DE3789941T2 - Transformation von Pflanzenzellen mittels beschleunigten Teilchen, die mit DNS beschichtet sind und Apparat dafür. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft das allgemeine Gebiet der gentechnischen Veränderung von Pflanzen und betrifft im besonderen die Transformation der Keimbahn einer Pflanzenlinie mit exogenem genetischen Material durch physikalisches Einführen des genetischen Materials in Pollen der Pflanze, sowie eine Vorrichtung zur Verwendung bei dem gentechnischen Verfahren.
• Ein hohes Maß an Anstrengungen und Forschung ist auf die genetische Transformation von Pflanzenspezies gerichtet worden. Es wird davon ausgegangen, daß es die Entwicklung wirksamer Mittel zur Transformation von pflanzlichen Keimbahnen mit Fremdgenen ermöglicht, die Verschiedenheit des genetischen Pools wirtschaftlich wichtiger Feldfruchtspezies zu erweitern und funktionelle Gene spezifischen Interesses selektiv in Feldfruchtspezies einzuführen. Die bis heute im Hinblick auf die Transformation oder die gentechnische Veränderung von Pflanzenspezies geleisteten Anstrengungen und durchgeführten Forschungen haben zu Ergebnissen geführt, die in Abhängigkeit der Pflanzenspezies erheblich variieren.
• Der bis heute zur Einführung exogener Gene in Pflanzen angewendete grundlegende Mechanismus hat mit der Transformation einzelner Pflanzenzellen wie entweder in Form von Protoplasten oder in Form einer als Kallus bekannten undifferenzierten Gewebemasse begonnen. In Pflanzenzellen funktionelle chimäre Gene sind in einzelne pflanzliche Protoplasten durch Elektroporation und Mikroinjektion eingeführt worden. Die derzeit am häufigsten angewendete Transformationstechnik hat sich jedoch den Vorteil der natürlichen Eigenschaft des pflanzlichen Pathogens Agrobakterium tumefaciens zunutze gemacht, welches die inhärente Fähigkeit besitzt, ein Teil der DNA des von ihm getragenen Ti (Tumorinduzierenden)-Plasmids in eine infizierte Pflanzenzelle zu übertragen. Durch die Insertion fremder Gene in Plasmide in Agrobakterium, die bestimmte Sequenzen des Ti-Plasmids tragen, kann die bakterielle Transformationseigenschaft nutzbar gemacht werden, um die Fremdgene in das Genom der infizierten Pflanzenzellen zu transportieren. Die Agrobakterium-vermittelte Transformation von Pflanzenzellen hat sich bei vielen Modell-Feldfruchtspezies, wie bei Tabak, Petunien und Karotten als hinreichend gut ausführbar erwiesen, wobei sie jedoch zwei signifikanten Beschränkungen unterliegt. Die erste Beschränkung liegt darin, daß die Vermittlung lediglich auf einer individuellen zellulären Ebene erfolgen kann, wie typischerweise mit somatischen Geweben, die anschließend künstlich zu einer vollständigen Pflanze regeneriert werden müssen. Dies beschränkt die Anwendbarkeit der Agrobakterium-vermittelten genetischen Transformation auf solche Feldfruchtspezies, die leicht aus Gewebetypen regeneriert werden können, die gegenüber einer Infektion mit Agrobakterium empfänglich sind. Eine zweite Beschränkung liegt darin, daß der natürliche Wirtsbereich von Agrobakterium lediglich dikotyle Pflanzen und eine begrenzte Anzahl monokotyler Spezies der Familie der Liliaceae einschließt. Daher hat sich die Agrobakterium-vermittelte Transformation nicht als ein wirksames Werkzeug für monokotyle Spezies von wirtschaftlichem Interesse wie die Getreidespezies erwiesen. Eine weitere Schwierigkeit von Agrobakterium-vermittelten Transformationen ist die Entstehung somoklonaler Varianten, die in Pflanzengeweben einer Gewebekultur spontan entstehen und die Identifizierung von Transformanten erschweren können.
• Es ist gezeigt worden, daß mindestens einige chimäre Genkonstruktionen wirksam sind zur Expression von Fremdgenen in den meisten Pflanzenzellen. Die Funktionalität dieser chimären Konstruktionen in sowohl monokotylen als auch dikotylen Pflanzen ist gezeigt worden durch Transformation von Maisprotoplasten in Kultur durch Techniken wie Elektroporation. Es gibt jedoch derzeit keine Methodik zur Regeneration vollständiger Maispflanzen oder vollständiger Pflanzen irgendeiner anderen wichtigen Feldfruchtspezies aus derartigen Protoplasten. Beispielsweise ist derzeit nicht bekannt, daß vollständige, intakte transformierte Maispflanzen regeneriert worden sind. Nichtsdestoweniger ist die genetische Transformation von Linien der Maispflanze und anderer Feldfruchtspezies ein erklärtes Ziel aufgrund der großen landwirtschaftlichen Bedeutung der üblichen Feldfruchtpflanzen und des Potentials zur Steigerung ihres Wertes und ihrer Produktivität.
• Es ist zuvor mindestens einmal vorgeschlagen worden, daß Maispflanzen durch genetische Transformation ihrer Pollen genetisch transformiert werden können. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 85/01856 von De Wet beschreibt ein Verfahren zur Übertragung exogener Gene in Blütenpflanzen durch Transformation der Pollen der Pflanzen. Versuche anderer, die Pollen von Pflanzen zu transformieren und transformierte Pflanzen zu regenerieren, sind gescheitert. Sanford et al., Theor. Appl. Genet., 69 (5-6), 571-74 (1985). Ein Bericht über ein ähnliches Ergebnis liegt vor. Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 715-719 (1986).
• Ein Verfahren zur Partikel-vermittelten Transformation von epidermalen Zwiebelzellen wurde von Sanford und Klein vorgestellt anläßlich eines Symposiums mit der Bezeichnung "Biotechnology in Plant Science: Relevance to Agriculture in the Eighties", Ithaca, NY, USA, 23.-27. Juli 1985 (Poster Nr. 28). Das beschriebene Verfahren verwendet eine ballistische Vorrichtung zur Beschleunigung DNA-tragender Wolframkügelchen in die Zellen. Weitere Berichte über diese Arbeit wurden nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht in Nature, 1987, Bd. 327, Seiten 70-73, und in Particulate Science and Technology, 1987, Bd. 5, Seiten 27-37.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter lebender Zellen bereit, welches die folgenden Schritte umfaßt: Herstellung von Kopien eines Fremdgens einschließlich einer kodierenden Region und flankierender regulatorischer Sequenzen, die zur Expression der kodierenden Region in den Zellen wirksam sind; Beschichtung biologisch inerter Trägerpartikel mit Kopien des Fremdgens; Aufbringung der Partikel auf eine ebene Trägerfolie, Beschleunigung der Trägerfolie durch Einwirkung einer Verdichtungswelle auf die Trägerfolie, und Dämpfung der Trägerfolie in der Weise, daß die Trägerpartikel durch ihre Bewegungsenergie von der Trägerfolie fortgetragen werden, so daß sich einige Partikel in dem Inneren einiger Zellen ansammeln, und Screening nach transformierten Zellen.
• Nach einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens betrifft die Erfindung ein Verfahren zur genetischen Transformation einer Pflanzenlinie, welches die folgenden Schritte umfaßt: Herstellung einer ein Fremdgen und regulatorische Sequenzen einschließenden DNA-Sequenz; Beschichtung biologisch inerter Partikel mit der DNA-Sequenz; physikalische Beschleunigung der die DNA tragenden Partikel in Richtung der Pollen der Pflanze, um die Partikel in den Pollen anzusammeln; Bestäubung einer weiblichen Mutterpflanze mit den Pollen; und Auswahl transformierter Pflanzen unter der Nachkommenschaft der Bestäubung.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Maispollen, der ein fremdes chimäres Gen und mindestens ein Trägerpartikel umfaßt, welches das Fremdgen physikalisch in den Pollen eingeführt hat.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die genetische Transformation von nicht nur Mais sondern auch anderen wichtigen Feldfruchtpflanzen durch Pollentransformation ohne das Erfordernis der Gewebekultur oder der Regeneration von Pflanzen.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ferner eine Vorrichtung zur Injektion von DNA-tragenden Trägerpartikeln in lebende Zellen auf einer Zieloberfläche bereitgestellt, wobei die Vorrichtung umfaßt:
• - eine ebene Trägerfolie, die so eingerichtet ist, daß auf der Oberfläche der Folie eine Schicht von mit DNA beschichteten biologisch inerten Trägerpartikeln aufgebracht werden kann,
• - Mittel zur Erzeugung einer ausreichenden Verdichtungswelle, um die Trägerfolie mit den darauf befindlichen Trägerpartikeln in Richtung der Zieloberfläche zu beschleunigen, und
• - Dämpfungsmittel, das sich in der Fortbewegungsrichtung der Trägerfolie zur Zieloberfläche befindet und derart angeordnet und konstruiert ist, daß die Trägerfolie gedämpft wird, wenn die Trägerfolie durch eine Verdichtungswelle beschleunigt wird, so daß die Trägerpartikel beschleunigt werden und in die Zellen auf der Zieloberfläche eindringen.
• Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das Verfahren relativ schnell und effizient sowie leicht verifizierbar und wiederholbar ist.
• Es ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der dadurch hergestellten Materialien, daß fremdes genetisches Material, sei es charakterisiert oder nicht, auf einfache Weise und schnell in jedweden gewünschten genetischen Hintergrund von Mais eingeführt werden kann zur Feldfruchtzüchtung, Molekularbiologie oder zu anderen ähnlichen landwirtschaftlichen oder wissenschaftlichen Zwecken.
• Ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß zahlreiche, d. h. tausende von Transformationsereignissen möglich und durchführbar sind, da sich das Verfahren im Vergleich zu früheren Techniken der Transformation somatischer Zellen oder zur Mikroinjektion, deren Durchführung schwierig ist oder die eine Behandlung von Zelle zu Zelle erfordern, leicht ausführen läßt.
• Andere Aspekte, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den anliegenden Zeichnungen ersichtlich.
• Fig. 1 ist eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung einer Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens konstruiert ist.
• Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Plasmidmanipulationen auf dem Weg zur Herstellung des Plasmids pCMC 1208.
• Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Plasmidmanipulationen auf dem Weg zur Herstellung des Plasmids pCMC 1022.
• Bei der Ausführung der erfindungsgemäß durchgeführten Pollenvermittelten pflanzengenetischen Transformation wird die DNA physikalisch in das Cytosol der pflanzlichen Pollen eingebracht, wobei die DNA von individuellen kleinen Partikeln eines biologisch inerten Materials getragen werden, die in Richtung der Pollen derart beschleunigt werden, daß die Partikel in die individuellen Pollenzellen eintreten, ohne diese jedoch zu zerstören oder unfähig zu machen. Es ist gefunden worden, daß die auf diese Weise eingeführte DNA in das genetische Material der Nachkommenschaft dieses Pollens eingegliedert wird. Demnach wird die gentechnische Veränderung von Pflanzen und Pflanzenlinien durch das Transformieren von Pollen auf die genannte Weise ermöglicht.
• Es gibt verschiedene Faktoren, die eine erfolgreiche Pollenvermittelte Transformation beeinflussen. Die Art und Weise, in der die Partikel beschleunigt werden, wird vorzugsweise sorgfältig ausgelegt, damit die individuellen, DNA-tragenden Partikel eine korrekte Bewegungsenergie und Geschwindigkeit aufweisen und bei Kontakt mit den Pollen in einer relativ gleichförmigen Verteilung vorliegen, damit sie in eine signifikante Anzahl von Pollenzellen eindringen, ohne diese in biologischer Hinsicht unfähig zu machen. Darüber hinaus sollte die DNA auf den Partikeln stabil und in der Lage sein, die Pflanzenzellen zu transformieren und die gewünschte Eigenschaft in den Pflanzenzellen zu exprimieren. Zusätzlich kann die DNA ihrerseits einen selektierbaren Marker enthalten, welcher in vermeintlich transformierten Pflanzensamen oder Pflänzchen nachgewiesen werden kann, um die spezifischen Pflanzen zu ermitteln, in denen eine genetische Transformation erfolgt ist. Wenn die Transformationsfrequenz hoch genug ist, kann ein derartiger selektierbarer Marker entbehrlich sein.
• Es gibt viele mechanische Systeme, die sich zur Beschleunigung biologisch inerter kleiner Trägerpartikel eignen. Mögliche Mechanismen können die ballistische Explosionsbeschleunigung von Partikeln, die Zentrifugalbeschleunigung von Partikeln, die elektrostatische Beschleunigung von Partikeln oder jedwede andere analoge Systeme einschließen, die in der Lage sind, kleinen inerten Partikeln eine Bewegungsenergie und Geschwindigkeit zu verleihen. Ein von den Anmeldern bevorzugtes neues Verfahren ist schematisch in der Fig. 1 veranschaulicht. Das dargestellte Verfahren macht Gebrauch von einer Verdichtungswelle, die durch eine elektrische Hochspannungsentladung erzeugt wird. In Fig. 1 ist ein Beschleuniger zur Beschleunigung der inerten Partikel unter Anwendung dieses Verfahrens dargestellt und insgesamt mit 10 bezeichnet. Ebenfalls in Fig. 1 ist die die Zielpollen tragende Zieloberfläche dargestellt und allgemein mit 22 bezeichnet.
• Der Beschleuniger 10 besteht aus mehreren Teilen. Eine Funkenentladungskammer 12 weist ein Paar von Elektroden 14 auf, die in ihr Inneres hineinragen. Die äußere Gestalt der Funkenentladungskammer 12 ist für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich, solange sie so gestaltet ist, daß eine angemessen beschaffene Verdichtungswelle erzeugt und in eine geeignete Richtung präsentiert wird, um zum Treiben der Trägerpartikel eingesetzt werden zu können. Die Anmelder haben gefunden, daß ein Teilstück eines Kunststoffrohres aus Polyvinylchlorid mit einem inneren Durchmesser von 13 mm zur Verwendung als Funkenentladungsabschnitt 12 ausreicht. Die Elektroden 14 ragen von gegenüberliegenden Seiten in das Innere hinein und sind ungefähr 5 mm unterhalb des oberen Endes der Funkenkammer 12 angeordnet. Die Elektroden 14 ihrerseits werden durch Gewindebolzen gebildet, die in geeignete Gewindegänge hineinragen, die in den inneren Oberflächen der Seitenwände der Funkenkammer 12 ausgebildet sind. Die Enden der die Elektroden 14 bildenden Gewindebolzen sind durch eine lichtbogenfeste Legierung geschützt, die erhalten wurde von den Kontaktpunkten eines Hochspannungsrelais, die auf eine Größe von ungefähr 2 mm · 2 mm · 3 mm geschnitten und mit den Enden der Gewindebolzen verlötet wurden. Der Zwischenraum zwischen den Elektroden 14 kann eingestellt werden, indem die Bolzen aus oder in die Funkenkammer 12 gedreht werden. Der bevorzugte Zwischenraum zwischen den Enden der Elektroden für eine Entladungsspannung von ungefähr 15 kV liegt zwischen 1 und 1,5 mm. Die Methode zur Herstellung und Anordnung der Elektroden 14 unterliegt natürlich einer großen Variationsbreite, obgleich es bevorzugt ist, daß die Elektroden in hohem Maße haltbar sind, und daß der Abstand des Funkenzwischenraumes zwischen den Elektroden leicht einstellbar ist.
• Ein Distanzring 16 ist über der Funkenkammer 12 angeordnet. Der Distanzring 16 kann aus demselben PVC-Rohr wie die Funkenkammer 12 hergestellt werden und wird vorzugsweise auf eine vertikale Länge von 6 mm geschnitten. Bei einer nicht verstellbaren Vorrichtung zur Transformation einer einzigen Feldfruchtspezies kann der Distanzring 16 lediglich als eine Verlängerung der Funkenentladungskammer 12 ausgebildet sein, obgleich es ein entfernbarer und austauschbarer Distanzring 16 erlaubt, die Einstellung des Abstandes zwischen der Funkenentladung und der Trägerfolie zu verändern, damit die Kraft der Partikelbeschleunigung durch Bedingungen oder durch die Spezies variiert werden kann. Der Distanzring 16 kann an seinem oberen Ende offen gelassen werden, wenn eine große Trägerfolie 18 verwendet wird, sie kann aber auch vorteilhafterweise im Bereich ihres oberen Endes teilweise mittels eines geeigneten Verschlusses verkleinert werden, um eine rechteckige Öffnung von etwa 9 · 13 mm zu bilden. Oberhalb des Distanzstückes 12 befindet sich eine Trägerfolie 18. Die Trägerfolie 18 ist eine ebene, leichte Folie in geeigneter Größe, damit sie oberhalb des Distanzringes 16 verbleibend angeordnet werden kann. Die Trägerfolie 18 ist aus flexiblem, biologisch inertem Folienmaterial, welches in der Lage ist, biologisch inerte kleine Partikel zu tragen. Die Trägerfolie 18 dient der Übertragung der Kraft einer Verdichtungswelle aus einer Funkenentladung auf die Beschleunigung der Trägerpartikel. Es ist gefunden worden, daß die Trägerfolie 18 vorteilhafterweise aus einem kunststoffbeschichteten aluminisierten Mylar von 1 Milli-Inch oder 0,5 Milli-Inch gebildet ist, wobei die Folien von 0,5 Milli-Inch bevorzugt sind, da sie in der Praxis zu einem besseren Eindringen in die Pollen führen. Allgemein gilt, daß je kleiner der tatsächliche Oberflächenbereich der Trägerfolie 18 ist, um so besser ist das Eindringen der Trägerpartikel in die Pollen. Diese Überlegung hinsichtlich des Eindringens wird ausgeglichen durch das Erfordernis, die Trägerfolie in einer Größe einzusetzen, die leicht handzuhaben ist und die ein Aufprallmuster über einen Bereich bereitstellt, der groß genug ist, um eine große Anzahl von Pollenzellen bei jeder einzelnen Injektion zu beschießen. Es hat sich herausgestellt, daß eine Trägerfoliengröße von 9 · 11 mm eine gute Größe darstellt, um ein gutes Eindringen der Partikel in die Zielpollen mit einem gewünschten Aufprallmuster zu ergeben.
• Die Trägerfolie dient ferner der Anordnung des Partikelmusters bei deren Auftreffen auf die Zieloberfläche. Ein gleichförmiges Partikelmuster ist in hohem Maße erwünscht, um sicherzustellen, daß möglichst viele Zellen auf der Zielfläche beschossen werden, um die Ausbeute an Transformanten zu maximieren. Nicht transformierte Zellen, Pollen oder andere, können einen kompetitiven Vorteil gegenüber Transformanten besitzen oder durch die Trägerpartikel teilweise geschwächt sein. Es ist deshalb wünschenswert, soweit wie möglich eine Injektionsrate der Targetzellen von nahezu 100% zu erreichen, und eine gleichförmige Schicht und Anordnung der Partikel auf einer Trägerfolie 18 unterstützt dieses Ziel.
• Hinsichtlich der Trägerpartikel sollte jedes hochverdichtete Material, das biologisch inert ist, zur Verwendung als DNA-Trägerpartikel im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Metallische Materialien sind bevorzugt, wie Wolfram und Gold, die eine Dichte von 19 aufweisen. Iridium mit einer Dichte von 22 könnte ebenfalls bevorzugt sein, ist aber von den Anmeldern nicht eingesetzt worden, da es lediglich in Form eines relativ groben Pulvers leicht erhältlich ist, wohingegen sphärische Partikel bevorzugt sind. Im Vergleich mit Gold ist Wolfram ebenfalls vermutlich weniger gewünscht, da es schon bei spurenweise vorhandener Feuchtigkeit zur Oxidation in Luft neigt. Durch eine derartige Oxidationsschicht auf den Trägerpartikeln können sich die Partikel miteinander verbinden, wodurch die durchschnittliche Partikelgröße aufgrund der Aggregation stark vergrößert wird. Die zu unregelmäßigen Aggregaten verklumpten Partikel sind weniger gewünscht für die Ausführung der vorliegenden Erfindung, da derartige Zusammenlagerungen hinsichtlich ihrer Masse und Größe stark variieren werden, wodurch der Erhalt gleichmäßig wiederholbarer Ergebnisse erschwert wird. Es ist gefunden worden, daß Gold für die erfindungsgemäßen Partikel ein optimales Material ist, da es eine hohe Dichte besitzt, sowohl gegenüber biologischen Materialien als auch gegenüber einer Oxidation relativ inert und im Handel leicht erhältlich ist in Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 bis 3 um. Geeignete DNA-Sequenzen können auf die Goldpartikel aufgetragen werden, und die Goldpartikel können in einer Weise auf die Trägerfolie aufgebracht werden, die nachfolgend detailliert ausgeführt wird.
• Oberhalb der Trägerfolie 18 ist ein Rückhaltesieb 20 angeordnet. Das Rückhaltesieb 20 ist ein rostfreies 100 mesh-Stahlsieb, das in einem Kunststoffhalter ungefähr 20 mm oberhalb des oberen Endes des Distanzringes 16 angeordnet ist. Das Rückhaltesieb 20 dient dem Dämpfen der Trägerfolie 18, damit sie sich nicht auf das Target zubewegen kann.
• Die Zieloberfläche 22 ist eine ebene Folie aus einem Material, in welchem die Zielzellen, d. h. Pollen oder andere Pflanzenzellen suspendiert werden können. In der Praxis hat sich herausgestellt, daß eine Petrischale von 60 mm · 15 mm, die sich umgekehrt über dem oberen Ende des das Rückhaltesieb haltenden Aufbaus befindet, ein leicht verwendbares Target ist. Der Abstand zwischen dem Rückhaltesieb 20 und den Zielzellen auf der Zieloberfläche 22 beträgt daher ungefähr 15 mm. Ein Abstand von größer als etwa 15 mm führt unter den nachfolgend dargelegten Spannungs- und Druckbedingungen zu einem verminderten Eindringen der Trägerpartikel in die Pollen, während ein Abstand von weniger als 10 mm im Falle der druckbedingten Ausdehnung des Rückhaltesiebs 20 zu zerquetschten Zellen führt.
• Wenn Pollen als Zielzellen verwendet werden, müssen sie derart auf die Zieloberfläche aufgebracht werden, daß die Zieloberfläche umgedreht werden kann und die Pollen lebensfähig bleiben. Da Pollen im allgemeinen sensitiv gegenüber Feuchtigkeit sind, sollte bei der Adhärenz der Pollen an die Zieloberfläche sowenig Feuchtigkeit wie möglich anwesend sein. Es ist gefunden worden, daß Mineralöl als ein derartiges Klebemittel geeignet ist. Wenn eine dünne Schicht Mineralöl auf den Boden einer als Zieloberfläche 22 zu benutzenden Petrischale aufgebracht, Pollen auf die Schale aufgestäubt und anschließend die Schale umgedreht wird, um überschüssiges Pollenmaterial zu entfernen, hat sich herausgestellt, daß auf der Zieloberfläche eine gleichförmige Monoschicht aus Pollenkörnern verbleibt, die während der Partikelinjektion an ihrer Stelle verbleiben und lebensfähig bleiben. Wenn in dieser Vorrichtung keine Pollen sondern andere Zellen verwendet werden, können andere Trägermedien wie Agar geeigneter sein.
• Der gesamte Aufbau des Partikelbeschleunigers 10 und der Zieloberfläche 22 kann teilweise evakuiert werden, um eine Verlangsamung der Partikel und/oder der Trägerfolie 18 durch den Luftdruck zu verhindern. Das Vakuum sollte lediglich ein Teilvakuum sein, da ein Hochvakuum die Zielpollenzellen austrocknen und damit lebensunfähig machen würde. Ein Vakuum von 460 bis 480 mm Hg hat sich als ausreichend und vorteilhaft erwiesen.
• Nach der einfachsten Erklärung der Arbeitsweise der Vorrichtung gemäß Fig. 1 beginnt das Abfeuern des Beschleunigers 10 mit der Anordnung eines Tropfens 24 destillierten oder demineralisierten Wassers zwischen die Elektroden 14. Die Menge an Wasser muß ausgewählt werden, damit sie den sich zwischen den Elektroden ausbildenden Lichtbogen nicht dämpft, aber dennoch ein ausreichendes Volumen aufweist, um eine Verdichtungswelle in dem Inneren der Funkenkammer 12 zu erzeugen, wenn die Entladung stattfindet. Es hat sich herausgestellt, daß das bevorzugte Volumen an Wasser ungefähr 2 bis 4 ul beträgt. Diese Menge an Wasser kann mittels einer zwischen die Enden der Elektroden 14 geführten Pipette aufgebracht werden. Der Wassertropfen 24 wird die Lücke zwischen den Elektroden überbrücken und dort verbleiben.
• Der Distanzring 16 wird dann auf das obere Ende der Funkenkammer 12 plaziert, und die Trägerfolie 18 wird auf das obere Ende des Distanzringes 16 plaziert. Das Rückhaltesieb 20 wird 5 mm oberhalb der Trägerfolie 18 angebracht, und die aus der umgedrehten Petrischale bestehende Zieloberfläche 22 wird oberhalb des Rückhaltesiebs 20 angebracht. Der Aufbau wird anschließend bis etwa 480 mm Hg evakuiert.
• Außerhalb der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung ist eine Spannungsquelle angeschlossen, um eine Gleichspannung von 15 000 Volt anzulegen. Die Gleichspannung von 15 000 Volt wird dann an einen 1 Mikrofarad-Kondensator angelegt, der dann von der Spannungsquelle entfernt wird. Durch Betätigung eines geeigneten Schalters wird dann die 15 000 Voltladung des Kondensators an die Elektroden 14 angelegt.
• Wenn die Spannung angelegt ist, springt ein elektrischer Entladungsbogen zwischen den beiden Elektroden 14. Der Lichtbogen führt sofort zu einer Verdampfung des kleinen Wassertropfens, der sich zwischen den Elektroden befindet. Eine durch die explosive Verdampfung des Wassertropfens erzeugte Verdichtungswelle breitet sich im Inneren der Funkenkammer 12 aus. Wenn die Verdichtungswelle die Trägerfolie 18 erreicht, wird die Trägerfolie 18 vertikal vom Distanzring 16 abgehoben und in Richtung des Rückhaltesiebs 20 beschleunigt. Wenn die Trägerfolie 18 auf das Rückhaltesieb 20 trifft, wird die Trägerfolie 18 dort zurückgehalten, und die auf der Trägerfolie 18 befindlichen Partikel verlassen die Trägerfolie und legen die Strecke zu den auf der Zieloberfläche 22 angeordneten Zellen in freiem Flug zurück. Wenn die Vorrichtung in korrekter Weise hergestellt und eingestellt worden ist, und die Vorgehensweise akkurat befolgt wird, wird eine signifikante prozentuale Menge der Trägerpartikel das Ziel mit einer korrekten Geschwindigkeit erreichen, um in die von der Zieloberfläche 22 getragenen Zellen einzudringen, ohne eine nicht vertretbare Menge der Zellen zu zerstören. Die Zellen auf der Zieloberfläche 22 können anschließend von der Zieloberfläche 22 entfernt und in geeigneter Weise ausgewählt werden, um Transformanten von Nicht-Transformanten abzutrennen. Wenn in dem Verfahren, wie bevorzugt, Pollen verwendet werden, wird der Pollen anschließend von der Zieloberfläche 22 entfernt und zur manuellen Bestäubung fertiler weiblicher Blütenpflanzen wie blühenden Mais verwendet, die daraufhin Samen oder Körner ausbilden. Die Samen können geerntet, ausgesät und hinsichtlich der morphologischen und biochemischen Eigenschaften bewertet werden, die durch die von den Trägerpartikeln in die Pollen eingeschleuste DNA erzeugt worden sind. Alternativ können unreife Embryos aus den sich entwickelnden Samengeweben herausgelöst und in einer geeigneten Gewebekultur zu kleinen Pflänzchen oder zu vollständigen Pflanzen gezogen werden. Die Pflanzen, Pflänzchen oder Gewebe von ihnen können anschließend in einem Selektionsverfahren auf der Grundlage eines selektierbaren Markers untersucht werden, der von der DNA getragen wird, mit der die Pollenzellen transformiert worden sind. Geeignete selektierbare Marker schließen exogene Resistenzeigenschaften wie Herbizid- oder Antibiotikaresistenzen oder morphologische Eigenschaften ein, deren Expression wahrgenommen werden kann.
• Obgleich die Vorrichtung gemäß Fig. 1 in besonderer Weise für das erfindungsgemäße Verfahren der Pollen-vermittelten Transformation von Pflanzen entwickelt worden ist, ist davon auszugehen, daß die Vorrichtung als solche gleichermaßen zur Transformation von anderen Gewebetypen, Pflanzen, Tieren oder Bakterien mit beschleunigten Partikeln geeignet ist. Die Vorrichtung erlaubt ein einfaches Einstellen der Partikelkraft durch Veränderung des Abstandes oder der Entladungsspannung. Sie ist relativ leicht zu handhaben, effizient und stabil, so daß Ergebnisse wiederholt werden können.
• Bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren erfordern die Verfahrensschritte der Aufbringung der DNA-Sequenzen auf die Partikel, der Aufschichtung der Partikel auf die Trägerfolie und der Herstellung der DNA zur Pflanzentransformation gleichermaßen besondere Beachtung. Jedes dieser Details des bevorzugten Verfahrens wird wiederum in bezug auf die Transformation von Pflanzen ausgeführt.
• Die DNA-Sequenz, die ein Fremdgen einschließt, welches in einer für die Pflanzentransformation geeigneten Form hergestellt worden ist, kann in einfacher Weise auf nackte Gold- oder Wolframpellets aufgetrocknet werden. Allerdings neigen derartige DNA- Molekül formen zu einer relativ kurzzeitigen Stabilität und zu einem schnelleren Abbau aufgrund ihrer chemischen Reaktionen mit dem metallischen oder oxidierten Substrat des Partikels selbst. Es ist demgegenüber gefunden worden, daß die DNA-Stränge eine in starkem Maße verbesserte Stabilität aufweisen und selbst über einen Zeitraum von mehreren Wochen nicht signifikant abgebaut werden, wenn die Trägerpartikel zuerst mit einem Einbettmittel beschichtet werden. Als geeignetes Einbettmittel hat sich Polylysin (Molekulargewicht 200 000) erwiesen, das auf die Trägerpartikel aufgetragen werden kann, bevor die DNA-Moleküle auf gebracht werden. Es wird davon ausgegangen, daß auch andere Einbettmittel polymerer oder anderer Art als ähnliche Einbettmittel geeignet sind. Das Polylysin wird auf die Partikel aufgetragen, indem die Goldpartikel in einer 0,02%igen Polylysinlösung gespült und die auf diese Weise beschichteten Partikel mit Luft oder Hitze getrocknet werden. Sobald die mit Polylysin beschichteten metallischen Partikel ordnungsgemäß getrocknet worden sind, können die DNA-Stränge auf die Partikel aufgebracht werden. Die DNA kann auf die Partikel in einem Verhältnis von 3 bis 30 ug DNA pro mg Goldkügelchen aufgebracht werden. In der Praxis hat man zu 100 ug DNA und 30 mg mit Polylysin vorbeschichteten Goldkügelchen von 1 bis 3 um nacheinander 5 ul 10 mM Na&sub2;HPO&sub4; und anschließend 5 ul 10 mM CaCl&sub2; zugegeben, um einen feinen CaHPO&sub4;-Niederschlag bereitzustellen, welcher sich bei der Trocknung der Lösung bildet. Der Niederschlag trägt die DNA auf die Kügelchen. Wenn die Kügelchen und die Phosphat- und Calciumchloridlösung mit der DNA vermischt worden sind, wird die Suspension unter einem Stickstoff (N&sub2;)-Strom unter häufigem Rühren getrocknet. Sobald der Niederschlag getrocknet ist, wird er unverzüglich in 100% Ethanol resuspendiert, um die Partikel auf die Trägerfolie zu plazieren.
• Bei der Aufbringung der Partikel auf die Trägerfolie ist es für ein erfolgreiches Vorgehen bevorzugt, auf der Trägerfolie eine gleichmäßige und reproduzierbare Schicht der Trägerpartikel zu schaffen. Hierfür können die Partikel nicht einfach auf die Trägerfolie aufgestäubt werden, da sie zur Aggregation neigen und daher ungleichmäßig in einer nicht reproduzierbaren Weise auf der Folie verteilt werden. Insbesondere wird die Feuchtigkeit oder der Wassergehalt auf der Folie die Aufbringung der Partikel auf die Folie zerstören und zu unerwünschten Aggregationen führen. Daher ist es zunächst erforderlich, die Mylarfolie zuvor mit einer hydrophilen Beschichtung zu versehen, um ein Tropfen von Wasser beim Aufbringen der Trägerpartikel zu verhindern. Zu diesem Zweck hat sich Hydroxyethylcellulose als geeignet erwiesen, obgleich auch andere ähnliche Materialien wie mit Säure hydrolysierte Cellulose verwendbar sind. Die mit Kunststoff beschichtete aluminisierte Mylarfolie wird mit einer 1%igen Hydroxyethylcelluloselösung abgewischt und anschließend mit ionisiertem Wasser abgespült und luftgetrocknet. Die in 100% Ethanol suspendierten Trägerpartikel mit der die DNA-Stränge enthaltenden präzipitierten Beschichtung werden anschließend auf die Trägerfolie aufgebracht. Es hat sich herausgestellt, daß 50 oder 100 ul einer gut gerührten Suspension der Trägerpartikel in Ethanol erfolgreich auf die Mylarfolie in einer Weise pipettiert werden können, die in vernünftiger Weise gleichförmig und reproduzierbar ist. Anschließend läßt man das pipettierte Aliquot dieser Suspension in einer verschlossenen Petrischale für mindestens 30 Sekunden absetzen. Die Petrischale muß verschlossen werden, um Wirbelströme zu verhindern, die sich aus der Raumluftströmung und einer hohen Verdampfungsrate ergeben, da derartige Wirbelströme möglicherweise zu einem übermäßigen Anhäufen der Partikel und damit zu einer ungleichförmigen Verteilung der Partikel auf der Folie führen. Nach der Absetzphase wird der Meniskus auf gebrochen und der überschüssige Ethanol abgezogen. Der verbleibende Ethanol wird entfernt durch Verdampfung in einer teilweise geöffneten Petrischale.
• Mit diesem Verfahren ist es beabsichtigt, die Trägerpartikel, die mit dem Präzipitat beschichtet sind, welches die DNA-Stränge enthält, auf die Mylar-Trägerfolie zu plazieren. Ein guter Mittelwert für das Auftragen, der sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als erfolgreich erwiesen hat, beträgt ungefähr 0,1 mg Trägerpartikel, die das Präzipitat und die DNA tragen, auf einen Bereich von 9 · 11 mm Trägerfolie. Eine derartige Dichte der Trägerpartikel bei der Aufbringung auf die Trägerfolie führt zu einer guten Überlebensrate der Pollen und ebenfalls zu einer hohen Penetrationsrate der beschleunigten Partikel in die Pollenkörner. Die tatsächliche Beschleunigung und die Penetration der Körner durch die Partikel werden in Abhängigkeit der Größe und des Durchmessers der Pollen variieren, und die Anzahl an Trägerpartikeln kann offensichtlich verändert werden, um gewünschtenfalls mehr oder weniger Partikel pro Querschnittsfläche der Zielzellen bereitzustellen.
• Die DNA zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung muß in einem Vektor konstruiert werden, der geeignet ist zur Expression des exogenen Gens in den Zellen der Maispflanze oder irgendeiner anderen Pflanze, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Die DNA-Sequenz kann chimär sein, aber vollständige, intakte, nicht-chimäre Gene von anderen Pflanzenspezies oder Linien derselben Spezies können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Vektoren für die Expression in Pflanzen müssen im allgemeinen neben der kodierenden Sequenz des gewünschten exogenen Gens geeignete flankierende regulatorische Sequenzen wie einen geeigneten Promotor, der in der Lage ist, die Transkription und Expression in Pflanzenzellen in vivo zu fördern, und einen Translationsterminator einschließen, der in der Lage ist, das Ende der Translation oder das geeignete Prozessieren der RNA in der Weise zu signalisieren, daß eine geeignete Translation der Boten-RNA zur Herbeiführung der Proteinsynthese ermöglicht wird. Es ist zuvor gezeigt worden, daß Pflanzengen- Promotoren, die in der Lage sind, in dikotylen Pflanzen die Transkription und Expression einer Kodierungssequenz herbei zuführen, auch in den monokotylen Pflanzen wie Getreide auf zellulärer Ebene wirksam sind, wenn auch in einigen Fällen mit geringerer Effizienz. Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 5824-5828, September 1985. Derartige Promotoren schließen den Nopalinsynthase-Promotor aus dem pflanzlichen Pathogen Agrobacterium tumefaciens und den Promotor CaMV35s ein, der aus der Sequenz des Cauliflower-Mosaikvirus abgeleitet ist. Eine in Pflanzen wirksame und geeignete Terminationssequenz ist die Polyadenylierungssequenz von dem Nopalinsynthasegen von Agrobacterium tumefaciens. Der Pflanzenexpressionsvektor kann ebenfalls einen in Pflanzenzellen arbeitenden selektierbaren Marker enthalten, um die Selektion transformierter Pflanzen zu erlauben. Der selektierbare Marker kann eine Eigenschaft, die biochemisch analysiert werden kann, oder eine phänotypische Eigenschaft beisteuern, die bei den pflanzlichen Nachkommen beobachtet werden kann. Selbstverständlich sind ein chimärer Promotor oder Kontrollsequenzen im Falle der Verwendung eines nicht-chimären intakten Gens mit flankierenden regulatorischen Sequenzen von derselben oder einer anderen Pflanze in dem vorliegenden Verfahren unwichtig, und das Gen kann mit seiner nativen Sequenz verwendet werden.
• Obgleich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere im Hinblick auf die Pollen-vermittelte Transformation von Mais beschrieben worden ist, sollte davon ausgegangen werden, daß das Verfahren keine nur für Mais geltenden Besonderheiten aufweist, und daß das Verfahren gleichermaßen zur Transformation von Pollen anderer Getreidepflanzen sowie für dikotyle Feldfrüchte wie Sojabohne und Baumwolle als auch für die meisten anderen Pflanzen geeignet ist. Es kann erforderlich sein, die Handhabung der Pollen anderer Spezies und den Abstand derjenigen Teile der Vorrichtung in Abhängig der Spezies zu variieren, die die Geschwindigkeit der Trägerpartikel beeinflussen, aber die grundlegende Vorrichtung und Vorgehensweise können bei anderen Pflanzenspezies angewendet werden.
• Obgleich das erfindungsgemäße Verfahren die Pollen-vermittelte Transformation von Pflanzen betrifft, ist die beschriebene Vorrichtung ferner gleichermaßen geeignet für die Transformation anderer pflanzlicher Gewebe wie embryonale Kalli oder somatische Embryos oder jedwedes andere pflanzliche oder anderes Gewebe in Kultur.
• Da nicht alle Pollen über eingeschleuste Trägerpartikel verfügen werden, und da nicht alle Pollenzellen oder Zygoten der Nachkommenschaft die DNA in ihr Genom aufnehmen werden, wird es erforderlich sein, die pflanzlichen Nachkommen zu einem bestimmten Zeitpunkt zur Auswahl von Transformanten einem Screening zu unterziehen. Wenn es gewünscht ist, eine Pflanze mit einem gegebenen Fremdgen zu transformieren, kann das Gen in einen chimären Expressionsvektor insertiert werden. Der chimäre Expressionsvektor könnte dann gemeinsam mit einem selektierbaren Markerplasmid wie dem nachfolgend beschriebenen pCMC1022 zur Transformation der Pflanzenzellen verwendet werden. Die beiden Vektoren (Fremdgen und selektierbarer Marker) können miteinander ligiert werden, um ein Plasmid herzustellen, oder die beiden Vektoren können getrennt voneinander kloniert und anschließend gemeinsam auf dieselben Trägerpartikel aufgebracht werden. In jedem Fall werden die produzierten Nachkommen hinsichtlich des Markers abgesucht, um die transformierten Nachkommen auszuwählen. Während die Verwendung eines derartigen selektierbaren Markers unter bestimmten Umständen gewünscht sein kann, kann davon abgesehen werden, wenn ein geeigneter morphologischer oder biochemischer Test vorhanden ist, um ein Screening hinsichtlich der transformierten Nachkommen durchzuführen. Ein morphologischer Screeningtest könnte hinsichtlich einer dominanten phänotypischen Eigenschaft der Nachkommen erfolgen. Ein geeigneter biochemischer Screeningtest könnte eine sog. "Southern" Blot- Hybridisierung hinsichtlich der Existenz der transformierenden DNA in dem Genon der pflanzlichen Nachkommen sein.
Beispiele 1. Herstellung von Vektoren A. Antibiotika-Resistenz
• Die Herstellung geeigneter Pflanzenexpressionsvektoren ist schematisch in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Fig. 2 veranschaulicht schematisch die Herstellung eines Pflanzenexpressionsvektors pCMC 1208. Die Herstellung des Plasmids pCMC 1208 begann mit der Spaltung des Plasmids pBR 325 (F. Bolivar, Gene, 4 : 121-136 (1978)) mit der Restriktionsendonuklease Taq I. Das Plasmid pBR 325 enthält eine Kodierungssequenz für das Antibiotika-Resistenzgen Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT), welche aus dem verbleibenden Rest des Plasmids durch Verdau mit Taq I herausgeschnitten wird. Nach Spaltung von pBR 325 wurden die Fragmente elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt, und das Fragment, welches das CAT-Gen enthielt, wurde herausgeschnitten. Das CAT-Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pUC 9 (Viera & Messing, Gene, 19 : 259-268 (1982)) ligiert, welches zuvor mit dem Restriktionsenzym Acc I gespalten worden war. Die durch Taq I und Acc I hergestellten Fragmentenden sind in diesem Fall komplementär, und daher konnten die Stränge direkt ligiert werden. Das in Fig. 2 mit pUC-CAT bezeichnete resultierende Plasmid enthielt die CAT-Kodierungssequenz, flankiert von Bereichen des Polylinkers von pUC9. Dieses Plasmid wurde mit Pst I und BamH I gespalten, und das kleinere der beiden Fragmente wurde mittels Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend mit einem intermediären Pflanzenexpressionsvektor pCMC 66 ligiert, welcher zuvor mit Pst I und BamH I gespalten worden war, um das CAT-Expressionsplasmid pCMC 1205 herzustellen. Das Plasmid pCMC 66 enthält den Nopalinsynthasepromotor (Nos Pr) aus Agrobacterium tumefaciens und eine Nopalinsynthase-Polyadenylierungssequenz (Poly A) aus demselben Organismus, umgebend sechs, für das Plasmid einmalige Restriktionsstellen. Das Plasmid pCMC 66 trägt ferner eine Version des β-Lactamasegens (bla), das in Bakterien eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin exprimiert, so daß eine Resistenz gegenüber Ampicillin in nachfolgenden, in E. coli durchgeführten Rekombinationen als Selektionsmarker verwendet werden kann.
• Das Plasmid pCaMV 10 (Gardner et al., Nucl. Acid Res., 9 : 2871-2888 (1981)) wurde mit Stu I gespalten, und das den Cauliflower- Mosaikvirus-35-Promotor (CaMV 35s) enthaltende Fragment wurde mit synthetischen Xho I-Oligonukleotidlinkern verknüpft. Das Fragment wurde anschließend mit Hph I verdaut, mit einer DNA- Polymerase zur Bildung glatter Enden behandelt, und anschließend mit den synthetischen Hind III-Oligonukleotidlinkern verknüpft. Eine Spaltung dieses Fragments mit sowohl Xho I als auch Hind III führte zu einem Fragment, das den CaMV35s-Promotor und die Transkriptionsstartstelle enthielt und an seinen Enden durch Addition der Restriktionsstellensequenzen modifiziert war.
• Der Nopalinsynthase-Promotor wurde aus pCMC 1205 durch Verdau des Plasmids mit Xho I und Hind III herausgeschnitten. Das größere der auf diese Weise hergestellten beiden Fragmente wurde mit dem CaMV35s-Promotorfragment ligiert, um pCMC 1208 herzustellen, welcher ein Pflanzenexpressionsvektor ist mit dem CaMV35s-Promotor, der CAT-Kodierungssequenz und der Nopalinsynthase-Polyadenylierungssequenz in der angegebenen Reihenfolge. Die CaMV35s-Promotor- und PolyA-Sequenzen dienten als flankierende regulatorische Sequenzen für die CAT-Kodierungssequenz.
• Beide Plasmide pCMC 1205 und pCMC 1208 wurden hinsichtlich ihrer Aktivität in Mais untersucht, indem sie mittels Elektroporation in Protoplasten eingeführt wurden und nachfolgend eine Analyse auf CAT-Aktivität erfolgte. Beide Konstruktionen erwiesen sich als aktiv in Maiszellen, aber pCMC 1208 zeigte eine signifikant höhere Aktivitätsrate und wurde daher für Pflanzentransformationsexperimente ausgewählt.
• Das Plasmid pCMC 1208 wurde in der erfindungsgemäßen Vorrichtung und in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Pollen-vermittelten genetischen Transformation von Mais verwendet. Es wurde jedoch gefunden, daß der Assay für die CAT-Aktivität in Maisgewebe einen starken Hintergrund aufwies, so daß das CAT-Gen nicht als optimaler Marker für Mais betrachtet wurde. Folglich wurde das Plasmid weiter manipuliert, um anstelle des CAT-Gens ein anderes Antibiotika-Resistenzgen von höherer Selektivität im Mais in den Vektor zu insertieren, wie in Fig. 3 dargestellt.
• Das Plasmid pCMC 1021 enthält den Nopalinsynthase-Promotor und die Nopalinsynthase-Polyadenylierungssequenz, die eine Kodierungsregion für das Enzym Aminoglykosid-3-Phosphotransferase II (APH 3'II) flankieren, welche zu einer Resistenz gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika wie Kanamycin hervorruft. Da Elektroporationsexperimente ergaben, daß der CaMV35s-Promotor in Mais sehr viel effektiver ist als der Nos Pr, wurde entschieden, den CaMV35s-Promotor auf pCMC 1021 zu übertragen. Das CaMV35s-Fragment aus pCMC 1208, dargestellt in Fig. 3, wurde isoliert durch Verdau mit Xho I und Hind III und Isolierung mittels Elektrophorese. Das Plasmid pCMC 1021 wurde ebenfalls mit Xho I und Hind III gespalten, und das größere Fragment wurde isoliert und mit dem CaMV35s-Fragment ligiert, um pCMC 1022 herzustellen. Im Plasmid pCMC 1022 ist die Kodierungssequenz für APH 3'II von den regulatorischen CaMV35s- und Nos pA-Sequenzen flankiert.
• Beide Plasmide pCMC 1208 und pCMC 1022 erwiesen sich nach Elektroporationstransformation und Proteinassays als wirksam zur Transformation und Expression in individuellen Zellen von Tabak, Baumwolle, Sojabohne und Mais. Pflanzenzellen, die in Kultur mit dem APH 3'II transformiert wurden, zeigten bei Baumwollen-, Sojabohnen- und Maiszellen eine Resistenz gegenüber Kanamycin.
B. Endosperm-Farbmarker
• Es wurde ein mit pMBzRI bezeichnetes Plasmid erhalten, das ein ungefähr 9,9 Kilobasen großes Eco RI-Fragment der genomischen DNA von Mais enthält, welches das vollständige, für das Enzym UDP Glukose-flavored Glukosyltransferase einschließt, ein Enzym, welches für die Synthese von Anthocyanpigmenten in der Maispflanze erforderlich ist. Das genomische Fragment enthält extensive, sowohl 5,- als auch 3'-flankierende DNA, und es wird daher erwartet, daß es geeignete regulatorische Sequenzen einschließt, die in Mais zur Expression des Gens wirksam sind. Da das klonierte Gen eine Kopie vollständiger Länge des normalen, funktionellen Maisgens ist, würde man erwarten, daß das klonierte Gen in Maiszellen voll aktiv und entsprechend funktionieren würde.
• Das Enzym selbst, UDP-Glukose-Flavonol-Glykosyltransferase, ist als selektierbarer Marker für die genetische Transformation von Mais geeignet, da Maislinien erhältlich sind, die rezessive Mutationen tragen, welche das endogene Gen aktivieren. Da das Enzym für das pflanzliche Wachstum und die Entwicklung nicht essentiell ist, sind die Pflanzen der mutierten Linien normal mit Ausnahme fehlender roter Anthocyanpigmente, die in zahlreichen Geweben des Wildtyps oder nicht-mutierter Maispflanzen gebildet werden. Die Einführung des Wildtyp-Gens in homozygote Mutantenlinien führt zu der Bildung des Enzyms und daher schließlich zur Bildung von Anthocyanen, so daß transformierte Pflanzen auf einfache Weise aufgrund ihrer charakteristischen Farbe identifiziert werden können. Damit ist das Plasmid pMBzRI ohne Veränderung zur Verwendung als Modellexpressionsvektor für Mais, und wenn es mit einem anderen interessierenden Gen gekoppelt ist, als praktischer, auffindbarer Transformationsmarker geeignet. Dies ist ein Beispiel eines potentiell geeigneten nicht-chimären Gens.
2. Transformation von Mais unter Verwendung von pCMC 1022
• Eine zur Verwendung als Trägerpartikel vorgesehene Menge von Goldkügelchen mit einem Durchmesser von 1 bis 3 um wurde mit Polylysin durch Eintauchen in 0,02% Polylysin vorbeschichtet und luftgetrocknet. 100 ug pCMC 1022 DNA in wäßriger Lösung wurden 33 mg beschichtete Kügelchen und anschließend nacheinander 5 ul 10 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 5 ul 10 mM CaCl&sub2; zugegeben, wodurch bei der Trocknung der Lösung unter einem Stickstoffstrom ein feines Präzipitat gebildet wurde. Die getrockneten und mit dem Präzipitat beschichteten Kügelchen wurden anschließend in 100% Ethanol resuspendiert und auf aluminisierte 2,0 Milliinch Mylarfolien von ungefähr 1 cm · 1 cm aufgebracht, die mit Kunststoff beschichtet waren. Die beschichteten Kügelchen wurden in einer Enddichte von 0,1 mg/cm² auf die Mylar-Trägerfolie aufgebracht.
• Die die beschichteten Kügelchen tragende Trägerfolie wurde oberhalb des Distanzringes 16 der Vorrichtung gemäß Fig. 1 angeordnet. Aus dem Zuckermais der Sorte Early Sun-Glo wurden mit der Hand Pollen gesammelt. Der Boden einer 60 mm Petrischale wurde mit einer dünnen Schicht Mineralöl versehen und die Pollen wurden hierauf aufgestäubt. Überschüssige Pollen wurden entfernt, indem die Petrischale umgedreht wurde, so daß eine Monoschicht erhalten wurde. Die Petrischale wurde verwendet als Zieloberfläche 22 in der Vorrichtung gemäß Fig 1.
• Ein Vakuum von 55-60 mm Hg wurde an die zusammengesetzte Vorrichtung gemäß Fig. 1 angelegt. Eine Entladung von 15 kV aus dem 1 uF-Kondensator wurde von den Elektroden 14 erzeugt, wodurch die beschichteten Partikel in Richtung der Pollen auf der Zieloberfläche 22 beschleunigt wurden.
• Das Verfahren zur Herstellung der Kügelchen und Pollen sowie der Feuerung der Vorrichtung gemäß Fig. 1 wurde mehrere Male wiederholt, bis sich eine adäquate Menge an behandelten Pollen angesammelt hatte. Die behandelten Pollen wurden mit einer Bürste von dem Boden der Petrischale abgebürstet und mit der Hand zur Bestäubung der Blüten weiblicher Pflanzen der Hybridsorten Kaltenberg 390 und CFS 5504 verwendet. Die Blüten wurden auf physikalische Weise von anderen Pollen isoliert.
• Von den auf diese Weise bestäubten Ähren wurden 52 Körner gebildet. Die unreifen Embryos wurden 14 Tage nach der Bestäubung aus den Ähren herausgelöst und in Kultur genommen auf einem Gewebekulturmedium für Maisembryos, enthaltend 50 ppm Kanamycin. Die Sämlinge, die sich auf dem Medium entwickelten, wurden direkt auf ihre APH-3'II-Aktivität analysiert, wobei sich 3 Sämlinge als positiv erwiesen, was darauf hindeutet, daß das Enzym APH-3'II in den Geweben des Sämlings exprimiert worden war, wodurch eine erfolgreiche Transformation dieser Pflanzen angezeigt wird.
• Eine dieser Pflanzen wurde vor der Überführung in ein Gewächshaus zur weiteren Anzucht auf ein nicht-selektives Medium überführt. Blattgewebe wurde hinsichtlich einer fortdauernden APH- 3'II-Aktivität analysiert und erwies sich als positiv.
• Die Anwesenheit von pCMC 1022-Sequenzen in der aus diesen Pflanzen und aus einer anderen Pflanze, die sich nicht als positiv erwies, isolierten DNA wurde mittels der Hybridisierungstechnik nach Southern bestimmt. Southern, J. Mol. Bio., 98 : 503-577 (1975). Die DNA wurde aus Kontroll- und Testmaisblattproben isoliert mittels Mikromodifikation der Cetyltrimethylammoniumbromid-Methode von Taylor und Powell, Focus, 4 : 4-6 (1982). 10 ug von jeder DNA-Probe wurden mit den Restriktionsenzymen Ava I und Hind III geschnitten, in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer ³²P-markierten Sonde hybridisiert, die mit dem nicht-kodierenden Strang der APH-II-Kodierungsregion korrespondierte. Nach Waschen des Filters wurden die hybridisierenden DNA-Fragmente autoradiographisch sichtbar gemacht.
• Das erwartete Fragment von 1 kb wurde in keiner Pflanze gefunden. Jede dieser Pflanzen zeigte jedoch ein ungefähr 4 kb großes Fragment, das mit der APH-3'II-Sonde hybridisierte und in keiner der nicht-transformierten DNA-Kontrollproben von Mais gefunden wurde. Eine der beiden Pflanzen (die für APH II positiv war) zeigte ferner ein in spezifischer Weise hybridisierendes Fragment von 3,7 kb. Die Tatsache, daß das beobachtete Fragment nicht die erwartete Größe aufweist, ist nicht allzu überraschend, da bei DNA, mit der pflanzliche und tierische Zellen transfiziert werden, im allgemeinen komplexe Restriktionsmuster beobachtet werden. Perucho et al., Cell, 22 : 309-317 (1980); Kiens et al., Plant Mol. Biol., 5 : 223-224 (1985); Paszkowski et al., EMBO J., 3 : 2717-2722 (1984); Riggs und Bates, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 5602-5606 (1986). Darüber hinaus kann die DNA in eukaryotischen Zellen z. B. durch Methylierung derart modifiziert sein, daß die erwarteten Restriktionsmuster verändert werden. Chandler und Walbot, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 1767-1771 (1986). Es ist bekannt, daß die beiden in diesem Beispiel eingesetzten Restriktionsendonukleasen Ava I und Hind III durch eine spezifische Methylierung innerhalb ihrer Erkennungssequenzen inhibiert werden können. McClelland und Nelson, Nucleic Acid Res., 13:r201-r207 (1985). Die Länge des Fragments von 4 kb entspricht der Einheitslänge des Plasmids pCMC 1022 und deutet darauf hin, daß diese Pflanzen tandemartig dublizierte Kopien des Plasmids enthalten. Ein Verdau mit nur einem der Enzyme würde dann die beobachteten Plasmid-Fragmentlängen erzeugen. Das Fragment von 3,7 kb scheint aus einer Umgruppierung des Plasmids herzurühren, vielleicht im Bereich seiner Verbindungsstelle mit der Mais-eigenen DNA.
• Zwei zusätzliche Replikate wurden erzeugt unter identischer Anwendung des obigen Verfahrens mit Pollen von Pflanzen des Typs CFS 5504, die auf Ähren desselben Typs aufgebracht wurden. Zwei aus dieser Vorgehensweise resultierende Pflanzen wurden aus den gebildeten Pflanzen zufällig ausgewählt, auf APH-3'II sowie mittels Southern Blot analysiert. Keine der beiden Pflanzen zeigte eine APH-3'II-Aktivität, wiesen aber das hybridisierende Fragment von 4,0 kb in ihrem Genom auf.
• Ein weiteres Replikat aus einem identischen Verfahren mit Pollen von A188 und einer mütterlichen Flint-Pflanze führte wiederum zu einer Nachkommenschaft, aus der eine Pflanze für die Analyse zufällig ausgewählt wurde. Die Blätter dieser Pflanze, die hinsichtlich APH-3'II positiv waren, zeigten in der Southern Blot-Analyse das Fragment von 4,0 kb.
3. Verwendung von pCMC 1022 mit anderen Genen
• Um Mais oder andere Pflanzen mit anderen interessierenden Genen zu transformieren, kann das Plasmid pCMC 1022 auf verschiedene Weise verwendet werden. Die für APH-3'II kodierende Sequenz kann durch Verdau von pCMC 1022 mit Hind III und Bam HI deletiert werden, und eine andere interessierende Gensequenz, die mit geeigneten Enden hergestellt worden ist, kann an ihrer Stelle ligiert werden. Wenn das interessierende Gen sich in vernünftiger Weise für eine Selektion eignet, kann das Plasmid direkt für Transformationen eingesetzt werden. Wenn das interessierende Gen separat mit geeigneten regulatorischen Sequenzen hergestellt wird und ein nachweisbarer Marker gewünscht ist, kann das interessierende Gen mit seinen regulatorischen Sequenzen in jede Stelle des Polylinkers stromaufwärts der CAMv35s-Sequenz in pCMC 1022 insertiert werden. Eine andere Alternative der Nutzbarmachung des nachweisbaren Markers von pCMC 1022 ist die Herstellung des interessierenden Gens in pCMC 1022 oder irgend einem anderen Pflanzenexpressionsvektor, und die gemeinsame Beschichtung der hier dargelegten Trägerpartikel mit pCMC 1022 und dem Genexpressionsvektor zur Transformation von Pflanzenzellen.
• Das Plasmid pCMC 1022 wurde am 14. November 1986 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 67269 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, hinterlegt.
• Die obige Hinterlegung erfolgte gemäß einem Vertrag zwischen der ATCC und der Cetus Corporation, einem Partner bei der Übertragung der vorliegenden Erfindung. Der Vertrag mit der ATCC sichert eine permanente Verfügbarkeit der Nachkommen dieser Zelllinien für die Öffentlichkeit bei Erscheinen des US-Patents, welches die Hinterlegung beschreibt und identifiziert, oder bei Veröffentlichung oder Offenlegung irgendeiner US- oder fremden Patentanmeldung, welche auch immer zuerst erscheint, und die Verfügbarkeit der Nachkommen dieser Zellinien für jemanden, der von einem Beamten der amerikanischen Patent- und Warenzeichen- Behörde gemäß 35 USC $ 122 und den diesbezüglichen Regeln dafür ermächtigt worden ist (einschließlich 37 CFR $ 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 O.G. 638). Der Bevollmächtigte der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, daß im Falle eines Absterbens, eines Verlustes oder einer Zerstörung der hinterlegten Zellinien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen, diese sofort nach Benachrichtigung durch eine lebensfähige Kultur derselben Zellinie ersetzt wird.
• Die vorliegende Erfindung wird durch die hinterlegten Mikroorganismen in ihrem Umfang nicht beschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen lediglich eine einzige Veranschaulichung eines Aspekts der Erfindung betreffen, und jeder Mikroorganismus, der funktionell äquivalent ist, liegt innerhalb des Bereichs dieser Erfindung.
• Es ist ebenfalls davon auszugehen, daß sämtliche Basenpaargrößen, die für Nukleotide angegeben sind, ungefähre Angaben darstellen und für die Zwecke der Beschreibung verwendet worden sind.
• Das Fremdgen wird vorzugsweise auf Trägerpartikel aufgezogen, die in Richtung der Pollen beschleunigt werden.
• Das Fremdgen kann eine Kodierungssequenz und geeignete flankierende regulatorische Sequenzen einschließen, damit die Kodierungssequenz in Geweben der Pflanze exprimiert wird.

Claims (32)

1. Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter lebender Zellen, umfassend die Schritte:

- Herstellung von Kopien eines Fremdgens einschließlich einer kodierenden Region und flankierender regulatorischer Sequenzen, die zur Expression der kodierenden Region in den Zellen wirksam sind,

- Beschichtung biologisch inerter Trägerpartikel mit Kopien des Fremdgens,

- Aufbringung der Partikel auf eine ebene Trägerfolie,

- Beschleunigung der Trägerfolie durch Einwirkung einer Verdichtungswelle auf die Trägerfolie, und Dämpfung der Trägerfolie in der Weise, daß die Trägerpartikel durch ihre Bewegungsenergie von der Folie fortgetragen werden, so daß sich einige Partikel in dem Inneren einiger Zellen ansammeln, und

- Screening nach transformierten Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die zum Beschuß der Trägerfolie erzeugte Verdichtungswelle erzeugt wird durch eine elektrische Hochspannungsentladung über einen Elektrodenabstand, der durch einen Wassertropfen überbrückt ist.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, bei dem die biologisch inerten Partikel metallisch sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die metallischen Partikel Goldkügelchen sind.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, umfassend den Schritt der Beschichtung der metallischen Partikel mit einem Einbettmittel, bevor sie mit den Genkopien beschichtet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Einbettmittel Polylysin ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, bei dem der Schritt der Beschichtung der metallischen Partikel mit den

Fremdgenkopien das Trocknen einer Lösung von Genkopien auf den Partikeln einschließt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem eine Lösung der Genkopien CaHPO&sub4; einschließt, welches mit den Genkopien auf die metallischen Partikel präzipitiert wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Trägerpartikel auf die Trägerfolie aufgebracht werden, indem die Trägerpartikel in Ethanol suspendiert werden und die ethanolische Suspension auf die Trägerfolie aufgebracht und getrocknet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die lebenden Zellen Pflanzenzellen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Pflanzenzellen, in die die Trägerpartikel durch Beschleunigung eintreten, Pollenzellen sind, wobei die auf diese Weise behandelten Pollen zur Bestäubung weiblicher Organe der Pflanze verwendet werden und die Nachkommenschaft aus der Bestäubung hinsichtlich transformierter Nachkommen abgesucht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem eine Monoschicht von Pflanzenpollen auf eine Zieloberfläche aufgebracht wird, und die Zieloberfläche in den Beschleunigungsweg der Trägerpartikel plaziert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, umfassend das Aufbringen einer Schicht aus Mineralöl auf die Zieloberfläche, das Aufstäuben von Pollen darauf, und das Entfernen von überschüssigem Öl davon.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, bei dem der Schritt der Bestäubung weiblicher Organe der Pflanze erfolgt, indem Pollen, in die Partikel mittels Beschleunigung eingedrungen sind, von der Zieloberfläche mit einem Pinsel abgebürstet werden und diese Pollen auf die weiblichen Organe einer ausgewählten weiblichen Mutterpflanze aufgestäubt werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Screening nach transformierten Zellen auf der Grundlage eines biochemischen Assays erfolgt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem sich der Assay auf Antibiotika-Resistenz bezieht.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, bei dem das Screening nach transformierten Zellen auf der Grundlage einer morphologischen Pflanzeneigenschaft erfolgt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, bei dem die Pflanzen Mais sind.

19. Maispollen, der ein fremdes chimäres Gen und mindestens ein Trägerpartikel umfaßt, welches das Fremdgen physikalisch in den Pollen eingeführt hat.

20. Maispollen nach Anspruch 19, in dem das Fremdgen eine kodierende Sequenz und geeignete flankierende regulatorische Sequenzen einschließt, so daß die kodierende Sequenz in den Nachkommen des Pollens exprimiert wird.

21. Vorrichtung zur Injektion von DNA-tragenden Trägerpartikeln in lebende Zellen auf einer Zieloberfläche, wobei die Vorrichtung umfaßt:

- eine ebene Trägerfolie, die so eingerichtet ist, daß auf der Oberfläche der Folie eine Schicht von mit DNA beschichteten biologisch inerten Trägerpartikeln aufgebracht werden kann,

- Mittel zur Erzeugung einer ausreichenden Verdichtungswelle, um die Trägerfolie mit den darauf befindlichen Trägerpartikeln in Richtung der Zieloberfläche zu beschleunigen, und

- Dämpfungsmittel, das sich in der Fortbewegungsrichtung der Trägerfolie zur Zieloberfläche befindet und derart angeordnet und konstruiert ist, daß die Trägerfolie gedämpft wird, wenn die Trägerfolie durch eine Verdichtungswelle beschleunigt wird, so daß die Trägerpartikel durch die Beschleunigung in die Zellen auf der Zieloberfläche eindringen.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der das Mittel zur Erzeugung einer Verdichtungswelle in der Weise konstruiert und angeordnet ist, daß eine Verdichtungswelle erzeugt wird durch eine elektrische Hochspannungsentladung über einen Elektrodenabstand, der durch einen Wassertropfen überbrückt ist.

23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, bei der das Mittel zur Erzeugung einer Verdichtungswelle einstellbar ist, so daß die Stärke der erzeugten Verdichtungswelle einstellbar ist.

24. Vorrichtung nach den Ansprüchen 21, 22 oder 23, bei der das Dämpfungsmittel ein Rückhaltesieb umfaßt.

25. Vorrichtung zum Injizieren von DNA-tragenden Partikeln in lebende Zellen, umfassend: eine Funkenentladungskammer (12); zwei Elektroden (14), die in die Funkenentladungskammer hineinragen und durch einen Elektrodenabstand voneinander entfernt sind, wobei die Elektroden derart beschaffen sind, daß sie an eine externe Hochspannungsentladungsquelle angeschlossen werden können; eine Trägerfolie (18), die in einem Abstand oberhalb der Funkenentladungskammer angeordnet ist und die Trägerpartikel empfängt; ein Rückhaltesieb (20), das oberhalb der Trägerfolie angeordnet ist; und eine Zieloberfläche (22), die in einem Abstand oberhalb des Rückhaltesiebs (20) angeordnet ist und die Zellen trägt, so daß die Trägerfolie (18) durch die in der Entladungskammer (12) mittels Funkenentladung erzeugte Verdichtungswelle in Richtung des Rückhaltesiebs (20) beschleunigt wird, so daß die Trägerpartikel mittels Beschleunigung in die Zellen auf der Zieloberfläche (22) eindringen.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, bei der zur Überbrückung des Abstandes zwischen den Elektroden (14) ein Wassertropfen (24) vorgesehen ist.

27. Vorrichtung nach Anspruch 25 oder 26, die eine Vakuumkammer umfaßt, um den Betrieb der Vorrichtung in einem Teilvakuum zu ermöglichen.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, bei der der Elektrodenabstand zwischen den Elektroden 1 bis 1,5 mm beträgt.

29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 28, bei der ein Distanzring (16) oberhalb der Funkenentladungskammer (12), aber unterhalb der Trägerfolie (18) angeordnet ist und an seinem oberen Ende mindestens eine partielle Öffnung aufweist.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, umfassend eine einstellbare, externe Quelle für eine Hochspannungsentladung, die derart an die Elektroden angeschlossen ist, daß die Hochspannungsentladung auf eine Spannung von bis zu 15 kV eingestellt werden kann.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, bei der die externe Quelle einen Kondensator umfaßt, in dem die Hochspannungs-Entladungsenergie bis zur Entladung durch die Elektroden gespeichert wird.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 31, in der die Trägerfolie aus aluminisiertem Mylar ist.