sub2; Testfall eine normale Reaktion erhalten. Dies lag daran, daß das hier verwendete frische Gesamtblut ausreichend Calcium enthielt, um ohne die Notwendigkeit einer Zugabe von zusätzlichem Calcium zum Reagenz den extrinsischen Weg auszulösen. Im Gegensatz dazu waren die Plasmakontrollen, deren Calciumgehalte durch Verwendung eines Calciumchelators abgereichert waren, beim (-) CaCl&sub2; Testfall nicht reaktiv.
Angesichts des Standes der Technik, der gezeigt hatte, daß eine bessere Reagenzstabilität erreicht werden kann, wenn Calcium nicht mit Thromboplastin aufbewahrt wird, war dies eine nützliche Feststellung. Da ein Test für den Hausgebrauch eine gute Reagenzstabilität benötigt und ausschließlich mit Gesamtblut funktionieren wird, können bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn die Formulierung kein Calcium enthält.
Ropaque® hatte mit Gesamtblut weiterhin eine günstige Wirkung, indem es die Intensität des Fluoreszenzsignals etwas verbesserte und die Gleichmäßigkeit des Signals erhöhte. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß auch ohne Ropaque® adäquate Ergebnisse erhalten wurden.

Beispiel 9: Studien hinsichtlich variabler Probengröße

Ein guter Test für den Hausgebrauch wird gegenüber Variationen der Menge an Gesamtblut, die zu dem Reagenz zugegeben wird, tolerant sein, und wird bevorzugt unter Verwendung extrem kleiner Probengrößen, bis hinab zu etwa 5 ul, funktionieren. In diesem Experiment wurden Proben des (-) CaCl&sub2; (-) Ropaque® und des (+) CaCl&sub2; (+) Ropaque® Materials, welches aus Experiment 8 übrig geblieben war, mit 5, 10 und 20 ul Gesamtblut getestet. Für beide Testfälle waren die Reaktionskinetiken und die Intensität der Fluoreszenzreaktion für alle Probengrößen identisch. Wenn das identische Experiment mit Schleicher & Schuell 34 G oder Whatman GF/C Glasfaser Filterpapieren durchgeführt wurde, wurde im Gegensatz dazu mit den 5 ul und 10 ul Gesamtblutproben überhaupt keine Reaktion beobachtet.

Beispiel 10: Quantitative Studien mit Gesamtblutproben

Zweck dieses Experiments war es, quantitative Daten über das Leistungsverhalten des Reagenzes zu erhalten, um eine Optimierung des Systems zu vereinfachen.
Ein flüssiges Reagenziengemisch wurde hergestellt durch Kombinieren der folgenden Reagenzien:
2400 ul Tris pH 7,5
1200 ul Thromboplastin
400 ul 100 mM CaCl&sub2;
400 mg BSA
200 mg Klucel®EF
200 ul 1 mg/ml N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcumarin
Dies wurde auf eine Probe einer 0,45 Micron asymmetrischen Polysulfonmembran auf die offene Porenseite aufgetragen. Überschüssige Probe wurde entfernt und die Membran wie üblich luftgetrocknet.
Die Membran wurde zu einzelnen Reagenzstreifen verarbeitet. Dies wurde gemacht, indem ein 1/2" breites 3 M Scotch'M Cat. 136 doppelseitiges Klebeband auf einen opaken Träger mit einer Schichtdicke von 10 Millizoll gegeben wurde, und durch die Mitte des Klebebands und durch den Träger Löcher mit einem Durchmesser von 1/4" gestanzt wurden. Danach wurde behandelte Membran mit der kleinen Porengröße nach unten auf das Klebeband laminiert. Die Reagenzstreifen wurden danach auf eine günstige Größe geschnitten und oberhalb der Betrachtungsfläche des weiter oben beschriebenen Instruments befestigt.
Blutproben wurden wie vorstehend beschrieben erhalten. Diese Proben wurden auf die Reagenzstreifen aufgetragen und wurden insgesamt 4 Minuten (240 Sekunden) in 10-Sekunden Intervallen beobachtet. Das Experiment wurde bei Raumtemperatur (25ºC) durchgeführt.
Die für eine normale Blutprobe (A), eine Blutprobe mit leicht verlängerter Prothrombin-Zeit (B) und eine Blutprobe mit stark verlängerter Prothrombin-Zeit (C) erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, daß das System fähig ist, klar zwischen den verschiedenen Gesamtblutproben zu unterscheiden.
Obwohl die vorstehende Erfindung für ein besseres Verständnis in gewisser Ausführlichkeit durch Erläuterung und Beispiel beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Testvorrichtung, umfassend:

eine einzelne permeable Membran mit einer Auftrageseite und einer gegenüberliegenden Indikatorseite, wobei die Membran im wesentlichen frei von Beeinflussung eines Koagulationswegs ist,

einen in der Membran imprägnierten Koagulationsinitiator, und

ein in der gleichen Membran wie der Koagulationsinitiator imprägniertes Substrat, wobei das Substrat bei Aktivierung durch eine Komponente des Koagulationswegs ein nachweisbares Signal erzeugt,

wobei Gesamtblut auf die Auftrageseite der Membran aufgetragen und auf der Indikatorseite infolge der Erzeugung der Koagulationswegkomponente ein nachweisbares Signal erzeugt werden kann.

2. Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die permeable Membran aus einem hydrophilen nicht-schwellfähigem Material, welches frei von Beeinflussung des Koagulationswegs ist, zusammengesetzt ist.

3. Testvorrichtung nach Anspruch 2, wobei das Material Polysulfon ist.

4. Testvorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Polysulfon eine asymmetrische Struktur hat.

5. Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die permeable Membran hydrophiles nicht-schwellfähiges Material ist, welches behandelt worden ist um eine Beeinflussung des Koagulationswegs zu inhibieren.

6. Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Koagulationsinitiator den extrinsischen Koagulationsweg auslöst.

7. Testvorrichtung nach Anspruch 6, wobei der Koagulationsinitiator ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Thromboplastin oder anderen Faktor VII aktivierenden Substanzen.

8. Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Koagulationsinitiator den intrinsischen Koagulationsweg auslöst.

9. Testvorrichtung nach Anspruch 8, wobei der Koagulationsinitiator ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ellagsäure, Kaolin, Siliziumoxid oder anderen Faktor XII aktivierenden Substanzen.

10. Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Koagulationswegkomponente, welche das Substrat aktiviert, Thrombin ist.

11. Testvorrichtung nach Anspruch 10, wobei das Thrombinsubstrat ein Peptid ist, welches abspaltbar an ein Reportermolekül gebunden ist, wobei Thrombin das Peptid bindet und das Reportermolekül von dem Peptid abspaltet, wobei das nachweisbare Signal erzeugt wird.

12. Testvorrichtung nach Anspruch 11, wobei das nachweisbare Signal Fluoreszenz ist.

13. Testvorrichtung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend einen in der Membran imprägnierten Puffer, der einen mit dem Koagulationsweg und dem Membranmaterial kompatiblen pH-Wert hält.

14. Testvorrichtung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend in der Membran imprägniertes Calcium.

15. Testvorrichtung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein in der Membran imprägniertes Pigment.

16. Testvorrichtung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein in der Membran imprägniertes Fließsteuermittel.

17. Verfahren zur Bestimmung des Koagulationsvermögens eines Patienten, wobei das Verfahren umfaßt:

Auftragen einer Gesamtblutprobe auf eine Auftrageseite einer permeablen Membran, wobei die Membran im wesentlichen frei von Beeinflussung eines Koagulationswegs ist und wobei ein Koagulationsinitiator und ein Substrat, welches bei Aktivierung durch eine Komponente des Koagulationswegs ein nachweisbares Signal erzeugt, in der Membran imprägniert sind, und

Bestimmen des nachweisbaren Signals auf einer Indikatorseite der Membran, wobei die Indikatorseite der Auftrageseite gegenüber liegt und das nachweisbare Signal aus der Erzeugung der Koagulationswegkomponente, welche in der Membran durch Wechselwirkung des Koagulationsinitiators und der Blutprobe initiiert wird, resultiert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Blutprobe vor dem Auftragen nicht gemessen wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Blutprobe durch einen Stich in den Finger erhalten wird.

20. Verfahren nach Anspruch 17, welches bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 17, welches bei einer kontrollierten Temperatur durchgeführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das nachweisbare Signal Fluoreszenz ist.

23. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das nachweisbare Signal temperaturkompensiert wird.