DE69214980T2 - Verfahren zur Reinigung von rekombinantem Hepatitis B-Virus-Oberflächenproteinen aus rekombinanten Zellen - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von rekombinantem Hepatitis B-Virus-Oberflächenproteinen aus rekombinanten ZellenInfo
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Description
- Hepatitis-B-Virus-(HBV)-DNA enthält mehrere offene Leseraster, von denen eines das env-Gen ist. Dieses Gen codiert 3 nahe verwandte Proteine; preS1+preS2+S, preS2+S und S, in ihrer jeweiligen genetischen 5'-3'-Reihenfolge. Sie umfassen die strukturellen Hüll- oder Oberflächen-("S")- Proteine. Die Proteine preS1+preS2+S, preS2+S und S werden gemeinsam als Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine bezeichnet. Die Proteine preS2+S und S kännen sich zu einer Struktur zusammenfügen, die als das 22 Nanometer-(22 nm)- Partikel oder als Australia-Antigen bekannt ist. Die 22 nm- Partikel kännen aus einer heterogenen Kombination von S- Proteinen bestehen oder homogen aus einer S-Proteinform. Man findet sämtliche S-verwandten Proteine im intakten HBV-Virion.
- Durch die Verwendung der DNA-Rekombinations-Technologie ist gezeigt worden, daß die DNA, die die S-Proteine codiert, in verschiedene Wirtszellen eingebracht werden kann (z.B. E. coli, Hefe, Insekten- und Säuger-Zellkulturen). Dies führt zur Synthese der Proteine preS1+preS2+S, preS2+S und S und der daraus folgenden Bildung der 22 nm-Partikel aus den Proteinen preS2+S und S. Sämtliche drei S-Proteinformen sind bekanntlich in vivo immunogen. Die Antikörper gegen die S-Proteine sind schützend, wobei das Protein preS2+S aufgrund des preS2- Bereichs immundominant ist. Der preS2-Bereich kann als Zellmembran-Wechselwirkungs-Sequenz bei der Virus-Replikation wirken.
- Die Expression des Proteins preS2+S in Hefezellen zeigte, daß das preS2+S-Protein mit Hefezellmembranen interagiert. Die Reinigung des Proteins preS2+S kann durch diese Eigenschaft erleichtert werden.
- Gegenwärtig gibt es ein Verfahren, mit dem man im wesentlichen reines membrangebundenes preS2+S-Protein reinigt. Dieses Verfahren hat einige Nachteile, wie u.a. :
- a) beträchtliche Mengen kontaminierender Hefeproteine in frühen Stadien des Reinigungsschemas,
- b) proteolytischer Abbau des Proteins preS2+S aufgrund hoher Spiegel kontaminierender Hefeproteasen,
- c) Zugabe (und anschließende Entfernung) von Protease- Inhibitoren zur Bekämpfung des proteolytischen Abbaus von preS2+S-Protein und
- d) Verringerung der Produktausbeute aufgrund der Anhäufung der vorstehenden Faktoren. Dieses so gereinigte Protein wird dann als Impfstoff beim Menschen für die Verhinderung der HBV- Infektion verwendet.
- Man kann nicht vorhersagen, welche Reinigungsverfahren für rekombinante Proteine geeignet sind, da rekombinante Proteine in einer Form präsentiert werden, die für die natürliche oder klassische Form gewöhnlich untypisch sind. Daher benötigen rekombinante Proteine häufig neuartige Kombinationen bekannter Verfahren oder vollkommen neue Reinigungsverfahren.
- Außerdem erfordern Impfstoffpräparate für den Menschen außergewöhnliche Reinheit. Daher ist das Ergebnis eines Reinigungsschemas schwieriger vorherzubestimmen.
- Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum wesentlichen Reinigen rekombinanter Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine aus rekombinanten Wirtszellen. Ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen, bei dem während der Reinigung keine Proteaseinhibitoren zugegeben werden müssen. Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine aus rekombinanten Wirtszellen, das ein stabileres Oberflächen-Proteinprodukt zur Folge hat. Diese und andere erfindungsgemäße Gegenstände werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
- Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine aus rekombinanten Wirtszellen bereit, umfassend die Schritte:
- a) Hitzebehandeln intakter Zellen, die das rekombinante Oberflächenprotein exprimieren, in einem Puffer mit neutralem pH-Wert;
- b) Aufbrechen der hitzebehandelten Zellen (a), wobei ein Rohextrakt erhalten wird;
- c) Entfernen von Zelltrümmern aus dem hitzebehandelten Extrakt (b) in Gegenwart von Detergens durch: i) Zentrifugation oder ii) Mikrofiltration, woraus ein hitzebehandelter, geklärter Extrakt hervorgeht;
- d) Einengen und Diafiltration des hitzebehandelten Extraktes (c);
- e) Entfernen des zugegebenen Detergens und Abtrennen kontaminierender Wirtszellproteine von dem Oberflächenprotein durch In-Kontakt-bringen des Produktes aus Schritt (d) mit einem detergensadsorbierenden Harz, gefolgt von Kontakt mit Weitporen-Silica, das die Oberflächenproteine adsorbiert und zurückhält, aber nicht die kontaminierenden Proteine;
- f) Elution des adsorbierten Oberflächenproteins aus dem Weitporen-Silica;
- g) Diafiltration des Eluates aus (f), um weiterhin niedermolekulargewichtige Verunreinigungen zu entfernen und um das Endprodukt einzuengen, das ein wesentlich gereinigtes Oberflächenprotein ergibt.
- Die erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten Verfahren zur Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine aus rekombinanten Wirtszellextrakten. Diese Verfahren beinhalten die kombinierte Behandlung der intakten Zellen bei einem neutralen pH-Wert und einer hohen Temperatur.
- Es ist selbstverständlich, daß die erfindungsgemäßen neuartigen Reinigungsverfahren auf einen weiten Bereich von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen oder Abschnitte davon anwendbar sind, einschließlich den Proteinen S, preS1+preS2+S und preS2+S, ob das Protein von menschlichem oder tierischem Serum oder von rekombinanten Organismen abstammt. Es ist auch selbstverständlich, daß verschiedene rekombinante Wirtszell- Spezies von dem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt sind. Die Proteine preS1+preS2+S, preS2+S und S werden gemeinsam als Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine bezeichnet. Ebenfalls eingeschlossen sind Fusionsproteine, die die gesamten Proteine S, preS1+preS2+S und preS2+S oder Abschnitte davon enthalten, sowie Mehrfachformen von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen, die gleichzeitig in einer rekombinanten Wirtszelle erzeugt werden.
- Ein Hauptbeispiel ist das von Hefezellen erzeugte rekombinante preS2+S-Protein. Dieses Hefe-Expressionssystem erzeugt die preS2+S-Aminosäuresequenzen. Ein anderes Beispiel ist das von Hefezellen erzeugte rekombinante S-Protein. Verfahren für die Reinigung anderer varianter Aminosäuresequenzen des S-Proteins werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind so aufgebaut, daß sie schnelle und wirksame Verfahren zur Reinigung aller S-Proteine oder S-Fusionsproteine, einschließlich S-Protein-Varianten sowie preS1+preS2+S- und preS2+S-Varianten und ihrer entsprechenden Fusionsproteine, gemäß den erfindungsgemäßen Prinzipien bereitstellen. Konservative Substitutionen [als Sätze definiert in Tabelle 1 von Taylor, W.R., J. Mol. Biol. 188: 233 (1986)] in der Aminosäuresequenz von preS1+preS2+S ergeben zum Beispiel gewöhnlich keine wesentliche oder neuartige Modifikation der Prinzipien und der Praxis der vorliegenden Erfindung. Man kennt konservative S-Antigen- Substitutionen; siehe Elfassi, E. et al., J. Theor. Biol. 121: 371 (1986). Deletionen innerhalb der Bereiche S, preS1 oder preS2+S benötigen außerdem gewöhnlich keine Modifikationen der hier erörterten Reinigungsverfahren. Es ist selbstverständlich, daß rekombinantes S-Protein oder Oberflächen-Antigen oder rekombinantes preS1+preS2+S-Protein oder preS2+S-Protein oder Teile davon in dieser Anmeldung all diese Variationen der Aminosäuresequenz enthält, gleichgültig, ob durch konservative Aminosäure-Substitution, Deletion oder durch einen anderen Prozeß, mit der Maßgabe, daß das rekombinante S-Protein, das Oberflächenantigen, das rekombinante preS1+S2+S-Protein oder Teile davon mit den Antikörpern immunochemisch reagieren, die für das preS1+S2+S-Protein oder für Teile davon, für das 22 nm-Partikel, das Australia-Antigen oder eine andere natürliche Form der HBV-Oberflächen-Antigensequenz spezifisch sind.
- Viele auf Hefe basierende Expressionssysteme dienen eindeutig als Quellen rekombinanter preS2+S-, S- und S- verwandter Proteine. Das Saccharomyces-cerevisiae-Expressionssystem ist als Nebenquelle vorgesehen. Andere Hefevektoren sind u.a. Shuttle-Vektoren, Cosmid-Plasmide, chimäre Plasmide und solche mit Sequenzen, die von den 2-Mikrometer-Ring- Plasmiden stammen. Sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
- Die Gattung Saccharomyces besteht aus vielen Arten. Am häufigsten wird S. cerevisae, oder Bäckerhefe, als Wirt für die durch rekombinante DNA vermittelte Expression einer Reihe fremder Polypetide verwendet.
- Die Unterscheidung zwischen anderen Arten der Saccharomyces-Gattung ist jedoch nicht immer gut definiert. Viele dieser Arten können mit S. cerevisae kreuzpaaren und besitzen wahrscheinlich regulierbare Promotoren und andere regulatorische Transkriptions- und Translations-Elemente, die zu denen in S. cerevisae analog oder mit ihnen identisch sind. Der Fachmann erkennt daher, daß man einen Wirt für die Expression S-verwandter Polypeptide auch aus anderen Arten der Gattung Saccharomyces auswählen kann. Dies sind u.a. carlsberaensis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, elongrgsorus, norbensis, oviformis und diastaticus. Sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
- Dane-Partikel (Serotyp adw) wurden als HBV-Nukleinsäure- Quelle für die Isolation der viralen offenen Leseraster (ORF) verwendet. Der Fachmann weiß, daß dieses Verfahren die Verwendung von Nukleinsäure aus HBV-Stämmen mit anderen serologischen Reaktivitäten mitumfaßt, die von der genetischen Diversität des Virus stammen. Die endogene Polymerasereaktion wurde eingesetzt, um kovalent geschlossene ringförmige doppelsträngige DNA des HBV-Genoms aus der nativ im HB-Virion befindlichen Nukleinsäureform mit Einzelstrangbruch und der mit Lücke herzustellen. Die DNA wurde isoliert, vollständig mit EcoRI gespalten, und in die EcoRI-Stelle von PBR322 kloniert, wodurch pHBV/ADW-1 entstand. Die rekombinanten Plasmide mit dem HBV-Genom in einer zirkulär permutierten Form an der EcoRI-Stelle des preS-Bereichs wurden ausgewählt. Das vollständige, die 55 Aminosäuren (aa) des preS2-Bereichs und die 226 aa des S-Bereichs codierende ORF wurde zunächst konstruiert, indem das nach Spaltung von PHBV/ADW-1 mit EcoRI und AccI erhaltene 0,8 Kilobasenpaar (kbp)-Fragment gereinigt wurde; dieses Fragment codiert das preS2+S-Polypeptid nur ohne Initiationscodon, die aminoterminalen 3 aa, die carboxyterminalen 3 aa und das Translations-Terminatorcodon.
- Man synthetisierte Oligonukleotide und ligierte sie an das Fragment, das so in ein HindIII-Fragment mit einer 10 bp nicht-translatierten 5'-flankierenden Sequenz aus Hefe und mit dem vollständigen preS2+S-ORF umgewandelt wurde. Die Sequenz an der 3'-Flanke des preS2-S-ORF wurde so ausgewählt, daß das Terminationscodon direkt an eine natürliche HindIII-Stelle in dem ADHI-Transkriptionsterminator grenzte. Somit wurde eine vollständige native, von Hefe stammende Verbindung geschaffen, ohne zusätzliche dazwischenliegende Basen. Der Fachmann erkennt, daß man für die Expression von preS2+S jeden geeigneten hefeaktiven Transkriptionsterminator anstelle von ADHI verwenden kann.
- Die 5'-flankierende Sequenz für die Konstruktion (ACAAAACAAAA) wurde so gewählt, daß sie mit der für den nichttranslatierten Leader (NTL) des Hefegens GAP63 (GAP) übereinstimmte [Holland, J. Biol. Chem., 225, 2596 (1980)] und dient auch als Konsensus für die GAP-Genfamilie. Die Konstruktion wurde derart hergestellt, daß der NTL direkt an das Initiationscodon des preS2+S-ORF ohne zusätzliche eingeschobene Basen angrenzt. Der Fachmann erkennt daher, daß sich die Auswahl der NTL-Sequenzen für die Expression von Hüllpolypeptiden auf andere Sequenzen erweitert, die zu geeigneten Expressionsspiegeln führen.
- Die DNA-Sequenz-Analyse ergab 2 Basensubstitionen, die zu aa-Unterschieden von der preS2+S-Sequenz, codiert von der DNA von pHBpreSGAP347/19T [Valenzuela et al., Biotechnology 3 (4), 317-320 (1985)], führten. Um für beide Konstruktionen identische Polypeptide zu bestimmen, wurden diese Nukleotidsubstitutionen durch ortsgerichtete Mutagenese [Zoller et al., Nucleic Acids Research 10: 6487-6500 (1982)] geändert. Dies waren T statt C an Base 64 des 846 bp ORF von HBV-preS2+S (codiert Phe statt Leu) und C statt A an Base 352 (codiert His statt Gln). Die codierte aa-Sequenz für die optimierte Konstruktion wurde dann nachgewiesen. Der Fachmann erkennt, daß diese Erfindung nicht auf diese Sequenz beschränkt ist und auf jede Sequenz erweitert werden kann, bei der die DNA ein Polypeptid mit HBV-Antigen-Wirkung codiert.
- Nach der Mutagenese wurde das oben beschriebene Fragment verwendet, um eine Expressions-Cassette wie zuvor beschrieben zu konstruieren [Kniskern et al., Gene, 46: 135-141, (1986)]. Sie bestand aus: (a) ca. 1,1 kbp des GAP491-Promotors, (b) einer von Hefe stammenden flankierenden 10-bp-Sequenz, (c) 846 Basenpaaren des HBV-preS2+S-Gens (Serotyp adw) ohne jegliche flankierende Virussequenzen und (d) ca. 0,4 kbp des Hefe-ADH1- Terminators. Diese Expressionscassette wurde in den Hefe- Shuttle-Vektor pC1/1 [Beggs, Nature 275: 104 (1978); Rosenberg et al., Nature 312: 77 (1984)] eingebracht, um das Plasmid pYGpreS2S-1 zu erzeugen, das zur Transformation des Hefestammes CF42 verwendet wurde, wodurch eine nachstehend als F403 bezeichnete Transformante erzeugt wurde. Diese Transformante wurde als gefrorene Stammkultur für die Bestimmung und die nachfolgenden Experimente angelegt. Der Parentalstamm CF42 wurde wie folgt erhalten:
- Eine spontane ura3-Mutation im Hefestamm 2150-2-3 (L. Hartwell, U. of Washington) wurde selektiert [Boeke et al., Mol. Gen. Genet., 197: 345-346, (1984)]. Der entstandene Stamm (MATa, ade1&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;, cirº) wurde diploidisiert, indem er mit Plasmid YCp50-HO [Jensen et al., P.N.A.S. USA, 80: 3035-3039, (1983)] transformiert wurde. Das funktionelle Hefegen HO ermöglicht den Zellen, den Paarungstyp umzuschalten. Die Nachkommenschaft von Einzelzelltransformanten ist ein Gemisch aus den Paarungstypen a und . Sie paaren sich während des Koloniewachstums. Ein diploides Klon-Isolat wurde von dem Plasmid befreit und als CF42 (MATa/a, ade1&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;) bezeichnet. Diese Transformanten wurden als gefrorene Stammkulturen für die Bewertung und die nachfolgenden Experimente angelegt.
- Rekombinante Hefe aus den gefrorenen pF403-Stammkulturen wurde in YEHD-Medium [Carty et al., J. Industrial Micro., 2, 117-121, (1987)] gezüchtet. Nach Wachstum bis zur stationären Phase wurden die Hefezellen geerntet. Es wurden Lysate hergestellt, durch Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt, und mit Antikörpern gegen HBSAG einem Immunoblotting unterzogen. Man fand zwei Haupt- Polypeptide mit Molekulargewichten von etwa 30 kD und 34 kD. Diese stimmten mit den vorherbestimmten Molekulargewichten des Translationsproduktes des preS2+S-ORF und seinem glykosylierten Derivat überein. Es wurde auch eine zusätzliche polydisperse (Molekulargewicht etwa 50 kD) Glykopeptidbande entdeckt, die der Population hyperglykosylierter Spezies entsprach und mit anti-Hefe sowie anti-HBs-Seren eine Immunreaktion einging. Außerdem waren Lysate der rekombinanten, aber nicht der parentalen Hefe positiv für preS2+S im Radioimmuntest (RIA). Elektronenmikroskopie-Untersuchung der partiell gereinigten Hefelysate zeigte die hohen Dichten der üblichen 22nm-preS2+S- Partikel.
- Der aus Hefe stammende Promotor leitet die Transkription des preS2+S-Gens ein. Der Fachmann erkennt daher leicht, daß jede in Hefe aktive Promotor-Sequenz statt des GAP491- Promotors eingesetzt werden kann. Der Fachmann erkennt auch leicht, daß ein geeignetes Testsystem, z.B. Immunoblot oder RIA oder Enzym-Immuntest (EIA) verwendet werden sollte, um die Expression von preS2+S-Polypeptiden in diesem System zu analysieren, so daß die Erntezeit der Kultur zur Erzielung einer größtmöglichen Ausbeute optimiert werden kann.
- Der GAP491-Promotor eignet sich für die Expression in Hefe einiger fremder Proteine, u.a. HBsAg [Bitter et al., Gene, 32: 263-274 (1984); Wampler et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 6830-6834 (1985)]. Aufgrund unserer vorherigen Ergebnisse der Expression von HBcAg zu ca. 40% des löslichen Hefeproteins (Kniskern et al., s.o.) verwendeten wir diesen Promotor, um die Expression von preS2+S-Antigen in geeigneten Hefe-Wirtszellen zu steuern.
- Um die Glykosylierung des rekombinanten hefeexprimierten preS2+S-Proteins zu kontrollieren und zu definieren, wurde das Hefe-Expressionsplasmid (pYGpreS2S-1) mit der oben beschriebenen Expressionscassette auch zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes KHY-107 (cir&spplus; ade1&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;), verwendet. Dieser wurde wie folgt konstruiert:
- Ein CZ5/L8347-1c-Stamm vom Paarungstyp a (mnn9&supmin;, SUCZ&supmin;) (C. Ballou, U. of Calif.) wurde mit dem Stamm 2150-2-3 vom - Typ (leu2&supmin; ade1&supmin;) (L. Hartwell, U. of Washington) gepaart, indem die Stämme auf einer YEHD-Agarplatte (Carty et al., s.o.) gemischt wurden. Die gepaarten Stämme wurden zur Selektion von Diploiden auf Minimalmedium ohne Leucin (leu&supmin;) und mit 2% Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle replikaplattiert. Nach Isolation von Einzelkolonien, wurden die Diploiden sporuliert. Die Asci wurden mit Standard- Techniken analysiert. Der KHY-107-Stamm wurde als Einzelspore isoliert und als cir&spplus; ade1&spplus;, leu2&supmin; und mnn9&supmin; charakterisiert (mit der Schiff-Färbetechnik).
- Transformierte Klone wurden auf Minimalmedium (leu&supmin;) mit 1 M Sorbitol selektiert. Diese klonierten Transformanten wurden als gefrorene Stammkulturen in 17 %igem Glycerin für die nachfolgende Bewertung und weitere Experimente erstellt.
- Das Expressionsplasmid pYGpreS2S-1 wurde auch verwendet, um den von Stamm KHY-107 (cir&spplus; ade1&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;) abstammenden KHY-107 (cirº ade1&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;) zu transformieren, wie beschrieben (Broach, G.R. " Methods in Enzymology", Bd. 101, Teil C, S. 307-325, 1987, Academic Press, N.Y.). Für die nachfolgende Bewertung und weitere Experimente wurden transformierte Klonisolate als gefrorenen Stammkulturen in 17%igem Glycerin erstellt.
- Klone transformierter Hefe [KHY-107(cir&spplus; ade1&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;)] mit dem Expressionsplasmid pYGpreS2S-1 wurden auf leu&supmin;-Selektions-Agarplatten mit 1 M Sorbitol plattiert und 2 bis 3 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Diese Hefen wurden in 5 bis 7 ml-Kulturen des komplexen YEHD- (Carty et al., s.o.) -Mediums mit 1 M Sorbitol überimpft. Die Kulturen wurden 12 bis 18 Stunden lang bei 30ºC unter Belüftung inkubiert. Kolben mit 50 ml komplexen YEHD-Medien mit 1 M Sorbitol (nachstehend als YEHDS bezeichnet) wurden mit den vorstehend erwähnten Kulturen angeimpft (auf eine anfängliche A&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 0,1) und 48-72 Std. lang bei 30ºC unter Schütteln (350 U/min.) auf eine endgültige A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Proben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;- Einheiten wurden in Röhrchen aliquotiert. Die Hefezellen wurden 10 Minuten lang bei 2000 x g pelletiert. Die Proben wurden entweder direkt untersucht oder bei -70ºC eingefroren aufbewahrt. Für den Test wurden die Pellets in 0,4 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert und in 1,5 ml Eppendorf- Röhrchen überführt. Die Hefezellen wurden aufgebrochen durch: 1) Zugabe von 200-300 mg gewaschener Glasperlen (0,45 mm) und lsminütiges Schütteln auf einem Vortex-Mischer, 2) Zugabe von TRITON X-100 auf 0,5%, 3) Schütteln auf dem Vortex-Mischer während 2 Minuten, und 4) Inkubation bei 4ºC während 10 Minuten. Die Zelltrümmer und die Glasperlen wurden durch Zentrifugation bei 2000 x g während 10 Minuten entfernt. Die geklärte Überstandsflüssigkeit wurde entfernt und auf Protein [nach dem Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)] und auf preS2+S-spezifischen RIA [Hansson et al., Infect. Immunol. 26, 125-130, (1979), Machida et al., Gastroenterology 86, 910-918, (1984)] untersucht.
- Es wurden fünf Klone parallel untersucht und mit einem entsprechenden Zeilpellet von Klon pF403 verglichen, der auf einen Wert von 1,0 als Referenz normalisiert wurde. Übliche entsprechende Werte der Antigenproduktivität der fünf Klone wurden wie in Beispiel VII aufgeführt erhalten.
- Klone transformierter Hefe [KHY-107(cirº ade1&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;)] mit dem Expressionsplasmid wurden auf leu&supmin;-Selektions- Agarplatten mit 1 M Sorbitol plattiert und 2 bis 3 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Diese Hefen wurden in 5 bis 7 ml-Kulturen mit komplexen YEHDS-Medien überimpft. Die Kulturen wurden 12 bis 18 Stunden lang bei 30ºC unter Belüftung inkubiert. Kolben mit 50 ml komplexen YEHDS-Medien wurden mit den vorstehend erwähnten Kulturen angeimpft (auf eine anfängliche A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1) und 48-72 Std. lang bei 30ºC unter Schütteln (350 U/min) auf eine endgültige A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Dreifachproben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Röhrchen aliquotiert. Die Hefezellen wurden 10 Minuten lang bei 2000 x g pelletiert. Die Proben wurden entweder wie oben beschrieben direkt untersucht oder bei -70ºC eingefroren aufbewahrt.
- Es wurden fünf Klone parallel untersucht und mit Klon pF403 verglichen, der auf einen Wert von 1,0 als Referenz normalisiert wurde. Übliche entsprechende Werte der Antigenproduktivität für die fünf Klone wurden wie in Beispiel VIII aufgeführt erhalten.
- Die Immunoblot-Analyse des preS2+S-Polypeptides, das von sämtlichen oben beschriebenen rekombinanten Klonen abstammte, in Wirtszellen mit dem Phänotyp mnn9, zeigte zwei Banden mit den scheinbaren Molekulargewichtsgrößen 30 kD und 34 kD. Die polydispersen (Molekulargewicht über 50 kD) hyperglykosylierten Spezies wurden weder mit anti-Hefe- noch mit anti-Hbs- Seren entdeckt.
- Die Erkennungssequenz für die N-gebundene Glykosylierung [Asn-X-Thr] in dem preS2+S-ORF wurde mutiert, um einen Expressionsvektor bereitzustellen, bei dem die intrinsische Natur des exprimierten Proteins die Regulation der Glykosyherung des HBV-preS2+S definiert. Der Klon pUC13preS2S diente als Ausgangsmaterial für diese Konstruktion.
- Zur Wiederherstellung des 5'-Bereichs des preS2+S-ORF wurde ein Oligonukleotidpaar synthetisiert, um das ORF von Bamfil stromauf zum ATG über einen 10 bp NTL und eine HindIII- Stelle zu einem EcoRI-kompatiblen Ende wiederherzustellen. Die Sequenz dieses Oligonukleotids, das eine A-nach-C-Mutation (an Base 31) und eine T-nach-A-Mutation (an Base 33) enthält, was zu einem aa-Austausch an Position 4 der S2-Proteindomäne von Asn nach Gln führt, ist:
- Dieses synthetische Oligonukleotidpaar wurde in pUC19 ligiert, der zuvor mit EcoRI und BamHI gespalten worden war. Das entstandene Plasmid wurde mit BamHI und SalI gespalten und danach mit dem aus pUC13preS2s gespaltenen und gereinigten 0,8-kbp-BamHI-SalI-Fragment ligiert, um das Plasmid pUC19preS2SWG-1 zu erzeugen. Dieses HindIII-Fragment enthält das preS2+S-ORF, bei dem Asn gegen Gln an Position 4 ersetzt ist. Mit diesem ORF wurde ein Hefe-Expressionsvektor analog wie bereits vorher beschrieben erzeugt.
- Das 0,8-kbp-HindIII-Fragment wurde auf analoge Weise aus pUC13preS2S isoliert und in einen pUC19-Vektor ligiert, bei dem die EcoRI- und die BamHI-Stelle zuvor zerstört worden waren. Der entstandene Vektor wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und mit einem synthetischen Oligonukleotidpaar ligiert, mit dem das preS2+S-Hüll-ORF von EcoRI bis BamHI mit einer A-nach-G-Mutation (an Base +7 des Oligonukleotides) wiederhergestellt wurde, was zu einem Aminosäureaustausch von Thr nach Ala an der Aminosäure +6 der preS2-Domäne führt.
- Die Sequenz dieses Oligonukleotides ist:
- Diese Konstruktion ergab die Herstellung von pUC19preS2SWG-2, der das ORF als ein HindIII-Fragment enthält, wobei Thr gegen Ala an Aminosäure 6 der preS2-Domäne ausgetauscht ist. Dieses ORF wurde verwendet, um einen Hefe- Expressionsvektor in analoger Weise wie zuvor beschrieben zu erzeugen.
- Die preS2+S-Antigenexpression wurde wie zuvor beschrieben bestimmt und war hinsichtlich der Produktivität zu der mit den oben beschriebenen Transformanten erhaltenen äquivalent. Klone beider Mutanten wurden als gefrorene Stammkulturen für die weitere Untersuchung konserviert. Die Immunoblot-Analysen, die mit anti-HBs-Seren oder anti-preS2-Seren entwickelt wurden, ergaben eine einzige Hauptspezies mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kD, das mit dem für das nicht-glykosylierte Translationsprodukt des preS2+S-ORF vorherbestimmten übereinstimmt.
- Für die in-vivo-Aktivitätsbestimmungen wurde das nichthyperglykosylierte preS2+S-Präparat an Alaun adsorbiert, und Gruppen von Mäusen wurden abgestufte Antigenmengen injiziert. Nach sechs Wochen wurden die Mäuseseren auf anti-HBs- Antikörper (AUSAB*) und anti-preS2-Antikörper untersucht [nach Neurath, J. Med. Virol., 17, 119-121, (1985)]. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, daß das preS2+S-Präparat genauso wirksam eine anti-HBs-Antikörperreaktion induzierte wie das HBsAg-Kontroll-Präparat (die wirksame immunisierende Dosis betrug 0,34 mg für preS2+S verglichen mit 0,25 mg für die HBsAg-Kontrolle). Außerdem zeigte das preS2+S-Präparat eine starke (wirksame immunisierende Dosis von 0,14 mg) Fähigkeit, gleichzeitig eine für die preS2-Domäne spezifische Antikörperreaktion zu induzieren.
- Die Gattung Saccharomyces besteht aus einer Reihe von Arten. Meistens wird S. cerevisiae, oder Bäckerhefe, als Wirt für die durch rekombinante DNA vermittelte Expression einer Reihe von Fremdpolypeptiden verwendet. Der Unterschied zwischen anderen Arten der Gattung Saccharomyces ist nicht immer gut definiert. Viele dieser Arten können mit S. cerevisiae kreuzpaaren und besitzen wahrscheinlich regulierbare Promotoren und andere regulatorische Transkriptions- und Translations-Elemente, die analog zu oder identisch mit denen in S. cerevisiae sind. Der Fachmann erkennt daher leicht, daß sich die Auswahl eines Wirtes für die Expression S-verwandter Polypeptide auf andere Arten der Gattung Saccharomyces ausdehnt, wie u.a. aber nicht beschränkt auf carlsbergensis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, elonargsorus, norbensis, oviformis und diastaticus.
- Einige Hefegattungen wie Hansenula, Candida, Torulopsis und Pichia enthalten bekanntlich Stoffwechselwege für die Verwendung von Methanol als einzige Kohlenstoffquelle für das Wachstum. Das Gen für die Alkoholoxidase, einem Enzym, das an diesem Stoffwechselweg teilnimmt, ist aus Pichia pastoris isoliert worden. Der Promotor des Alkohol-Oxidase-Gens aus P. pastoris ist isoliert worden. Man hat gezeigt, daß er in Gegenwart von Methanol induzierbar ist. Dieses induzierbare Promotorsystem eignet sich für die Expression von Polypeptiden, die negativ auf den Wirt wirken. Man hat gezeigt, daß dieser Promotor insbesondere aktiv ist bei der Regulation der Expression von S-Polypeptiden in P. pastoris. Dies hebt die Fähigkeit anderer Hefegattungen hervor, als Wirte für die durch rekombinante DNA vermittelte Genexpression von S- Polypeptiden in immunologisch aktiver Form zu wirken. Dem Fachmann ist es daher ersichtlich, daß sich die Selektion eines Wirtes für die Expression von preS2+S-haltigen Polypetiden auf Arten anderer Hefegattungen der Familien Saccharomycetaceae und Cryptococcaceae ausdehnt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, Kluyveromyces und Saccharomycodsis.
- Die Reinigungsverfahren des erfindungsgemäßen rekombinanten preS2+S eliminieren bei jedem Reinigungsschritt das früher erforderliche Einbringen von Proteaseinhibitoren vollständig. Hefezellen, die mit Expressionsvektoren transformiert sind, die ein Hepatitis B-Virus-Oberflächenprotein oder Varianten davon codieren, werden gezüchtet und geerntet. Die Zellen können, wenn erwünscht, aufbewahrt werden, indem sie in einer Pufferlösung, bspw. PBS, gewaschen werdenl und eine Zellpaste hergestellt wird, die gewöhnlich bei -70ºC eingefroren aufbewahrt wird.
- Die Reinigung beginnt gewöhnlich wie folgt. Ein Ansatz der frischen oder gefrorenen Zellpaste wird in einem Puffer suspendiert. Zum Aufbrechen im großen Maßstab hat sich das milde Perlen-Aufbrech-Verfahren als ungeeignet erwiesen. Aufbrechen durch einen Hochdruck-Homogenisator (etwa 10000 bis 20000 psi mit einem Gaulin- oder Stansted-Homogenisator) ist aufgrund seiner schnellen und wirksamen Durchführung bevorzugt.
- An dieser Stelle kann es erwünscht sein, ein Detergens zu dem Rohextrakt zuzugeben. Die Zugabe eines Detergens erleichtert die Trennung der Zellmembranen aus Hefe von unerwünschten Zelltrümmern. Es ist gezeigt worden, daß preS2+S-Protein sowie andere Formen der Oberflächenproteine an Hefezellmebranen binden. Man kann eine Reihe von neutralen oder nichtionischen Detergenzien verwenden, wie u.a., aber nicht beschränkt auf Detergenzien der TRITON-N-Reihe, Triton- X-Reihe, BRIJ-Reihe, TWEEN-Reihe oder EMASOL-Reihe, Desoxycholat, Octylglucopyranosid oder NONIDET-P-40. Zwitterionische Detergenzien wie CHAPS oder CHAPSO sind ebenfalls geeignete Mittel.
- Wird ein Detergens verwendet, ist das bevorzugte Detergens TRITON-X-100 bei einer Konzentration von etwa 0,5%. Es wird darauf hingewiesen, daß das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung von Detergens in diesem Schritt nicht erfordert und die Verwendung von Detergenzien fakultativ ist.
- Die Hitzebehandlung ist über einen Temperaturenbereich und über einen Behandlungsdauer-Bereich wirksam. Gewöhnlich wird ein Temperaturbereich von 45ºC bis 60ºC verwendet, wobei 50ºC die bevorzugte Temperatur ist. Die Hitzebehandlung dauert gewöhnlich zwischen 20 bis 40 Minuten, wobei 30 Minüten die bevorzugte Zeit ist. Das Material wird dann auf etwa 10ºC gekühlt, indem es vorzugsweise in einem Eiswasser-Bad untergebracht wird oder unter Verwendung eines Wärmeaustauschers.
- Die Entfernung von Zelltrümmern aus dem wärmebehandelten Rohextrakt ist notwendig, um physikalisches Verschließen währen der nachfolgenden Reinigungsschritte zu verhindern. Zelltrümmer können durch Zentrifugation, Mikrofiltration oder Filtration, die einen geklärten Extrakt erzeugen, entfernt werden. Zentrifugation und Mikrofiltration sind die am stärksten bevorzugten Verfahren. Die Zentrifugation kann unterschiedlich lange bei verschiedenen Zentrifugalkräften durchgeführt werden. Man zentrifugiert angemessenerweise bei etwa 3000 x g während 15 Minuten bei 4ºC. Es kann auch von Vorteil sein, den Extrakt vor dem Zentrifugieren zu verdünnen, um die gewöhnlich viskose Beschaffenheit eines Hefezell- Rohextraktes zu verringern. Die Verdünnung ändert keinen nachfolgenden Verfahrens schritt.
- Die Mikrofiltration hat den Vorteil, daß Filtration und Dialyse gleichzeitig durchgeführt werden können. Verschiedene Typen von Mikrofiltrationseinheiten eignen sich für die Verwendung in diesem Schritt, z.B. Krosflo von Mikrogon Inc. oder jede Art von Hohlfaser-Cassetten von Amicon oder A/G- Technology. Bei dem bevorzugten Mikrofiltrationsverfahren wird der Extrakt durch eine Prostak-Durapore-Membran (Millipore), Platten- und Rahmen-Mikrofiltrationseinheit mit einer Porengröße von etwa 0,1 Mikrometer bis 0,2 Mikrometer, bei einem Einlaßdruck von etwa 2 bis 7 psi geleitet, mit einem Puffer, der aus etwa 0,1 M TRIS, pH-Wert etwa 10,4 und ca. 0,1 % TRITON X-100 besteht.
- Der Überstand aus der Zentrifugation oder das Filtrat aus der Mikrofiltration kann vor dem nächsten Schritt dieses Verfahrens eingeengt werden.
- Die Einengung kann durch mehrere Verfahren erfolgen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Dialyse, Futration, Lyophilisierung, Ultrafiltration und Diafiltration. Das erfindungsgemäße bevorzugte Einengungsverfahren ist das Durchleiten des geklärten Extraktes durch ein Hohlfaser- Ultrafiltrationssystem mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 10&sup5;. Das Volumen des geklärten Extraktes wird gewöhnlich ca. 6,5fach für das Mikrofiltrationsprodukt und ca. 2fach für das verdünnte zentrifugierte Produkt verringert, was ein eingeengtes Retentat ergibt. Nach der Einengung wird das Retentat diafiltriert, um weiter niedermolekulargewichtige Verunreinigungen zu entfernen. Die Diafiltration wird mit einem Hohlfasersystem mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 10&sup5; durchgeführt.
- Wird TRITON X-100 zugegeben, kann man es durch mehrere herkömmliche Verfahren entfernen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Dialyse, Zugabe bestimmter organischer Lösungsmittel, Kühlen, Chromatographie-Trennung und Kontakt mit einem Gel oder Harz, das spezifisch Detergentien bindet, wie Extractogel (Pierce) und XAD-Harz (Romicon). Das erfindungsgemäße bevorzugte Verfahren zur Entfernung von TRITON X-100 ist, den hitzebehandelten Extrakt mit dem TRITON X-100 durch eine Cassette aus XAD-2- oder XAD-4-Harz (Polystyroldivinylbenzol) zu leiten. Der hitzebehandelte Extrakt wird etwa 10 Stunden lang bei 4ºC durch die XAD- Cassette rundgeführt und dann in einem geeigneten Gefäß, bspw. einer verschließbaren Glasflasche, aufgefangen.
- Werden die Zellen in einem Puffer mit hohem pH-Wert zerstört, wird der pH-Wert des hitzebehandelten Extraktes dann zwischen einem pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 7,9 eingestellt, wobei der bevorzugte pH-Wert etwa 7,7 beträgt. Einstellen des pH-Wertes auf etwa 7,7 nach der Hitzebehandlung bei einem hohen pH-Wert nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert beträchtlich die Adsorption der Oberflächenproteine an das in einem anschließenden Schritt verwendete Weitporen-Silica. Die Einstellung des pH-Wertes des hitzebehandelten Extraktes kann vor dem TRITON X-100-Entfernungsschritt erfolgen, ohne das Ergebnis des Verfahrens zu beeinträchtigen. Der Fachmann sieht daher, daß die Schritte pH-Wert-Einstellung und Triton X-100- Entfernung erfindungsgemäß auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden können, ohne daß das Ergebnis des Verfahrens wesentlich beeinträchtigt wird.
- Das Oberflächenprotein wird dann leicht von den Verunreinigungen getrennt, wobei im wesentlichen reines Hepatitis-B- Virus-Oberflächenprotein erhalten wird. Das bevorzugte Verfahren zur Eliminierung der Verunreinigungen ist die Adsorption des Oberflächenproteins an weitporiges Silica. Das am stärksten bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren ist die Adsorption des Oberflächenproteins an ein weitporiges Silica mit einer Porengröße im Bereich von etwa 100 bis 150 nm (1000 bis 1500 Å) und einem Silica-Partikelgrößenbereich von etwa 30 bis 130 Micron (Amicon). Das Oberflächenprotein tritt leicht in die Poren des Silicas ein und wird zurückgehalten. Die zellulären Proteinverunreinigungen aus Hefe können daher leicht weggewaschen werden.
- Die Adsorption des Oberflächenproteins an weitporiges Silica kann chromatographisch erfolgen oder auf nichtchromatographische chargenweise Art. Die chromatographische Adsorption wird durchgeführt, indem der Extrakt mit eingestelltem pH-Wert durch ein Bett aus weitporigem Silica in einem Säulenchromatographiegerät geleitet wird. Gewöhnlich wird etwa 1 Liter hitzebehandelter Extrakt bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 200 ml/Stunde auf eine 5cm ummantelte Säulenapparatur aufgetragen, die ca. 300 ml (ca. 100 g Trockengewicht) Perlen aus weitporigem Silica enthält.
- Die nichtchromatographische Adsorption an weitporiges Silica erfolgt gewöhnlich, indem der hitzebehandelte Extrakt mit dem Silica in einem geeigneten Gefäß, bspw. einer verschließbaren Glasflasche, gemischt wird. Das bevorzugte Verfahren ist die Zugabe von 300 ml weitporigem Silica zu etwa 1 l hitzebehandeltem Extrakt in einer Glasflasche und Inkubation unter ständigem Mischen. Die Adsorption wird vorzugsweise etwa 1,5 Stunden bei etwa 4-8ºC fortgesetzt, obwohl unterschiedliche Zeiten und Temperaturen geeignet sind.
- Unadsorbiertes Material kann auch nichtchromatographisch aus dem Oberflächenprotein-adsorbierten Silica ausgewaschen werden, oder das Silica kann zur chromatographischen Adsorption in eine Säulenapparatur wie vorstehend beschrieben gegeben werden. Es wird chargenweise gewaschen, indem der hitzebehandelte Extrakt aus dem weitporigen Silica abgelassen wird und mehrere Volumen eines Puffers zugegeben werden, der die an das Silica adsorbierten Oberflächenproteine nicht loslöst. Der bevorzugte Puffer ist PBS. Das Silica wird entwässert und die Waschschritte 3- bis 5mal wiederholt.
- Chromatographisches Waschen des Oberflächenproteinadsorbierten Silica erfolgt durch Hindurchleiten des PBS durch das Silica bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 200 ml/Stunde bis die Extinktion bei 280 nm konstant ist.
- Das Oberflächenprotein wird aus dem gewaschenen weitporigen Silica mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 8,5 bis 9,0 eluiert. Oberflächenproteine werden vorzugsweise mit einer Pufferlösung desorbiert, die aus etwa 0,05 M Borat bei einem pH-Wert von etwa 8,7 besteht. Die Desorption von Oberflächenproteinen kann bei höheren Temperaturen über einen weiten Bereich erleichtert werden. Eine Desorption bei etwa 55ºC ist bevorzugt.
- Nichtchromatographische Desorption erfolgt, indem 1200 ml 0,05 M Boratpuffer bei pH-Wert 8,7 mit etwa 700 ml gewaschenen Oberflächenprotein-adsorbiertem weitporigen Silica gemischt werden. Die Desorption wird etwa 25 Minuten lang fortgesetzt. Das Eluat wird dann gesammelt, die Desorptionsschritte werden zweimal wiederholt und das Eluat wird gekühlt.
- Chromatische Desorption erfolgt, indem die ummantelte Säule mit dem gewaschenen Silica auf etwa 55ºC erwärmt wird. Der 0,05 M Boratpuffer bei pH-Wert 8,7 wird auf 55ºC erwärmt und dann bei einer Geschwindigkeit von 500 ml/Std. auf die Säule aufgetragen. Das Eluat wird dann gesammelt und gekühlt. Das Volumen des Eluates ist gewöhnlich ungefähr äquivalent zu dem Volumen des auf das weitporige Silica aufgetragenen hitzebehandelten Extraktes.
- Die Konzentration des eluierten Oberflächenproteins ist gewöhnlich erwünscht. Das bevorzugte Konzentrationsverfahren ist das Hindurchleiten des Eluates durch ein Hohlfaser-Diafiltrationssystem mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 10&sup5; mit einem 0,05 M Boratpuffer, pH-Wert 8,7. Das Volumen des eluierten Oberflächenproteins kann mit diesem System gewöhnlich um das 16fache verringert werden. Das Diafiltrationsretentat kann, sofern notwendig, mittels Mikrofiltration sterilisiert werden.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne jedoch diese darauf zu beschränken. Die Offenbarung jeder in den folgenden Beispielen erwähnten Bezugsstelle ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
- HBV-Dane-Partikel (Serotyp adw) wurden isoliert und aus menschlichem Plasma (Träger) gereinigt. Doppelsträngige DNA wurde von der endogenen Polymerase in den Dane-Partikeln nach den Verfahren von Landers et al., [J. Virology, 23, 368-376, (1977)] und Hruska et al., [J. Virology, 21, (1977)] synthetisiert. Die DNA wurde nach Spaltung mit Proteinase K in SDS isoliert, gefolgt von Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung. Die genomische HBV-DNA wurde mit EcoRI gespalten. Es entstand ein einzelnes 3,2-kbp-Fragment, das in die EcoRI-Stelle von pBR322 kloniert wurde, wobei pHBV/ADW-1 entstand. Die Gegenwart der HBV-DNA wurde durch EcoRI-Spaltung, Southern-Blot-Übertragung auf Nitrozellulose und Hybridisierung mit [³²p]-markierten spezifischen Oligonukleotidsonden bestätigt.
- Das Plasmid pHBV/ADW-1 (beschrieben in Beispiel I) wurde mit EcoRI und AccI gespalten, und das 0,8-kbp-Fragment durch präparative Agarosegelelektrophorese gereinigt.
- Um den 5'-Teil des preS2+S-ORF wiederauf zubauen, wurde ein Oligonukleotidpaar synthetisiert, das das ORF von der EcoRI-Stelle stromauf des ATG über eine 10-bp-NTL-Sequenz bis zu einem HindIII-Terminus wiederherstellt. Die Sequenz dieses Oligonukleotids ist:
- Um den 3'-Teil des preS2+S-ORF wiederauf zubauen, wurde ein zweites Oligonukleotidpaar synthetisiert, das das ORF von der AccI-Stelle über den Transiationsterminator bis zu einem HindIII-Terminus wiederherstellt. Die Sequenz dieses Oligonukleotids ist:
- Das Plasmid pGAP-tADH-2, das den GAP491-Promotor [Holland et al., J. Biol. Chem., 255: 2596, (1980)] und den ADH1- Transkriptionsterminator in pBR322 enthält, hat eine einzelne HindIII-Klonierungsstelle, in die das oben beschriebene preS2+2-ORF ligiert wurde. Dabei entstand pEGpreS2S-1. Die Gegenwart und die Orientierung von HBV-DNA wurde durch Restriktionsendonuklease-Analysen und Southern-Blot-Übertragung bestätigt. Die Expressionscassette mit dem preS2+2-ORF wurde aus pEGpreS2S-1 durch SuhI-Spaltung entfernt und durch präparative Agarosegelelektrophorese isoliert. Die Cassette wurde dann in den Shuttle-Vektor pC1/1 (Beggs, s. o.; Rosenberg et al., s.o.) kloniert, der zuvor mit SphI gespalten worden war, um einen Hefeexpressionsvektor (pYGpreS2S-1) zu erzeugen, der dann zum Transformieren von S. cerevisiae wie unten beschrieben verwendet wurde.
- Das entstandene Plasmid pYGpreS2S-1 (aus Beispiel II oben) mit der Expressionscassette wurde verwendet, um den S. cerevisiae-Stamm CF42, (MAT a/a, ade1&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;), der wie folgt hergestellt wurde, zu transformieren:
- Eine ura3-Mutation in Hefestamm 2150-2-3 (L. Hartwell, U. of Washington) wurde ausgewählt (Boeke et al., s. o.) . Der entstandene Stamm (MATa, ade1&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;, cirº) wurde durch Transformation mit dem Plasmid YCp50-HO [Jensen et al., PNAS USA, 80: 3035-3039, (1983)) diploidisiert. Ein diploider Stamm wurde von dem Plasmid befreit und mit CF42 (MAT a/a, ade1&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;) bezeichnet.
- Ein transformierter Klon (pF403) wurde für die nachstehend beschriebene Auswertung selektiert und als gefrorene Stammkultur (in 17%igem Glycerin) angelegt.
- Der Klon pf403 der Hefe, der das in Beispiel III beschriebene Expressionsplasmid enthält, wurde auf leu&supmin;- Agarplatten plattiert und bei 30ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Diese Hefe wurde in 5-7-ml-Kulturen aus komplexen YEHD-Medien überimpft, und die Kulturen wurden 12 bis 18 Stunden lang bei 30ºC unter Belüftung inkubiert. Kolben mit 50 ml komplexen YEHD-Medien wurden aus den obigen Kulturen auf eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1 angeimpft und 48-72 Stunden lang bei 30ºC unter Schütteln (350 U/min) auf eine endgültige A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Dreifachproben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Röhrchen aliquotiert, und die Hefezellen wurden 10 Minuten lang bei 2000xg pelletiert. Die Pellets wurden entweder direkt getestet oder bei -70ºC für den weiteren Gebrauch als ein interner Vergleichsstandard für die Bewertung der kontrollierten Glykosylierungsklone verwendet, die in den Beispielen VII, VIII, IX und X nachstehend beschrieben werden (für diese Vergleiche wurden die Werte für den Klon pF403 auf 1,0 normalisiert). Für den Test wurden die Pellets in 0,4 ml phosphatgepufferter Salzlösung mit 2 mM PMSF resuspendiert. Die Hefezellen wurden aufgebrochen durch: 1) die Zugabe von 200-300 mg gewaschenen Glasperlen (0,45 mm), 2) Rühren auf einem Vortex-Mischer während 15 min, 3) Zugabe von TX-100 auf 0,5% (v/v), 4) Rühren auf einem Vortex-Mischer während 2 min, und 5) Inkubation bei 4ºC während 10 min. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch Zentrifugation bei 2000xg während 10 min entfernt. Die geklärte Überstandsflüssigkeit wurde entfernt und auf Protein untersucht [durch das Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)] und durch einen für preS2+S spezifischen RIA [Hansson et al., 5.0. Machida et al., s.o.].
- Das entstandene Plasmid (pYGpreS2S-1) aus Beispiel II oben mit der Expressionscassette wurde verwendet, um S. cerevisiae KHY-107 (cir&spplus;) zu transformieren. Dieser wurde wie folgt konstruiert:
- Der Stamm CZ5/LB347-1C (mnn9&supmin;, SUCZ&supmin;) vom Paarungstyp a wurde mit dem Stamm 2150-2-3 (leu2&supmin;, ade1&supmin;) vom Typ gepaart, indem die Stämme auf einer YEHD-Komplett-Medium-Platte gemischt wurden. Um auf Diploide zu selektieren, wurden die gepaarten Stämme auf leu&supmin;-Minimalmedium, das 2% Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, replikaplattiert. Nach der Isolation von Einzelkolonien wurden die Diploiden sporuliert, und die Asci wurden mittels Standardtechniken prapariert. Der KHY-107-Stamm wurde als Einzeispore isoliert und als cir&spplus;, ade1&spplus;, leu2&supmin;, und mnn9&supmin; (durch die Schiff Färbetechnik) charakterisiert.
- Die Klone wurden auf Minimalmedium (leu&supmin; und mit 1 M Sorbitol) selektiert, als gefrorene Stammkulturen (in 17%igem Glycerin) angelegt und wie nachstehend beschrieben bewertet.
- Das in Beispiel II oben verwendete Expressionsplasmid wurde verwendet, um S. cerevisiae-Stamm KHY-107 (cirº) zu transformieren, der von Stamm KHY-107 (cir&spplus;) stammt, wie von Broach ["Methods in Enzymobgy", Bd. 101, Teil C, 307-325, (1983)] beschrieben. Klone wurden selektiert, als gefrorene Stammkulturen wie vorstehend in Beispiel V beschrieben angelegt und für die Expression von preS2+S wie nachstehend in Beispiel VIII beschrieben bewertet.
- Hefeklone mit dem in Beispiel V beschriebenen Expressionsplasmid wurden auf leu&supmin;-Selektionsagarplatten mit 1 M Sorbitol plattiert und 2-3 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Diese Hefen wurden in 5-7 ml-Kulturen von komplexen YEHDS überimpft, und die Kulturen wurden 12-18 Stunden lang bei 30ºC unter Belüften inkubiert. Kolben mit 50 ml YEHDS-Medium wurden aus den vorstehenden Kulturen (auf eine anfängliche A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,1) überimpft und wurden 48-72 Std. bei 30ºC unter Schütteln (350 U/min) bei einer endgültigen A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Proben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Röhrchen aliquotiert, und die Hefezellen wurden 10 min lang bei 2000xG pelletiert. Die Proben wurden entweder direkt wie in Beispiel IV beschrieben getestet oder bei -70ºC eingefroren aufbewahrt. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch Zentrifugation bei 2000xG während 10 min entfernt. Die geklärte Überstandsflüssigkeit wurde entfernt und mit einem für preS2+S spezifischen RIA wie vorstehend beschrieben auf Protein getestet.
- Fünf Klone wurden parallel untersucht und mit einem äquivalenten Zeilpellet aus Klon pF403 (siehe Beispiel IV oben) verglichen, der auf einen Wert von 1,0 zum Vergleich normalisiert wurde. Übliche relative Werte der Antigenproduktivität für die fünf Klone waren:
- (1) Ellis et al., (1987) In "Viral Hepatitis and Liver Disease" A. Zuckerman (Hrsg.), New York: Alan R. Liss Inc. S. 1079, und Kniskern et al., (1988) Hepatology, 8 82-87.
- Immunoblot-Analyse, die mit Kaninchen-anti-HBs oder McAb gegen die preS2-Domäne entwickelt wurde, ergab eine einzelne Hauptspezies mit einem Molekulargewicht von ca. 34 kD. Klon "a" oben, nachstehend als Klon 14007-230-1A bezeichnet, wurde für die weitere Entwicklung selektiert.
- Hefeklone mit dem in Beispiel VI beschriebenen Expressionsplasmid wurden auf leu&supmin;-Selektions-Agarplatten mit 1 M Sorbitol plattiert und 2-3 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Diese Hefen wurden in 5-7 ml YEHDS-Medium überimpft, und die Kulturen wurden 12-18 Stunden lang bei 30ºC unter Belüften inkubiert. Kolben mit 50 ml komplexem YEHDS-Medium wurden aus den vorstehenden Kulturen (auf eine anfängliche A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,1) überimpft und wurden 48-72 Std. bei 30ºC unter Schütteln (350 U/min) auf eine endgültige A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Dreifachproben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Röhrchen aliquotiert, und die Hefezellen wurden 10 min lang bei 2000xG pelletiert. Die Proben wurden entweder direkt wie vorstehend beschrieben getestet oder bei -70ºC eingefroren aufbewahrt. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch Zentrifugation bei 2000xG während 10 min entfernt. Die geklärte Überstandsflüssigkeit wurde entfernt und auf Protein und preS2+S-Antigen wie vorstehend beschrieben getestet.
- Fünf Klone wurden parallel untersucht und mit Klon pF403 (siehe Beispiel IV oben) verglichen, der auf einen Wert von 1,0 zum Vergleich normalisiert wurde. Übliche relative Werte der Antigenproduktivität für die fünf Klone waren:
- * Siehe Beispiel VII
- Die Immunoblot-Analyse (siehe Beispiel VII) ergab eine einzelne Hauptbande mit einem Molekulargewicht von ca. 34 kD. Klon "a" oben, nachstehend als Klon 14007-284-1A bezeichnet, wurde für die weitere Entwicklung selektiert.
- Die gefrorene Stammkultur 14007-230-1A (Beispiel VII oben) wurde auf leu&supmin;-Platten mit 1 M Sorbitol überimpft. Die Platten wurden 2-3 Tage lang umgedreht bei 28ºC inkubiert. Impfkulturen wurden entweder wie in Beispiel VII oben beschrieben angelegt, oder die Zucht auf den Platten wurde in YEHDS-Medium resuspendiert, und die resuspendierte Zucht wurde in einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben mit 500 ml YEHDS überführt. Der Kolben wurde bei 28ºC und 350 U/min in einen Schüttelinkubator mit kontrollierter Umgebung 18-22 Std. lang inkubiert.
- Impfmaterial (5%(v/v)) aus dem Zuchtkolben wurde in einen 250ml- oder einen 21-Kolben mit 50 ml bzw. 500 ml YEHDS überführt. Die Produktionskolben wurden dann wie oben beschrieben 40-46 Stunden lang inkubiert. Gewöhnlich wurde eine optische Dichte von 8,0 A660-Einheiten erhalten. Die Zellen aus den Kolben wurden durch Zentrifugation der Kolbeninhalte in 500 ml-Zentrifugenbechern während 10 min bei 1300xg geerntet. Der Überstand wurde dekantiert, und das Zeilpellet wurde in 50-100 ml einer gepufferten Salzlösung resuspendiert.
- Aliquote (0,6 ml) 20%iger Aufschlämmungen gewaschener Zellen wurden mit Glasperlen (0,45-0,52 mm) in 1,5-ml- Eppendorf-Röhrchen aufgebrochen. PMSF (6,5 ml 200 mM Stammlösung) wurde als Proteaseinhibitor hinzugegeben. Nach dem Aufbrechen wurden Aliquote aus den Röhrchen entfernt und für Immunoblot-Analyse bei -70ºC eingefroren. Triton X-100 wurde zu der restlichen Probe in die Röhrchen auf eine Endkonzentration von 0,5% hinzugegeben, die Proben wurden kurz gemischt und 20-40 min lang bei 4ºC inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt, und der geklärte Zellextrakt auf preS-RIA und Lowry-Protein untersucht.
- Ein gewöhnlicher erhaltener Wert betrug 15,65 mg preS2+S/ml Gärungsbrühe und 0,04 mg preS2+S/mg Gesamt-Protein.
- Die gefrorene 14007-230-1A-Stammkultur wurde auf leu&supmin;- Platten mit 1 M Sorbitol überimpft. Die Platten wurden 2-3 Tage lang bei 28ºC umgekehrt inkubiert. Die Zucht auf den Platten wurde in YEHDS resuspendiert, und die resuspendierte Zucht wurde in einen 21-Erlenmeyerkolben mit 500 ml YEHDS überführt. Der Kolben wurde 18-22 Std. lang bei 28ºC und 350 U/min in einem Schüttelinkubator bei kontrollierter Umgebung inkubiert. Diese Impfkulturen wurden dann verwendet, um die Gefäße des Produktionsstadiums zu beimpfen.
- Impfmaterial (1-5% (v/v)) aus einem oder mehr Kolben wurde in 16l- oder 250l-Fermenter mit 10l bzw. 200 l YEHDS überführt. Die 16l-Fermenter wurden bei 500 U/min, 5 l Luft/min und 28ºC betrieben. Die 250 l-Fermenter wurden bei 160U/min, 60 l Luft/min und 28ºC betrieben. Die Fermenter wurden 40-46 Stunden nach dem Animpfen mit der Impfkultur gerntet. Es wurden gewöhnlich optische Dichtewerte von 15,0 A&sub6;&sub6;&sub0;-Einheiten erhalten. Das Ernten bestand aus der Einengung der Zellen mit einer Hohlfaser-Filtervorrichtung und anschließendem Waschen der Zellen in gepufferten Salzlösungen. Zellaufschlämmungen wurden wie unten beschrieben getestet oder für weitere Verarbeitung und Analyse bei -70ºC gefroren aufbewahrt.
- Kleine Proben (0,6 ml) aus 20%igen Aufschlämmungen gewaschener Zellen wurden mit Glasperlen (0,45-0,52 mm) in 1,5-ml-Eppendorfröhrchen aufgebrochen. PMSF (6,5 ml 200 mM Stammlösung) wurde als ein Proteaseinhibitor zugegeben. Aliquote wurden nach dem Aufbrechen aus den Röhrchen entfernt und für Immunoblot-Analyse bei -70ºC eingefroren. Zu der restlichen Probe in den Röhrchen wurde Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 0,5% gegeben. Die Proben wurden kurz gemischt und 20-40 Minuten lang bei 4ºC inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt, und der geklärte Zellextrakt wurde auf pres-RIA und Lowry-Protein untersucht. Ein Durchschnittswert für die Antigenproduktivität war 8,4 mg preS2+S/ml Gärungsbrühe und 0,025 mg preS2+S Protein/mg Gesamtprotein.
- Etwa 250 g gefrorene Zellpaste (die rekombinantes S- Protein erzeugt) wurde auf 17% Feuchtgewicht/Volumen (ca. 1500 ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert. Die Zellen wurden auf 45ºC durch Eintauchen in ein Wasserbad erhitzt. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei 45ºC gehalten, und dann auf Eis auf etwa 10ºC gekühlt. Die Zellen wurden dann durch zwei Durchgänge durch einen Gaulin-Homogenisator aufgebrochen.
- Nach der Homogenisierung wurde 10%iges Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 0,3% gegeben und etwa 15 Minuten lang gemischt. Der Zellextrakt wurde dann bei 3600xg 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt.
- Der Überstand wurde dann über eine Säule mit etwa 200 g XAD-2-Harz geleitet, um das Triton X-100 zu entfernen. Das Eluat wurde dann direkt über eine Säule mit etwa 150g weitporigem Silica mit einer Porengröße von etwa 150 nm (1500 Å) und einer Partikelgröße von etwa 50 Mikrometer geleitet. Die verwendeten Säulen besaßen 5 cm Durchmesser (Pharmacia) und wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 200 ml pro Stunde betrieben.
- Die Silicasäule wurde mit PBS gewaschen bis die A&sub2;&sub8;&sub0; wieder den Grundwert erreicht hatte.
- Das S-Protein wurde aus der Silica-Säule eluiert, indem zuerst kalter Boratpuffer (50 mM, pH-Wert 8,7, 4ºC) bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 500 ml pro Std. verwendet wurde, bis ein Anstieg der A&sub2;&sub8;&sub0; beobachtet wurde. Sobald die A&sub2;&sub8;&sub0; anstieg, wurde die Säule auf 55ºC erhitzt. Borat-Puffer mit 55ºC wurde durch die Säule bei etwa 500 ml pro Std. geleitet. Das Eluat mit dem S-Protein (etwa 1 l) wurde auf Eis gesammelt. Das Eluat wurde dann auf etwa 200 ml durch Diafiltraton gegen 50 mM Borat-Puffer bei pH-Wert 8,7 eingeengt, unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 10&sup5;. Das S-Protein wurde dann durch einen 0,2 Mikrometer-Filter filtriert und aufbewahrt. Es stellte sich heraus, daß das Produkt stabil war, ohne daß in der Western-Blot-Analyse ein beträchtlicher Abbau beobachtet wurde.
Claims (5)
1. Verfahren zum wesentlichen Reinigen rekombinanter
Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine aus einem rekombinanten
Wirtszellextrakt, umfassend die Schritte:
a) Erhitzen der Wirtszellen in einem Puffer mit einem
neutralen pH-Wert auf zwischen etwa 40ºC und 50ºC, gefolgt von
Kühlen auf etwa Umgebungstemperatur;
b) Aufbrechen der hitzebehandelten Zellen (a), wobei ein
Rohextrakt erhalten wird;
c) Zugeben von Detergens zu dem Produkt aus Schritt (b);
d) Entfernen unerwünschter Wirtszelltrümmer durch
Zentrifugation oder Mikrofiltration;
e) Einengen und Ultrafiltration des Produktes aus
Schritt (d);
f) Entfernen des Detergens von dem Produkt aus
Schritt (e);
g) Behandeln des Produktes aus Schritt (f) mit
weitporigem Silica, um Oberflächenprotein zu adsorbieren;
h) Eluieren von Oberflächenprotein von dem weitporigen
Silica;
i) Einengen des Eluates aus Schritt (h), wobei im
wesentlichen gereinigtes Oberflächenprotein erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Produkt aus
Schritt (d) durch eine mit einem Hohlfaser-Diafiltrationsgerät
mit einem Nennretentionsmolekulargewicht von etwa 100000
durchgeführte Diafiltration eingengt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, Schritt (g), wobei die
Silicaadsorption unter Verwendung eines weitporigen Silicas mit
einem Porengrößenbereich von etwa 100 bis 150 Nanometer (1000
bis 1500 Å) und einem Silicateilchengrößenbereich von etwa 30
bis 130 Mikrometer durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (i) durch eine
Diafiltration mit einem Hohlfaser-Diafiltrationsgerät mit
einem Nennretentionsmolekulargewicht von etwa 100000
durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante
Wirtszelle eine Hefeart ist.
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