DE3887375T2

DE3887375T2 - Pflanzengewebe-Transformation.

Info

Publication number: DE3887375T2
Application number: DE3887375T
Authority: DE
Inventors: Sharon Clarice Harvey Alfinito; Paul Shartzer Dietrich; Lynn Ellen Murry; Ralph Michael Sinibaldi
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1987-05-05
Filing date: 1988-05-03
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2008-05-04
Also published as: EP0290395B1; IE63004B1; EP0290395A2; KR880014104A; ZA883238B; CA1328236C; PT87394B; EP0574356A1; IE940815L; IL86245A; JPS63301792A; EP0290395A3; DK240088D0; IE881323L; PL272245A1; BR8802175A; DE3887375D1; ATE100858T1; PT87394A; HUT46741A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung von DNA in monokotyle (monokot) und dicotyle (dikot) Pflanzenzellen mittels eines DNA transportierenden elektrischen Stroms. Das Verfahren sorgt für den direkten Transfer von Plasmid DNA in intaktes monokotyles und dikotyles Gewebe.

Hintergrund der Erfindung

Die genetische Transformation von Pflanzen wurde bis jetzt auf zwei verschiedenen Wegen angegangen. Beide weisen jedoch Beschränkungen auf, wenn sie auf monokotyle Pflanzen angewendet werden, insbesondere auf kommerziell wertvolle Feldfrüchte, wie den Getreiden.
Das erste dieser Verfahren beruht auf der Möglichkeit, eine Region des tumorinduzierenden (Ti) Plasmids der Bodenmikroben der Agrobacterium Gattung nach der Infektion eines Wirts mit dem Bakterium mit dem Wirtszellgenom zu fusionieren. Eine genetische Manipulation des Plasmids erlaubt daher die Einführung von fremder DNA in eine Wirtszelle. Da monokotyle Pflanzen im allgemeinen gegenüber diesem Mikroorganismus jedoch nicht empfindlich sind, ist dieses Verfahren auf die Transformation von dikotylen Pflanzen beschränkt. Obwohl die genetische Transformation von Asparagus durch dieses Verfahren beschrieben wurde [WO-A 86 03776] und Grimsley et al., Nature 325 (1987) 177 den Transfer von DNA in Getreide mittels Agrobacterium beschrieben haben, wurde bis jetzt noch nicht gezeigt, daß eine tatsächliche Transformation, das heißt die Aufnahme und die Integration der exogenen DNA in das Wirtszellgenom oder die Expression der gewünschten neuen Eigenschaften stattfinden kann.
Das zweite Verfahren beinhaltet die direkte Aufnahme von Nukleinsäuren durch die Pflanzenprotoplasten. Eine solche Aufnahme kann entweder chemisch, das heißt eine Polyethylenglycol stimulierte Aufnahme, wie von Paszkowski et al., Meth Enzym 118 (1986) 668 beschrieben, oder durch die Verwendung von elektrischen Pulsen mit hoher Voltzahl im Millisekundenbereich erreicht werden. Die letztere Technik wird als Elektroporation oder Elektroinjektion beschrieben und dürfte dadurch funktionieren, daß vorübergehend Risse in die Pflanzenzellwand geschlagen werden, durch die extern bereitgestellte Nukleinsäuren leicht hindurch können. Man vergleiche auch beispielsweise Fromm et al., PNAS 82 (1985) 5824, Fromm et al., Nature 319 (1986) 791 und WO-A 87 06614. Der Erfolg dieses Verfahrens hängt jedoch von der Möglichkeit ab, eine reife fruchtbare Pflanze aus einem Protoplasten regenerieren zu können, ein Aspekt, der im Fall der Getreide nur beim Reis demonstriert wurde. Es wurden Versuche unternommen, Maisprotoplasten zu fruchtbaren Pflanzen zu regenerieren, beispielsweise Graves et al., Theor Appl Genet 54 (1979) 209, aber diese waren bis jetzt nicht erfolgreich.
Es wurden auch Untersuchungen angestellt, mittels des Elektroporationsverfahrens nackte RNA in Zellen dikotyler Pflanzen zu transferieren. Morikawa et al., Gene 41 (1986) 121 zeigten, daß RNA vom Tabakmosaikvirus (TMV) von ganzen Mesophyllzellen der dikotylen Pflanze Nicotiana aufgenommen werden kann. Von diesem auf einzelne Zellen angewendeten Verfahren wurde jedoch berichtet, daß es Zellen mit einer geringen Überlebensrate produziert, und es ist nicht klar gezeigt, daß die Wirtszellen transformiert und nicht infiziert wurden. Falls die Elektroporation von einzelnen monokotylen Zellen in Zukunft erreicht würde, würde weiterhin das Problem existieren, aus einzelnen Zellen ganze Pflanzen, insbesondere fruchtbare Maispflanzen, zu regenerieren.

DEFINITIONEN

Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wurde darauf geachtet, daß die Terminologie gemäß der derzeitig im Fachgebiet akzeptierten Bedeutung verwendet wird. Falls keine allgemein akzeptzierte Bedeutung existiert oder diese zweideutig ist, werden die folgenden Definitionen als Kontrolle angegeben.
"Elektrotransformation" ist die Verwendung eines langanhaltenden, kontinuierlichen direkten elektrischen Stroms, um die Aufnahme von DNA in einen Wirt oder eine Empfängerzelle und die anschließende Integration dieses genetischen Materials in das Wirtszellgenom zu induzieren,
Pflanzengewebe" ist eine Zellpopulation,
"Embryo" ist das Entwicklungsstadium, in dem die bestimmten Organe oder Organsysteme, wie Wurzeln oder Sprossen, nicht sichtbar differentiert sind, aber die zu den Organen führenden Zellkompartimente vorhanden sind.
"Kallus" ist ein Pflanzenzellhaufen, der aus der Gewebekultur einer einzelnen Pflanzenzelle oder eines Pflanzengewebes resultiert,
"CM(30)" ist ein künstliches Maismedium, dessen Zusammensetzung in Tabelle A gezeigt ist,
"MTM" ist ein künstliches Flüssigmedium, das zur Kultivierung von Maisrispen brauchbar ist, und dessen Zusammensetzung in Pareddy, Greyson and Walden, Planta 170 (1987) 141 beschrieben ist,
"BSS" ist ein künstliches Flüssigmedium zur Kultivierung von Stammstreifen von Brassica, dessen Zusammensetzung in Tabelle B gezeigt ist.
"TMM" ist ein künstliches Medium für die Kultivierung von Tomatenembryos, dessen Zusammensetzung in Tabelle B gezeigt ist.
Ein "Protoplast" ist eine Pflanzenzelle, von der die Zellwand im allgemeinen durch enzymatischen Verdau entfernt wurde, wobei aber noch immer eine Zellmembran vorhanden ist.
"Meristem" oder "meristematisches Gewebe" setzt sich aus Zellen zusammen, die alle zur weiteren Teilung fähig sind, aus denen dann embryonales primäres oder sekundäres Gewebe entsteht.
"Genom", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf das in einer Zelle gefundene genetische Material, sowohl chromosomales als auch extrachromos omal es,
eine durch DNA "transformierte" Zelle ist eine Zelle, die diese DNA oder einen Abkömmling hiervon während der Mitose oder Meiose enthält, die diese DNA Sequenz immer in ihrem Genom behält,
"membranpermeabilisierende Mittel" sind die für die Säugetierzellen bekannten Mittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation von pflanzlichem Zellmaterial, gekennzeichnet durch Zusammenbringen des Zellmaterials mit einer Transformationslösung, die DNA und ein membranpermeabilisierendes Mittel enthält, in Gegenwart eines elektrischen Stroms für eine Zeit, die zur Bewirkung der Transformation ausreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist zahlreiche Vorteile auf. Es ermöglicht die Durchdringung zahlreicher Zellschichten, so daß gesamte Gewebe und nicht nur Einzelzellen verwendet werden können. Die Zellen werden nicht verletzt, behalten ihre Lebensfähigkeit und können für die Herstellung reifer, fruchtbarer Pflanzen verwendet werden. Das Verfahren ermöglicht auch die Transformation von Pflanzen, die bis vor kurzem nicht erfolgreich transformiert wurden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten, fruchtbaren Pflanze, das gekennzeichnet ist durch Zusammenbringen von Pflanzenzellen mit einer Transformationslösung, die DNA und ein zellmembranpermeabilisierendes Mittel enthält, in Gegenwart eines elektrischen Stroms für eine zur Bewirkung einer Transformation ausreichenden Zeit, und Kultivieren der so transformierten Pflanzenzellen unter Kulturbedingungen.
Um das erfindungsgemäße Transformationsverfahren von den sogenannten Elektroporations oder Elektroinjektionstechniken zu unterscheiden, in denen kurze elektrische Strompulse (im allgemeinen im Bereich von einigen usec bis etwa 400 msec) verwendet werden, wird dieses Transformationsverfahren als Elektrotransformation definiert.
Da die vorliegende Erfindung eine konstantere, länger angewandte elektronentreibende Kraft (Spannung) verwendet, die DNA zu und durch die Zellmembran befördert oder transportiert, wird deren Permeabilität durch das membranpermeabilisierende Mittel ausreichend gesteigert.
Zur erfindungsgemäßen Elektrotransformation kann jedes nicht-protoplastische Pflanzenmaterial verwendet werden. Daher zielt die vorliegende Erfindung beispielsweise auf die Transformation von Pflanzengewebe, Pflanzenembryos, meristematischem Gewebe, wie Rispen- oder Ährenmeristem, Achsknospen, Stammstreifen, Kallus oder Zellsuspensionen. Wenn man embryonales Gewebe vom Mais verwendet, ist es bevorzugt, daß die Embryos das dritte Entwicklungsstadium erreicht haben, wie es von Abbe und Stein in Am J Botany 41 (1954) 286-287 definiert ist, das heißt ein Stadium zwischen 22 und 28 Tagen nach der Bestäubung. Ein Maisembryo in Stadium 3 ist typischerweise 3 mm lang, und das Knotengewebe des Scutellums ist von außen durch die zwei Einschnürungen, die es absetzen, erkennbar. Innerhalb der Coleorrhiza ist die primäre Wurzel sichtbar geworden und innerhalb des Coleoptils haben die ersten und zweiten Blätter merklich an Größe zugenommen. Dieses Stadium ist durch den dritten Blattursprung charakterisiert, der erst vor kurzem in Erscheinung getreten ist. Das verwendete Pflanzenmaterial ist der Einfachheit halber ausgeschnitten.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird der Einfachheit halber in einem horizontalen Gelelektrophoresesystem ausgeführt, beispielsweise einem Agarosegelelektrophoresesystem, in das das zu transformierende Pflanzenmaterial und die DNA in Probentaschen eingebracht werden, so daß der elektrische Strom von der DNA zum Pflanzenmaterial läuft.
Wenn man embryonales Gewebe verwendet ist es bevorzugt, daß der Embryo so im Probenloch positioniert wird, daß die das meristematische Gewebe enthaltende Seite zu den die Transformationslösung enthaltenden Probentaschen schaut. Eine die DNA (die zur Vereinfachung der Selektion in einem späteren Schritt beispielsweise eine DNA Sequenz enthalten kann, die für die Resistenz gegenüber einem bestimmten Antibiotikum kodiert) enthaltende Lösung und ein membranpermeabilisierendes Mittel werden dann in die zu den das Pflanzenmaterial enthaltenden nächstliegenden Probentaschen gegeben. Bevorzugte membranpermeabilisierende Mittel sind polar, so daß sie zusammen mit der DNA zur und durch die Zellmembran befördert werden, wenn die Spannung angelegt wird. Geeignete Beispiele für membranpermeabilisierende Mittel beinhalten DMSO, Lysolecithin und Detergenzien, wie Natriumdodecylsulfat und Triton-X, vorzugsweise DMSO. Die Konzentrationen eines solchen membranpermeabilisierenden Mittels sollten ausreichen, um die Zellmembran vorübergehend permeabel zu halten, aber ohne die Integrität der intrazellulären Organellmembranen zu zerstören. Solche Konzentrationen können in weiten Bereichen variieren und unter anderem vom beteiligten Pflanzenmaterial abhängen. Festeres Pflanzenmaterial, wie dikotyles Zellmaterial kann beispielsweise einer Konzentration von 10% DMSO widerstehen. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse mit einer Konzentration des membranpermeabilisierenden Mittels von etwa 1 Gewichtsprozent bis etwa 4 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 2 Gewichtsprozent der Transformationslösung erhalten. Ein markierender Farbstoff kann optional in der Transformationslösung enthalten sein, um das Wandern der Vektoren zu verfolgen. Beispiele von geeigneten markierenden Farbstoffen könnten Bromphenol blau, Bromkresol grün oder Xylolcyanol sein. Solche Farbstoffe und ihre Verwendung für einen solchen Zweck sind im Fachgebiet gut bekannt. Es wird ein elektrischer Strom mit wenig Volt derart angelegt, daß er von den Vektor-enthaltenden Probentaschen in Richtung der das Pflanzenmaterial enthaltenden Probentaschen läuft. Danach werden die Gewebe mit steriler Flüssigkeit gewaschen und auf festes Medium gegeben, daß sie sich vom Schock des Elektrotransformationsverfahrens erholen können. Die Zeitspanne auf dem festen Medium hängt vom Alter und der Größe der behandelten Gewebe ab und jüngere und/oder kleinere Gewebe können vor dem Selektionsverfahren eine längere Erholungsperiode benötigen. Die Gewebe werden normalerweise für 2-3 Tage auf dem Medium gehalten, wonach die erfolgreich transformierten Gewebe selektiert werden, wobei dieses Verfahren, falls der Transformationsvektor eine für eine Resistenz gegenüber einem bestimmten Antibiotikum kodierende DNA Sequenz enthielt, durch das Aussetzen der Gewebe gegenüber diesem bestimmten Antibiotikum durchgeführt werden kann. Jene Gewebe, die auf dem Selektionsmedium auskeimen (im Fall der Embryos Wurzel und Sprossen entwickeln) oder wachsen und Chlorophyll entwickeln, haben eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum durch Aufnahme und Einbau der transformierenden DNA erworben.
Die angelegte Voltzahl (Spannung) sollte ausreichen, um den Transport der DNA in die Zellen zu unterstützen und nicht eine Spannung überschreiten, die die Zellen wesentlich schädigt. Die verwendete Spannung kann innerhalb weiter Bereiche variieren und hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie dem Typ und der Form des verwendeten Pflanzenmaterials und der Zeit, während der die Spannung anliegt. Daher überleben 50% der Maisembryos, wenn sie in einem Gelelektrophoresesystem für fünf Minuten bei 200 V unter Spannung gesetzt werden, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. (Mais gehört zu den stabilsten Monokotyledonen, und Dikotyledonen überleben im allgemeinen besser, als Monokotyledonen.) Es können Voltzahlen bis zu 110 V ohne ernsthafte Beschädigung des Embryos verwendet werden, obwohl die Keimung verzögert sein kann. Voltzahlen über 200 V sollten im allgemeinen vermieden werden. Auf der anderen Seite kann ,- eine Transformation noch mit einer Spannung, die nicht größer als 8 V ist, erreicht werden. Im allgemeinen werden befriedigende Ergebnisse erhalten, wenn eine elektrische Spannung von 40 V bis 140 V, beispielsweise von 50 V bis 140 V, vorzugsweise von etwa 50 V bis 110 V und vor allem von 52 V bis 80 V angelegt wird. In dem in den Beispielen verwendeten Gelelektrophoresesystem liegen die Elektroden 18 cm auseinander. Daher ergibt das Anlegen einer Spannung von beispielsweise 50 V in einem solchen System eine elektrische Feldstärke von 50 V/18 cm oder 2, 78 V/cm. Dies gibt eine Vorstellung über die Größenordnung der angelegten elektrischen Feldstärke. Die in einem solchen System produzierte elektrische Stromstärke hängt unter anderem von der Transformationslösung (Gel etc. ) und den angelegten Voltzahlen ab. In dem in Beispiel 1 verwendeten Elektrophoresesystem wird bei einer Voltzahl von 52 V ein elektrischer Strom von etwa 25 mA gebildet.
Die Zeitspanne der Einwirkung des elektrischen Stroms hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie dem Abstand der das Gewebe enthaltenden Probentaschen und der die Transformationslösung enthaltenden Probentaschen und auch von der Größe der Gewebsprobe. Daher ist die minimale Zeitspanne die, die DNA in der Transformationslösung benötigt, um unter dem Einfluß des elektrischen Felds in den Bereich des Gels zu kommen, der die Pflanzenmaterialproben enthält. Falls der Abstand zwischen den zwei Reihen der Probentaschen bei Anlegen des Stroms 1 mm beträgt, benötigt die Transformationslösung bei einer Voltzahl von 52 V etwa 13 bis 15 Minuten, um hinter einen Maisembryo zu kommen, und benötigt etwa 20 Minuten, um hinter ein größeres Gewebe zu kommen, wie einer sich gerade entwickelnden Rispe. Im allgemeinen führt die Transformation zu guten Ausbeuten nach einer Einwirkung der elektrischen Spannung für 5 bis 25 Minuten, insbesondere für 10 bis 20 Minuten.
Der Abstand zwischen den Reihen mit den Probentaschen, das heißt jene , die die Gewebeprobe enthalten und jene, die die Transformationslösung enthalten, hängt von der Stärke der Transformationslösung und der Konzentration des Trägergels ab, so daß der Abstand vorzugsweise größer ist, wenn das Gel verdünnter ist.
Die verwendete DNA liegt der Einfachheit halber in Vektorform vor, vorzugsweise in Plasmidform, wobei das Plasmid mittels der herkömmlichen rekombinanten DNA Techniken genetisch manipuliert ist, wie sie Fachleuten bekannt sind, so daß diese DNA enthalten, mit der die Transformation des Pflanzengewebes gewünscht wird.
Zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete DNA gehört jede DNA, die aus einer anderen Quelle, wie der Wirts- oder Empfängerzelle, stammt. Beispiele von einer solchen wertvollen DNA, die im erfindungsgemäßen Elektrotransformationsverfahren verwendet werden kann, könnte daher für Zein kodierende DNA beinhalten, das das Speicherprotein von Mais ist, oder gewebsspezifische Promotoren, wie jene der Maisgene, die bei chimären Konstruktionen verwendet werden können. Ein Beispiel eines solchen Promotors kann der Alkoholdehydrogenasepromotor (ADH) sein, der n Wurzeln induzierbar ist.
Eine bevorzugte DNA Klasse zur erfindungsgemäßen Verwendung kann als Fremd-DNA klassifiziert werden. Der Ausdruck Fremd-DNA, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede DNA, die aus einer anderen Quelle, als der Wirts- oder Empfängerart stammt. Fremd-DNA beinhaltet beispielsweise nicht-pflanzliche DNA, synthetische DNA Sequenzen, durch rekombinante DNA Techniken gebildete Sequenzen, DNA Sequenzen aus Bakterien, Pilzen, Viren, Tieren und dergleichen.
Geeignete Fremd-DNA kann nicht-pflanzliche DNA Promotoren beinhalten, wie T-DNA Promotoren der Ti und Ri Plasmide, Promotoren von Pflanzenviren, wie CaMV, TMV, BMV etc. und dergleichen. Wertvolle Fremd-DNA kann ebenfalls fremde Struktursequenzen von den Genen für beispielsweise Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Neomycinphosphotransferase II (npt-II), Nopalinsynthase (nos), β-Galactosidase (β-gal), das Glyphosatresistenzgen (EPSP, das das Enzym ist, das Resistenz gegenüber der Glyphosat-5-enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase verleiht) und Gene vom Bacillus thuringiensis, die für ein kristallines Protein als Insektentoxin kodieren. Dies wurde beispielsweise von Adang et al, Gene 36 (1985) 289 und Wong et al., Proc 9th Int Spore Cong (Herausgeber Hoch & Setlows 1985) beschrieben. Beispiele von Genen vom Bacillus thuringiensis Typ, die für ein kristallines Protein als Insektentoxin kodieren, beinhalten das B.t. var kurstaki Gen, das für ein Proteintoxin kodiert, das für Schmetterlingslarven toxisch ist, vorzugsweise für Noctuidea, insbesondere Heliothis zea und Heliothis virescens und Spodoptera Arten, wie Spodoptera exigua und Spodoptera frugiperda, und beinhalten das B. t. var tenebrionis Gen, das für ein Proteintoxin kodiert, das für Coleoptera Schädlinge toxisch ist, speziell Chrysomelidae, insbesondere Diabrotica Arten, wie D. longicornis, D. undecimpunctata und D. virgifera und Leptinotarsa Arten, wie L. decemlineata. Die vorhergenannten Heliothis, Spodoptera und Diabrotica Arten sind Schädlinge, die Getreide, wie Mais infizieren. Fremd-DNA beinhaltet auch synthetische Gene, wie synthetische DNA Sequenzen, die auf nativen Wirtspflanzengenen basieren, beispielsweise ein verändertes Zeingen, um die Aminosäurezusammensetzung des Maisspeicherproteins zu verändern. Die erfindungsgemäße Fremd-DNA enthält vorzugsweise chimäre Konstruktionen, wie heterologe Sequenzkombinationen von Promotor und Strukturgen. Zu Beispielen für solche heterologe Konstruktionen gehören das B.t. Toxingen unter der Kontrolle des ADH Promotors und Selektionsmarker, wie die CAT oder npt-II Struktursequenz unter der Kontrolle eines T-DNA Promotors oder eines CaMV Promotors. Solche Kombinationen können gemäß den herkömmlichen rekombinanten Techniken konstruiert werden, wie sie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) und DNA Cloning Vol I & II (Herausgeber D. Glober 1985) beschrieben sind. Andere DNA Sequenzen oder Kombinationen hiervon, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, fallen Fachleuten sofort auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Pflanzenmaterial mit einem Selektionsmarkergen transformiert, wodurch die Identifizierung erfolgreich transformierter Gewebe vereinfacht wird. Beispiele für solche Markergene sind Gene, die für eine Resistenz gegenüber Antibiotika (wie Kanamycin, Hygromycin, Neomycin und Chloramphenicol), Gene für Herbizidresistenz und Gene für eine Farbe (beispielsweise das Anthocyaningen) kodieren. Das Vorkommen eines für Antibiotikaresistenz kodierenden Gens ermöglicht es beispielsweise transformierten Pflanzenzellen in einem Medium zu überleben und zu wachsen, das das selektive Antibiotikum enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Pflanzenmaterial durch Gene transformiert, die für Eigenschaften kodieren, die einen großen kommerziellen oder landwirtschaftlichen Wert aufweisen, wie Resistenz gegenüber Insekten, Resistenz gegenüber Herbiziden, Resistenz gegenüber Viren, Resistenz gegenüber Pilzen, oder für Enzyme kodieren, die in bestimmte biochemische Stoffwechselwege eingreifen, wie die, die zur Sythese von essentiellen Aminosäuren führen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Pflanzenmaterial durch DNA transformiert, die ein Selektionsmarkergen und eine oder mehrere DNA Sequenzen enthält, die andere gewünschte Eigenschaften kodieren. Die Verwendung eines Markergens meint, daß erfolgreich transformiertes Material einfach von nichttransformierten Material unterschieden werden kann, das das spätere Screening auf Material, das das cotransferierte Gen oder Gene in dessen Genom aufgenommen hat, die für sich nicht leicht selektierbar sind.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren transformierte Pflanzenmaterial kann man wachsen lassen und zu fruchtbaren Pflanzen regenerieren.
Genetisch transformierte, gesunde fruchtbare monokotyle Pflanzen sind neu. Die Erfindung liefert demnach monokotyles Pflanzenmaterial, das in dessen Genom DNA von einer anderen Quelle als der Wirts- oder Empfängerart enthält und zur Regeneration in gesunde, fruchtbare Pflanzen fähig ist.
Der hierin verwendete Ausdruck gesund soll die erfindungsgemäßen Pflanzen von Pflanzen unterscheiden, die auf natürliche Weise durch Viren und dergleichen infiziert wurden.
Die Erfindung liefert weiterhin gesunde, fruchtbare monokotyle Pflanzen, die in ihrem Genom DNA enthalten, die von einer anderen Quelle als der Wirts- oder Empfängerart und Teilen hiervon, insbesondere den Samen solcher Pflanzen, stammt.
Bevorzugtes monokotyles Pflanzenmaterial oder Pflanzen sind gemäß der Erfindung Feldfrüchte der Familie der Gramineae, insbesondere Getreide, wie Reis, Weizen, Hirse, Gerste, Sorghum, Roggen, Hafer, Triticale und Mais, insbesondere Getreide, die ausgewählt sind aus Weizen, Hirse, Gerste, Sorghum, Roggen, Triticale und Mais, vor allem Mais.
Zu bemerken ist jedoch, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch ein bequemes Alternativverfahren zur Transformation von dikotylen Pflanzen darstellt, zu denen Brassica oleracea Arten, Tomaten, Sonnenblumen, Karotten, Kürbisse, Kartoffeln, Sojabohnen, Baumwolle und dergleichen gehören.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung, aber sollen deren Umfang nicht beschränken.
Temperaturen sind in Grad-Celsius (ºC) und Prozente (%) sind in Gewichtsprozent angegeben. Die Elektrotransformation wird im wesentlichen bei Raumtemperatur ausgeführt, wobei jedoch die Temperatur des Elektrophoresesystems unter dem Einfluß des elektrischen Stroms ansteigen kann.

TABELLE A

CM(39) Medium (flüssig oder fest)
MS Hauptsalze
NH&sub4;NO&sub3; 1,65 g/l
KNO&sub3; 1,90 g/l
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,44 g/l
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,37 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 0,17 g/l
MS Nebensalze
H&sub3;BO&sub3; 6,20 mg/l
MnSO&sub4; H&sub2;O 16,80 mg/l
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 10, 60 mg/l
KI 0, 83 mg/l
Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O 0,25 mg/l
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,025 mg/l
CoCl&sub2;·6H&sub2;O 0,025 mg/l
Vitamine
Thiamin HCl 0,25 mg/l
L-Asparagin 13,2 mg/l
Glycin 7, 7 mg/l
Kohlenstoffquelle
Saccharose 20 g/l
Agar (zur Verfestigung) 8 g/l
Destilliertes Wasser auf einen Liter

TABELLE B

BSS Medium
4fach Difco Salzmischung 1 500 ml/l
Nicotinsäure 0, 5 mg/l
Pyridoxin HCl 0, 5 mg/l
Thiamin HCl 1,0 mg/l
Inosit 100 mg/l
Naphtalinessigsäure 0,2 mg/l
Benzyladeninphosphat 1,0 mg/l
Saccharose 30 g/l
Agar (zur Verfestigung) 16 g/l
destilliertes Wasser auf einen Liter
ph auf 5,8 eingestellt
TMM Medium
4fach Difcosalzmischung¹ 250 ml
Nicotinsäure (0,5 mg/ml) 1 ml
Pyridoxin HCl (0,5 mg/ml) 1 ml
Thiamin HCl (0,5 mg/ml) 2 ml
Inosit (100 mg/ml) 1 ml
IAA² (0, 1 mg/ml) 5 ml
Saccharose 20 g
Agar (zur Verfestigung) 8 g
destilliertes Wasser auf 490 ml
pH auf 6,0 eingestellt
¹Difco Salzmischung ist eine im Handel erhältliche Mischung der Murashige und Skoogs ("MS") Haupt- und Nebensalze und 4fach bezieht sich auf die Stärke der Stammlösung. ² IAA = Indolylessigsäure

BEISPIEL 1

In jede von acht Probentaschen in einem 0,7%igen Agarosegel wird ein ausgeschnittener Maisembryo (P3780) in Stadium 3 (im Kühlschrank für 7 Tage synchronisiert) gegeben. In jede der acht zusätzlichen Probentaschen, die parallel zu den ersten acht Probentaschen in 1 mm Abstand verlaufen, werden 15 ul (10 ug) Plasmid DNA (H83E oder H83R), 2 ul Bromphenolblaufarbstoff und 2% DMSO gegeben, wobei der Rest destilliertes Wasser ist. Der Embryo wird in der Probentasche so positioniert, daß die das meristematische Gewebe enthaltende Seite des Embryos in Richtung der Probentaschen schaut, die die Transformationslösung enthalten. Die Plasmide H83E und H83R, die jeweils das pUC 8 Plasmid mit einem 35S Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) [Nukleotide 7013 bis 7436, siehe Hohn et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96 (1982) 193], eine für die Hygromycinphosphotransferase (HPT) kodierende Sequenz [das BamHl Fragment von pLG83, siehe Gritz und Davies, Gene 25 (1983) 179] und einen Terminator der Nopalinsynthase (NOS) [Nukleotide 682 bis 437, siehe Bevan et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 369] enthalten. Die HPT Sequenz befindet sich in der Sinn- Orientierung bezogen auf die Promotor und Terminatorsequenzen im Plasmid H83E und in der Antisinn-Orientierung im Plasmid H83R.
Jedes Gel wird in ein horizontal es Gelelektrophoresesystem (BRL H6) mit 450 ml sterilem Tris-Acetat-EDTA-Laufpuffer (pH 8,0) gegeben. Die Gele werden einem elektrischen Strom von 52 V für eine Zeitspanne von entweder 10, 12,5 oder 15 Minuten ausgesetzt, der von der DNA in Richtung der Embryos läuft. Nach der Behandlung werden die Embryos mit sterilem CM(30) Medium gewaschen und für 3 Tage auf festes CM(30) Medium gegeben. Die Embryos werden dann in 100 ug/ml Hygromycin enthaltendes CM(30) Medium überführt. Die Embryos werden nach 11 und 14 Tagen nach der Elektrotransformationsbehandlung mit folgenden Ergebnissen untersucht:
Nach 11 Tagen keimen alle Embryos aus (entwickeln Wurzeln und Sprossen). Nach 11 und 14 Tagen sind die Keimlinge der Tabelle C grün, was zeigt, daß sie eine Resistenz gegenüber Hygromycin durch Einbau des pLG83 Gens erworben haben. Die Kontrolle (a) entspricht den in den Tests elektrotransformierten Geweben, wird aber danach in Abwesenheit von Hygromycin gezogen, die Kontrolle (b) entspricht der dem elektrischen Strom aber in Abwesenheit der Transformationslösung ausgesetzten Geweben und wird nachher in Gegenwart von Hygromycin gezogen. Nichttransformierte hygromycinresistente Kontrollen werden kalkweiß und hören zu wachsen auf. Tabelle C Kontrolle Tag

BEISPIEL 2

14 Tage nach der Behandlung mit der Plasmid DNA werden die grünen Keimlinge (Sämlinge) aus jeder Testgruppe in Beispiel 1 gesammelt und zerrieben, und die Nukleinsäure wird gemäß der von Rogers et al., Plant Mol Biol 5 (1985) 69 beschriebenen Cetyltrimethylammoniumbromidverfahren (CTAB) extrahiert.
Das geerntete Keimlingsgewebe aus jeder Gruppe wird in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis zu einem feinen Pulver verrieben und in ein Teströhrchen gegeben. Das Gemisch wird langsam auf 65ºC erwärmt und 1 ul/mg einer Lösung von CTAB [2% CTAB (w/v), 100 mM Tris (pH 8,0), 20 mM EDTA (pH 8,0), 1,4 M NaCl und 1 % PVP (Polyvinylpyrrolidon)] wird zugegeben, und anschließend wird für 3 Minuten auf 65ºC erwärmt. Ein gleiches Volumen Sevag (CHCl&sub3; Isoamylalkohol im Verhältnis 24 : 1) wird zugegeben und vermischt.
Das Gemisch wird bei 11 000 Upm für 30 sec zentrifugiert und die oberste Phase wird in ein neues Röhrchen gegeben und CTAB (10% w/v) und 0,7 M NaCl werden zugegegeben. Die Zentrifugation wird wiederholt und die oberste Phase wird erneut abgetrennt und mit CTAB und NaCl verdünnt. Ein Volumen CTAB Präzipitationspuffer [1% CTAB, 50 mM Tris (pH 8,0) und 10 mM EDTA (pH 8,0) und 1 M NaCl] werden für 10 min auf 65ºC aufgeheizt. Nach der vollständigen Rehydratisierung werden die Nukleinsäuren erneut mit 2 Volumen Ethanol gefällt und dann durch Zentrifugation für 13-15 Minuten in einem Kühlraum pelletiert. Man läßt mit allen Proben Minigele laufen und prüft das Vorkommen von DNA.
Zur Dot-Blot-Analyse wird die extrahierte DNA auf 100ºC aufgeheizt, 20fach SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, 20 mM EDTA, pH 7,4) werden zugegeben und die Lösung wird gekühlt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Diese wird mit nicktranslatierter DNA (BRL Kit Nr. 5210 und H83E) hybridisiert, siehe Rigby et al J Mol Biol 113 (1977) 237. Die Nitrozellulose wird in 2fach SSPE und 0,1% SDS gewaschen, dann für 1 Stunde auf 50ºC aufgeheizt, gefolgt von einem Schütteln in einfachem SSPE und 0,1% SDS bei Raumtemperatur für eine Stunde und anschließender Exposition auf einem Röntgenfilm, siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1983). Die Ergebnisse zeigen eine starke Hybridisierung und daher Transformation, die in 10% der Dot-Blot behandelten Proben auftritt.

BEISPIEL 3

Im Anfangsstadium befindliche Maisrispen (1,0-1,5 cm lang) (cvx. 0h 43 und Se60) werden aseptisch zerlegt, wie dies von Pareddy und Greyson, Plant Cell Tissue Organ Cult 5: (1985) 119 beschrieben wurde, und bis zur Elektrotransformationsbehandlung auf MTM Medium gehalten. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 werden die Rispen und die Transformationslösung, die entweder a) 8 ul (10 ug) Plasmid H83E, 2% DMSO und 29 ul destilliertes Wasser, oder b) 15 ul (10 ug) Plasmid H83R, 2% DMSO und 22 ul destilliertes Wasser enthält, in ein 0,7%iges Agarosegel in eine Elektrophoresesystemapparatur gegeben und einem elektrischen Strom von 52 V für 13 Minuten ausgesetzt. Nach der Behandlung werden die Rispen in steriles CM(30) Medium mit 50 ug/ml zugegebenen Gentamycin gegeben und vorsichtig für kurze Zeit gewaschen. Das Gentamycin wirkt als antibakterielles Mittel. Dann werden sie in sterile Kulturflaschen gegeben, die 50 ml MTM Medium enthalten, und die Kulturflaschen werden auf ein Fensterbrett gestellt. Zwei Tage nach der Behandlung werden 5 ug/ml Hygromycin zu jeder Flasche gegeben.
Sechs Tage nach der Zugabe des Hygromycins, stirbt eine von 3 mit H83R behandelten Rispen (hört mit dem Wachstum auf und bleicht weiß aus). Zehn Tage nach der Zugabe sterben 2 von 15 mit H83E behandelte Rispen. Dreizehn Tage nach der Zugabe sterben weitere 2 mit H83E behandelte Rispen. Die verbleibenden Rispen wachsen weiter und bleiben nach 25 Tagen nach Zugabe des Hygromycins grün. Des weiteren bildet eine der mit H83E behandelten Rispen Pollen.

BEISPIEL 4

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 werden zwischen den oberen zwei Knoten in der Knospe des Schößlings von Brassica oleracea entnommene Stammstreifen (ungefähr 1 · 3 · 4 mm) [cv italica, CrGC-9 (Crucifer Genetics Co-opperative-9)] in ein 0,7%iges Agarosegel in einer Elektrophoresesystemapparatur zusammen mit einer Transformationslösung gegeben, die 15 ul (10 ug) Plasmid pZ025 DNA, 2 ul Bromphenolblaufarbstoff und 2% DMSO enthält, und einem elektrischen Strom von 52 V für 15 Minuten ausgesetzt.
Nach der Behandlung werden die Stammstreifen kurzeitig in steriles BSS Medium, dann für eine Woche in ein 20 ug/ml Hygromycin enthaltendes Selektionsmedium und schließlich für eine Woche in 5 ug/ml Hygromycin enthaltendes Medium überführt. Vierundzwanzig Stammstreifen bilden einen Kallus, wenn sie in BSS Medium ohne Hygromycin überführt werden. Nach zwei Monaten bilden sie Sprossen und werden in einem feuchten Kultivierungsraum in Erde überführt, um Wurzeln zu bilden.
Blätter von zwei Hygromycin-selektierten Brassica werden in Stücke geschnitten und einer zweiten Selektion in 25 ug/ml Hygromycin enthaltendem BSS Medium unterworfen. Die Stücke bleiben grün und bilden Schößlinge. Wenn sie in BSS mit halber Salzstärke und ohne Hygromycin überführt werden, bilden sie Wurzeln. Blätter derselben zwei primären Transformanden werden auch auf das Vorkommen des Hygromycingens hin analysiert. Jedes Blatt (ungefähr 0,2 g) wird in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser zu einem Pulver zerrieben. Es werden 15 ml eiskalter Saccharosepuffer (enthält 15% Saccharose, 50 mM Tris pH 8,0 und 50 mM EDTA) und 0, 25 M NaCl zu dem Gewebe im Mörser gegeben und das Zerreiben wird fortgesetzt. Die Suspension wird in ein 5 ml Zerkleinerungsglas eines Wheatonhomogenisators gegeben und per Hand 5-10 mal zerkleinert. Die Suspension wird dann in ein 1, 5 ml Eppendorfreaktionsgefäß gegeben und für 3 Minuten bei 6500 Upm zentrifugiert. Das rohe Kernpellet wird dann in 0,5 ml eiskaltem Saccharosepuffer (wie oben, bloß ohne NaCl) resuspendiert. 1 ul Diethyldicarbonat wird zugegeben und die Suspension wird bei Raumtemperatur stark gemischt. Als nächstes werden 5 ul 20%iges SDS zugegeben, stark vermischt und dann für 10 Minuten auf 70ºC aufgeheizt. 50 ul 5M Kaliumacetat werden zugegeben und die Lösung wird stark gemischt. Das Reaktionsgefäß wird dann für 30 Minuten auf Eis gekühlt.
Die Kalium-SDS Fraktion wird gefällt und für 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wird in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und wiederholt mit Phenol:Chloroform extrahiert, bis die Farbe verschwindet und die Interphase klar wird. Es wird eine Ethanolfällung ausgeführt und die Lösung wird zur Gewinnung der DNA für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Die Transformanden werden auf das Vorkommen des eingeführten Hygromycingens untersucht. Die gesamte DNA wird quantifiziert und mittels des Restriktionsenzyms TaqI geschnitten. Die DNA Fragmente werden mittels einer horizontalen Gelelektrophorese (0,7% Agarose) bei 70 V für 3 Stunden aufgetrennt und mittels eines alkalischen Verfahrens zum DNA Kapillarblotverfahrens auf eine Biorad Zeta Probe Membran transferiert, wie es im Biorad Zeta Probe Blotting Membranes Instruction Manual ausgeführt ist. Nach der Prähybridisierung, der Hybridisierung und dem Waschen, das ebenfalls nach dem oben erwähnten Handbuch ausgeführt wird, sind die Membranen fertig zur Autoradiographie.
Ein isoliertes 1 kb Fragment des Hygromycingens wird mit ³²P CTP markiert gemäß dem im Amersham Multiprime DNA Labeling Systems Manual auf den Seiten 1 bis 28 angegebenen Verfahren mit niedrig-schmelzender Agarose. Es sind die diagnostischen 1,4 kb und 0,7 kb Fragmente in den transformierten DNAs vorhanden und fehlen bei der Kontroll-DNA.
Das Plasmid pZ025 ist dasselbe, wie H83E (aus Beispiel 1), außer daß die HPT kodierende Sequenz aus den Nukleotiden 197 bis 1251 besteht und durch einen Austausch eines Guanins durch ein Adenin an der Position 206 modifiziert ist.

BEISPIEL 5

Gemäß den Verfahren von Beispiel 1 werden in Stadium 3 ausgeschnittene Maisembryos und die Transformationslösung, die 15 ul (10 ug) Plasmid pZ033 DNA, 2% DMSO und 22 ul destilliertes Wasser enthält, in ein 0,7%iges Agarosegel in einer Elektrophoresesystemapparatur gegeben und einem elektrischen Strom von 52 V für 13 Minuten ausgesetzt.
Nach der Behandlung werden die Embryos mit sterilem flüssigen CM(30) Medium gewaschen und auf festes CM(30) Medium aufgebracht. Es wurde kein Versuch unternommen, auf die Plasmid DNA zu selektieren. Die entstehenden Sämlinge werden auf herkömmliche Art zu erwachsenen Maispflanzen herangezogen, die dann gegenseitig unter Bildung von F&sub1; Pflanzen bestäubt werden. Die Samen aus den Kolben der F&sub1; Pflanzen läßt man auskeimen und für eine Woche wachsen, um CAT Assays unter Etablierung der Kolben auszuführen, die Transformanden enthalten. Zusätzliche Samen von den entstehenden potentiell positiven Kolben werden gepflanzt, und die Wurzeln der entstehenden Pflanzen werden geerntet und im CAT Assay getestet. Von den ersten acht potentiell transformierten Kolben zeigen zwei eine Transformation.
Blätter von den CAT positiven F&sub1; Transformanden werden auf das Vorkommen der eingeführten CAT Gensequenzen hin untersucht. Die Verfahren zur Extrahierung, zum Schneiden, Auftrennen, Blotten und Sondieren der DNA stimmen mit denen im Beispiel 4 angegebenen überein. Ein diagnostisches 1,2 kb Fragment wird jedesmal freigesetzt, wenn das Plasmid pZ033 (35S-CAT-NOS) oder mit diesem Plasmid transformierte genomische DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI geschnitten und mit dem CAT Gen sondiert werden. In dieser zusammengehörigen Familie ist das 1,2 kb Fragment immer mit einem 1,4 kb Fragment assoziiert. Die aus der zur Bildung dieser F&sub1; Familie verwendete Rispe und aus allen Positiven extrahierte DNA enthält die 1,2 kb und 1,4 kb Fragmente. Im Gegensatz dazu fehlen allen Kontrollen (Kern-DNA aus 3780, Gesamt-DNA aus 3780 und F&sub1; Hybrid 3780) diese Fragmente.
Das Plasmid pZ033 enthält einen CaMV 35S Promotor (Nukleotide 7069 bis 7569) in der SacI Schnittstelle von pUC19 (im Handel von Pharmacia und von US Biochemical erhältlich), das 773 bp Chloramphenicolacetyltransferasegen (CAT) von Tu9 [siehe Alton und Vapnek, Nature 282 (1979) 864], dessen TagI Enden zu PstI Schnittstellen verändert wurden, in der PstI Schnittstelle, und einen NOS Terminator (Nukleotide 682 bis 437) zwischen den PstI und der HindIII Schnittstellen.
Der CAT Assay läuft folgendermaßen ab:

CAT ASSAY

1. Extraktion des Sämlings oder anderer Gewebe
A Der Sämling oder ein anderes Gewebe wird in 150 ul (oder einem Vielfachen hiervon) 0,25 M Tris-HCl pH 7,8 zerrieben.
B Die Probe wird auf Eis ultrabeschallt (3 Impulse auf Einstellung Nr. 2)
C Die Probe wird für 3 Minuten bei 12 000 · g zentrifugiert und der Überstand wird in ein sauberes Röhrchen gegeben.
D Die Probe wird für 12 Minuten in einem Wasserbad auf 65ºC aufgeheizt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
E Die Probe wird für 30 Sekunden zentrifugiert, der Überstand gesammelt und im CAT Assay verwendet.
2. Ansetzen eines Röhrchens für jede Reaktion. Ebenfalls Ansetzen einer Kontrolle für die CAT aus E. coli (13 · 100 mm Röhrchen) Negativkontrolle Potentieller Transformand Positive CAT Kontrolle Überstand (0,5 Einheiten/ul) ¹&sup4;C Chloramphenicol Inkubation* Gesamt * Inkubation für 5 Minuten bei 37ºC, um das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur zu bringen
3. Inkubation der Proben bei 37ºC für 1-2 Stunden.
4. Beenden der Reaktion mit 2 ml Ethylacetat, das mit kaltem Wasser gesättigt ist. Zugabe von 1 ml H&sub2;O, um die Interphase besser sichtbar zu machen.
5. Verschließen des Röhrchens mit Parafilm und starkes Mischen auf Einstellung 1 für etwa 1 min.
6. Zentrifugation in einer IEC für 3-5 Minuten auf Einstellung 5.
7. Transfer der obersten Schicht in kleine Röhrchen (13 · 75 mm).
8. Geschützt unter N&sub2; bis zur Trockne trocknenlassen (ungefähr 45 Minuten - Vermeidung eines Übertrocknens)
9. Während die Proben trocknen, Vorbereitung des DC Behälters mit dem Laufmittel, 100 ml Chloroform: Methanol 95 : 5. Anbringen von Löschpapieren im Behälter an allen Seiten.
10. Präparieren einer 20 · 20 cm Silicagel 60 DC Platte.
Anzeichnen einer Linie mit Bleistift 1,5 cm vom Boden entfernt. Anzeichen der Probenpositionen mittels Schnittpunkten. Die Trennung läuft durch aufsteigende Chromatographie.
11. Nachdem die Proben getrocknet sind, werden sie in 30 ul Ethylacetat (nicht wassergesättigt) resuspendiert.
12. Punktförmiges Aufbringen der Proben auf eine sehr kleine Fläche mit einer 10 ul Mikropipette. Während dem punktförmigen Auftragen bläst ein Haartrockner über die Platte.
13. Einbringen der Platte in den Behälter und Laufenlassen des Laufmittels bis die Front 3 mm vom oberen Rand der Platte entfernt ist (40-50 Minuten).
14. Geschütztes Trocknenlassen der Platte an der Luft für 15 oder 20 Minuten und anschließendes Einbringen bei RT über Nacht in eine Kassette mit einem Stück Film (vorgeblitzt).
15. Entwickeln des Films am nächsten Tag.

BEISPIEL 6

Gemäß den Verfahren von Beispiel 1 werden Tomatenembryos (Burpees Super Beefsteak VFN) in die Probentaschen eines 0,7%igen Agarosegels in einem horizontalen Elektrophoresesystem neben die Probentaschen gegeben, die eine Transformationslösung enthalten, die aus 10 ug Plasmid pZ060 oder pZ0 67 DNA, 2% DMSO und Bromphenolblau als Markierungsfarbstoff besteht. Die Embryos werden für etwa 15 Minuten einem elektrischen Strom von 52 V ausgesetzt.
Nach der Elektrotransformation werden die Embryos in TMM Medium überführt, um sich 2-3 Tage zu erholen. Dann werden sie für 10 Tage auf selektives Tomatenmedium gegeben, das 25 ug/ml Hygromycin enthält. Keiner der unbehandelten Kontrollsämlinge überlebt diese Selektion. Die Transformanden werden dann in ein Medium gerettet, das 0,5 mg IAA enthält und schlagen Wurzeln, bevor sie in Erde umgesetzt werden.
Blätter dieser primären Transformanden werden auf das Vorkommen von eingeführter DNA untersucht, insbesondere des Hygromycingens. Die Gesamt-DNA wird aus dem Pflanzengewebe isoliert, mit dem Restriktionsenzym TaqI geschnitten, aufgetrennt, geblottet und hybridisiert, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist. Diagnostische Hygromycinfragmente (1,4, 0,7 und 0,4 kb) kommen in den transformierten DNAs vor und sind in der Kontroll-DNA nicht vorhanden.
Das Plasmid pZ0 60 wird aus dem Plasmid pUC 8 mit dem 35S Promotor, der für HPT kodierenden Sequenz und dem nos Terminator von pZ025 (siehe Beispiel 4), direkt in Serie gefolgt von einer zweiten Kopie des 35S Promotors, der für CAT kodierenden Sequenz von pZ0 33 (siehe Beispiel 5) und einer zweiten Kopie des nos Terminators konstruiert.
Das Plasmid pZ0 67 wird aus dem Plasmid pUC 8 mit dem 35S Promotor von H83E (siehe Beispiel 1), der für die B-Glucuronidase (GUS) kodierenden Region auf einem PstI Fragment von RAJ-260 (Jefferson et al., PNAS 83 (1986) 8447) und dem nos Terminator, direkt gefolgt (in Serie) von dem 35S Promotor, der HPT Sequenz und dem nos Terminator von pZ0 25 (siehe Beispiel 4) konstruiert.

BEISPIEL 7

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 werden Maisembryos im Stadium 3 in die Probentaschen eines 0,7%igen Agarosegels in einem horizontalen Elektrophoresesystem neben die Probentaschen gegeben, die die Transformationslösung enthalten, die 10 ug Plasmid Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk)/HPT (pZ085-BTK/HPT) Plasmid DNA, 2% DMSO und Bromphenolblau als Markierungsfarbstoff enthält. Die Embryos werden dann einem kontinuierlichen elektrischen Strom von 52 V für etwa 15 Minuten ausgesetzt, bevor sie in CM(30) Medium überführt und auf die erworbene Hygromycinresistenz selektiert werden. Die Hygromycinresistenz zeigenden Keimlinge werden zu größeren Sämlingen herangezogen und durch herkömmliche Bioassayverfahren für Schädlingsresistenz gegenüber Heliothis Arten, wie Heliothis virescens und Spodoptera Arten getestet. Die transformierten Sämlinge zeigen verglichen mit unbehandelten Standards eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Heliothis und Spodoptera Arten.
Das Plasmid pZ0 85 wird folgendermaßen konstruiert. Das die kodierende Sequenz für die B-Glucuronidase (GUS) von pRAJ 275 (erhältlich von Clontech Laboratories) enthaltende SalI-EcoRI Fragment wird modifiziert, um die EcoRI Schnittstelle am 3' Ende in eine PstI Schnittstelle umzuwandeln. Eine Eigenschaft des GUS Gens ist, daß eine NcoI Schnittstelle das Startcodon (ATG) der kodierenden Sequenz teilt. pZ0 85 besteht aus den 35S Promotor- und nos Sequenzen, wie sie in pZ0 33 (siehe Beispiel 5) gefunden werden, und dem oben beschriebenen Sal-Pst Fragment (anstelle des CAT Gens).
pz0 85-BTK-HPT wird hergestellt durch Verwendung des Nco- Pst Fragments von pAMVBTS, das eine modifizierte Btk Sequenz enthält [Barton et al, Plant Physiol 85 (1987) 1103] anstelle des NcoI-PstI Fragments von pZ0 85. Diese Sequenz wird unmittelbar gefolgt (in Serie) vom 35S Promotor und dem nos Terminator von pZ0 33 (siehe Beispiel 5) mit der HPT Sequenz von pZ0 25 (siehe Beispiel 4).

BEISPIEL 8

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1. werden Maisembryos in Stadium 3 in die Probentaschen eines 0, 7%igen Agarosegels in einem horizontalen Elektrophoresesystem neben die Probentaschen gegeben, die eine Transformationslösung enthalten, die 10 ug Plasmid Btt/HPT DNA (pZ0 85. Btt-HPT), 2% DMSO und Bromphenolblau als Markierungsfarbstoff enthält. Die Embryos werden einem kontinuierlichen elektrischen Strom von 52 V für etwa 15 Minuten ausgesetzt, worauf sie in CM(30) Medium überführt und auf erworbene Hygromycinresistenz selektiert werden. Die Resistenz zeigenden Keimlinge werden zu größeren Sämlingen herangezogen und mittels herkömmlicher Bioassayverfahren auf Resistenz gegenüber dem Maiswurzelwurm (Diabrotica spp.) getestet. Bacillus thuringiensis var tenebrionis (Btt) bildet ein insektizides Toxin gegen den Maiswurzelwurm und andere Coleoptera-ähnliche Insekten.
pZ0 85-Btt-HPT wird hergestellt durch Verwendung eines modifizierten Nco-Pst Fragments der Btt kodierenden Sequenz [Sekar et al, PNAS 84 (1987) 7036], die modifiziert am ATG Startcodon eine NcoI Schnittstelle enthält und am 3' Ende der kodierenden Region eine PstI Schnittstelle enthält, anstelle des NcoI-PstI Fragments von pZ0 85 (siehe Beispiel 7). Diese Sequenz wird unmittelbar gefolgt (in Serie) vom 35S Promotor und dem nos Terminator von pZ0 33 (siehe Beispiel 5) mit der HPT Sequenz von pZ0 25 (siehe Beispiel 4).

Claims

1. Verfahren zur Transformation von pflanzlichem Zellmaterial, gekennzeichnet durch Zusammenbringen des Zellmaterials mit einer Transformationslösung, die DNA und ein membranpermeabilisierendes Mittel enthält, in Gegenwart eines elektrischen Stroms für eine Zeitspanne, die zur Bewirkung des Transports der DNA in das Pflanzenmaterial und eine Transformation ausreicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA Vektor DNA ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die DNA Plasmid DNA ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 unter Verwendung eines horizontalen Gelelektrophoresesystems, in das die zu transformierenden Pflanzenzellen und das DNA Material in Probentaschen eingebracht werden können, so daß der elektrische Strom von der DNA zu den Pflanzenzellen läuft.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das membranpermeabilisierende Mittel ein polares membranpermeabilisierendes Mittel ist, ausgewählt aus Dimethylsulfoxid, Lysolecithin, Natriumdodecylsulfat oder anderen Detergenzien.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, worin das Pflanzenmaterial ein Pflanzengewebe, ein pflanzlicher Embryo, ein Meristemgewebe, Achsknospen, Stammstreifen oder ein Kallus ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Pflanzenmaterial Pflanzenmaterial vom Mais ist.

8. Verfahren zur Herstellung transformierter fruchtbarer Pflanzen, das gekennzeichnet ist durch Transformieren von pflanzlichem Zellmaterial gemäß dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 7 und Kultivieren der so transformierten Pflanzenzellen unter Kulturbedingungen.