CN101878306A - 使用细胞色素p450的金刚烷羟基化物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
提供作为功能性树脂或药物的中间体有用的具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物的高收率且廉价的制备方法。可以使用细胞色素P450得到具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物。具体地,通过将N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物羟基化,可以制备N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物。
Description
技术领域
本发明涉及使用细胞色素P450的金刚烷羟基化物的制备方法。
背景技术
金刚烷羟基化物,作为光刻法领域中的感光性树脂等功能性树脂的单体(专利文献1)、或药物领域中的11β-羟基类固醇脱氢酶I型(11βHSD1)的抑制剂(专利文献2、27页)是已知的。此外,作为DPPIV抑制剂,已知具有金刚烷基的化合物。而且,合成这些化合物时,金刚烷羟基化物的一部分的取代基被保护的化合物从其反应性考虑,作为合成中间体是有用的。
一直以来已知使用微生物的金刚烷衍生物的羟基化物的生产方法。例如,可以利用Beauveria sulfurescens的生物转化,生产被苯甲酰胺保护的金刚烷衍生物的羟基化物(非专利文献1)。此外,对于被酞酰亚胺保护的金刚烷衍生物,有报告指出通过Sporotrichum sulfurescens的生物转化,可以生产二羟基物(非专利文献2)。
细胞色素P450(以下也称为P450)为还原与一氧化碳结合时,在450nm附近表现出特异性的吸收带(索雷谱带)的含血红素的蛋白质的总称。P450除了与许多的动植物组织、真菌(カビ)、酵母的微粒体,一部分动植物组织的线粒体的内膜结合之外,在某些种的细菌、真菌中以可溶性的方式存在。
P450具有各种基质特异性,有可以以各种有机化合物为基质的表现出非常宽的基质特异性的酶,另一方面也存在仅与比较有限种类的有机化合物反应的基质特异性相当严格的酶。P450参与作为生理活性脂质的胆固醇、类固醇激素、胆汁酸、活性型维生素D的生物合成,血红素、脂肪酸或类花生酸的代谢,以及含有药物的外源化学物质的代谢等。作为P450的具体的机能,已知对表达该P450的细胞的生物异源物质(生物异源物质xenobiotic)的羟基化反应、环氧化反应、脱烷基化反应、脱氮反应等各种反应进行催化的机能。
已知来自微生物的例如真菌或细菌中、对工业上有用的物质的生产起作用的P450的例子,一部分实际上用于有用药物的工业生产。代表性的例子为通过Streptomyces carbophilus将密实菌素(compactin)的6β位羟基化,得到作为产物的高脂血症的治疗药普伐他汀(非专利文献3、专利文献3)。利用Pseudonocardia autotrophica将维生素D3的1α位和25位羟基化来生产活性型维生素D3的方法也得到实用化。
对于金刚烷的羟基化,在非专利文献4中记载了通过作为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的P450的P450cam将金刚烷羟基化的技术。此外,在非专利文献5中,暗示了由470种的微生物筛选将金刚烷羟基化的5种微生物,P450参与其中之一的灰平链霉菌(Streptomycesgriseoplanus)的金刚烷的羟基化。
但是,在任意一个文献中,对于使用P450的具有金刚烷骨架的化合物的羟基化、例如使用P450的N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的羟基化都没有记载或暗示。
[专利文献1]日本特开2006-63061号公报
[专利文献2]国际公开第WO04/056744号小册子
[专利文献3]日本特开平6-70780号公报
[非专利文献1]Journal of Organic Chemistry、1992年、57卷、P.7209-7212
[非专利文献2]The Journal of Organic Chemistry、1968年、33卷、p.3201-3207
[非专利文献3]Gene、1995年、163卷、p.81-85
[非专利文献4]Archives of Biochemistry and Biophysics、1984年、228卷、p.493-502
[非专利文献5]Applied Microbiology and Biotechnology)、2006年、71卷、p.502-504
发明内容
本发明的目的在于,提供具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物(例如,N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物)的使用P450的高收率且稳定的制备方法,该具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物为用作功能性树脂、药物的中间体的单羟基-2-金刚烷胺的原料。
本发明人进行了深入研究,结果发现了使用P450之一的CYP109B1,将具有金刚烷骨架的化合物的金刚烷部分羟基化的方法。具体地,首次发现可以由N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物生产N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物。此外,发现使用通过改变CYP109B1得到的CYP109B1突变体、109FK、109FK突变体,可以提高N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的生产效率。此外发现,得到的N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物为作为药物的中间体优选的反式体100%。
即,本发明涉及以下技术方案。
(1)N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的制备方法,其特征在于,使用细胞色素P450,将N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物羟基化。
(2)(1)记载的制备方法,其中,细胞色素P450为由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或由在所述氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且具有羟基化活性的蛋白质。
(3)(1)记载的制备方法,其中,细胞色素P450为由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L和F232M中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质,或由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
(4)(1)记载的制备方法,其中,N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物为下式所示的化合物,
[化学式1]
(式中,R为氢或亲水性基团)。
(5)(1)记载的制备方法,其中,N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物为下式所示的化合物,
[化学式2]
(式中,R为氢或亲水性基团)。
(6)下式所示化合物的制备方法,
[化学式3]
其特征在于,通过(1)~(5)中任意一项记载的制备方法得到N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物,并进行脱保护。
(7)(6)记载的制备方法,其特征在于,不分离N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物。
(8)式(III)所示化合物的制备方法,
[化学式4]
其特征在于,通过(6)或(7)中任意一项记载的制备方法得到(I)所示的化合物,使其与式(II):A-R1-R2-R3-X(式中,A为可以被取代的环烃基或可以被取代的杂环基,R1为单键、-C(=O)-、-O-或NR4-,R2为单键或可以被取代的亚烷基,R3为单键或C(=O)-,X为羟基、卤素或由羟基衍生的离去基团,R4为氢或可以被取代的烷基)所示的化合物反应。
(9)使用由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或由在所述氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且具有羟基化活性的蛋白质,将具有金刚烷骨架的化合物的金刚烷部分羟基化的方法。
(10)含有在SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列,且具有羟基化活性的蛋白质。
(11)由下述氨基酸序列构成的蛋白质,所述氨基酸序列为SEQ IDNO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L和F232M中的1个或数个突变而成的氨基酸序列。
(12)由SEQ ID NO.:3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或含有在该氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列,且具有羟基化活性的蛋白质。
(13)由下述氨基酸序列构成的蛋白质,所述氨基酸序列为SEQ IDNO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1个或数个突变而成的氨基酸序列。
(14)下式所示的化合物、其盐或它们的溶剂化物。
[化学式5]
(15)下式所示的化合物、其盐或它们的溶剂化物,
[化学式6]
(式中,R为氢或亲水性基团)。
本发明的具有金刚烷骨架的化合物的金刚烷部分的羟基化方法,实现稳定的生产和供给,可以有效、安全且廉价地制备具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物。
具体实施方式
本说明书中使用的术语除了特别说明的情况之外,以该领域中通常使用的意思使用。以下对本说明书中使用的术语进行说明。
本发明中,“细胞色素P450”用作具有金刚烷骨架的化合物的羟基化的催化剂。例如,在通过将N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物羟基化制备N-(5-羟基-2-金刚烷基)苯甲酰胺衍生物的方法中用作催化剂。作为P450的蛋白质是否可以用作具有金刚烷骨架的化合物的羟基化的催化剂,例如可以通过使该蛋白质、或该蛋白质以及由向该蛋白质供给电子的铁氧化还原蛋白和还原酶构成的还原体系作用于作为基质的N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物,是否得到N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物来判断。更具体地说,可以使用用合适的培养基培养可以表达P450的微生物,检出在培养基中蓄积的N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的有无的方法。根据需要,可以通过将由向P450供给电子的铁氧化还原蛋白和还原酶构成的还原体系导入到微生物内来更有效地进行检测。N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的检测例如可以通过使用通过本发明得到的N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物作为标准品的高效液相色谱(HPLC)来进行。具体地说,可以使用在后述实施例中记载的方法。作为本发明中有用的P450,可以举出例如CYP109B1、CYP101、CYP105D等以及它们的衍生物等。
P450的“衍生物”指的是实质上具有与P450相同的生物学机能或活性、即本发明中的羟基化活性的多肽。该多肽的C末端可以为羧基、羧酸盐、酰胺或酯中的任意一种。可以举出例如,与其它蛋白质的融合蛋白质,附加修饰基团得到的修饰物,通过缺失、置换或附加氨基酸残基得到的突变体等。
作为融合蛋白质中使用的“其它蛋白质”,优选为通过融合使该融合蛋白质表现出实质上与P450相同或更强的羟基化活性的蛋白质。可以举出例如,R450Rhf还原酶结构域、P450BM3还原酶结构域等。
作为修饰物的修饰基团,可以举出表现出荧光性的官能团、不参与多肽的立体结构的形成的官能团等。此外,还可以为构成天然来源的P450的氨基酸残基以外的氨基酸残基(例如β-丙氨酸等)。作为表现出荧光性的官能团,可以举出曙红、异硫氰酸荧光素(FITC)等。作为不参与多肽的立体结构的形成的官能团,可以举出以β-丙氨酸残基等为代表的间隔基团等。上述官能团优选存在于末端。
作为突变体,包括由在P450的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成的具有P450机能的蛋白质等。
“缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列”,可以举出例如,含有(A)P450的氨基酸序列中的1个或2个以上(优选1~30个左右、更优选1~10个左右、进一步优选数(1~5)个)的氨基酸缺失而成的氨基酸序列,(B)P450的氨基酸序列中的1个或2个以上(优选1~30个左右、更优选1~10个左右、进一步优选数(1~5)个)的氨基酸被其它氨基酸置换而成的氨基酸序列,(C)在P450的氨基酸序列上附加1个或2个以上(优选1~30个左右、更优选1~10个左右、进一步优选数(1~5)个)的氨基酸而成的氨基酸序列,或(D)将它们组合而成的氨基酸序列的蛋白质。缺失、置换或附加氨基酸序列时,作为该缺失、置换或附加的位置不特别限定。但是,本发明中使用的P450的突变体为即使由于缺失、置换或附加,也具备具有金刚烷骨架的化合物的羟基化的催化剂作用的多肽。可以举出与P450的氨基酸序列具有至少60%以上同源性的多肽,优选为具有80%以上同源性的多肽,进一步优选为具有95%以上同源性的多肽。
本说明书中,“CYP109B1”指的是由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列构成的蛋白质。
“CYP109B1的突变体”指的是含有在SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有羟基化活性的蛋白质。具体地说,可以举出由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L和F232M中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质等。“1个或数个突变”指的是1~5个左右、优选1~3个、进一步优选1个或2个突变。特别优选由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F,I77F和L357P,I77F、M105I和T234A,I77F和F232M中的1~5个、优选1~3个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
“CYP109FK”指的是由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列构成的蛋白质。
“CYP109FK突变体”指的是含有在SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有羟基化活性的蛋白质。具体地说,可以举出由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质等。“1个或数个突变”指的是1~5个左右、优选1~3个、进一步优选1个或2个突变。特别优选由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1~5个、优选1~3个、特别优选1个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
“具有金刚烷骨架的化合物”若为具有金刚烷骨架的化合物,则包含任意的化合物。优选举出被保护的2-氨基金刚烷。
“被保护的2-氨基金刚烷”若为金刚烷胺的氨基被保护的化合物,则包含任意的化合物。而且,金刚烷部分的被羟基化部分以外的部分可以具有取代基。对该取代基不特别限定,可以举出例如,F、Cl、Br、I等卤素,可以被取代的烷基(例如非取代烷基、氨基甲酰基烷基),羟基,烷氧基,硝基,芳基,芳基烷基,羧基,酯(例如烷氧基羰基等),氨基甲酰基,烯基,炔基,氨基甲酰氧基,被保护的羟基(例如烷基羟基等)等作为取代基。优选举出N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物、N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺、N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺、N-(2-金刚烷基)-对甲氧基苄氧基羰基胺等。
“N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物”指的是N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺或其衍生物。作为衍生物,例如包括苯环部分被卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、芳基、芳基烷基、羧基、酯、氨基甲酰基等取代而成的化合物,金刚烷基的被羟基化部分以外的部分被卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、芳基、芳基烷基、羧基、酯、氨基甲酰基等取代而成的化合物,以及苯环部分和金刚烷部分被上述取代基取代而成的化合物。优选举出下式所示的化合物。
[化学式7]
(式中,R为氢或亲水性基团)
“亲水性基团”指的是与水的亲和性强的基团。即,指的是通过静电性的相互作用或氢键等可以与水分子形成弱的键合的原子团。可以举出例如,-OH、-COOH、-NH2、-OSO3H、-SO3H、-OPO3H2等。特别优选-COOH。
“N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物”指的是N-(单羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺或其衍生物。作为衍生物,例如包括苯环被卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、芳基、芳基烷基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基等取代而成的化合物。优选举出下式所示的化合物。
[化学式8]
(式中,R为氢或亲水性基团)。进一步优选举出下式所示的化合物。
[化学式9]
(式中,R为氢或亲水性基团)
通过本发明得到的具有金刚烷骨架的化合物的例如N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物通过除去保护基团,可以容易地转化为单羟基-2-金刚烷胺、即下式所示的化合物。
[化学式10]
此外,本发明中,在由N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物制备N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物,通过脱保护得到单羟基-2-金刚烷胺的步骤中,可以分离N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物,也可以不分离。还可以在制备N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物时,一次性进行纯化、脱保护。此外,如实施例8所述,还可以通过在灭菌的同时进行脱保护,不分离N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物来得到单羟基-2-金刚烷胺。
进一步地,通过使上述得到的单羟基-2-金刚烷胺与式(II):A-R1-R2-R3-X(式中,A为可以被取代的环烃基或可以被取代的杂环基,R1为单键、-C(=O)-、-O-或NR4-,R2为单键或可以被取代的亚烷基,R3为单键或C(=O)-,X为羟基、卤素或由羟基衍生的离去基团,R4为氢或可以被取代的烷基)所示的化合物反应,可以制备式(III)所示的化合物。
[化学式11]
[化学式12]
为使式(I)所示的化合物与式(II)所示的化合物反应,制备式(III)所示的化合物的步骤。
作为溶剂,可以举出N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、芳烃类(例如甲苯、苯、二甲苯等)、饱和烃类(例如环己烷、己烷等)、卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷等)、醚类(例如四氢呋喃、二乙基醚、二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷等)、酯类(例如乙酸甲酯、乙酸乙酯等)、酮类(例如丙酮、甲乙酮等)、腈类(例如乙腈等)、醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等)、水以及它们的混合溶剂等。优选为卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷等)、腈类(例如乙腈等)、醚类(例如四氢呋喃、二乙基醚、二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷等)、醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等)和水等。
虽然不进行限定,但是优选为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲苯、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、二乙基醚、二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、甲苯、四氢呋喃和水。
进一步优选为二氯甲烷、甲醇、乙醇。
R5为-C(=O)-、X为羟基时,该步骤中可以使用缩合剂和碱。作为缩合剂,例如可以使用1,1-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺或水溶性碳二亚胺(1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)等。作为碱,可以举出例如,金属氢化物(例如氢化钠等)、金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钡等)、金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钙、碳酸铯等)、金属醇盐(例如甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾等)、碳酸氢钠、金属钠、有机胺(例如三乙基胺、二异丙基乙基胺、DBU、2,6-二甲基吡啶等)等。
R5为-C(=O)-、X为卤素时,该步骤中可以使用上述记载的碱。
R3为-C(=O)-、R4为可以被取代的亚烷基、R5为单键、X为卤素或由羟基衍生的离去基团时,该步骤中可以使用上述碱。
对反应条件不特别限定,可以在约-20~100℃、优选约-10~80℃下通常搅拌1小时~36小时、优选搅拌1小时~24小时。
如此得到的化合物(III)作为11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂、二肽基肽酶IV(DPP IV)抑制剂和Jak3抑制剂等是有用的。
“卤素”包含氟、氯、溴和碘。
“烷基”指的是碳原子数为1~10的直链状或支链状的烷基,可以举出例如,甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。优选为碳原子数为1~6或1~4个的烷基,可以举出例如,甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基。
“烷氧基”、“烷氧基羰基”的烷基部分的意思与上述烷基相同。
“芳基”可以举出单环芳烃基(例如苯基)和多环芳烃基(例如1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基、9-菲基等)。
“芳基烷基”指的是被上述芳基取代的上述烷基。
“环烃基”包含“环烷基”、“环烯基”、“芳基”。
“环烷基”指的是碳原子数为3~15的环状饱和烃基,可以举出例如,环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥环烃基、螺烃基等。
“桥环烃基”包含从2个以上的环共有2个或更多的原子的碳原子数为5~8的脂肪族环除去1个氢得到的基团。具体地说,可以举出双环[2.1.0]戊基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基和双环[3.2.1]辛基、三环[2.2.1.0]庚基等。
“螺烃基”包含从2个烃环共有1个碳原子构成的环除去1个氢得到的基团。具体地说,可以举出螺[3.4]辛基等。
“环烯基”指的是碳原子数为3~7个的环状不饱和脂肪族烃基,可以举出例如,环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基,优选为环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基。环烯基还包括环中具有不饱和键的桥环烃基和螺烃基。
“杂环基”包含“杂芳基、杂环基”。
“杂芳基”指的是单环芳族杂环基团和稠合芳族杂环基团。单环芳族杂环基团指的是由环内可以含有1~4个氧原子、硫原子和/或氮原子的5~8元芳环衍生的在可以取代的任意位置可以具有键合键的基团。稠合芳族杂环基团指的是环内可以含有1~4个氧原子、硫原子和/或氮原子的5~8元芳环与1~4个的5~8元芳族碳环或其它的5~8元芳杂环稠合而成的在可以取代的任意位置可以具有键合键的基团。可以举出例如,呋喃基(例如2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(例如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(例如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(例如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(例如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、***基(例如1,2,4-***-1-基、1,2,4-***-3-基、1,2,4-***-4-基)、四唑基(例如1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(例如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(例如3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(例如2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(例如3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(例如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(例如3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(例如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咱基(例如3-呋咱基)、吡嗪基(例如2-吡嗪基)、噁二唑基(例如1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(例如2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(例如2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(例如1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、喹喔啉基(2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(例如3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(例如2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(例如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(例如1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(例如1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(例如2-蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(例如1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(例如1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(例如1-吩嗪基、2-吩嗪基)或吩噻嗪基(例如1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)等。
“杂环基”指的是环内可以含有1~4个氧原子、硫原子和/或氮原子,在可以取代的任意位置可以具有键合键的非芳族杂环基团。此外,这种非芳族杂环基团可以进一步通过碳原子数为1~4的烷基链桥联,或与环烷烃(优选5~6元环)、苯环稠合。若为非芳族则可以为饱和的,也可以为不饱和的。可以举出例如,1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶子基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基等。
“亚烷基”包含1~6个亚甲基连接而成的二价基团,具体地可以举出,亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基和六亚甲基等。
“由羟基衍生的离去基团”可以举出-OMs、-OTs、-OTf、-ONs等。其中,“Ms”表示甲磺酰基、“Ts”表示对甲苯磺酰基、“Tf”表示三氟甲磺酰基、“Ns”表示邻硝基苯磺酰基。
作为式(II)和式(III)中的A,优选为可以被取代的杂环基团。进一步优选举出可以被取代的杂芳基或可以被取代的杂环基。更优选举出呋喃、噻吩、吡咯、吡唑、***、噁唑、噻唑、异噻唑、吡啶、吗啉、哌啶、哌嗪、吡咯烷、四氢噻吩、苯并噁嗪、苯并呋喃、吡咯并吡啶。虽然不特别限定,但是特别优选异噁唑和吡唑。此外,作为A,可以举出可以被取代的环烃基。优选为苯基。
作为取代基,可以举出-OR5、-SR5、可以被取代的烷基、可以被取代的烯基、可以被取代的炔基、可以被取代的环烷基、可以被取代的环烯基、可以被取代的芳基、可以被取代的杂芳基、可以被取代的杂环基、式:-CH=CH-C(RaRb)-Rc-Rd表示的基团或式:-(CReRf)m-C(RaRb)-Rc-Rd表示的基团等。
Ra和Rb分别独立地为氢、可以被取代的烷基或卤素,此外Ra和Rb还可以与邻接的碳原子一起形成可以被取代的环,
Rc为-(CH2)n-(其中n为0~3的整数),
Rd为氢、卤素、羟基、羧基、氰基、可以被取代的烷基、可以被取代的烯基、可以被取代的炔基、可以被取代的环烷基、可以被取代的环烯基、可以被取代的芳基、可以被取代的杂芳基、可以被取代的杂环基、式:-C(=O)-NRgRh表示的基团或式:-NRiRj表示的基团,
Re和Rf分别独立地为氢、卤素或可以被取代的烷基,Rg和Rh分别独立地为氢、可以被取代的烷基、可以被取代的烯基、可以被取代的炔基、可以被取代的环烷基、可以被取代的环烯基、可以被取代的芳基、可以被取代的杂芳基、可以被取代的杂环基、可以被取代的烷基磺酰基、可以被取代的环烷基磺酰基、可以被取代的芳基磺酰基、可以被取代的杂芳基磺酰基、可以被取代的杂环基磺酰基、可以被取代的烷氧基、可以被取代的氨基甲酰基,此外Rg和Rh还可以与邻接的氮原子一起形成可以被取代的环,
Ri和Rj分别独立地为氢、羧基、羟基、可以被取代的烷基、可以被取代的烯基、可以被取代的炔基、可以被取代的环烷基、可以被取代的环烯基、可以被取代的芳基、可以被取代的杂芳基、可以被取代的杂环基、可以被取代的酰基、可以被取代的氨基甲酰基、可以被取代的硫代氨基甲酰基、可以被取代的烷基磺酰基、可以被取代的环烷基磺酰基、可以被取代的芳基磺酰基、可以被取代的杂芳基磺酰基、可以被取代的杂环基磺酰基、可以被取代的烷氧基羰基、可以被取代的环烷氧基羰基、可以被取代的芳氧基羰基、可以被取代的杂芳氧基羰基、可以被取代的杂环氧基羰基、可以被取代的烷基羰基、可以被取代的环烷基羰基、可以被取代的芳基羰基、可以被取代的杂芳基羰基、可以被取代的杂环基羰基、可以被取代的氨磺酰基,此外Ri和Rj还可以与邻接的氮原子一起形成可以被取代的环,
R5为可以被取代的烷基、可以被取代的烯基、可以被取代的环烷基、可以被取代的芳基、可以被取代的杂芳基或可以被取代的杂环基,
m分别独立地为1~3的整数。
R1优选为单键。
R2优选为单键。
R3优选为-C(=O)-。
X优选为羟基。
式(II)和式(III)表示的化合物及它们的具体的制备方法集中记载于国际公开第2006/132197号小册子、国际公开第2007/058346号小册子、PCT/JP2007/056538、日本特愿2007-132259中。
将本发明的具有金刚烷骨架的化合物羟基化的方法,例如通过将N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物羟基化来制备N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-苯甲酰胺衍生物的方法(以下有时也称为“本发明的制备方法”)的特征在于,使用具有羟基化活性的P450(以下有时也称为“本发明的蛋白质”)作为催化剂。具体地说,本发明的制备方法含有对作为基质的N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物作用
(a)本发明的蛋白质、或该蛋白质以及由向该蛋白质供给电子的铁氧化还原蛋白和还原酶构成的还原体系,或
(b)可以表达本发明的蛋白质的微生物
中的至少一种,将金刚烷部分选择性地羟基化的步骤。
(a)本发明的蛋白质
本发明的蛋白质可以通过获得并利用编码该蛋白质的多核苷酸(以下有时也称为“本发明的基因”)来制备。以下具体地记载了本发明的基因的获得方法、本发明的蛋白质的制备方法(表达载体的制备方法、转化体的制备方法等)。
(1)本发明的基因的获得方法
利用枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),按照常规方法制备cDNA文库,由此获得本发明的基因。
作为cDNA文库制法,可以举出Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press),Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience),DNACloning 1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition(1995)(Oxford University Press)等中记载的方法,或使用市售的试剂盒,例如SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司制)、ZAP-cDNA Synthesis Kits(Stratagene公司制)等的方法。
作为通过该方法获得的cDNA,可以举出例如编码由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA等,具体地,可以举出由SEQID NO.2记载的碱基序列构成的DNA等。该cDNA可以用于将本发明的基因整合到适当的表达载体中得到的表达用质粒的制备中。对于表达载体、表达用质粒的使用方法等,在“本发明的蛋白质的制备方法”中进行说明。
此外,也可以通过根据氨基酸序列,化学合成编码本发明的蛋白质的DNA来制备DNA。DNA的化学合成,可以使用利用硫代亚磷酸盐(thiophosphite)法的岛津制作所社制的DNA合成机、利用亚磷酰胺(phosphoamidite)法的Perkin Elmer公司制的DNA合成机(型号392)等来进行。
进一步地,根据氨基酸序列,使用寡核苷酸作为正义引物和反义引物,将由表达与这些DNA互补的mRNA的细胞的mRNA制备的cDNA作为模板,进行PCR,由此也可以制备目的DNA。
(2)本发明的蛋白质的制备方法
本发明的蛋白质可以通过使用Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press),Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)等中记载的方法等、例如以下的方法,使编码本发明的蛋白质的多核苷酸在宿主细胞中表达来制备。
作为宿主细胞,若为原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等可以表达目的基因的细胞则可以使用任意一种。作为表达载体,使用可以在上述宿主细胞中自主复制、或可以整合到染色体中,在适于本发明的蛋白质的转录的位置含有启动子的载体。
(i)使用原核生物作为宿主的情况
本发明的蛋白质的表达载体优选可以在原核生物中自主复制的同时,由启动子、核糖体结合序列、编码本发明的多肽的DNA、转录终止序列构成。还可以含有控制启动子的基因。
作为表达载体,可以举出例如,pBTrp2、pBTac1、pBTac2(RocheDiagnostics公司制),Bluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制),pSTV28、pUC118、pUC19(宝酒造社制),pKK233-2(GEHealthcare公司制),pSE280、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen公司制),pGEMEX-1(Promega公司制),pQE-8(Qiagen公司制),pGEX(GE Healthcare公司制),pET system(Novagen公司制),pMAL-c2(New England Biolabs公司制),pKYP10(日本特开昭58-110600),pKYP200(Agricultural Biologycal Chemistry,48,669(1984).),pLSA1(Agricultural Biologycal Chemistry,53,277(1989).),pGEL1(Proceeding of the National Academy of Sciences USA,82,4306(1985).),pEG400(Journal of Bacteriology,172,2392(1990).),pTrs30(FERM BP-5407),pTrs32(FERM BP-5408),pGHA2(FERMBP-400),pGKA2(FERM B-6798),pPA1(日本特开昭63-233798),pTerm2(日本特开平3-22979、US4686191、US4939094、US5160735)等。
作为启动子,若为可以在大肠杆菌等宿主细胞中表达的启动子则可以为任意的启动子。可以举出例如,trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子,SPO1启动子,SPO2启动子,penP启动子等。此外,还可以使用2个Ptrp串联而成的启动子(Ptrpx2)、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子等人为地设计改变而成的启动子等。
优选使用将作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间调节成适当的距离、例如6~18个碱基而成的质粒。本发明的基因的表达中未必需要转录终止序列,但是优选紧邻结构基因下游配置转录终止序列。
作为宿主细胞,可以举出埃希氏菌(Escherichia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、微杆菌(Microbacterium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属等原核生物,作为埃希氏菌属,可以举出大肠杆菌的XL1-Blue株、XL2-Blue株、DH1株、MC1000株、KY3276株、W1485株、JM109株、HB101株、No.49株、W3110株、NY49株、BL21株、BL21(DE3)株、BL21(DE3)pLysS株、HMS174(DE3)株和HMS174(DE3)pLysS株等,作为沙雷氏菌属,可以举出无花果沙雷氏菌(S.ficaria)株、居泉沙雷氏菌(S.fonticola)株、液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)株、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)株等,作为芽孢杆菌属,可以举出枯草芽胞杆菌(B.subtilis)株、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)株等,作为短杆菌属,可以举出产氨短杆菌(B.ammoniagenes)株、B.immariophilum(ATCC:14068)株、解糖短杆菌(B.saccharolyticum)(ATCC:14066)株等,作为棒状杆菌属,可以举出谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(ATCC:13032)株、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(ATCC:14067)株、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(ATCC:13869)株、嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)(ATCC:13870)株等,作为微杆菌属,可以举出嗜氨微杆菌(M.ammoniaphilum)(ATCC:15354)株等,作为假单胞菌属,可以举出臭味假单胞菌(P.mephitica)株等。
作为重组载体的导入方法,若为向上述宿主细胞导入DNA的方法则均可以使用,可以举出例如,电穿孔法(Nucleic Acids Research,16,6127(1988)),磷酸钙法(Proceedings of the National Academy of SciencesUSA,69,2110(1972)),原生质体法(日本特开昭63-2483942),Gene,17,107(1982).、Molecular & General Genetics,168,111(1979)中记载的方法等。
(ii)使用酵母作为宿主的情况
使用酵母作为宿主时,作为表达载体,可以举出例如,YEp13(ATCC:37115)、YEp24(ATCC:37051)、YCp50(ATCC:37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子,若为可以在酵母中表达的启动子则可以为任意一种,可以举出例如,ADH1(醇脱氢酶)启动子、PHO5(酸性磷酸酶)启动子、PGK1(磷酸甘油酸激酶)启动子、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、GAL1(半乳糖激酶)启动子、GAL10(UDP半乳糖-4-差向异构酶)启动子、MFα1(α信息素)启动子、CUP1(金属硫蛋白)启动子等。
作为宿主,可以举出例如,糖酵母(Saccharomyces)属、啤酒糖酵母(S.cerevisiae)种,裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)属、粟酒裂殖糖酵母(S.pombe)种,克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)属、乳克鲁维氏酵母(K.lactis)种,丝孢酵母(Trichosporon)属、茁芽丝孢酵母(T.pullulans)种,许旺氏酵母(Schwanniomyces)属、河岸许旺氏酵母(S.alluvius)种以及毕赤氏酵母(Pichia)属、巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)种等。
作为重组载体的导入方法,若为向宿主导入DNA的方法则均可以使用,可以举出例如,电穿孔法(Methods in Enzymology,194,182(1990))、原生质球法(Proceedings of the National Academy of SciencesUSA,84,1929(1978))、乙酸锂法(Journal of Bacteriology,153,163(1983))以及Proceedings of the National Academy of Sciences USA,75,1929(1978)记载的方法等。
(iii)使用动物细胞作为宿主的情况
使用动物细胞作为宿主时,作为表达载体,例如可以使用pcDNA1/Amp、pcDNA1、pCDM8、pREP4(Invitrogen公司制),pAGE107(Cytotechnology,3,133(1990)),pAGE103(The Journal ofBiochemistry,101,1307(1987)),pAMo、pAMoA(pAMoPRSA)(TheJournal of Biological Chemistry,268,22782-22787(1993)),pAS3-3(日本特开平2-22705)等。
作为启动子,若为可以在宿主中表达的启动子则均可以使用,可以举出例如,人巨细胞病毒(hCMV)的早早期(IE、Immediate-early)基因的启动子、SV40的早期启动子、莫洛尼鼠类白血病毒的长末端重复系列启动子(Long Terminal Repeat Promoter)、逆转录病毒的启动子、HSP启动子、SRα启动子以及金属硫蛋白的启动子等。此外,还可以同时使用启动子和人CMV的IE基因的增强子。
作为宿主使用的动物细胞,可以举出人源性细胞株的HEK293(人胚肾细胞、ATCC:CRL-1573)、Namalwa(伯基特氏淋巴瘤、ATCC:CRL-1432)、HeLa(***细胞、ATCC:CCL-2)、HBT5637(白血病细胞、日本特开昭63-299)、BALL-1(白血病细胞)和HCT-15(大肠癌细胞),小鼠源性细胞株的Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓瘤细胞、ATCC:CRL-1581)和NSO(小鼠骨髓瘤细胞),猴源性细胞株的COS-1(非洲绿猴肾细胞(SV40转化细胞)、ATCC:CRL-1650)和COS-7(非洲绿猴肾细胞(SV40转化细胞)、ATCC:CRL-1651),仓鼠源性细胞株的CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞、ATCC:CCL-61)和BHK-21(C-13)(西西里幼仓鼠肾细胞(シシリアンハムスタ一仔腎細胞)、ATCC:CCL-10),大鼠源性细胞株的PC12(肾上腺黑素细胞瘤、ATCC:CRL-1721)和YB2/0(大鼠骨髓瘤细胞、ATCC:CRL-1622)等。
作为重组载体的导入方法,若为向宿主导入DNA的方法则均可以使用,可以举出例如,电穿孔法(Cytotechnology,3,133,(1990))、磷酸钙法(日本特开平2-22705)、脂质转染法(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA,84,7413(1987)、Vilology,52,456(1973).)。
(iv)使用植物细胞作为宿主的情况
使用植物细胞或植物个体作为宿主时,可以按照公知的方法(组织培养,20(1994),组织培养,21(1995),Trends in Biotechnology,15,45(1997))来生产多肽。作为表达载体,可以举出例如,Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。作为在基因表达中使用的启动子,若为可以在植物细胞中表达的启动子则均可以使用,可以举出例如,花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。此外,通过在启动子与表达的基因之间***玉米的醇脱氢酶基因的内含子1等,可以提高基因的表达效率。
作为宿主,可以举出马铃薯、烟草、玉米、水稻、油菜籽、大豆、西红柿、胡萝卜、小麦、大麦、黑麦、紫花苜蓿、亚麻等的植物细胞。
作为重组载体的导入方法,若为向宿主导入DNA的方法则均可以使用,可以举出例如,使用土壤杆菌(Agrobacterium)的方法(日本特开昭59-140885、日本特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(日本特开昭60-251887)、基因枪(particle gun)法(日本特许第2606856号、日本特许第2517813号)等。
(v)使用昆虫细胞作为宿主的情况
使用昆虫细胞作为宿主时,作为转移载体,可以举出例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(Invitrogen公司制)等,作为感染用病毒,可以举出例如,感染盗夜蛾亚科(ヨトウガ科昆虫)昆虫的杆状病毒(Baculovirus)苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMnPV)Bac-N-Blue DNA等。昆虫细胞的转化方法,例如可以使用Baculovirus Expression Vector:ALaboratory Manual(1992)(W.H.Freeman and Company),MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press),Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience),BioTechno1ogy,6,47(1988)等中记载的方法。
向昆虫细胞培养液中添加含有目的基因的转移载体以及感染昆虫细胞用的杆状病毒DNA,使表达利用重组制备的目的基因的病毒感染昆虫细胞,由此可以表达多肽。
作为用作宿主的昆虫细胞,可以举出草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(甘蓝夜蛾)源性细胞株、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)源性细胞株等,具体地,作为草地贪夜蛾源性细胞,可以举出Sf9(ATCC:CRL-1711、卵巢细胞)、Sf21(卵巢细胞)等,作为粉纹夜蛾源性细胞株,可以举出High Five、BTI-TN-5B1-4(***、Invitrogen公司制)等。
作为重组载体的导入方法,若为可以向宿主导入的方法则均可以使用,可以举出例如,磷酸钙法(日本特开平2-22705)、脂质转染法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA,84,7413(1987))等。此外,与动物细胞同样地,还可以使用电穿孔法(Cytotechnology,3,133(1990))等。
(vi)培养方法
保有整合了编码本发明的蛋白质的DNA的重组载体的转化体为大肠杆菌、酵母、动物细胞或植物细胞等细胞时,按照适于各种宿主的通常的培养方法培养,产生、蓄积该蛋白质,由转化体或培养液回收该蛋白质,由此可以制备该蛋白质。转化体为动物个体或植物个体时,按照适于各种宿主的通常的养育方法饲养或栽培,产生、蓄积该蛋白质,由该动物个体或植物个体回收该蛋白质,由此可以制备该蛋白质。
宿主为动物个体时,例如,饲养保有本发明的基因的非人转基因动物,在该动物中产生、蓄积该重组DNA编码的本发明的蛋白质,由该动物个体中回收该蛋白质,由此可以制备本发明的蛋白质。作为动物个体中的产生、蓄积场所,可以举出例如,该动物的乳、唾液、卵等。
宿主为植物个体时,例如,栽培保有编码本发明的蛋白质的基因的转基因植物,在该植物个体中产生、蓄积该重组DNA编码的本发明的蛋白质,由植物个体中回收该多肽,由此可以制备本发明的蛋白质。
宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物时,例如,在培养基中培养保有编码本发明的蛋白质的基因的转化体,在培养液中产生、蓄积该重组DNA编码的本发明的蛋白质,由该培养液回收该蛋白质,由此可以制备本发明的蛋白质。
在培养基中培养保有编码本发明的蛋白质的基因的转化体的方法,可以按照在宿主的培养中使用的通常方法来进行。
作为对将大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物作为宿主得到的转化体进行培养的培养基,若为含有该生物可以利用的碳源、氮源、无机盐类等,可以有效地进行转化体的培养的培养基,则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。
转化体为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物时,作为对得到的转化体进行培养的培养基,若为含有该宿主可以利用的碳源、氮源、无机盐类等,可以有效地进行转化体的培养的培养基,则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。作为对宿主为大肠杆菌的转化体进行培养时的培养基,例如,优选为含有细菌用胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的YT培养基。
作为碳源,若为各微生物可以利用的碳源即可,可以使用葡萄糖、,果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物,乙酸、丙酸等有机酸,乙醇、丙醇等醇类。
作为氮源,可以使用氨,氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机酸、有机酸的铵盐,其它含氮物质,以及蛋白胨,肉膏,酵母提取物,玉米浆,酪蛋白水解物,豆饼、豆饼水解物,各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐,可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。
培养温度优选为15~40℃,培养时间通常为5小时~7天。培养中pH保持在3.0~9.0。pH的调整使用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。此外,培养中根据需要,还可以向培养基中添加氨苄西林、四环素、卡那霉素等抗生素。
对利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化的微生物进行培养时,根据需要还可以向培养基中添加诱导物。例如,对利用使用lac启动子的表达载体转化的转化体进行培养时,还可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等,对利用使用trp启动子的表达载体转化的转化体进行培养时,还可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。导入了基因的植物的细胞或器官可以使用发酵罐进行大量培养。作为培养的培养基,可以使用通常使用的Murashige and Skoog(MS)培养基,怀特(White)培养基,或向这些培养基中添加植物生长素、细胞***素等植物激素而成的培养基等。
本发明的蛋白质制备用转化体为动物细胞时,培养该细胞的培养基使用通常使用的RPMI1640培养基(The Journal of the AmericanMedical Association,199,519(1967))、MEM培养基(Science,130,432(1959).)、D-MEM培养基(Virology,8,396(1959).)、199培养基(Proceedings of the Society for the Biological Medicine73,1(1950).)或向这些培养基中添加胎牛血清(FCS)等而成的培养基等。
培养通常在pH 6~8、25~40℃、5%CO2存在下等条件下进行1~7天。此外,培养中根据需要,还可以向培养基中添加卡那霉素、青霉素、链霉素等抗生素。
转化体为昆虫细胞时,作为培养的培养基,可以使用通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制),Sf-900II SFM培养基(Invitrogen公司制),ExCell400、ExCell405(JRH Bioscience公司制)、Grace’s InsectMedium(Nature,195,788(1962).)等。
(vii)制备方法
本发明的蛋白质可以通过培养转化体,由培养液分离、纯化本发明的蛋白质来制备。本发明的蛋白质的分离、纯化方法可以通过该领域中公知惯用的常规方法来进行。例如,可以使用酶的分离、纯化方法或Sandler等人的糖转移酶的纯化方法(Methods in Enzymology,83,458)。
本发明的蛋白质作为溶解性多肽产生、蓄积时,将如上所述培养转化体的培养液例如用离心分离等方法分离为细胞或菌体和培养基。本发明的蛋白质存在于宿主细胞内时,将采取的细胞或菌体用STE溶液等适当的缓冲液洗涤后,用超声波、弗氏细胞压碎器、Manton-Gaulin匀浆器、戴诺磨等破碎细胞或菌体,通过离心分离或过滤以无细胞溶液形式得到。
本发明的蛋白质的分离、纯化中使用的缓冲液中可以含有适量的表面活性剂,例如,可以含有月桂基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰基肌氨酸钠(サルコシル)等。
得到的粗纯化物中含有的目的蛋白质的分离、纯化方法可以组合本身公知的各种分离、纯化方法来进行。作为这些公知的方法,可以举出例如,溶剂萃取法,用硫酸铵等进行的盐析法,透析法,用有机溶剂进行的沉淀法,超滤法,凝胶过滤,二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶色谱、DIAION HPA-75(三菱化学社制)等使用树脂的阴离子色谱、离子交换色谱、S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等使用赖氨酸的阳离子色谱、丁基琼脂糖凝胶等疏水性色谱、亲和色谱等各种色谱法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电点电泳法等各种电泳等。
本发明的蛋白质作为不溶性多肽产生、蓄积时,与上述同样地分离细胞或菌体,通过适当的方法破碎后,回收含有该多肽的流份。将回收的样品用月桂基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰基肌氨酸钠(Sarcosil)等表面活性剂等增溶剂进行增溶。将该增溶剂稀释或透析直至不含有或几乎不含有增溶剂的浓度,使该多肽构成为正常的立体结构之后,通过与上述同样的分离、纯化方法,可以得到纯化样品。
此外,还可以将本发明的蛋白质作为与其它蛋白质的融合蛋白质生产,利用使用对融合的蛋白质具有亲和性的物质的亲和色谱进行纯化(山川彰夫、实验医学、13、469-474(1995).)。作为融合蛋白质中使用的附加蛋白质,可以举出蛋白质A、FLAG等(Proceedings of theNational Academy of Sciences USA,86,8227(1989),Genes Development,4,1288(1990),日本特开平5-336963,、日本特开平6-823021)。使用蛋白质A时,可以通过生产本发明的蛋白质与蛋白质A的融合蛋白质,使用免疫球蛋白G进行亲和色谱来进行纯化。使用FLAG肽时,可以通过生产本发明的蛋白质与FLAG的融合蛋白质,使用抗FLAG抗体进行亲和色谱来进行纯化。
本发明的蛋白质,可以按照公知的方法,使用体外(in vitro)转录、翻译体系进行生产(Journal of Biomolecular NMR,6,129-134(1995),Science,242,1162-1164(1988).,The Journal of Biochemistry,110,166-168(1991).)。
本发明的蛋白质可以以其氨基酸序列为基础,通过Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成法,或市售的肽合成仪器,例如APEX396(Advanced Chemtech公司制)、433A(AppliedBiosystems公司制)、PS3(Protein Technologies公司制)、9050(Perceptive公司制)、PSSM-8(岛津制作所制)等肽合成仪器来化学合成。
本发明的蛋白质的结构解析可以通过蛋白质化学中通常使用的方法,例如用于基因克隆的蛋白质结构解析(遺伝子クロ一ニングのためのタンパク質構造解析)(平野久著、东京化学同人发行、1993年)记载的方法实施。本发明的蛋白质的羟基化活性可以通过对具有金刚烷骨架的化合物、例如作为基质的N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物作用本发明的蛋白质,以N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的产量来检出。更具体地说,可以使用将可以表达本发明的蛋白质的微生物用适当的培养基培养,检出蓄积在培养基中的N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的蓄积量的方法。N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的检出例如可以通过使用本发明得到的N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物作为标准品的HPLC来进行。具体地说,可以使用后述实施例中记载的方法。
(vii)突变型多肽的制备方法
本发明的蛋白质的氨基酸的缺失或置换,可以通过申请前公知技术的定点诱变法实施。1个或数个氨基酸的缺失或置换可以按照Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)(ColdSpring Harbor Laboratory Press.),Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience),Nucleic Acids Research,10 6487(1982).,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,79,6409(1982).,Gene 34,315(1985).,Nucleic Acids research,13,4431(1985).,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,82,488(1985).,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,81,5662(1984).,Science 224,1431(1984).,WO 85/00817,Nature,316,601(1985)等中记载的方法制备。
(b)可以表达本发明的蛋白质的微生物
可以在本发明的制备方法中使用的微生物,只要为与基质作用时,在可以与基质作用的状态下可以表达本发明的蛋白质的微生物则不特别限定,可以举出例如,导入了本发明的基因的转化体、已知表达本发明的蛋白质的天然的微生物,例如属于芽孢杆菌属的微生物、优选为枯草芽胞杆菌,属于假单胞菌属的微生物,属于链霉菌属的微生物等。从可以人为地增加微生物中含有的本发明的蛋白质的量方面考虑,优选为转化体。
为了制备可以在本发明的制备方法中使用的各种转化体而可以使用的宿主细胞,只要在可以与基质作用的状态下可以表达本发明的蛋白质则不特别限定,可以举出例如,通常使用的公知的微生物,例如大肠杆菌或酵母(啤酒糖酵母、Saccharomyces cerevisiae),或公知的培养细胞,例如脊椎动物细胞(例如CHO细胞或COS细胞)或昆虫细胞。从增殖速度快、处理容易方面考虑优选为大肠杆菌。此外,可用于制备该转化体的表达载体,只要在可以与基质作用的状态下可以表达本发明的蛋白质则不特别限定,可以根据使用的宿主细胞的种类适当选择。
对于宿主细胞、表达载体、转化体、转化体的培养方法等,在上述“(2)本发明的蛋白质的制备方法”中进行了具体说明。
本发明的制备方法中,使基质与可以表达本发明的蛋白质的微生物作用时,可以使用静止菌体反应(休止菌体反応)或生长菌体反应(生育菌体反応)。可以分别利用公知的方法。静止菌体反应指的是培养可以表达本发明的蛋白质的微生物后,停止菌体的增殖、添加基质的方法。例如,可以利用后述实施例1~6中记载的方法。生长菌体反应指的是在培养可以表达本发明的蛋白质的微生物的同时添加基质的方法。例如,可以利用后述实施例7或实施例8记载的方法。
本发明的制备方法中,基质与
(a)本发明的蛋白质、或该蛋白质以及由向该蛋白质供给电子的铁氧化还原蛋白和还原酶构成的还原体系,或
(b)可以表达本发明的蛋白质的微生物
中的至少一种作用时的反应条件优选为以下的条件。
反应温度可以考虑到本发明的蛋白质的最优温度、以及基质和产物的稳定温度等来适当确定,例如可以在10~45℃、优选15~40℃、更优选20~40℃、特别优选25~35℃下实施。
反应pH也可以考虑到本发明的蛋白质的最优pH、以及基质和产物的稳定pH等来适当确定,例如可以在4~10、优选5~9、更优选6~9、特别优选7~8下实施。
反应时间可以按照上述各种条件(即,使用的溶剂、反应温度或反应pH),或使用的基质和本发明的蛋白质或微生物的种类等适当确定,例如为1~100小时、优选为5~48小时、更优选为12~36小时。
对所使用的本发明的蛋白质的量不特别限定,例如可以以0.5~20μmol/L的浓度实施。
此外,本发明的制备方法中,使基质与本发明的蛋白质或可以表达本发明的蛋白质的微生物作用时,根据需要还可以添加包合剂。可以增大基质的化学稳定性或在水中的溶解性,或降低基质对酶或微生物的阻碍。作为该包合剂,可以举出羟丙基-β-环糊精、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、甲基-β-环糊精(Me-β-CD)。
本发明的制备方法中,使基质与本发明的蛋白质或可以表达本发明的蛋白质的微生物作用时,根据需要可以共存辅酶(例如NADPH或NADH、优选NADPH),进一步地可以共存上述辅酶的再生***。本发明的制备方法中,通过根据使用的本发明的蛋白质的种类共存适当的辅酶,可以提高其反应性。
此外,由于随着反应的进行,辅酶被消耗(例如NAD(P)H被消耗、转化为NAD(P)+),进而通过共存上述辅酶的再生***,由此可以提高其反应性。作为辅酶再生***,各辅酶公知各种再生***,例如作为NAD(P)H的再生***,可以举出例如,葡萄糖与葡萄糖脱氢酶的组合、甲酸与甲酸脱氢酶的组合、或丙醇与醇脱氢酶的组合等。
可以在本发明的制备方法中共存的这些辅酶、或辅酶再生***的添加量,可以根据使用的基质以及本发明的蛋白质或微生物的种类等适当确定。
可以停止反应,按照由该反应物采取发酵产物的通常方法,进行具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物、例如N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的分离。具体地说,例如可以通过溶剂萃取、离子交换色谱、活性炭处理、结晶、膜分离等,从培养基分离具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物。
本发明还含有用于进行上述反应的酶群。具体地,可以举出以下的蛋白质。
—含有SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有羟基化活性的蛋白质。
—由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L和F232M中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
—由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或含有在该氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有羟基化活性的蛋白质。
—由例如SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
这些蛋白质可以通过上述“本发明的蛋白质的制备方法”中记载的方法得到。
此外,本发明也含有以下的化合物。这些化合物在成为作为功能性树脂、药物的中间体有用的单羟基-2-金刚烷胺的原料的N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的制备中有用。
下式所示的化合物、其盐或它们的溶剂化物。
[化学式13]
此外,本发明还含有以下的化合物。这些化合物在作为功能性树脂或药物的中间体有用的单羟基-2-金刚烷胺的制备中有用。
下式表示的化合物、其盐或它们的溶剂化物。
[化学式14]
作为“盐”,可以举出例如,盐酸、硫酸、硝酸或磷酸等无机酸的盐,对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸或柠檬酸等有机酸的盐,铵、三甲基铵或三乙基铵等有机碱的盐,钠或钾等碱金属的盐,以及钙或镁等碱土类金属的盐等。
“溶剂化物”可以对于上述化合物、与任意数目的溶剂分子配位。优选为水合物。
以下举出实施例对本发明进行更具体的说明,但是它们不对本发明进行限定。
作为基因操作方法,只要不特别说明,使用Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory)中记载的方法。
[实施例1]
通过使用CYP109B1的静止菌体反应进行的金刚烷的羟基化
[种培养]
将***了CYP109B1基因(SEQ ID NO.2)的表达载体(pET-109B1-CamA-CamB)导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。将该转化体接种到LB培养基2ml中,用300rpm的往复振荡机在37℃下培养24小时,制成母种。
[主培养]
将M9mix培养基(6.78g/L Na2HPO4(无水)、3g/L KH2PO4、0.5g/LNaCl、1g/L NH4Cl、4g/L酪蛋白氨基酸、100μM CaCl2)100ml灭菌,向其中添加100μl的100mM FeSO4、1ml的2mg/ml胸腺嘧啶。向其中加入Merck公司制的Overnight Auto Induction System(2ml的SolutionI、5ml的Solution II、100μl的Solution III),进而添加100μl的50mg/ml羧苄青霉素、100μl的80mg/ml的5-氨基乙酰丙酸,制成主培养培养基。在加入有50ml主培养培养基的500ml广口锥形烧瓶中接种500μl的母种,在25℃、120rpm下培养24小时。
[生物体催化反应]
离心分离培养液,除去上清液得到菌体。将菌体用25ml磷酸钾缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.4)、10%甘油、1mM EDTA、2mM DTT、1mMD-葡萄糖)分别稀释至菌体浓度按照培养液换算为1倍、2.5倍、5倍,加入到附有挡板的500ml锥形烧瓶中,制成反应液。向该反应液中添加N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺至终浓度为5000μg/ml、pH为7.4,开始反应。在28℃、180rpm下反应31小时,添加等量丙酮,用反相HPLC进行分析。结果基质以表1记载的转化率分别转化为N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺。
[表1]
菌体浓度 | 1倍 | 2.5倍 | 5倍 |
基质5000μg/ml | 61% | 100% | 100% |
[实施例2]
通过使用CYP109FK的静止菌体反应进行的金刚烷的羟基化
[载体的制备]
参考Applied Microbiology and Biotechnology,2006,71卷,p.455-462,制备CYP109B1与P450Rhf还原结构域的融合蛋白(109FK)的表达载体。具体地,109FK基因(SEQ ID NO.4)的构建中使用重叠延伸PCR法。以pET-109B1-CamA-CamB为模板,使用引物1(SEQ ID NO.7)和引物2(SEQ ID NO.8)实施PCR,此外以红球菌属(Rhodococcus)NCIMB9784株的基因组为模板,使用引物3(SEQ IDNO.9)和引物4(SEQ ID NO.10)进行PCR。然后,以各PCR产物为模板,使用引物1和4,实施PCR,***到克隆载体(pCR-BluntII-TOPO)中(pCR-109FK)。由pCR-109FK载体用XbaI、BamHI切出含有109FK基因的片段,***到表达载体pET21a中,制备109FK的表达载体(pET-109FK)。
[种培养]
将pET-109FK导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。将该转化体接种到每1孔加入有500μl的LB培养基的96孔深孔板中,在900rpm下,37℃培养24小时,制成母种。
[主培养]
使用实施例1记载的主培养培养基,在每1孔加入有500μl的主培养培养基的96孔深孔板中每1孔接种5μl母种,在25℃、900rpm下培养24小时。
[生物体催化反应]
离心分离96孔深孔板的培养液,除去上清液得到菌体。该菌体用加入有1mg/ml的N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺的100μl磷酸钾缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.4)、10%甘油、1mM EDTA、2mM DTT、1mMD-葡萄糖)稀释,开始反应。在28℃、900rpm下反应24小时。添加等量丙酮,用反相HPLC进行分析,结果18%的基质转化为N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺。
[实施例3]
通过使用CYP109FK突变体的静止菌体反应进行的金刚烷的羟基化
[随机突变的导入]
向109FK基因随机导入突变时使用易错PCR法。具体地,使用Stratagene公司的GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒,按照实验方案,以pET-109FK为模板,使用引物1和4,以突变频率为0-4.5/kb实施易错PCR。得到的PCR片段用XbaI和HindIII进行限制酶处理,***到pET21a中,制备表达载体(pET-109FKm)。
[筛选]
将pET-109FKm导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。采取作为该转化体的2296个菌落,将各菌落接种到每1孔加入有500μl的LB培养基的96孔深孔板中,在900rpm下,37℃培养24小时,制成母种。
使用实施例1记载的主培养培养基,在每1孔加入有500μl的主培养培养基的96孔深孔板中每1孔接种5μl母种,在25℃、900rpm下培养24小时。
离心分离96孔深孔板的培养液,除去上清液得到菌体。该菌体用加入有1mg/ml的N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺的1ml磷酸钾缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.4)、10%甘油、1mM EDTA、2mM DTT、1mM D-葡萄糖)稀释,开始反应。在28℃、900rpm下反应24小时后,添加等量丙酮,用反相HPLC进行分析。结果91个菌落与导入了pET-109FK的转化体相比,活性提高1.50倍以上。由菌落抽提质粒,利用测序鉴定突变部位。得到的突变中,对于I77和F232,通过使用Stratagene公司的Quick Change II Site-Directed Mutagenesis试剂盒的定点突变,实施对其它氨基酸的置换。通过与筛选相同的方法对各突变体的活性进行确认,结果可知,表2记载的突变与其它的突变(例如表3记载的突变)相比,活性提高。
[表2]
转化率 | 与109FK的相对比 | |
109FK | 12.9 | 1.00 |
I77F | 67.8 | 5.26 |
I77W | 67.8 | 5.27 |
M105I | 28.0 | 2.17 |
A196D | 21.2 | 1.64 |
F232I | 31.7 | 2.47 |
F232L | 38.7 | 3.01 |
F232M | 31.7 | 2.46 |
T234A | 26.3 | 2.04 |
T244A | 21.8 | 1.70 |
V399E | 19.0 | 1.48 |
K702E | 21.9 | 1.70 |
[表3]
转化率 | 与109FK的相对比 | |
M272T | 10.1 | 0.78 |
F232K | 2.7 | 0.21 |
[实施例4]
通过使用利用随机突变得到的CYP109B1突变体的静止菌体反应进行的金刚烷的羟基化
[随机突变的导入]
向CYP109B1基因导入随机突变时使用易错PCR法。具体地,使用Stratagene公司的GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒,按照实验方案,以pET-109B1-CamA-CamB为模板,使用引物1和引物5(SEQID NO.11),以突变频率为0-4.5/kb实施易错PCR。得到的PCR片段用XbaI和KpnI进行限制酶处理,***到用XbaI和KpnI进行了限制酶处理的pET-109B1-CamA-CamB的7kb的片段中,制备表达载体(pET-109B1m-CamA-CamB)。
[筛选]
将pET-109B1m-CamA-CamB导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。采取作为该转化体的880个菌落,将各菌落接种到每1孔加入有500μl的LB培养基的96孔深孔板中,在900rpm下,37℃培养24小时,制成母种。
使用实施例1记载的主培养培养基,在每1孔加入有500μl的主培养培养基的96孔深孔板中每1孔接种5μl母种,在25℃、900rpm下培养24小时。
离心分离96孔深孔板的培养液,除去上清液得到菌体。该菌体用加入有1mg/ml的N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺的500μl磷酸钾缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.4)、10%甘油、1mM EDTA、2mM DTT、1mMD-葡萄糖)稀释,开始反应。在28℃、900rpm下反应2小时后,添加等量丙酮,用反相HPLC进行分析。结果16个菌落与导入了pET-109FK的转化体相比,活性提高1.23倍以上。由菌落抽提质粒,通过测序鉴定突变部位。通过与筛选相同的方法对各突变的活性进行再确认,结果可知,表4记载的突变与其它的突变(例如表5记载的突变)相比,活性提高。
[表4]
转化率 | 与109B1的相对比 | |
109B1 | 23.2 | 1.00 |
I77F | 33.5 | 1.44 |
L357P | 30.3 | 1.31 |
A362T | 27.1 | 1.17 |
F41L | 26.7 | 1.15 |
[表5]
转化率 | 与109B1的相对比 | |
E242K | 14.3 | 0.62 |
Q46R | 23.2 | 1.00 |
[实施例5]
通过使用导入了CYP109FK突变体的突变的CYP109B1突变体的静止菌体反应进行的金刚烷的羟基化
将实施例3中判明的109FK基因的突变的一部分导入到CYP109B1基因中,用实施例4的筛选方法进行活性的研究。其中,菌体用加入有3mg/ml的N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺的1ml磷酸钾缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.4)、10%甘油、1mM EDTA、2mM DTT、1mMD-葡萄糖)稀释,反应时间改变为16小时。结果可知表6记载的突变提高活性。
[表6]
转化率 | 与109B1的相对比 | |
109B1 | 47.9 | 1.00 |
I77F | 70.9 | 1.48 |
I77W | 61.2 | 1.28 |
M105I | 57.5 | 1.20 |
T234A | 55.8 | 1.17 |
另一方面,F232中导入突变的CYP109B1基因的活性的确认通过实施例4的筛选的方法来实施。结果可知表7记载的突变提高活性。
[表7]
转化率 | 与109B1的相对比 | |
109B1 | 9.6 | 1.00 |
F232I | 14.9 | 1.55 |
F232L | 14.8 | 1.55 |
F232M | 15.7 | 1.64 |
[实施例6]
通过使用CYP109B1突变体(177F)的静止菌体反应进行的金刚烷的羟基化
[种培养]
将***了CYP109B1突变体(I77F)基因(SEQ ID NO.5)的表达载体(pET-109B1(I77F)-CamA-CamB)导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。将该转化体接种到LB培养基2ml中,用300rpm的往复振荡机在37℃下培养24小时,制成母种。
[主培养]
与实施例1同样地实施主培养。
[生物体催化反应]
与实施例1同样地实施生物体催化反应。反应后,添加等量丙酮,用反相HPLC进行分析的结果可知,基质以表8记载的转化率分别转化为N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺。
[表8]
菌体浓度 | 1倍 | 2.5倍 | 5倍 |
基质5000μg/ml | 88% | 100% | 100% |
[纯化]
将上述反应液一并离心分离后,获得上清液113ml。使上清液40ml吸附到5ml的HP20SS中,用0.1%甲酸水溶液2CV洗涤后,用0.1%甲酸、50%丙酮水溶液洗脱,得到活性流份。对活性流份进行浓缩、冷冻干燥,得到N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺的粉末125mg。通过NMR进行结构解析,结果在3.92的H与1.71及1.62的H之间观测到NOE,可知反式体100%。
1H NMR(DMSO-d6)δ:8.40(1H、br.s)、7.74(1H、br.s)、7.522(1H、td、J=7.5、1.1Hz)、7.461(1H、td、J=7.5、1.1Hz)、7.40(1H、br.d、J=~8Hz)、4.40(1H、br.s)、3.92(1H、m)、2.05(2H、br.s)、1.97(2H、m)、1.96(1H、m)、1.71(2H、br.d)、1.62(2H、br.d、J=~12Hz)、1.61(1H、br.s)、1.28(2H、br.d、J=~12Hz)
[实施例7]
通过使用CYP109B1突变体(177F)的生长菌体反应进行的金刚烷的羟基化
[种培养]
将***了CYP109B1突变体(I77F)基因(SEQ ID NO.5)的表达载体(pET-109B1(I77F)-CamA-CamB)导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。
将一铂环的该转化体接种到加入有50ml的LB培养基的500ml广口锥形烧瓶中,在37℃、180rpm下培养5.5小时,制成母种。
[主培养]
将1L的L培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl)灭菌,向其中添加1ml的100mM FeSO4、20g的甘油、30g的羟丙基-β-环糊精、10ml的50mg/ml羧苄青霉素、10ml的80mg/ml 5-氨基乙酰丙酸、10ml的2mg/ml胸腺嘧啶、0.1g的MgCl2、0.1ml的AdecanolLG121,添加作为基质的N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺至终浓度为5000μg/ml,制成主培养培养基。在加入有1L主培养培养基的3L小型罐中接种40ml的母种,控制在28℃、600rpm、pH 6.5下开始培养。培养开始6小时后添加IPTG至终浓度为1mM。培养中,适当添加酪蛋白氨基酸、甘油、基质,最终添加的基质量达到30g/L。反应开始72小时后,用反相HPLC分析结果可知67%的基质转化为N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺。
[实施例8]
通过使用CYP109B1突变体(I77F)的生长菌体反应进行的金刚烷的羟基化以及单羟基-2-金刚烷胺的制备
[载体的制备]
将来自大肠杆菌(Escherchia coli)JM109株的甘油脱氢酶基因(SEQID NO.6)***到pCDFDuet中,构建表达载体(pCDFD-GLD)。
[种培养]
将pCDFD-GLD和实施例7记载的pET-109B1(I77F)-CamA-CamB导入到大肠杆菌(BL21(DE3))中,得到转化体。将一铂环该转化体接种到加入有50ml的LB培养基的500ml广口锥形烧瓶中,在37℃、180rpm下培养7小时,制成母种。
[主培养]
将1L的L培养基/M9(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、6.78g/LNa2HPO4(无水)、3g/L KH2PO4、5.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl)灭菌,向其中添加1ml的100mM FeSO4、20g的甘油、30g的羟丙基-β-环糊精、1ml的50mg/ml羧苄青霉素、1ml的50mg/ml链霉素、1ml的80mg/ml5-氨基乙酰丙酸、10ml的2mg/ml胸腺嘧啶。进一步加入Merck公司制的Overnight Auto Induction System(20ml的Solution I、50ml的SolutionII、1ml的Solution III),添加作为基质的N-(金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺至终浓度为5000μg/ml,制成主培养培养基。在加入有1L主培养培养基的3L小型罐中接种40ml的母种,控制在28℃、500rpm、pH 6.5下开始培养。培养中,适当添加酪蛋白氨基酸、甘油、基质,最终添加的基质量达到30g/L。反应开始72小时后,用反相HPLC分析,结果可知90%的基质转化为N-(5-羟基-金刚烷-2-基)-邻羧基苯甲酰胺。
[纯化]
将培养液用盐酸调整至pH为4后,在120℃下、灭菌15分钟,将保护基团脱保护。用氢氧化钠水溶液将pH调整为7后,通过离心分离得到上清液1.65L。使上清液1L吸附到300ml的铵离子型的DiaionPK208中,用2N氨水洗脱,由此得到活性流份。对活性流份进行浓缩、冷冻干燥后,溶解在100ml的水中,吸附到120ml的氢氧离子型的Amberlite IRA410。用水洗脱,获得活性流份后,进行浓缩、冷冻干燥,得到单羟基-2-金刚烷胺的粉末9.64g。通过FDLA法测定纯度,结果可知,单羟基-2-金刚烷胺的纯度为96.6%。
[实施例9]
[化学式15]
在氮气氛围气体下,向化合物3(150mg)的二甲基甲酰胺溶液(DMF)(5ml)中,加入单羟基-2-金刚烷胺(140mg)、1-羟基苯并***(HOBT)(31mg)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(WSC)(174mg)、三乙基胺(TEA)(180μl),在室温下搅拌14小时。反应结束后,加入2N盐酸水溶液(30ml),用乙酸乙酯进行萃取。有机层依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤,用硫酸镁干燥。蒸馏除去溶剂,残渣用硅胶色谱纯化,得到化合物4(226mg)。
NMR:(CDCl3);1.06(d,J=6.6Hz,6H),1.53-2.20(m,14H),3.72(s,3H),3.98(d,J=6.6Hz,2H),6.25-6.30(m,1H),7.71(s,1H)
产业实用性
本发明的方法,可以用作作为功能性树脂、药物的中间体有用的具有金刚烷骨架的化合物的羟基化物的廉价、高收率的制备方法。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO.1表示CYP109B1的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2表示实施例1中使用的编码CYP109B1的基因的碱基序列。
SEQ ID NO.3表示CYP109FK的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4表示编码CYP109FK的基因的碱基序列。
SEQ ID NO.5表示编码CYP109B1突变体(I77F)的基因的碱基序列。
SEQ ID NO.6表示来自大肠杆菌(Escherichia coli)JM109株的甘油脱氢酶基因。
序列表
<110>Shionogi & Co.,Ltd.
<120>08P00078WO
<130>使用细胞色素P450的金刚烷羟基化物的制备方法
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>396
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<220>
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是Asp或Asn残基.
<220>
<222>(113)..(113)
<223>Xaa是Arg或Gln残基.
<400>1
Met Xaa Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser
20 25 30
Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp
35 40 45
Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val
85 90 95
Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile
100 105 110
XaaGlu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu
115 120 125
Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile
130 135 140
Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala
145 150 155 160
Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala
165 170 175
Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala
180 185 190
Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln
195 200 205
Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Phe Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly
225 230 235 240
Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser Ile Leu
245 250 255
Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met
260 265 270
Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val
275 280 285
Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile
290 295 300
Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp
305 310 315 320
Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro
325 330 335
Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala
340 345 350
Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser
355 360 365
Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser
370 375 380
Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met
385 390 395
<210>2
<211>1191
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌
<400>2
atggatgtgt taaaccgccg gcaagccttg cagcgagcgc tgctcaatgg gaaaaacaaa 60
caggatgcgt atcatccgtt tccatggtat gaatcgatga gaaaggatgc gcctgtttcc 120
tttgatgaag aaaaccaagt gtggagcgtt tttctttatg atgatgtcaa aaaagttgtt 180
ggggataaag agttgttttc cagttgcatg ccgcagcaga caagctctat tggaaattcc 240
atcattaaca tggacccgcc gaagcataca aaaatccgtt cagtcgtgaa caaagccttt 300
actccgcgcg tgatgaagca atgggaaccg agaattcgag aaatcacaga tgaactgatt 360
caaaaatttc aggggcgcag tgagtttgac cttgttcacg atttttcata cccgcttccg 420
gttattgtga tatctgagtt gctgggagtg ccttcagcgc atatggaaca gtttaaagca 480
tggtctgatc ttctggtcag tacaccgaag gataaaagtg aagaagctga aaaagccttt 540
ttggaagaac gagataagtg tgaggaagaa ctggccgcgt tttttgccgg catcatagaa 600
gaaaagcgaa acaaaccgga acaggatatt atttctattt tagtggaagc ggaagaaaca 660
ggcgagaagc tgtccggtga agagctgatt ccgttttgca cgctgctgct ggtggccgga 720
aatgaaacca ctacaaacct gatttcaaat gcgatgtaca gcatattaga aacgccaggc 780
gtttacgagg aactgcgcag ccatcctgaa ctgatgcctc aggcagtgga ggaagccttg 840
cgtttcagag cgccggcccc ggttttgagg cgcattgcca agcgggatac ggagatcggg 900
gggcacctga ttaaagaagg tgatatggtt ttggcgtttg tggcatcggc aaatcgtgat 960
gaagcaaagt ttgacagacc gcacatgttt gatatccgcc gccatcccaa tccgcatatt 1020
gcgtttggcc acggcatcca tttttgcctt ggggccccgc ttgcccgtct tgaagcaaat 1080
atcgcgttaa cgtctttgat ttctgctttt cctcatatgg agtgcgtcag tatcactccg 1140
attgaaaaca gtgtgatata cggattaaag agcttccgtg tgaaaatgta a 1191
<210>3
<211>727
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有融合CYP109B1和P450Rhf还原酶结构域的蛋白质
<400>3
Met Asp Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
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<210>4
<211>2184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码含有融合CYP109B1和P450Rhf
还原酶结构域的蛋白质的基因
<400>4
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<210>5
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码具有I77F突变的CYP109B1蛋白的基因
<400>5
atggatgtgt taaaccgccg gcaagccttg cagcgagcgc tgctcaatgg gaaaaacaaa 60
caggatgcgt atcatccgtt tccatggtat gaatcgatga gaaaggatgc gcctgtttcc 120
tttgatgaag aaaaccaagt gtggagcgtt tttctttatg atgatgtcaa aaaagttgtt 180
ggggataaag agttgttttc cagttgcatg ccgcagcaga caagctcttt tggaaattcc 240
atcattaaca tggacccgcc gaagcataca aaaatccgtt cagtcgtgaa caaagccttt 300
actccgcgcg tgatgaagca atgggaaccg agaattcgag aaatcacaga tgaactgatt 360
caaaaatttc aggggcgcag tgagtttgac cttgttcacg atttttcata cccgcttccg 420
gttattgtga tatctgagtt gctgggagtg ccttcagcgc atatggaaca gtttaaagca 480
tggtctgatc ttctggtcag tacaccgaag gataaaagtg aagaagctga aaaagccttt 540
ttggaagaac gagataagtg tgaggaagaa ctggccgcgt tttttgccgg catcatagaa 600
gaaaagcgaa acaaaccgga acaggatatt atttctattt tagtggaagc ggaagaaaca 660
ggcgagaagc tgtccggtga agagctgatt ccgttttgca cgctgctgct ggtggccgga 720
aatgaaacca ctacaaacct gatttcaaat gcgatgtaca gcatattaga aacgccaggc 780
gtttacgagg aactgcgcag ccatcctgaa ctgatgcctc aggcagtgga ggaagccttg 840
cgtttcagag cgccggcccc ggttttgagg cgcattgcca agcgggatac ggagatcggg 900
gggcacctga ttaaagaagg tgatatggtt ttggcgtttg tggcatcggc aaatcgtgat 960
gaagcaaagt ttgacagacc gcacatgttt gatatccgcc gccatcccaa tccgcatatt 1020
gcgtttggcc acggcatcca tttttgcctt ggggccccgc ttgcccgtct tgaagcaaat 1080
atcgcgttaa cgtctttgat ttctgctttt cctcatatgg agtgcgtcag tatcactccg 1140
attgaaaaca gtgtgatata cggattaaag agcttccgtg tgaaaatgta a 1191
<210>6
<211>1104
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>6
atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60
ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120
ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180
attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240
gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300
aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360
gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420
ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480
cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540
gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600
gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660
gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg 720
agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg 780
accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840
acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc 900
catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960
aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020
ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080
cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1(FW T7)
<400>7
cccgcgaaat taatacgact cactatagg 29
<210>8
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物2(RV-109-EcoRI-Rhf-2)
<400>8
cggttgatgg cggtgcagca cgaattccat tttcacacgg aagctcttta atccg 55
<210>9
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物3(FW Rhf-EcoRI-109-2)
<400>9
cggattaaag agcttccgtg tgaaaatgga attcgtgctg caccgccatc aaccg 55
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物4(RV-Rhf-Link-Red-HindIII+EcoRV)
<400>10
aagatatcaa gctttcagag tcgcagggcc agcc 34
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物5(PCR cyp109B1 A11)
<400>11
cctgcaggtt acattttcac acggaagctc ttt 33
Claims (15)
1.N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物的制备方法,其特征在于,使用细胞色素P450,将N-(2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物羟基化。
2.如权利要求1所述的制备方法,其中,细胞色素P450为由SEQID NO.1或SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或由在所述氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成,且具有羟基化活性的蛋白质。
3.如权利要求1所述的制备方法,其中,细胞色素P450为由SEQID NO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L和F232M中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质,或由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,不分离N-(5-羟基-2-金刚烷基)-苯甲酰胺衍生物。
9.使用由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或由在该氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成,且具有羟基化活性的蛋白质,将具有金刚烷骨架的化合物的金刚烷部分羟基化的方法。
10.含有在SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列,且具有羟基化活性的蛋白质。
11.由SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列具有选自I77F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L和F232M中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
12.由在SEQ ID NO.:3记载的氨基酸序列构成的蛋白质,或含有在该氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列,且具有羟基化活性的蛋白质。
13.由SEQ ID NO.3记载的氨基酸序列具有选自I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E和K702E中的1个或数个突变而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
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