JPS6137738A - B型肝炎ワクチン - Google Patents
B型肝炎ワクチンInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)に対す有効なワ
クチンに関するものであり、詳しくはB型肝炎ウィルス
の感染機作に関する新たな知見にもとづいて、その感染
を防止するための新しいタイプのワクチンを提供するも
のである。
クチンに関するものであり、詳しくはB型肝炎ウィルス
の感染機作に関する新たな知見にもとづいて、その感染
を防止するための新しいタイプのワクチンを提供するも
のである。
B型肝炎は主として血液を介して感染するウィルス性疾
患である。
患である。
B型肝炎ウィルスは、1970年にDaneらによって
、オーストラリア抗原(Au抗原、HBs抗原)陽性皿
内に確認されたものであって、二重構造をした球形DN
Aウィルスである。
、オーストラリア抗原(Au抗原、HBs抗原)陽性皿
内に確認されたものであって、二重構造をした球形DN
Aウィルスである。
HBVに感染したヒトの血清を遠心して電子顕微鏡下で
観察すると、直径42nmの大型球形粒子(Dane粒
子)、直径22nmの小型球形粒子および管状粒子が見
出される。
観察すると、直径42nmの大型球形粒子(Dane粒
子)、直径22nmの小型球形粒子および管状粒子が見
出される。
Dane粒子は、中心に直径27nmの内部粒子(eo
re粒子)を有し、また表面には外殻がある。eOrE
!粒子内には、分子量約1.6X106の2本鎖DNA
とDNAポリメラーゼが含まれている。
re粒子)を有し、また表面には外殻がある。eOrE
!粒子内には、分子量約1.6X106の2本鎖DNA
とDNAポリメラーゼが含まれている。
1)ane粒子の外殻は、HBs抗原(ugsAg)活
性を有し、これとは別にeore粒子表面にはHBe抗
原(HBcAg)活性がある。またeore粒子には分
子量約19.000 (PI3)の単位核蛋白が存在す
るが、PI3の一部はeore粒子の表面に露出して、
そのN末端側の部分はHBa抗原(HBeAg)活性を
もつ。t(BeAgは血中に出現することがある。
性を有し、これとは別にeore粒子表面にはHBe抗
原(HBcAg)活性がある。またeore粒子には分
子量約19.000 (PI3)の単位核蛋白が存在す
るが、PI3の一部はeore粒子の表面に露出して、
そのN末端側の部分はHBa抗原(HBeAg)活性を
もつ。t(BeAgは血中に出現することがある。
したがって、HBV関連抗原としては、[(BeAg、
HBsAg、 HBeAg、の三種類が現在知られてい
る。
HBsAg、 HBeAg、の三種類が現在知られてい
る。
また、HBsAgには共通抗原としてraJがあるが、
さらに抗原性の違いからadr、 adw、 ayw、
ayrの4種のサブタイプが知られている。これらサ
ブタイプは、[(BY株の違いによって、産生されるH
BsAgのアミノ酸配列に多少の違いが生じたものと考
えられる。
さらに抗原性の違いからadr、 adw、 ayw、
ayrの4種のサブタイプが知られている。これらサ
ブタイプは、[(BY株の違いによって、産生されるH
BsAgのアミノ酸配列に多少の違いが生じたものと考
えられる。
B型肝炎は1(BVキャリアの血液が輸注されることに
より、受血者に高率に発生するほか、注射針やカミソリ
の刃についた微量の血液によって感染することがありう
る。
より、受血者に高率に発生するほか、注射針やカミソリ
の刃についた微量の血液によって感染することがありう
る。
日本において、年間激症肝炎4,400例、急性肝炎1
8万例、慢性肝炎30万例、肝硬変12万例が存在する
と推定される肝疾患のうち、各30%程度が、また原発
性肝癌8.400例のうち約50%がB型肝炎ウィルス
によって発生すると推定されている。
8万例、慢性肝炎30万例、肝硬変12万例が存在する
と推定される肝疾患のうち、各30%程度が、また原発
性肝癌8.400例のうち約50%がB型肝炎ウィルス
によって発生すると推定されている。
さらに無症候のHBVキャリア()tBV保有者)は世
界で約2億人、わが国では約300万人も存在すると推
定され、全人口に対するキャリアの割合は日本が先進国
中最高の値を示している。したがって、t(BVキャリ
アの血液を介してB型肝炎が感染する危険が大きい。
界で約2億人、わが国では約300万人も存在すると推
定され、全人口に対するキャリアの割合は日本が先進国
中最高の値を示している。したがって、t(BVキャリ
アの血液を介してB型肝炎が感染する危険が大きい。
そのため、B型肝炎ウィルスに対して、ワクチネーショ
ンが望まれ、とくに有効でかつ副作用の少ないワクチン
の研究と開発が切望されていた。
ンが望まれ、とくに有効でかつ副作用の少ないワクチン
の研究と開発が切望されていた。
現在供用されているB型肝炎ワクチンは、I(BV陽性
血からHBs抗原を分離精製し、不活性化したものであ
るが、HBVが現在培養増殖できず、原料であるHBV
陽性血を大量に確保することが困難であるとともに、コ
ストが高いこと、異物蛋白や未知のウィルス等が混入す
ることによる危険を完全に免れない欠点があった。
血からHBs抗原を分離精製し、不活性化したものであ
るが、HBVが現在培養増殖できず、原料であるHBV
陽性血を大量に確保することが困難であるとともに、コ
ストが高いこと、異物蛋白や未知のウィルス等が混入す
ることによる危険を完全に免れない欠点があった。
したがって、HBVに対する合成ワクチンの必要性が示
唆されてきたが、本願の発明者らは、B型肝炎ウィルス
に対して有効であり、かつ安全性に優れたポリペプタイ
ドワクチンを発明した。
唆されてきたが、本願の発明者らは、B型肝炎ウィルス
に対して有効であり、かつ安全性に優れたポリペプタイ
ドワクチンを発明した。
本願は本願発明者らによる、B型肝炎ウィルスとヒト肝
細胞の付着に関する新たな知見に基礎を置くものである
。すなわち、B型肝炎ウィルスが、肝細胞表面のPo1
y−ISA (重合したヒト血清アルブミン)を介して
、ヒトの肝細胞に特異的に付着することを突き止め、さ
らにB型肝炎ウィルス粒子上のPo1y−ISA受容体
が、HBeAgの如何なる部位に位置するかの探索をつ
づけた。
細胞の付着に関する新たな知見に基礎を置くものである
。すなわち、B型肝炎ウィルスが、肝細胞表面のPo1
y−ISA (重合したヒト血清アルブミン)を介して
、ヒトの肝細胞に特異的に付着することを突き止め、さ
らにB型肝炎ウィルス粒子上のPo1y−ISA受容体
が、HBeAgの如何なる部位に位置するかの探索をつ
づけた。
その結果、HBeBe人件陽性血漿由来BsAg粒子か
ら精製しなP31ポリペプタイド上に、Po1y−IS
Aに対する受容体が存在することを解明した。これに対
し、HBsAg粒子から精製したP22ポリペプタイド
はPo1y−HSAに付着せず、したがってP22上に
はPo1y−ISAに対する受容体が存在しないことを
見出した。
ら精製しなP31ポリペプタイド上に、Po1y−IS
Aに対する受容体が存在することを解明した。これに対
し、HBsAg粒子から精製したP22ポリペプタイド
はPo1y−HSAに付着せず、したがってP22上に
はPo1y−ISAに対する受容体が存在しないことを
見出した。
さらにP31ポリペプタイドとB型肝炎ウィルスの遺伝
情報との関係を探索した結果、P31はHBV−DN人
のS領域によりコードされる226残基のアミノ酸から
なるP22とその上流に存在するPre−S隣接領域に
よってコードされる55個のアミノ酸によって構成され
ることを解明した(図1)。
情報との関係を探索した結果、P31はHBV−DN人
のS領域によりコードされる226残基のアミノ酸から
なるP22とその上流に存在するPre−S隣接領域に
よってコードされる55個のアミノ酸によって構成され
ることを解明した(図1)。
したがって上記55個のアミノ酸からなる部分にPo1
y−ISA受容体が存在する事が推測された。事実P3
1をCNBrで切断する事により単離した上記55個の
アミノ酸からなるペプタイドはPo1y−HSAと結合
する事が解明された。
y−ISA受容体が存在する事が推測された。事実P3
1をCNBrで切断する事により単離した上記55個の
アミノ酸からなるペプタイドはPo1y−HSAと結合
する事が解明された。
以上の知見にもとづき、本願の発明者らは、B型肝炎ウ
ィルスに対する新しいワクチン、ポリペプタイドワクチ
ンP31を発明した。
ィルスに対する新しいワクチン、ポリペプタイドワクチ
ンP31を発明した。
本発明のポリペプタイドワクチンP311より型肝炎ウ
ィルスのP’oly−1(SA受容体をブ四ツクするこ
とによりHBVがヒト肝細胞に付着するのを防止するワ
クチンである。
ィルスのP’oly−1(SA受容体をブ四ツクするこ
とによりHBVがヒト肝細胞に付着するのを防止するワ
クチンである。
さらに、本発明のポリペプタイドワクチンP31は、そ
のPre−3領域1)NAによりコードされるペプタイ
ド部分(N末端より第4番目アミノ酸残基入s、n)に
多ta類が結合している状態(P35)においても、I
(BVに対するワクチンとして使用することができるも
のである。
のPre−3領域1)NAによりコードされるペプタイ
ド部分(N末端より第4番目アミノ酸残基入s、n)に
多ta類が結合している状態(P35)においても、I
(BVに対するワクチンとして使用することができるも
のである。
ポリペプタイドワクチンP31の製造方法Cよ次のとお
りである。
りである。
HBeAgが陽性で、かツHBsAg価(R−PHA価
)の高い血漿を遠心して、Dane粒子を除去して得ら
れtコ上清中の小型粒子を浮上遠心と庶糖によるレート
遠心によって得る。
)の高い血漿を遠心して、Dane粒子を除去して得ら
れtコ上清中の小型粒子を浮上遠心と庶糖によるレート
遠心によって得る。
精製した小型粒子(HBsA4粒子)を1%(W/v)
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および1%(v/v
) 2 / ルカプトエタ) −ル(2−ME)を含
むトリス−塩酸緩衝液中でインキユベートシ、構成ペプ
タイドに分解する。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および1%(v/v
) 2 / ルカプトエタ) −ル(2−ME)を含
むトリス−塩酸緩衝液中でインキユベートシ、構成ペプ
タイドに分解する。
ポリペプタイドはMaizelの方法により、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により、分画し、P3131ポ
リペプタイドを得る。セファデックスG25 (ファル
マシア:スウェーデン)を用い水を溶媒として上記分画
をゲル濾過し、遊離のSDSや電気泳動緩衝液に用いた
試薬を除く。ボイドボリュームに溶出しポリペプタイド
P31の物理化学的性質は次のとおりである。
リルアミドゲル電気泳動により、分画し、P3131ポ
リペプタイドを得る。セファデックスG25 (ファル
マシア:スウェーデン)を用い水を溶媒として上記分画
をゲル濾過し、遊離のSDSや電気泳動緩衝液に用いた
試薬を除く。ボイドボリュームに溶出しポリペプタイド
P31の物理化学的性質は次のとおりである。
アミノ酸分析。 10μgのP31を6N−HClで
減圧下110℃で24.48.72時間加水分解し、日
立アミノ酸分析計835で測定した。ロイシン、イソロ
イシン、バリンは最高値を、スレオニンとセリンは0時
間に内そうした値を用いた。
減圧下110℃で24.48.72時間加水分解し、日
立アミノ酸分析計835で測定した。ロイシン、イソロ
イシン、バリンは最高値を、スレオニンとセリンは0時
間に内そうした値を用いた。
(近似値)
アスパラギン酸 5
アスパラギン 9
スレオニン 24
セリン 31
グルタミン酸 2
グルタミン 8
グリシン 18
アラニン 9
バリン 14
メチオニン フ
イソロイシン 16
0イシン 38
チロシン 6
フェニルアラニン 20
リジン 2
ヒスチジン 2
アルギニン 10
プヮリン 32
トリプトファン 14
システイン 14
末端アミノ酸。N末端アミノ酸は手動エドマン分解法に
より調べた。C末端アミノ酸配列1f 0 、2 M、
エチル・モルフォリン−酢酸(PH,8,5)中で25
℃、15分、30分間カルボキシペプチダーゼAを作用
させた後、アミノ酸分析により決定した。N末端アミノ
酸はメチオニン、C末端アミノ酸配列は−バリン−チロ
シン−イソロイシンであった。
より調べた。C末端アミノ酸配列1f 0 、2 M、
エチル・モルフォリン−酢酸(PH,8,5)中で25
℃、15分、30分間カルボキシペプチダーゼAを作用
させた後、アミノ酸分析により決定した。N末端アミノ
酸はメチオニン、C末端アミノ酸配列は−バリン−チロ
シン−イソロイシンであった。
笈±31 31,000ダルトン(測定法 5D
S−PAGE) 温度安定性 100℃ 20 min 5tabl
e吸収特性 280nm λmax2 9 0
nm 5houlder本願の発明者らはさらにP3
1のPre−S領域のアミノ酸配列のうち、親水性部位
で各サブタイプ間に共通の部分を選び、これを化学的に
合成してそのPo1y−USAとの反応性と免疫原性を
調べた。その結果、Asp−Pro−Arg−Va l
−Arg−Gly−Leu−Try−Phr (or−
Leu)−Pro−人1a−Gly−Gly−Ser−
Ser−Ser−Gly−Thr−Val(+) シ’
yンスを含有する合成ポリペプタイド(Aspペプタイ
ド)とPo1y−HSA受容体を持たないHBsAg小
型粒子との結合物はAspペプタイドを介してPo1y
−ISAと結合する事が明らか1こなった1表1)。
またこのAspペプタイドは免疫原性をも有することを
見出し、これをB型肝炎ウィルスに対するワクチンとす
ることを発明した。即ち、乙のA5Pペプタイドをモル
モットに免疫して得られた抗血清は、HBeAg陽性血
清から精製したHBsAgと結合したが、HBeAb陽
性血清から精製したHBsAgとは殆ど結合しなかった
。このことにより、この人spペプタイドに対する抗体
がB型肝炎つィルス上のPo1y−I(SA受容体をブ
ロックしB型肝炎ウィルスがPo1y−USAを介して
ヒト肝細胞に付着するのを阻止できる効率の高いワクチ
ンであることが明らかになった。
S−PAGE) 温度安定性 100℃ 20 min 5tabl
e吸収特性 280nm λmax2 9 0
nm 5houlder本願の発明者らはさらにP3
1のPre−S領域のアミノ酸配列のうち、親水性部位
で各サブタイプ間に共通の部分を選び、これを化学的に
合成してそのPo1y−USAとの反応性と免疫原性を
調べた。その結果、Asp−Pro−Arg−Va l
−Arg−Gly−Leu−Try−Phr (or−
Leu)−Pro−人1a−Gly−Gly−Ser−
Ser−Ser−Gly−Thr−Val(+) シ’
yンスを含有する合成ポリペプタイド(Aspペプタイ
ド)とPo1y−HSA受容体を持たないHBsAg小
型粒子との結合物はAspペプタイドを介してPo1y
−ISAと結合する事が明らか1こなった1表1)。
またこのAspペプタイドは免疫原性をも有することを
見出し、これをB型肝炎ウィルスに対するワクチンとす
ることを発明した。即ち、乙のA5Pペプタイドをモル
モットに免疫して得られた抗血清は、HBeAg陽性血
清から精製したHBsAgと結合したが、HBeAb陽
性血清から精製したHBsAgとは殆ど結合しなかった
。このことにより、この人spペプタイドに対する抗体
がB型肝炎つィルス上のPo1y−I(SA受容体をブ
ロックしB型肝炎ウィルスがPo1y−USAを介して
ヒト肝細胞に付着するのを阻止できる効率の高いワクチ
ンであることが明らかになった。
更に、人spペプタイド、精製P31.5IIS+ 2
ME処理したHBsAgを免疫して得られたモノクロー
ナル抗体のうちAspペプタイドに対する抗体は全鋼P
o1y−H3人とHBsAgの結合を阻止した(表2)
。即ち、ASpペプタイドは非常に効率の高い合成ワク
チンであることが明らかになった。なお特許請求の範囲
第1項記載のベプタイドのうち、第9番目のアミノ酸残
基はロイシンに置き換えることができる。
ME処理したHBsAgを免疫して得られたモノクロー
ナル抗体のうちAspペプタイドに対する抗体は全鋼P
o1y−H3人とHBsAgの結合を阻止した(表2)
。即ち、ASpペプタイドは非常に効率の高い合成ワク
チンであることが明らかになった。なお特許請求の範囲
第1項記載のベプタイドのうち、第9番目のアミノ酸残
基はロイシンに置き換えることができる。
これはPre−5領域のアミノ酸配列がサブタイプ間で
異なり、ILdrでフェニルアラニンであるのに対しa
dwではロイシンであることに基づく。しかし、19残
基のアミノ酸からなる合成ペプタイドを免疫して得られ
る抗体は、adw型HBsAgとも結合し、サブタイプ
共通のものであることがわかった。特許請求範囲第1項
のベプタイドはMerrifieldらの方法(Mer
rifield RB Adv、 Enzyme。
異なり、ILdrでフェニルアラニンであるのに対しa
dwではロイシンであることに基づく。しかし、19残
基のアミノ酸からなる合成ペプタイドを免疫して得られ
る抗体は、adw型HBsAgとも結合し、サブタイプ
共通のものであることがわかった。特許請求範囲第1項
のベプタイドはMerrifieldらの方法(Mer
rifield RB Adv、 Enzyme。
旦 221−296,1969)による同相法で合成さ
れ、合成後、6N−ICI、110℃、24時間、減圧
下で加水分解後、アミノ酸組成を確認したものである。
れ、合成後、6N−ICI、110℃、24時間、減圧
下で加水分解後、アミノ酸組成を確認したものである。
以下、本発明にかかる各ペプタイドについて製造及び免
疫学的検定の実施例を述べる。
疫学的検定の実施例を述べる。
実施例1
本発明のポリペプタイドP31. P35を次の方法に
よ7て製造した。
よ7て製造した。
(1) ■BsAg粒子省精製
F[BeAg陽性で、サブタイプがadrの■Bs抗原
価(R−PHA価)が高い血漿をプールし、37.00
0Xg、16時間の遠心を行い、Dane粒子をペレッ
トとして除去した。上溝中の小型粒子を、ICBrによ
る浮上超遠心と庶糖の−よるレート(rite)超遠心
によって得た。
価(R−PHA価)が高い血漿をプールし、37.00
0Xg、16時間の遠心を行い、Dane粒子をペレッ
トとして除去した。上溝中の小型粒子を、ICBrによ
る浮上超遠心と庶糖の−よるレート(rite)超遠心
によって得た。
(2) アクリルアミドゲル電気泳動600mgの精
製HBs抗原粒子を1%(、/v)SDSおよび1%(
v/v) 2−MEを含む0,01Mトリス−塩酸緩衝
液(PH8,0)で90m1にして37℃30分インキ
ュベートして構成ポリペプタイドに分解した。そのポリ
ペプタイドをMaizelの方法に従ってMacro
Pageの装置を用い、直径9cm高さ9cmのポリ
アクリルアミドカラムによる調製用ゲル電気泳動にかけ
た。サンプルを9%ポリアクリルアミドゲルで作った分
離用ゲルの上に作製した濃縮ゲル(3%)上にアプライ
した。50V定電圧で2℃で泳動し、30分毎に分画し
た。HBsAgポリペプタイドはセファデックスG−2
5で脱塩後、凍結乾燥した。分析用ゲル電気泳動は5D
S−ポリアクリルアミドゲルにより、E(oeffer
社スラブゲル電気泳動装置を用いて行った。
製HBs抗原粒子を1%(、/v)SDSおよび1%(
v/v) 2−MEを含む0,01Mトリス−塩酸緩衝
液(PH8,0)で90m1にして37℃30分インキ
ュベートして構成ポリペプタイドに分解した。そのポリ
ペプタイドをMaizelの方法に従ってMacro
Pageの装置を用い、直径9cm高さ9cmのポリ
アクリルアミドカラムによる調製用ゲル電気泳動にかけ
た。サンプルを9%ポリアクリルアミドゲルで作った分
離用ゲルの上に作製した濃縮ゲル(3%)上にアプライ
した。50V定電圧で2℃で泳動し、30分毎に分画し
た。HBsAgポリペプタイドはセファデックスG−2
5で脱塩後、凍結乾燥した。分析用ゲル電気泳動は5D
S−ポリアクリルアミドゲルにより、E(oeffer
社スラブゲル電気泳動装置を用いて行った。
(−即ち、サンプルに指示薬としてブロモフェノールブ
ルーを加え、その指示薬が濃縮ゲル(3%)内を通過し
ている間は15mAで、また分離用ゲル(10%)に入
ってからは30mAで泳動した。泳動後、蛋白質は、0
.05%(w/v)クーマンジ−ブリリアントブルー染
色し、糖はZaehariusらの方法によるPAS染
色により染色した。これにより構成ポリペプタイドの1
つとしてP31. P35を得た(第2図)。構成ポリ
ペプタイド量は蛋白染色したゲルをAuto 5ea
nner (ヘレナ社)を用い550nmの波長でスキ
ャンして求めた。不純物除去ののち精製した。
ルーを加え、その指示薬が濃縮ゲル(3%)内を通過し
ている間は15mAで、また分離用ゲル(10%)に入
ってからは30mAで泳動した。泳動後、蛋白質は、0
.05%(w/v)クーマンジ−ブリリアントブルー染
色し、糖はZaehariusらの方法によるPAS染
色により染色した。これにより構成ポリペプタイドの1
つとしてP31. P35を得た(第2図)。構成ポリ
ペプタイド量は蛋白染色したゲルをAuto 5ea
nner (ヘレナ社)を用い550nmの波長でスキ
ャンして求めた。不純物除去ののち精製した。
実施例2
特許請求の範囲第1.第2項のベプタイドを次の方法に
よって製造した。
よって製造した。
Merrifieldの固相法に基づき、ペプタイドの
C末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させて
おき、ついでN末端の方向に向かって、t−ブトキシカ
ルボニルアミノ酸を1個ずつ順次縮合させていき、As
p−Pro−Arg−Val−Arg−Gly−Leu
−Tyr−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly−
Set−Set−Ser−Gly−Thr−Valのシ
ーケンスからなるポリペプタイド(Aspペプタイド)
を合成した。
C末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させて
おき、ついでN末端の方向に向かって、t−ブトキシカ
ルボニルアミノ酸を1個ずつ順次縮合させていき、As
p−Pro−Arg−Val−Arg−Gly−Leu
−Tyr−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly−
Set−Set−Ser−Gly−Thr−Valのシ
ーケンスからなるポリペプタイド(Aspペプタイド)
を合成した。
また入spペブタイドの第9アミノ酸残基をLeuに置
換えしたポリペプタイドを合成した。
換えしたポリペプタイドを合成した。
合成後、0N−ICl、110℃、24時間、減圧下で
加水分解後、アミノ酸組成を確認した。
加水分解後、アミノ酸組成を確認した。
実施例3
ポリペプタイドP31. P35の免疫原性(ワクチン
効果)を次の方法により確認した。
効果)を次の方法により確認した。
(1)本発明のポリペプタイドP31のPo1y−US
Aに対する反応性をtiBeAg陽性の血漿から分離し
た1(BsAg粒子、P35(ポリペプタイドP31に
糖が結合したもの) 、P22 (第2図参照) 、P
27 (P22に糖が結合したもの)のPo1y−IS
Aに対する反応性と比較した。固相としてPo1y−I
SA、ラベル第2抗体として抗HBs抗体を用いてサン
ドウィッチ法により調べた。
Aに対する反応性をtiBeAg陽性の血漿から分離し
た1(BsAg粒子、P35(ポリペプタイドP31に
糖が結合したもの) 、P22 (第2図参照) 、P
27 (P22に糖が結合したもの)のPo1y−IS
Aに対する反応性と比較した。固相としてPo1y−I
SA、ラベル第2抗体として抗HBs抗体を用いてサン
ドウィッチ法により調べた。
その結果、P31、P35の滴定曲線はHBeAg陽性
血から得た■BsAg粒子のものと同一であって、Po
1y−t(SAに対する反応性が認められた。他方、P
22. P27は、いずれもPo1y4S人と反応しな
かった(第3図)。
血から得た■BsAg粒子のものと同一であって、Po
1y−t(SAに対する反応性が認められた。他方、P
22. P27は、いずれもPo1y4S人と反応しな
かった(第3図)。
また、HBsAg粒子および上記各ポリペプタイドはモ
ノメリックな血清アルブミンと【よ結合しなかっtこ。
ノメリックな血清アルブミンと【よ結合しなかっtこ。
(2)種特異性
ヒトおよびチンパンジーのみがB型肝炎ウィルス(HB
V)に感受性を有し、その他の動物ζよHBVに対する
感受性を有しない。
V)に感受性を有し、その他の動物ζよHBVに対する
感受性を有しない。
そこで、本発明のP31の種特異性を調査しtコ。
種々の動物の重合アルブミンをマイクロタイタープレー
トの穴にコートしてP31との反応性を検査したところ
ヒトおよびチンノ<ンジーの重合アルブミンはP31と
結合したが、ウサギ、牛、マウス、馬、卵白、ウッドチ
ャックの重実施例4 特許請求の範囲第1項のベプタイドの免疫原性(ワクチ
ン効果)を次の方法により確認しな。
トの穴にコートしてP31との反応性を検査したところ
ヒトおよびチンノ<ンジーの重合アルブミンはP31と
結合したが、ウサギ、牛、マウス、馬、卵白、ウッドチ
ャックの重実施例4 特許請求の範囲第1項のベプタイドの免疫原性(ワクチ
ン効果)を次の方法により確認しな。
(1)卵白アルブミン(OVA ovalbumin
)とベプタイドのカップリング ペプタイドはカップリング試薬として1−エチル−3(
3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(Sig
ma chemical U、S、人)を用いて、
キャリアープロティンである卵白アルブミン(Sigm
a chemical U、S、A、)Lこ結合させた
。
)とベプタイドのカップリング ペプタイドはカップリング試薬として1−エチル−3(
3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(Sig
ma chemical U、S、人)を用いて、
キャリアープロティンである卵白アルブミン(Sigm
a chemical U、S、A、)Lこ結合させた
。
即ち合成ペプタイド5mgと0VA1.5mgを0゜5
mlの生理的食塩水に溶かし、15mgのカップリング
試薬を加えた後、室温で、1晩反応させた後、生理的食
塩水に対し2日間透析した。
mlの生理的食塩水に溶かし、15mgのカップリング
試薬を加えた後、室温で、1晩反応させた後、生理的食
塩水に対し2日間透析した。
(2)免疫
メスのHartlay系のモルモットにIIIIgペプ
タイドー卵白アルブミン結合物0.1m1te0.2m
lフロイントの完全アジュバントとのエマルジョンとし
て皮下に接種した。4週間後に同様に追加免疫を行い、
更にその1週間後に心臓穿刺により採血し、血液を凝固
させ遠心分離により血清を得tこ。
タイドー卵白アルブミン結合物0.1m1te0.2m
lフロイントの完全アジュバントとのエマルジョンとし
て皮下に接種した。4週間後に同様に追加免疫を行い、
更にその1週間後に心臓穿刺により採血し、血液を凝固
させ遠心分離により血清を得tこ。
(31検定(ラジオイムノアッセイ)
ポリビニルマイクロタイタープレートを用いサンドウィ
ッチ法、インヒビジョン法でアッセイした。
ッチ法、インヒビジョン法でアッセイした。
即ち、サンドウィッチ法では固相として重合ヒトアルブ
ミン、マウス抗Pre−Sモノクローナル抗体、精製H
BsAg (adr、HBeAg陽性血清又は■BeA
b陽性血清由来)精製t(BsAg (adw、 HB
eAg陽性血清)、プロナーゼ処理t(BsAg (a
dr)、HBskgポリペプタイドP3イドP22、合
成ペプタイドを各々につき、100μg/mlの濃度の
溶液100μlをウェルに入れ室温1時間吸着させたも
のを用いた。
ミン、マウス抗Pre−Sモノクローナル抗体、精製H
BsAg (adr、HBeAg陽性血清又は■BeA
b陽性血清由来)精製t(BsAg (adw、 HB
eAg陽性血清)、プロナーゼ処理t(BsAg (a
dr)、HBskgポリペプタイドP3イドP22、合
成ペプタイドを各々につき、100μg/mlの濃度の
溶液100μlをウェルに入れ室温1時間吸着させたも
のを用いた。
テストサンプル50μlを穴に入れ、37℃90分イン
キュベート後125Iラベル抗HBs抗体、抗Pre−
Sモノクローナル抗体あるいはP3]を各々につき10
0μl入れ、37℃、90分、インキュベートした。
キュベート後125Iラベル抗HBs抗体、抗Pre−
Sモノクローナル抗体あるいはP3]を各々につき10
0μl入れ、37℃、90分、インキュベートした。
つエルを切り取りその放射活性を測定した。
各ステップの間は生理的食塩水で5回洗浄した。
インヒビジョン法では、テストサンプル50μmと
1ラベル抗Pre−Sモノクロナール抗体50μlを3
7℃、90分インキユペートシ、その混合物50μlを
P31でコートしたウェルに入れ37℃、90分、イン
キュベートした。サンプルのかわりに、緩衝液を用いた
0%インとビシミンをもとにテストサンプルの結果を%
インヒビジョンで示した。尚、ヨード(I)ラベルはク
ロラミンT法(Greenwood、F、c、 (19
63)Biochemieal、 J、 89 。
1ラベル抗Pre−Sモノクロナール抗体50μlを3
7℃、90分インキユペートシ、その混合物50μlを
P31でコートしたウェルに入れ37℃、90分、イン
キュベートした。サンプルのかわりに、緩衝液を用いた
0%インとビシミンをもとにテストサンプルの結果を%
インヒビジョンで示した。尚、ヨード(I)ラベルはク
ロラミンT法(Greenwood、F、c、 (19
63)Biochemieal、 J、 89 。
114−12j)により行い、得られた放射ラベル物質
の比活性は5μCi/μgであった。
の比活性は5μCi/μgであった。
(4) モノクリ−ナル抗体の作成
りalb/eマウス(雌)の腹腔に、人spペプタイド
、P31、SDS+2ME処理HBsA処理釜BsAg
イントの完全アジユバントとのエマルジョンとして注入
した。3週後Aspペプタイド他各々で追加免疫し3日
後に牌臓細胞(spleen cell)を得た融合(
f(ybridization) 、クローニング、お
よびそれに続く培養はOi and Herzenbe
rgの方法(Oi、 ■、 ’fら Immunog
lobulin produciB hybrid
cell 1ines、 In 5elec
ted methodsin cellular
Immunology、 Freeman an
dCO,San Francisco 351−3
72.1980)に従って行った。
、P31、SDS+2ME処理HBsA処理釜BsAg
イントの完全アジユバントとのエマルジョンとして注入
した。3週後Aspペプタイド他各々で追加免疫し3日
後に牌臓細胞(spleen cell)を得た融合(
f(ybridization) 、クローニング、お
よびそれに続く培養はOi and Herzenbe
rgの方法(Oi、 ■、 ’fら Immunog
lobulin produciB hybrid
cell 1ines、 In 5elec
ted methodsin cellular
Immunology、 Freeman an
dCO,San Francisco 351−3
72.1980)に従って行った。
各々の抗体の選択は、例えばPH1ではHBeBe人件
陽性血漿精製したHBsAg粒子とそれをプロナーゼE
(科研科学製)で軽く処理しPH1とPX3を消失させ
た[(BsAg粒子をとツジ赤血球に結合させたものを
用いPHA法 (Vyas G、Nら 5cience
170 332−333 19701F行シな。
陽性血漿精製したHBsAg粒子とそれをプロナーゼE
(科研科学製)で軽く処理しPH1とPX3を消失させ
た[(BsAg粒子をとツジ赤血球に結合させたものを
用いPHA法 (Vyas G、Nら 5cience
170 332−333 19701F行シな。
抗体の特異性はPH1あるいはP22を固相化し125
Iラベルの抗マウスIgG (Rabbit)を2次抗
体としたラジオイムノアッセイにより調べた。
Iラベルの抗マウスIgG (Rabbit)を2次抗
体としたラジオイムノアッセイにより調べた。
各々の抗体を分泌するクローンはマウスの腹腔で増殖さ
せた。腹水を得、133M 硫安で塩析後セファデックスG200 (ファ) ル
マシア社製)のゲル濾過を行った。
せた。腹水を得、133M 硫安で塩析後セファデックスG200 (ファ) ル
マシア社製)のゲル濾過を行った。
(5) モノクローナル抗体と各ペプタイドとの反応
Aspペプタイドと反応をよくするモノク四−ナル抗体
IgGクラスの8種類を使って、P。
IgGクラスの8種類を使って、P。
Iy−H5AとHBsAgの反応を阻害するかをラジオ
イムノアッセイ、サンドイツチ法で調べたところ金側が
結合を阻止した(表2)。
イムノアッセイ、サンドイツチ法で調べたところ金側が
結合を阻止した(表2)。
強力なワクチン効果が得られた。
(6) ペプタイドの免疫原性特性
ペプタイドの免疫原性特性(immunogen ic
i ty)を調べるために、ペプタイドをOVAに結
合させた結合物(1mg)をフ四インドの完全アジュバ
ントとの懸濁液として、3匹のモルモットの皮下に免疫
した。4週間後に追加免疫しその1週間後、採血した。
i ty)を調べるために、ペプタイドをOVAに結
合させた結合物(1mg)をフ四インドの完全アジュバ
ントとの懸濁液として、3匹のモルモットの皮下に免疫
した。4週間後に追加免疫しその1週間後、採血した。
凝塊(clot)後、得られた血清について、サンド
ウィッチ法によるラジオイムノアッセイにより、抗体の
検定(assay)を行った。
ウィッチ法によるラジオイムノアッセイにより、抗体の
検定(assay)を行った。
即ち、固相に、 HBeAg陽性血から精製したHBs
Ag(adr、 adw)そのHBsAg (adr)
をプロナーゼ処理したもの、HBeAg陽性血から精製
したf(Bs (adr)、およびHBsAgポリペプ
タイドP3イド P22を用いて、サンプルをインキュ
ベーション後、12’r−pa1ベプタイドを免疫され
た3匹のモルモットから得られた血清はいずれも合成ペ
プタイドと反応した。更にPH1(adr)およびHB
eAg陽性血から精製したHBsAg (adr、 a
ds)とも結合した。
Ag(adr、 adw)そのHBsAg (adr)
をプロナーゼ処理したもの、HBeAg陽性血から精製
したf(Bs (adr)、およびHBsAgポリペプ
タイドP3イド P22を用いて、サンプルをインキュ
ベーション後、12’r−pa1ベプタイドを免疫され
た3匹のモルモットから得られた血清はいずれも合成ペ
プタイドと反応した。更にPH1(adr)およびHB
eAg陽性血から精製したHBsAg (adr、 a
ds)とも結合した。
しかし、一方Pronase処理する事により PH1
とPX3が消失したHBsAg (adr) 、HBe
Ab陽性血から精製したHBsAgおよびP22との反
応性は低かった。乙の結果から、このペプタイドはモル
モットに主としてポリペプタイドP31、P35含量の
多いHBeAg陽性血中のHBsAgと結合し、しかも
adrとadwの共通部分と反応する抗体を作らせるこ
とが解った。
とPX3が消失したHBsAg (adr) 、HBe
Ab陽性血から精製したHBsAgおよびP22との反
応性は低かった。乙の結果から、このペプタイドはモル
モットに主としてポリペプタイドP31、P35含量の
多いHBeAg陽性血中のHBsAgと結合し、しかも
adrとadwの共通部分と反応する抗体を作らせるこ
とが解った。
特許請求の範囲第2項のベプタイドについ実施例5
PreS領域ペプタイドの反応性について調べた。
(1) PH1のPreS領域に対するモノクローナ
ル抗体uyb4togの特異性を(表4)に示した。乙
の抗体はPH1との反応性は高いがP22との反応性は
低い事がらPreS領域に特異的であることが解った。
ル抗体uyb4togの特異性を(表4)に示した。乙
の抗体はPH1との反応性は高いがP22との反応性は
低い事がらPreS領域に特異的であることが解った。
(21PH1からのPre−s領域ペプタイドの分離。
PH1はP22のN末端アミノ酸Metの上流にh5残
基のアミノ酸からなるペプタイドが結合したものと推測
され、また、Pre−S領域にはMet!fN末端にの
み存在するので、PH1をCNBrで開裂する乙とによ
りPre−S領域のベプタイドを単離した。ここでHB
sAg粒子およびPH1を70%ギ酸、0 、1 NM
CIで処理するとPo1y−HSA受容体ば完全に失活
するのでSDS溶液中でCNBr開製を打製た。このペ
プタイドのアミノ酸分析値から、アラニンを4残基とし
て他のアミノ酸残基数を計算した。
基のアミノ酸からなるペプタイドが結合したものと推測
され、また、Pre−S領域にはMet!fN末端にの
み存在するので、PH1をCNBrで開裂する乙とによ
りPre−S領域のベプタイドを単離した。ここでHB
sAg粒子およびPH1を70%ギ酸、0 、1 NM
CIで処理するとPo1y−HSA受容体ば完全に失活
するのでSDS溶液中でCNBr開製を打製た。このペ
プタイドのアミノ酸分析値から、アラニンを4残基とし
て他のアミノ酸残基数を計算した。
その結果、HBV−DNA塩基配列から推定されるPr
eS領域のアミノ酸組成(adr)とよく一致した。
eS領域のアミノ酸組成(adr)とよく一致した。
(3) 抗PreS%/クローナル抗体とPH1のP
reSペプタイドとの反応。
reSペプタイドとの反応。
単離したPreSペプタイドとPH1を免疫して得たモ
ノクローナル抗体Hyb−4408との反応をインヒビ
ジョンテストによって調べた。即ち、種々の濃度のPr
e−Sペプタイドと125IラベルHyb−4408を
予めインキュベートしておき、この混合物をPH1を固
相したウェルに入れ、インキュベート後カウントを測定
した。Pre−Sペプタイドのかわりに生理的食塩水を
用いたものを0%インヒビジョンコントロールとし、表
5に示した。Pre−Sペプタイドの濃度が増加するに
っれPH1と125I Hyb4408との反応の阻害
は大きくなり、3〜100μg/mgでははゾ直線関係
が見られた。この事により単離されたPreSペプタイ
ドは抗Pre−Sモノクローナル抗体(Hyb4408
)と結合することが解った。
ノクローナル抗体Hyb−4408との反応をインヒビ
ジョンテストによって調べた。即ち、種々の濃度のPr
e−Sペプタイドと125IラベルHyb−4408を
予めインキュベートしておき、この混合物をPH1を固
相したウェルに入れ、インキュベート後カウントを測定
した。Pre−Sペプタイドのかわりに生理的食塩水を
用いたものを0%インヒビジョンコントロールとし、表
5に示した。Pre−Sペプタイドの濃度が増加するに
っれPH1と125I Hyb4408との反応の阻害
は大きくなり、3〜100μg/mgでははゾ直線関係
が見られた。この事により単離されたPreSペプタイ
ドは抗Pre−Sモノクローナル抗体(Hyb4408
)と結合することが解った。
(4) Po1yt(SAとPre−Sペプタイドと
の結合。
の結合。
単離したPreSペプタイドとPo1yHSAの反応性
をPolyHS人を固相に、第2ラベル抗体として抗P
re−Sモノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に
よるラジオイムノアッセイ法で調べた。
をPolyHS人を固相に、第2ラベル抗体として抗P
re−Sモノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に
よるラジオイムノアッセイ法で調べた。
(表6)に示したようにPreSペプタイドはPo1y
−HSAと結合する乙とが明らかになり、PH1のPr
e−3領域にPo1y−H3A受容体が存在することが
解った0 表−I AspペプタイドーHBs、 HBs抗原(
PAL、セプターe)PH1と重合アルブミンの反応 方法 固相に重合アルブミン、ラベル第2抗体に抗H
BS抗体(ウマ)を使っ たサンドイツチ法 (cp−) 11: Asp−ペプタイドーHBs bHBs抗原(PAレセプターe) #80C・H
Bs抗原(PAレセプターの)#122d: PH1 E−陰性コントロール 表−2抗Pre−Sモノクローナル抗体の性状−方法 Asp。
−HSAと結合する乙とが明らかになり、PH1のPr
e−3領域にPo1y−H3A受容体が存在することが
解った0 表−I AspペプタイドーHBs、 HBs抗原(
PAL、セプターe)PH1と重合アルブミンの反応 方法 固相に重合アルブミン、ラベル第2抗体に抗H
BS抗体(ウマ)を使っ たサンドイツチ法 (cp−) 11: Asp−ペプタイドーHBs bHBs抗原(PAレセプターe) #80C・H
Bs抗原(PAレセプターの)#122d: PH1 E−陰性コントロール 表−2抗Pre−Sモノクローナル抗体の性状−方法 Asp。
同相に人spポリペプタイド、ラベル第2抗体(こ抗マ
ウス血清を用いたサンドイツチ法。
ウス血清を用いたサンドイツチ法。
P、A阻害
固相にP−ISA (又はp−C5A) 、ラベル第2
抗体(こ抗tlBs抗体を用い、PAレセプターをもつ
HBsAg@試料と混和した阻止法 (cp−) ※ Aspペプタイドを免疫して得られたモノクローナ
ル抗体 表−30VA結合ペプタイドの免疫原性*−4HBVD
NAのPre−S領域にコードされるアミノ酸配列に対
するモノクローナル抗体(N。
抗体(こ抗tlBs抗体を用い、PAレセプターをもつ
HBsAg@試料と混和した阻止法 (cp−) ※ Aspペプタイドを免疫して得られたモノクローナ
ル抗体 表−30VA結合ペプタイドの免疫原性*−4HBVD
NAのPre−S領域にコードされるアミノ酸配列に対
するモノクローナル抗体(N。
4408)の特異性※1
※1 様々な材料から得たHBs抗原とHBs抗原ポリ
ペプタイド(50μg/ml)をマイクロプレートのウ
ェルにコートシ、アイソトープラベルしたPre−Sア
ミノ酸配列に対するモノクロナル抗体(anti−Pr
e−S No、44081X 10105epとの反応
性を調べた。
ペプタイド(50μg/ml)をマイクロプレートのウ
ェルにコートシ、アイソトープラベルしたPre−Sア
ミノ酸配列に対するモノクロナル抗体(anti−Pr
e−S No、44081X 10105epとの反応
性を調べた。
※2 正常マウス血清のIgG分画
※3 プロナーゼ処理によりpoly−1(SAへのレ
セプターを失った■Bs抗原粒子 HBVDNA= B型肝炎ウィルスデオキシリボ核酸 HBeAg = B型肝炎e抗原 HBsAg= B型肝炎S抗原 IgG =免疫グ四プリンG 表−5抗Pre−Sモノクローナル抗体ttyb−44
ogと★ 試料(50μl)と125I抗Pre−Sモ
ノクロナル抗体(50μl)を37℃、90分で混合、
インキュベート後50μlをとり、P31で固相された
ウェルに入れ、37℃、90分の阻止反応によった。
セプターを失った■Bs抗原粒子 HBVDNA= B型肝炎ウィルスデオキシリボ核酸 HBeAg = B型肝炎e抗原 HBsAg= B型肝炎S抗原 IgG =免疫グ四プリンG 表−5抗Pre−Sモノクローナル抗体ttyb−44
ogと★ 試料(50μl)と125I抗Pre−Sモ
ノクロナル抗体(50μl)を37℃、90分で混合、
インキュベート後50μlをとり、P31で固相された
ウェルに入れ、37℃、90分の阻止反応によった。
表−6Pre−Sペグタイド上にpoly−HSAレセ
プターが存在する証明 ※ 50μlのサンプルをpoly−USAでコートし
たつエルに入れた。アイソトープラベル抗PreSモ/
クローナル抗体(Hyb−4408)を第二抗体として
用い、つエルの放射能活性を測定した。
プターが存在する証明 ※ 50μlのサンプルをpoly−USAでコートし
たつエルに入れた。アイソトープラベル抗PreSモ/
クローナル抗体(Hyb−4408)を第二抗体として
用い、つエルの放射能活性を測定した。
第1図は、ポリペプタイド(P22. P27)とPo
1y−HSAへの結合部位を持つポリペプタイド(P3
1゜P35)の構成図(aaはアミノ酸残基)。 第2図は、HBs抗原ポリペプタイドのSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動 構成ベプタイドに分解されたHBs抗原粒子(A)をP
35 (B) 、 P31 (C)と同様に分析用SD
Sゲル電気泳動し、タンパクと炭水化物について染色を
行った。(A’、 B′、 C′)矢印はP35. P
31. P27. P22の位置を示す。 第3図は、FIBs抗原ポリペプタイドとヒト血清重合
アルブミンの反応性を示す。 Hue抗原陽性血漿より得た20nmのHBs抗原粒子
と3種のHBs抗原ポリペプタイド(P 31 。 P35. P22)をpoly−HSAでコートシたつ
エル中でインキュベートした。結合したポリペプタイド
、および粒子はアイソトープラベル抗HBs抗体で検出
した。 黒丸(1)はP31.白丸(2)はP35.白玉角(3
)はP22゜黒三角(4)はHBs抗原粒子を示す。 P27はP22と類似した結合曲線を示した。 第4図は、種々の動物種の重合アルブミンによるP31
のヒト血清重合アルブミンへの結合の阻害を示す。 P31は濃度を段階的に上げたヒト血清重合アルブミン
、チンパンジー重合アルブミンとインキュベートし、P
o1y−ISAでコートしたつエルへ移した。ウェルは
洗浄し、結合したP31をアイソトープラベル抗HBs
抗体て検出した。 固定化したPo1y−HSAとP31の結合阻害率(%
)で結果を示した。 黒丸Aはヒト重合アルブミン、白画角Bはチンパンジー
重合アルブミンを示す。 他の動物の重合アルブミンによる阻害は1濃度(1mg
/ml)で行い矢印で示した。 Cはウサギ、Dはウシ、Eはマウス、Fはウマ、Gは卵
白、Hはウッドチャックを示す。 図面の浄書(内容に変更なし) !1(凹 俸3図 HBs扶旅粒子 陸6 片ぐリベプタイドの濃度 (t
り/dす隼+図 噛LETルブ)ンシ1カロ(1重+/w手続補正書(方
式)(指令) 昭和59年12月25日 特許庁長官 志 賀 学 殿 1 事件の表示 昭和59年特許願第159124号 2 発明の名称 B型肝炎ワクチン 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都杉並区荻窪4−28−14−701中村 徹雄 4 代理人 東京都港区赤坂2丁目17番54号 パレロワイヤル赤坂1号館919号室 5 補正命令の日付 昭和59年11月7日 (発送日 昭和59年11月27日)7〈ご二ニー゛、
。 6 補正の対象 特許願添付の図面のうち「第2図」 7 補正の内容 別紙添付の第2図のとおり 8 添付書類の目録 第2図
1y−HSAへの結合部位を持つポリペプタイド(P3
1゜P35)の構成図(aaはアミノ酸残基)。 第2図は、HBs抗原ポリペプタイドのSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動 構成ベプタイドに分解されたHBs抗原粒子(A)をP
35 (B) 、 P31 (C)と同様に分析用SD
Sゲル電気泳動し、タンパクと炭水化物について染色を
行った。(A’、 B′、 C′)矢印はP35. P
31. P27. P22の位置を示す。 第3図は、FIBs抗原ポリペプタイドとヒト血清重合
アルブミンの反応性を示す。 Hue抗原陽性血漿より得た20nmのHBs抗原粒子
と3種のHBs抗原ポリペプタイド(P 31 。 P35. P22)をpoly−HSAでコートシたつ
エル中でインキュベートした。結合したポリペプタイド
、および粒子はアイソトープラベル抗HBs抗体で検出
した。 黒丸(1)はP31.白丸(2)はP35.白玉角(3
)はP22゜黒三角(4)はHBs抗原粒子を示す。 P27はP22と類似した結合曲線を示した。 第4図は、種々の動物種の重合アルブミンによるP31
のヒト血清重合アルブミンへの結合の阻害を示す。 P31は濃度を段階的に上げたヒト血清重合アルブミン
、チンパンジー重合アルブミンとインキュベートし、P
o1y−ISAでコートしたつエルへ移した。ウェルは
洗浄し、結合したP31をアイソトープラベル抗HBs
抗体て検出した。 固定化したPo1y−HSAとP31の結合阻害率(%
)で結果を示した。 黒丸Aはヒト重合アルブミン、白画角Bはチンパンジー
重合アルブミンを示す。 他の動物の重合アルブミンによる阻害は1濃度(1mg
/ml)で行い矢印で示した。 Cはウサギ、Dはウシ、Eはマウス、Fはウマ、Gは卵
白、Hはウッドチャックを示す。 図面の浄書(内容に変更なし) !1(凹 俸3図 HBs扶旅粒子 陸6 片ぐリベプタイドの濃度 (t
り/dす隼+図 噛LETルブ)ンシ1カロ(1重+/w手続補正書(方
式)(指令) 昭和59年12月25日 特許庁長官 志 賀 学 殿 1 事件の表示 昭和59年特許願第159124号 2 発明の名称 B型肝炎ワクチン 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都杉並区荻窪4−28−14−701中村 徹雄 4 代理人 東京都港区赤坂2丁目17番54号 パレロワイヤル赤坂1号館919号室 5 補正命令の日付 昭和59年11月7日 (発送日 昭和59年11月27日)7〈ご二ニー゛、
。 6 補正の対象 特許願添付の図面のうち「第2図」 7 補正の内容 別紙添付の第2図のとおり 8 添付書類の目録 第2図
Claims (4)
- (1)Asp−Pro−Arg−Val−Arg−G1
y−Leu−Try−Phe−Pro−Ala−Gly
−Gly−Ser−Ser−Ser−Gly−Thr−
Valのシーケンス(Aspペプタイド)からなり、重
合したヒト血清アルブミンに対する受容体を有し、B型
肝炎ウィルスの肝細胞に対する付着を阻止する、B型肝
炎ポリペプタイドワクチン。 - (2)第9アミノ酸残基がLeuである、特許請求の範
囲第1項のB型肝炎ポリペプタイドワクチン。 - (3)次の理化学的性質を有する、B型肝炎ポリペプタ
イドワクチンP31。 (i)作用 重合したヒト血清アルブミン(Polymeri−ze
d human serum albumin.pol
y−HSA)に対する受容体を有し、B型肝炎ウィルス
の肝細 胞に対する付着を阻止する。 (ii)DNAコード HBV−DNA上の表面蛋白質の主要ポリペプタイドで
あるP22をコードしているS領域(226残基のアミ
ノ酸をコードしている)と、その上流に位置するPre
−S領域(163残基のアミノ酸をコードしている)の
うちP22のN末端から上流に遡った55残基(P8)
のアミノ酸をコードしている領域。 (iii)構成アミノ酸; アスパラギン酸、アスパラギン、スレオ ニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、
アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェ ニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アル ギニン、プロリン、トリプトファン、シス テイン; (iv)1モル中のアミノ酸モル数; アスパラギン酸、約5;アスパラギン、 約9;スレオニン、約24;セリン、 約31;グルタミン酸、約2;グルタ ミン、約8;グリシン、約18;アラ ニン、約9;バリン、約14;メチオ ニン、約7;イソロイシン、約16; ロイシン、約38;チロシン、約6; フェニルアラニン、約20;リジン、約 2;ヒスチジン、約2;アルギニン、 約10;プロリン、約32;トリプトフ ァン、約14;システイン、約14; (v)分子量;約31,000ダルトン(SDS−PA
GE) (vi)安定PH;中性 (vii)温度安定性;100℃、20min、sta
ble(viii)吸収特性;280nmにピーク29
0nmにショルダー - (4)特許請求の範囲第3項のポリペプタイドワクチン
において、N末端より第4番目アミノ酸残基(Asn)
に糖鎖が結合したポリペプタイドP35(分子量約35
,000ダルトン)。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15912484A JPS6137738A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | B型肝炎ワクチン |
DK345685A DK345685A (da) | 1984-07-31 | 1985-07-30 | Hepatitis b vaccine |
EP85305457A EP0171260B1 (en) | 1984-07-31 | 1985-07-31 | Hepatitis b vaccine |
AT85305457T ATE61938T1 (de) | 1984-07-31 | 1985-07-31 | Hepatitis-b-impfstoff. |
DE8585305457T DE3582284D1 (de) | 1984-07-31 | 1985-07-31 | Hepatitis-b-impfstoff. |
IE191285A IE58647B1 (en) | 1984-07-31 | 1985-07-31 | Hepatitis B vaccine |
US07/239,028 US5019386A (en) | 1984-07-31 | 1988-08-29 | Hepatitis B vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15912484A JPS6137738A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | B型肝炎ワクチン |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26804187A Division JPS63264426A (ja) | 1987-10-23 | 1987-10-23 | B型肝炎ワクチン |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6137738A true JPS6137738A (ja) | 1986-02-22 |
JPH045653B2 JPH045653B2 (ja) | 1992-02-03 |
Family
ID=15686755
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15912484A Granted JPS6137738A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | B型肝炎ワクチン |
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JP (1) | JPS6137738A (ja) |
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DE (1) | DE3582284D1 (ja) |
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US4847080A (en) * | 1984-03-07 | 1989-07-11 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers |
US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
FR2637184A1 (fr) * | 1988-10-05 | 1990-04-06 | Inst Nat Sante Rech Med | Anticorps monoclonal reconnaissant une region pre-s1 de la grande proteine d'enveloppe du virus de l'hepatite b et ses applications, notamment pour le diagnostic in vitro et le traitement de l'hepatite b |
AT392417B (de) * | 1989-09-20 | 1991-03-25 | Immuno Ag | Komplex geeignet zur durchfuehrung eines verfahrens zur reinigung von pre-s-hepatitis-b- virus-oberflaechenantigen |
US5274081A (en) * | 1989-09-20 | 1993-12-28 | Immuno A.G. | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen |
US5576175A (en) * | 1989-09-20 | 1996-11-19 | Immuno Aktiengesellschaft | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen |
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US6607727B1 (en) | 1991-08-26 | 2003-08-19 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus |
US6322789B1 (en) | 1991-08-26 | 2001-11-27 | Epimmune, Inc. | HLA-restricted hepatitis B virus CTL epitopes |
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- 1985-07-31 IE IE191285A patent/IE58647B1/en not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-08-29 US US07/239,028 patent/US5019386A/en not_active Expired - Fee Related
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