DE3787445T2

DE3787445T2 - Verfahren zur Isolierung von langkettiger Nukleinsäure.

Info

Publication number: DE3787445T2
Application number: DE3787445T
Authority: DE
Inventors: Metin Dr Colpan; Karsten Dr Henco; Arndt Stichel
Original assignee: DIAGEN INST MOLEKULARBIO
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1986-11-22
Filing date: 1987-11-12
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2007-11-13
Also published as: EP0268946A3; CA1339772C; DE3639949A1; EP0268946A2; JPH0713077B2; JPS63150294A; ATE94553T1; US5057426A; EP0268946B1; DE3787445D1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Trennung von langkettigen Nucleinsäuren von anderen Substanzen aus Nucleinsäuren und andere Stoffe enthaltenden Lösungen, insbesondere Nucleinsäuren/Proteinmischungen aus biotechnologischer Herstellung, aus Bakterien, Viren, tierischen und pflanzlichen Geweben und Zellen, insbesondere Zellinhaltsstoffen und/oder deren Abbauprodukten sowie Bestandteilen der Körperflüssigkeiten, die nicht langkettige Nucleinsäuren sind, sowie die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Die Nucleinsäure-Präparation aus natürlichen Quellen, insbesondere aus Viren, bakteriellen oder eukaryontischen Zellen, Zellverbänden oder Geweben sowie Körperflüssigkeiten ist eine Schlüsseltechnik für verschiedenste präparative und analytische Problemlösungen in der Biologie und Medizin. Einige wichtige Anwendungen seien im folgenden exemplarisch genannt:
Die Molekularbiologie bedient sich replikationsfähiger Vehikel für DNA-Fragmente, zu denen Plasmide, Phagen, Viren usw. gehören. Um die DNA- oder RNA-prozessierenden Enzyme anwenden zu können, bedarf es zunächst einer hochgereinigten DNA oder RNA. Ähnliches gilt für die genetische Analytik von beispielsweise Viren aus Gewebeflüssigkeiten oder genomischer DNA aus Gewebe. Da zum spezifischen Nachweis bestimmter Charakteristika von Nucleinsäuren wie zum Beispiel Restriktionspolymorphismen diese Nucleinsäuren vor der Analyse einem enzymatischen Abbau unterworfen werden, müssen sie in einer solchen Reinheit vorliegen, daß diese Methoden des enzymatischen Abbaus durchführbar sind. Die bislang bekannten Verfahren erlauben es nicht, aus so unterschiedlichen Ausgangsmaterialien wie Nucleinsäuren und andere Stoffe enthaltenden Lösungen, insbesondere Nucleinsäuren/Proteinmischungen aus biotechnologischer Herstellung, Gewebe, Blut, Sputum, Zellkulturen, Bakterien, Pilzen, renalen und fäkalen Exkrementen die DNA/RNA nach ähnlichen und einfachen Arbeitsanweisungen zu extrahieren und zu konzentrieren.
Die Probleme werden deutlicher, wenn man an die Virusdiagnostik, zum Beispiel Hepatitis B-DNA-Nachweis in Blut und Leberbiopsien, die Individualzuordnung in der Kriminalistik, der forensischen Medizin oder der Vaterschaftsanalyse denkt, wobei zur Analyse zelluläre Nucleinsäuren aus sehr unterschiedlichen Quellen wie Spermien, Gewebe (frisch, verkohlt, gefroren, eingetrocknet usw.) erhalten werden müssen für die technisch vergleichbare Art der Folgeanalyse.
Die bisher bekannten Verfahren zur Reinigung langkettiger Nucleinsäuren verlangen längere Zentrifugationsschritte oder wäßrige Phenol/Zweiphasenextraktionen. Solche Verfahren sind sehr personal- und kostenintensiv und außerdem zu aufwendig, um sie im automatisierten Betrieb einfach zu realisieren. Die bekannten und gebräuchlichen Reinigungsverfahren benötigen zudem kostspielige Geräte, etwa Kühlzentrifugen und Ultrazentrifugen, die überdies noch wertvolles Material wie Cäsiumchlorid für Dichtegradienten-Zentrifugation oder Rotoreinsätze für den Einmalgebrauch verbrauchen.
Ein Verfahren, das in EP-A-0 104 210 beschrieben ist und auf dem Einsatz von HPLC-Geräten basiert, eignet sich zwar zur chromatographischen Trennung von Nucleinsäuren, jedoch werden langkettige Nucleinsäuren wie zum Beispiel γ-Phagen-DNA durch mechanische Einwirkung beschädigt.
In Journal of Chromatography Library. Vol 31 ist in "Gradient Elution in Column Liquid Chromatography, Theory and Practice", P. Jandera und J. Churacek (S. 383), offenbart, daß die Chromatographie auf Hydroxylapatit- und Polyaminosäure/Diatomeenerde-Säulen die beste Methode zur DNA-Abtrennung von RNA und höheren Oligonucleotiden zur Entfernung von Proteinen und zur Trennung nativer und denaturierter DNA ist. Die Chromatographie auf Anionenaustauschersäulen führt jedoch zur Fraktionierung in viele Peaks, die gewöhnlich nicht alle vollständig charakterisiert sind. Für die Elution werden stufenweise oder kontinuierliche Natriumchlorid-Gradienten in einem geeigneten Puffer verwendet. Auch ein Harnstoff- Gradient kann verwendet werden. Erwähnt wird auch, daß Anionenaustauscher, die allerdings an einen Kieselgel-Träger gebunden sind, mit einer Teilchengröße von 10 um getestet wurden und eine schnellere Analyse ergeben.
Kato et al. beschreiben und offenbaren in Journal of Chromatography 266 (1983) 385-394, die Hochleistungsanionenaustauschchromatographie von Proteinen mit Säulenmaterialien auf Siliciumdioxid-Basis mit einem Porendurchmesser von 250-300 Å, die auch zur Trennung von Nucleinsäuren geeignet sind. Die Teilchengröße des offenbarten Säulenmaterials ist 10 um. Dies bedeutet, daß lediglich Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Anwendungen offenbart sind. Als Nucleinsäuren werden tRNA, rRNA unterschiedlicher Größe sowie DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe bis zu 590 Basenpaaren getrennt.
Riesner et al., Journal of Chromatography 296, 339-353 (1984), offenbaren die Trennung von Nucleinsäuren mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie durch Verwendung eines Materials mit einer Teilchengröße von 10 um. Dieses Zitat beschreibt auch die Elution von Nucleinsäuren über einen kontinuierlichen Salzgradienten.
Millard et al., Journal of Chromatography 107, 125-140 (1975), offenbaren die Chromatographie von Genom-DEAE-Cellulose. DEAE-Cellulose gehört zu den nichtporösen chromatographischen Materialien.
Cherayil et al. offenbaren in Biochemistry (1965), 1174-1183, die Trennung von sRNA auf DEAE-Cellulose und DEAE-Sephadex.
Diese Nucleinsäuren besitzen globuläre Strukturen. Die Materialien sind nicht in der Lage, langkettige Nucleinsäuren zu trennen, die eine starrere, stabähnliche Struktur aufweisen, wie beispielsweise Plasmide, λ- oder M13-Phagen und dergleichen.
Ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA wird in Patent Abstracts of Japan, Vol. 11, Nr. 13 (C-397) [2460] beschrieben. Eine cyclische doppelsträngige DNA, die RNA und andere DNA enthält, wird einer speziellen Gelfiltrationschromatographie unterzogen, um die rasche und wirtschaftliche Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA zu erreichen. Eine cyclische doppelsträngige DNA, die andere Komponenten enthält, wird vorher mit Ribonuclease behandelt, um einen Teil der RNA zu spalten, wird dann einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen unter Verwendung eines kugelförmigen, hydrophilen, halbstarren Vinylpolymer-Gels, das an seinen Seitenketten Hydroxyl-Gruppen und Ether-Gruppen aufweist und in wäßrigen Lösungen quillt, mit einem mittleren Porendurchmesser von mehr als 1000 Å und einer mittleren Teilchengröße von weniger als 100 um, wobei als Elutionsmittel eine wäßrige Lösung mit einem pH von 7,0-8,5 verwendet wird, enthaltend 2-500 mM Tris-hydrochlorid, 1-50 mM EDTA und 10-1000 mM NaCl, um eine Plasmid-DNA mit 3-12 kbp abzutrennen und zu reinigen.
EP-A-0 240 191 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von DNA, die in einem Virus oder einer Zelle enthalten ist, umfassend die Schritte: Isolieren des Virus oder der Zelle mit Satelliten-DNA; Umsetzen eines Protein-Zersetzungsmittels mit dem Virus oder der Zelle, um DNA-bedeckendes Protein zu zerstören oder zu denaturieren; Zusetzen von wenigstens dem doppelten Volumen Alkohol zur Reaktionsmischung für die Ausfällung der DNA; Zuführen einer im vorherigen Schritt erhaltenen alkoholhaltigen Lösung in eine Trennsäule, um die ausgefallene DNA zurückzuhalten; Durchleiten einer wäßrigen Alkohollösung mit hoher Alkoholkonzentration durch die Säule zur Entfernung von Verunreinigungen; und Durchleiten einer wäßrigen Alkohollösung mit niedriger Alkoholkonzentration oder einer alkoholfreien wäßrigen Lösung durch die Säule, um die DNA zu eluieren.
Aus Bernardi, G. (1971), "Methods in Enzymology" (Grossman, L. & Moldave, K., Hrsg.) Band 21, Seiten 95 bis 139, Academic Press, New York, ist ein Verfahren bekannt zur Abtrennung von Nucleinsäuren von Proteinen, niedermolekularen Substanzen und zellulären Bestandteilen wie etwa Oligo- und Polysacchariden durch chromatographische Reinigung an Hydroxylapatit (HAP). Dieses Verfahren wurde auch zur Reinigung von Plasmiden und X-Phagen-DNA eingesetzt (siehe Colman, A. et al, 1978, Eur.J. Biochem. 91, 303 bis 310; Shoyab, M. & Sen, A., 1978, J.Biol. Chem. 253, 6654 bis 6656; und Johnson, T.R. & Ilan, J., 1983, Anal.Biochem. 132, 20 bis 25). Das Verfahren ist jedoch nicht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vergleichbar. So ist beispielsweise der Trennwirkungsgrad in mg Nucleinsäure pro g Trenngel mit ca. 1 mg/l g im erfindungsgemäßen Verfahren etwa 100mal höher als beim HAP-Verfahren. Die Trennung auf HAP ergibt für langkettige Nucleinsäuren hohe Ausbeuteverluste, insbesondere bei zellulärer DNA, und erfordert hohe Phosphat- und Harnstoff-Konzentrationen im Elutionspuffer, was sich bei der Weiterverarbeitung der aufgetrennten langkettigen DNA negativ auswirkt. Die bekannten Gelpermeationsverfahren sind nicht in der Lage, hochmolekulare Nucleinsäuren von anderen hochmolekularen Substanzen wie Proteinen und Polysacchariden zu trennen, da diese Materialien lediglich nach Größe und Form selektieren.
Für die direkte Hybridisierungsreaktion ist gewöhnlich die Produktreinheit, die nach bekannten Verfahren erzielt wird, hinreichend. Für eine Anzahl von Nachweisproblemen ist die Konzentration der gereinigten, langkettigen Nucleinsäure jedoch zu gering, als daß ein direkter Hybridisierungsnachweis möglich wäre.
Als Beispiele seien genannt die Analyse von AIDS-Virus- Nucleinsäuren in stark unterrepräsentierten infizierten Zellen einer Lymphknotenbiopsie oder der Nachweis eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) in einer kleinen Menge Zellen, die bei einer Amniozentese oder Chorionbiopsie anfallen.
Sollen spezifische Nucleinsäuresequenzen enzymatisch amplifiziert werden, so muß die zu amplifizierende Nucleinsäure in einer Reinheit vorliegen, daß Enzyme wie etwa Polymerasen nicht inhibiert werden (Saiki, R.K. et al., 1985, Science 230, 1350 bis 1354). Ein essentieller Reinigungsschritt der bekannten Verfahren ist der Einsatz einer phenolischen Extraktion, um effizient die Entfernung von Proteinen und organischen Agenzien, die Enzyme hemmen können, zu erreichen. Phenol ist jedoch ein starkes Haut- und Lebergift und sollte nur unter strengen Sicherheitsvorkehrungen und von gut geschultem Personal verarbeitet werden. Zudem sind Flüssigextraktionen zeit- und personalintensiv.
Bisher konnten nur in Forschungslaboratorien derartige Reinigungen von langkettigen Nucleinsäuren, insbesondere innerhalb der Molekularbiologie, durchgeführt werden, da die bekannten Verfahren zeitraubend, instrumentations- und kostenintensiv und aufgrund der verwendeten Chemikalien wie Phenol überdies gesundheitsschädlich sind. Eine typische Arbeitsanleitung läßt sich in folgende Schritte aufteilen:
a) Aufschluß der Zellen oder Gewebe oder Körperflüssigkeiten, der mittels einer Reihe von Verfahren wie mechanische Verfahren (zum Beispiel Mahlen) in Kombination mit physikalischen Verfahren (zum Beispiel Koch-Verfahren - "boiling procedure"), mit enzymatischen Verfahren (zum Beispiel mit Proteinase K, Lysozym etc.) und mit chemischen Verfahren (zum Beispiel Natronlauge, Diethylpyrocarbonat) geschehen kann und der den Zellinhalte für weitere Enzyme und Reagenzien zugänglich macht;
b) grobe Klärung der Lösung von Zelltrümmern mittels Zentrifuge;
c) Schritte zur Protein-Entfernung und erste Anreicherung der Nucleinsäure, gewöhnlich unter Zuhilfenahme eines Zweiphasensystems, bestehend aus phenolischer Phase/wäßriger Phase; und
d) Hochreinigungstechniken wie etwa Ultrazentrifugieren.
Den bekannten Verfahren zur Reinigung langkettiger Nucleinsäuren (> 20 kB Molekulargewicht > 13 Millionen Dalton) ist gemeinsam, daß sie sich nur schwer rationalisieren lassen, falls die Nucleinsäure-Präparationen routinemäßig durchgeführt werden sollen. Dieser Zustand ist beispielsweise gegeben in Laboratorien der Molekularbiologie, die ständig hochreine Plasmide oder Phagen-DNA bereitstellen müssen.
In der medizinischen Diagnostik besteht dringender Bedarf, neue Aussagen durch die Analyse genetischen Materials zu erhalten. Erwähnt sei das Problem der Hepatitis-Diagnostik, wobei nur der direkte Virusnachweis Aufschluß über eine Infektiosität erlaubt, oder der genetische Nachweis einer genetisch bedingten Profeindeffizienz, zum Beispiel einer Thalassämie. Die Aufarbeitung des zu analysierenden Materials (DNA oder RNA), insbesondere bei großen Probenzahlen, erweist sich als entscheidendes Hindernis auf dem Weg zu einer Diagnostik auf genetischer Basis, wenn sie den bekannten serologischen Verfahren in ihrer massenmäßigen Anwendbarkeit gleichkommen soll.
Die Bedeutung einer automatisierten Nucleinsäureaufarbeitung ist außerordentlich groß. Diese Verfahrensweise ist die Voraussetzung für eine allgemein anwendbare Diagnostik auf genetischer Grundlage, die in ihrer Bedeutung den verbreiteten serologischen Diagnosemethoden entsprechen könnte. Beide Verfahren decken Bereiche ab, deren Aussagen sich in komplementärer Weise ergänzen.
Während in der Immunologie qualitativ und quantitativ die Zell- oder Virusprodukte bestimmt werden können, findet bei der genomischen Analyse die Diagnose auf der Ebene des Informationsspeichers der Nucleinsäure statt.
Die Gentechnologie ermöglicht eine extrem hochauflösende Diagnostik aufgrund der Tatsache, daß nahezu jeder einzelne Baustein der bis zu Milliarden Bausteine umfassenden Erbspeicher geprüft werden kann. Die Verfahrensweise erlaubt, die An- oder Abwesenheit infektiösen Erbmaterials, beispielsweise eines AIDS-Erregers, zu bestimmen oder genetische Erkrankungen zu erkennen, etwa Muskeldystrophie, ohne daß Genprodukte in Form von beispielsweise Protein/Antigenen exprimiert werden müssen oder das Fehlen derselben festgestellt werden muß.
Weiterhin ermöglicht die Biotechnologie, insbesondere die Gentechnologie, die Herstellung von Produkten mittels transformierter Mikroorganismen. Dabei taucht jedoch ein sehr schwerwiegendes Problem dadurch auf, daß nicht ausgeschlossen werden kann, daß potentiell schädliche Erbinformationen bei Verwendung biotechnologisch hergestellter Produkte in die Zellen bzw. in die Erbinformation des Verbrauchers übernommen werden und dort zur Transformation, Infektion, Antibiotika- Resistenz etc. führen.
Das Problem wiegt umso schwerer, als neuerdings vermehrt homologe transformierte Zellsysteme eingesetzt werden anstelle von Organismen wie E. coli oder Hefe, so z. B. Hamster-Ovarzellen, menschliche Fibroblasten, Krebszellen etc. Hierbei wird das Ziel verfolgt, möglichst humanidentische Proteinprodukte zu erzeugen, die in Konformation und vor allem Modifikation, etwa Glykosylierung und anderen posttranslatorischen Modifikationen den menschlichen Proteinen gleichen.
Gleichzeitig erhöht sich damit jedoch die Gefahr einer möglichen Transformation menschlicher Zellen des Patienten durch homologe DNA-Sequenzen oder adaptierte Vektorsysteme mit ihren Eigenschaften wie Selbstreproduzierbarkeit, Resistenzverhalten, Präsenz starker Promotoren, Enhancer-Elemente, onkogener Information sowie "gene dosis"-Effekte. Auch für Erbinformation aus E. coli, Hefe, B. subtilis etc. sind solche Befürchtungen geäußert worden. Es besteht also die Gefahr, daß Präparate Nucleinsäure enthalten, die entweder direkt pathogen wirkt, etwa im Falle bestimmter Viren und onkogener DNA, oder die indirekt krebsauslösend wirken kann, indem sie in die Empfänger-DNA integriert wird und dabei Mutationen auslöst. Es ist daher wünschenswert, daß sämtliche therapeutischen Produkte möglichst frei von Nucleinsäuren sind. So empfiehlt die amerikanische Gesundheitsbehörde (FDA) zur Zeit, daß nicht mehr als 1 bis 10 pg DNA/Tagesdosis verabreicht werden sollen.
Nach den Verfahren gemäß dem Stand der Technik fallen je nach Art des produzierenden Systems in den ersten Schritten der Reinigung biotechnologisch hergestellter Produkte unterschiedliche Mengen an Nucleinsäure an. Es sind lediglich Spuren an Nucleinsäure-Verunreinigung vorhanden, sobald die Zellen das synthetisierte Produkt kontinuierlich sezernieren, so daß nur ungewollt lysierte Zellen Nucleinsäuren nennenswert freisetzen. Es kann jedoch das gesamte Zelläquivalent an Nucleinsäuren als Verunreinigung auftreten, wenn die Wirtszellen nach Batch-Produktion zwecks Produktfreisetzung oder Abtötung komplett lysiert werden. In diesem Fall ist der erste Schritt häufig die Präzipitation der DNA/RNA durch Polykationen wie etwa Polyimin. Dieser Schritt führt jedoch nicht zur vollständigen Abtrennung der Substanzen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht also in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Abtrennung langkettiger Nucleinsäuren aus Gewebe und Körperflüssigkeiten, das
a) es in gleicher Weise erlaubt, aus unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien wie Gewebe, Blut, Sputum, Zellkulturen, Bakterien, Pilzen, renalen und fäkalen Exkrementen sowie pflanzlichem Gewebe aus Kalluskulturen, Wurzeln etc. die Nucleinsäuren in ähnlicher Weise zu extrahieren und zu konzentrieren,
b) keine längeren Zentrifugationsschritte, insbesondere Ultrazentrifugationen, verlangt,
c) ohne kostspielige Geräte, insbesondere ohne Kühlzentrifugen und Ultrazentrifugen, und ohne wertvolles Material wie Cäsiumchlorid für Dichtegradienten oder Rotoreinsätze für Einmalgebrauch durchgeführt werden kann,
d) eine hohe Reinheit der Nucleinsäure garantiert,
e) ohne Phenol-Extraktionsschritt arbeitet,
f) für die Automatisierung geeignet ist,
sowie Mischungen von langkettigen Nucleinsäuren und anderen Stoffen, wie sie bei biotechnologisch hergestellten Produkten anfallen, durch Extraktion der langkettigen Nucleinsäure trennt.
In der EP-A-0 104 210 ist ein Verfahren zur Auftrennung von Nucleinsäuren bis hin zur Plasmidgröße (< 10 000 Basenpaare 6 Millionen Dalton) beschrieben. Mit Hilfe des dort beschriebenen Materials, das sich dadurch auszeichnet, daß ein hochporöses Silicagel als Träger verwendet wird, das mit einer Anionenaustauscherbeschichtung versehen ist und in der HPLC-Chromatographie eingesetzt wird, lassen sich zum Beispiel vorgereinigte Plasmide hochrein darstellen. Dennoch sind auch hier Zentrifugationsschritte und Präzipitationsschritte notwendig, die für eine Anwendung in der Massenanalyse bzw. -präparation nicht geeignet sind. Ein entscheidender Nachteil besteht darin, daß bei größeren Molekülen, zum Beispiel λ-Phagen-DNA, während der chromatographischen Trennung mit Teilchen < 10 um die Scherkräfte so groß werden, daß die Moleküle nicht mehr intakt isoliert werden können. Das trifft umso mehr auf zelluläre DNA mit vielfachen Längen im Vergleich zu λ-Phagen-DNA zu.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur Trennung langkettiger Nucleinsäuren von anderen Substanzen aus Lösungen, die Nucleinsäuren und andere Stoffe enthalten, unter Vermeidung des Schrittes einer Chloroformund/oder Phenol-Extraktion und/oder einer Dichtegradientenzentrifugation, wobei die langkettigen Nucleinsäuren an einem porösen Anionenaustauscher fixiert werden und der Anionenaustauscher eine Teilchengröße von 15 bis 250 um und einen Porendurchmesser von 50 bis 2500 nm aufweist,
während die davon zu trennenden Substanzen aus dem Anionenaustauschermaterial ausgewaschen werden mittels einer Waschlösung mit einer Ionenstärke, die unterhalb des Elutionspunkts der abzutrennenden langkettigen Nucleinsäuren liegt, und die fixierten Nucleinsäuren anschließend vom Anionenaustauscher mittels einer Waschlösung hoher Ionenstärke abgetrennt werden.
Der poröse Anionenaustauscher besteht vorzugsweise aus einem Chromatographiematerial auf der Basis von Silicagel, Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der obengenannten Trägermaterialien, deren Oberflächen mit chemischen Gruppen modifiziert sind, die Anionenaustauscheraktivitäten zeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die poröse Matrix aus modifizierten Silicagel-Teilchen mit einer Teilchengröße von 15 bis 250 um, vorzugsweise 25 bis 40 um. Die Poren weisen Durchmesser von 100 bis 2500 nm, vorzugsweise ca. 400 nm auf. Die Modifizierung des Silicagels erfolgt vorzugsweise dadurch, daß das Trägermaterial mit einem Silanisierungsreagens zu einem Anionenaustauscher umgesetzt wird.
Wie in EP-A-0 104 210 offenbart, werden bei dieser Reaktion γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan und N,N-Dimethylaminoethanol als Reganzien eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht dabei unter anderem den Verzicht auf phenolische Extraktion des zu untersuchenden Aufschlusses zur Reinigung der langkettigen Nucleinsäuren von störenden Bestandteilen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren müssen hydrophile Oberflächen verwendet werden, da Nucleinsäuren, insbesondere langkettige Nucleinsäuren dahin tendieren, starke Wechselwirkungen mit der Matrix einzugehen, wenn Salzlösungen hoher Ionenstärke verwendet werden. Die starken hydrophoben Wechselwirkungen können zu Kontaminations- und Ausbeuteproblemen führen.
Die schonende enzymatische Proteolyse kann entweder allein oder auch in Kombination unter Anwendung mechanischer Mittel erfolgen. Es steht eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, nämlich mechanische Verfahren (zum Beispiel Mahlen) in Kombination mit physikalischen Verfahren (zum Beispiel Koch- Verfahren - "boiling procedure"), enzymatische Verfahren (zum Beispiel mit Proteinase K, Lysozym etc.) und chemische Verfahren (zum Beispiel mit Natronlauge, Diethylpyrocarbonat).
Diese Verfahren lassen sich entweder allein oder in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Extraktion langkettiger Nucleinsäuren einsetzen. Einige dieser bekannten Verfahren [T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook (CSH), 1982, "Molecular cloning" (C.S.H.)] verwenden Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Sarcosyl als Detergens bzw. solubilisierendes und proteindenaturierendes Agens. In Anwesenheit von mehr als 0,1% SDS (bevorzugt verwendet werden 0,1 bis 2%) wird die Bindung von DNA/RNA an die die polykationische Oberfläche des Trägers beeinflußt und stark herabgesetzt. Ist SDS für den Aufschluß unvermeidlich, dann muß die wäßrige Phase mit Phenol und/oder Chloroform versetzt werden, d. h. eine Flüssig/Flüssig-Extraktion ist notwendig, um das SDS zu entfernen. Eine Alternative besteht in einem dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschalteten Festphasenextraktionsschritt mittels hydrophob beschichteter Träger (Reversed-Phase-Trägern).
Die von den langkettigen Nucleinsäuren abzutrennenden Substanzen werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch gründliches Auswaschen mittels einer Waschlösung niedriger Ionenstärke entfernt. Das gebildete Eluat ist praktisch frei von langkettigen Nucleinsäuren. Besonders vorteilhaft ist dies bei der Entfernung von langkettigen Nucleinsäuren aus biotechnologisch herstellten Produkten. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine mehr als 99%ige bis zu 100%ige Trennung der langkettigen Nucleinsäuren von Nucleinsäure/- Protein-Mischungen.
Der bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte poröse Anionenaustauscher erfüllt insbesondere die folgenden Kriterien, die es besonders vorteilhaft für die Entfernung von langkettigen Nucleinsäuren aus Nucleinsäureproteingemischen machen:
1. hohe Affinität zu langkettigen Nucleinsäuren;
2. niedrige Affinität zu anderen Stoffen, insbesondere zu Proteinen;
3. keine unspezifischen Wechselwirkungen mit anderen Stoffen wie mit Proteinen;
4. keine unspezifische Retention von anderen Stoffen, insbesondere Proteinen infolge physikalisch bedingter Einschlüsse (enge Poren);
5. Sterilisierbarkeit;
6. geringes Ausbluten der porösen Matrix;
7. keine toxischen Abbauprodukte der porösen Matrix;
8. hohe Kapazität der porösen Matrix für Nucleinsäuren;
9. Regenerierbarkeit;
10. Physiologische Elutionsbedingungen; sowie
11. hohe Prozeßflußgeschwindigkeit.
Die Abtrennung der langkettigen Nucleinsäure von der Matrix geschieht durch Spülen des porösen Anionenaustauschers mit einer Lösung hoher Ionenstärke (Salzkonzentration).
Bei der Reinigung von Plasmid-DNA, zum Beispiel aus rekombinanten E. coli-Bakterien, können unterschiedliche Aufschlußverfahren für die Wirtszellen verwendet werden. All diese Verfahren führen nach einer Zentrifugation bei ca. 12 000 g zu dem sogenannten klaren Lysat, einem von Zellbruchstücken und der chromosomalen DNA weitgehend befreiten klaren Überstand, der Plasmid-DNA, RNA, Proteine und andere lösliche Bestandteile enthält. Es seien genannt das Lysozym/Tritonbzw. SDS-Verfahren (siehe Maniatis et al.), das NaOH/SDS- Verfahren (Birnboim, H.C. & Doly, I., 1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513 bis 1523; Ish-Horowicz, D. & Burke, J.F., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2989 bis 2998), das Phenol-Verfahren (Klein, R.D. et al., 1980, Plasmid, 3, 88 bis 91) und das "Boiling"- Verfahren (Holmes, D.S. & Quigley, M., 1981, Anal.Biochem. 114, 193 bis 197).
Die klaren Lysate können, sofern sie keine nennenswerten Mengen (≤ 0,01%) an ionischen Detergentien wie SDS enthalten, direkt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden, wobei durch die Wahl der geeigneten Ionenstärkebedingungen (vorzugsweise 0,5 bis 0,7 M) über Adsorption an den porösen Anionenaustauscher zum Beispiel Proteine, Lipide, RNA und kleinere Moleküle von langkettiger DNA, insbesondere DNA von Plasmiden, abgetrennt werden, wobei letztere an das Trägermaterial gebunden wird. Durch Zusatz von Harnstoff im Auftragspuffer wird das Bindungsverhalten der langkettigen DNA nicht beeinflußt, jedoch der Trennwirkungsgrad gegenüber Proteinen optimiert. Auf diese Weise kann die hohe Kapazität des Materials von ca. 1 ug Nucleinsäure pro 1 mg der porösen Matrix spezifisch für die DNA genutzt werden trotz des hohen molaren Überschusses an zellulärer RNA.
Unspezifisch gebundene RNA und Proteine werden durch Waschen mit Pufferlösungen geringer Ionenstärke in wenigen Waschschritten von der porösen Matrix entfernt. Die Elution findet anschließend durch Extraktion des porösen Anionenaustauschers mit Puffern hoher Ionenstärke statt.
Aufgrund des außergewöhnlich hohen Trennwirkungsgrads des erfindungsgemäßen Verfahrens zwischen RNA/Protein einerseits und langkettiger DNA andererseits ist eine sich üblicherweise anschließende RNase- und eventuell Proteinase-Behandlung nicht notwendig. Wenn das klare Lysat SDS-frei ist wie nach Kaliumacetat-Fällung oder wie es durch Lysozym/TritonX-100- Lyse erzeugt wird, kann nach Einstellung einer Ionenstärke von 0,5 bis 0,7 M das Lysat direkt über den porösen Anionenaustauscher geleitet werden, um langkettige Plasmide zu extrahieren. Anderenfalls können SDS und Proteine zuvor durch Phenolisierung und Vermischen mit Chloroform extrahiert werden, worauf sich die DNA-Extraktion durch das erfindungsgemäße Verfahren anschließt. Im Lysat gelöstes Phenol interferiert nicht mit dem Plasmid-Bindungsverhalten des porösen Anionenaustauschers.
Ist das Volumen der Lysate sehr groß, empfiehlt sich zunächst eine DNA-Präzipitation durch Polyethylenglycol (PEG), Ethanol oder Isopropanol. Danach wird das Pellet in Tris-Puffer gelöst, die Lösung auf die gewünschte Ionenstärke eingestellt und über den porösen Anionenaustauscher geleitet. Dadurch wird die DNA aus der Lösung extrahiert, in nachfolgenden Waschvorgängen mit Puffern geringer Ionenstärke gewaschen und anschließend mit Tris-Puffer hoher Ionenstärke wieder extrahiert. Anschließend kann die DNA, wenn gewünscht, durch a) Dialyse, b) Präzipitation oder c) Gelpermeationschromatographie entsalzt werden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Plasmid- DNA zeigt mindestens ebenso gute Eigenschaften wie die mittels bekannten Reinigungsverfahren isolierte. Die Plasmid- DNA kann verarbeitet werden mit Restriktionsenzymen und DNA- Ligasen; des weiteren ist die DNA sequenzierbar und transfektierbar.
λ-Phagen sind häufig verwendete Transportvehikel für rekombinante Nucleinsäuren und werden für viele Anwendungen den Plasmidvektoren vorgezogen, da sie
a) nach Proteineinkapselung (invitro-packaging) sehr effizient Fremd-DNA in Zellen einschleusen und sich so zur Errichtung umfangreicher Genbänke eignen;
b) sowohl kleine als auch sehr große DNA-Fragmente aufnehmen können;
c) eine gute Lagerfähigkeit haben; und
d) leicht zu züchten sind.
Viele Klonierungsexperimente beginnen mit der Errichtung einer λ-Genbank, insbesondere einer statistisch errichteten Genbank. Da auf dieser Stufe nur ungenügend charakterisierte DNA eingesetzt wird, ist die Gewährleistung der biologischen Sicherheit oft problematisch. So müssen zum Beispiel bei der Klonierung onkogener Substanzen oder viraler Sequenzen (HTLV- III/LAV-1) Sicherheitsstämme und Sicherheitsphagen der biologischen Sicherheitsstufe 2 (B2) eingesetzt werden und unter hoher Laborsicherheit (L2 oder L3, ZKBS, Berlin, siehe V. überarbeitete Fassung für den Umgang mit neurekombinierter DNA) aufgearbeitet werden. Hierbei stellen Aufarbeitungsschritte wie Zentrifugationen, insbesondere aufwendige, langwierige und kostspielige Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugationen und das Ernten der Phagen Sicherheitsprobleme für Labor und Personal dar.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Reinigung von Phagen/Phagen-DNA unter Umgehung von Zentrifugationsschritten. Eine gewachsene bzw. lysierte Bakterienkultur kann gegebenenfalls vollständig in einer Sterilbank aufgearbeitet werden, um eine λ-DNA mit einer Reinheit zu ergeben, die die den Cäsiumchlorid-gereinigten Präparationen entspricht.
Auch einzelsträngige DNA, beispielsweise M13-Phagen-DNA, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigt werden. Aus Zell-Lysaten kann einzelsträngige DNA in hoher Ausbeute und Reinheit für Sequenzierungs- und Hybridisierungsexperimente eingesetzt werden. Nachdem die Phagen isoliert worden sind, wird die einzelsträngige DNA freigesetzt und am porösen Anionenaustauscher adsorbiert. Die störenden Bestandteile werden durch Waschen entfernt.
Zur Isolierung zellulärer DNA aus Gewebe unterschiedlichster Herkunft wird das Material nach bekannten Verfahren gespalten und aufgeschlossen. So wird nach einer mechanischen Homogenisierung, zum Beispiel unter Stickstoff, in einer Kugelmühle oder durch effizientes Zerquetschen und Scheren des Materials ein proteolytischer Aufschluß in Gegenwart denaturierender und/oder solubilisierender Agenzien angeschlossen. Proteinase K ist ein bevorzugtes Enzym für den proteolytischen Aufschluß, da es noch in Gegenwart von 1% SDS und EDTA effizient zur Lyse von Zellen und Zellkernen führt. Nach dem Stand der Technik müssen in zeitaufwendigen Flüssig/Flüssig- Extraktionen das SDS und die Proteine entfernt werden, und an diese Schritte schließt sich eine Dialyse und Präzipitation der DNA an. Diese Verfahrensweise ist aufwendig und nur schwer zu automatisieren. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es jedoch, langkettige DNA unter schonenden Bedingungen aus den obenerwähnten Probenmaterialien in Lösung zu bringen, die DNA unter Umgehung von Phenol-Extraktionsschritten an den porösen Anionenaustauscher zu fixieren, zu waschen und anschließend schonend in einem kleinen Volumina zu eluieren (0,5 bis 5 ml, vorzugsweise 1 bis 3 ml).
Infektionen mit Viren spielen eine wichtige Rolle in der Transfusions- und Transplantationsmedizin und generell bei immunsupprimierten Patienten. Beispielsweise kann eine akute CMV (Cytomegalievirus)-Infektion durch Analyse renaler Exkremente nachgewiesen werden. Nach dem Stand der Technik werden die Bakterien durch einen Filtrationsschritt oder lowspeed-Zentrifugationsschritt vom Urin abgetrennt und danach die Virus-DNA aus der Proteinhülle freigesetzt und durch gleichzeitig stattfindende Konzentrierung gereinigt. Hierfür sind nach dem Stand der Technik Ultrazentrifugen eingesetzt worden.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt den beschriebenen porösen Anionenaustauscher, indem CMV-Viren in situ nach Zusatz von Harnstoff, Detergenz und Puffer lysiert werden, wonach die DNA (130 bis 150·10&sup6; Dalton) freigesetzt wird. Durch Adsorption an den porösen Anionenaustauscher wird die DNA konzentriert und mit Pufferlösungen niedriger Ionenstärke gewaschen. Anschließend wird die DNA mit einem Puffer hoher Ionenstärke eluiert. Wenn sich der weiteren Analyse ein Dot- Blot-Verfahren anschließt, ist eine Entsalzung der DNA nicht erforderlich.
Die Verwendung eines porösen Anionenaustauscher, der aus einem Chromatographiematerial auf der Basis von Silicagel, Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der obengenannten Trägermaterialien besteht, vorzugsweise in oberflächlich modifizierter Form, deren Oberflächen vorzugsweise so modifiziert sind, daß die Matrix Anionenaustauscheraktivitäten aufweist, gewährleistet die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Teilchengröße der porösen Matrix auf Silicagel-Basis beträgt beispielsweise 15 bis 250 um, vorzugsweise 25 bis 40 um, und der Porendurchmesser 100 bis 2500 nm, vorzugsweise ca. 400 nm.
Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus einem Behälter, hergestellt aus einem Material, das den Einsatzbedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens widersteht. Der Behälter nimmt den porösen Anionenaustauscher auf und besitzt mindestens jeweils eine Einlaß- und Auslaßöffnung.
Abbildung 1 zeigt schematisch den Behälter für den porösen Anionenaustauscher gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, bestehend aus einer Kartusche 1, die vorzugsweise einen im wesentlichen zylindrischen Hohlkörper bildet und deren Seitenwände 2 aus einem Material bestehen, das den Einsatzbedingungen (Anwesenheit mehr oder weniger aggressiver Chemikalien und korrodierender Salze) widersteht. Vorzugsweise bestehen die Seitenwände 2 aus Kunststoff. Besonders einfach ist die Herstellung der Kartuschen unter Verwendung eines Schrumpfschlauches, beispielsweise aus Polytetrafluorethylen (PTFE).
Einlaß- 3 und Auslaßöffnung 4 werden durch Filter 5a und 5b begrenzt. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Filter aus hydrophilem Material wie Glas, hydrophilem Kunststoff oder Kunststoff, der mit hydrophilem Material beschichtet ist. Es können aber auch hydrophobe Materialien eingesetzt werden. Die Eintrittsöffnung 3 kann gewünschtenfalls so ausgestaltet werden, daß ein Luer-Lock-System 6 direkt an die Eintrittskanüle 7 anschließbar ist. Die Austrittsöffnung 4 besitzt in einer bevorzugten Ausführungsform einen innenliegenden Schlauch 8, vorzugsweise aus Silicon, der an das Filter 5b angeschlossen ist und vorzugsweise nicht über das Ende der Austrittskanüle 9 hinausragt. Das Kartuscheneluat wird durch einen Schlauch 10 abgeleitet, der vorzugsweise aus Kunststoff besteht, insbesondere aus hydrophilem Kunststoff. Trotzdem können auch hydrophobe Kunststoffe wie etwa PTFE eingesetzt werden. Der Behälter kann auch durch Spritzgießen hergestellt werden.
Abbildung 2 zeigt schematisch eine andere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Behälters, der vorzugsweise durch Spritzgießen hergestellt werden kann. Die Bezugsziffern haben folgende Bedeutungen:
1 Kartusche
2 Wandung
3 Einlaß
4 Auslaß
5a poröse Fritte
5b poröse Fritte
7 Einlaßschlauch
9 Auslaßschlauch
11 poröses Harz
Abbildung 3 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Behälters. Auch dieser Behälter kann durch Spritzgießen hergestellt werden. Die Bezugsziffern haben folgende Bedeutungen:
1 Kartusche
2 Wandung
3 Einlaß
4 Auslaß
5a poröse Fritte
5b poröse Fritte
6 Luer-Lock-Anschluß
7 Einlaßschlauch
9 Auslaßschlauch
11 poröses Harz
Das Lumen des Behälters für die poröse Matrix 11 ist abhängig vom Verwendungszweck. Üblicherweise beträgt das Innenvolumen bei analytischen Verfahren etwa 0,02 bis 5 cm³, vorzugsweise 0,1 bis 1 cm³. Sollen Lösungen, die Nucleinsäuren und andere Stoffe enthalten, im präparativen Maßstab gereinigt werden, können auch größer dimensionierte Behälter verwendet werden. Die poröse Matrix 11 besteht aus einem Anionenaustauscher auf Silicagel-Basis. Der Porendurchmesser des Materials beträgt 50 bis 2500 nm, vorzugsweise ca. 400 nm bei einer Teilchengröße von 15 bis 250 um, vorzugsweise 25 bis 40 um.
Das Gemisch von aufgeschlossenen Zellen aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten wird nach der schonenden Proteolyse, gegebenenfalls in Kombination mit mechanischen Mitteln, durch die Eintrittsöffnung in die Kartusche geführt und kommt mit dem porösen Anionenaustauscher in innige Berührung. Dabei entzieht die poröse Matrix dem Gemisch die langkettigen Nucleinsäuren, während die anderen Substanzen die Kartusche durch die Austrittsöffnung verlassen. Es ist dabei darauf zu achten, daß das Applikationsgemisch des aufgeschlossenen Materials eine niedrige Ionenstärke besitzt. Beispielsweise werden bei ca. 300 mM NaCl langkettige RNA und DNA adsorbiert, wogegen Proteine und niedermolekulare Substanzen nicht in nennenswertem Maße adsorbiert werden; bei Konzentrationen größer 500 mM NaCl binden nur noch langkettige Einzelstrang- DNA und Doppelstrang-DNA, während bei Salzkonzentrationen um 700 mM NaCl dann nur noch langkettige doppelsträngige DNA am porösen Anionenaustauscher adsorbiert wird.
Abbildung 4 zeigt die typischen Elutionsprofile bei der NaCl- Gradienten-Elution bei pH 7,0. Die Absorption verschiedener Substanzen bei 260 nm wird gegen die NaCl-Konzentration aufgetragen. Dieses beispielhafte Diagramm zeigt die sehr gute Trennung der Biomoleküle. Die gepunktete Fläche symbolisiert den Bereich, in dem Proteine, Polysaccharide, niedermolekulare Metaboliten und Farbstoffe aus dem Anionenaustauscher eluieren. Dies geschieht im Bereich von 0 bis 0,4 M NaCl. Bei 0,1 M eluieren zum Beispiel Nucleotide, während das Standardprotein BSA (Rinderserum-Albumin) bei einer NaCl-Konzentration von 0,3 M eluiert. Der Decamer-Linker eluiert jedoch bei etwa 0,4 M NaCl. Aus dem Graphen läßt sich entnehmen, daß tRNA bei 0,5 N eluiert, 5S-RNA bei 0,65 M, 16S- und 23S-rRNA und mRNA zwischen 0,8 M und 0,9 M. M13-Phagen und andere einzelsträngige (ss) DNA bei 1,1 M, doppelsträngige (ds) DNA mit 150 Basenpaaren etwas unterhalb 1,2 M, und schließlich Plasmid-DNA, beispielsweise die der λ-Phage, bei 1,3 M NaCl, wobei letztere mit der vorhergehenden leicht überlappt. Die Werte sind nur ungefähr bestimmt, da sie je nach experimentellen Bedingungen schwanken könnten, wie jeder Fachmann wohl erwartet.
Wird der poröse Anionenaustauscher unter Bedingungen synthetisiert, die nicht zur maximalen Oberflächenladungsdichte führen, verschiebt sich das Trennprofil insgesamt zu niedrigeren Ionenstärken, ohne daß der Trennwirkungsgrad signifikant beeinflußt wird. Dieser Effekt ist sogar erwünscht, wenn man die DNA bei niedrigerer Salzkonzentration eluieren muß.
Nachdem die Probe die Kartusche verlassen hat, wird die Kartusche sorgfältig mit einer Waschlösung der gewünschten Ionenstärke (wie oben ausgeführt) gespült, um danach die langkettigen Nucleinsäuren vom porösen Anionenaustauscher zu desorbieren. Dies geschieht durch Eluieren mit einer Lösung hoher Ionenstärke. Dazu kann die zweite Lösung im einfachsten Fall durch die gleiche Eintrittsöffnung 3 eingeleitet und die gleiche Austrittsöffnung 4 abgeleitet werden. Gewünschtenfalls können aber auch Kartuschen verwendet werden, die für die Lösung geringer Ionenstärke und die Lösung hoher Ionenstärke verschiedene Eintrittsöffnungen und verschiedene Austrittsöffnungen aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich in einer weiteren Ausführungsform als "Batch"-Verfahren realisieren, das sich durch besonders einfache Handhabung auszeichnet. Das Batch- Verfahren hat den Vorteil, daß es Scherkräfte auf die hochmolekularen Nucleinsäuren verhindert. Mit diesem Verfahren lassen sich Nucleinsäuren mit bis zu 500 000 bp (Molekulargewicht ungefähr 300 000 D) in präparativem Maßstab isolieren, ohne daß die empfindlichen Moleküle durch Scherkräfte abgebaut werden. Ein zur Extraktion der langkettigen Nucleinsäuren geeigneter poröser Anionenaustauscher wird in ausreichender Menge in ein Reaktionsgefäß gegeben und mit der zu extrahierenden Probe innig gemischt, wobei die erwünschte Ionenstärke der Lösung wie oben angegeben einzustellen ist. Dabei werden die langkettigen Nucleinsäuren am porösen Anionenaustauscher adsorbiert. Durch mehrere Waschschritte werden die kontaminierenden Bestandteile abgetrennt. Danach werden die langkettigen Nucleinsäuren durch Elution mit einem Puffer erwünschter Ionenstärke schonend vom porösen Anionenaustauscher abgetrennt. Der poröse Anionenaustauscher basiert auf einem oberflächenmodifizierten Chromatographiematerial aus Silicagel, Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der oben genannten Trägermaterialien. Auf der Basis von modifiziertem Silicagel beträgt der Porendurchmesser 50 bis 2500 nm, vorzugsweise ca. 400 nm und die Teilchengröße 15 bis 250 um, vorzugsweise 25 bis 40 um.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Die Präparation eines Plasmids (2860 Basenpaare) wird wie folgt durchgeführt:
Im Anschluß an das Alkali/SDS-Aufschlußverfahren wird eine 100 ml-Kultur in LB-Ampicillin-Medium (siehe Maniatis et al.) mit Plasmid-transformierten HB-101 E. coli-Zellen 10 Minuten bei 5000 g und 5ºC zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig dekantiert und das Zell-Pellet in 2 ml 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA resuspendiert.
Man läßt die Probe 5 min lang bei 20ºC absetzen. Dann werden 4 ml frisch angesetzte 1%ige SDS-Lösung in 0,2 m NaOH zugesetzt, vorsichtig gemischt, und die Mischung wird 5 min lang auf Eis inkubiert. Danach werden 3 ml kalte Natriumacetat- Lösung (3M Na-Acetat, 2M Essigsäure) zugesetzt, vorsichtig gemischt, und die Mischung wird für eine weitere Stunde auf Eis inkubiert. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei ca. 10 000 g, 10ºC erhält man einen klaren, plasmidhaltigen Überstand. Wird anstelle von Natriumacetat Kaliumacetat eingesetzt, so wird das SDS weitestgehend ausgefällt.
Bei großen Lysatvolumina empfiehlt sich zunächst eine DNA- Präzipitation durch PEG, Ethanol oder Isopropanol. Danach wird das Pellet in 10 mM Tris-Puffer pH 7,5, 1 mM EDTA gelöst, auf 0,6 M NaCl eingestellt und über 200 mg des Anionenaustauscher geleitet. Dadurch wird die DNA (ca. 100 ug) aus der Lösung extrahiert. Im nachfolgenden Waschschritt wird die Gelphase mit 0,8 M NaCl, 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 1 mM EDTA gewaschen und mit ca. 1 ml 1,2 M NaCl, 50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,5, 1 mM EDTA extrahiert. Anschließend kann die DNA durch Dialyse, Präzipitation oder Gelpermeationschromatographie entsalzt werden.

Beispiel 2

Die Präparation von λ-Phagen-DNA wird wie folgt durchgeführt:
Eine gewachsene und lysierte λ-Phagen/E. coli-Kultur (50 ml) wird bei 5000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert oder auf Eis für 30 Minuten stehen gelassen (siehe Maniatis, T. et al.). Die Überstände oder Teile davon werden durch engporige Sterilfilter, zum Beispiel 0,45 um, filtriert, um intakte Zellen oder schwebende Zelltrümmer zurückzuhalten.
Die Phagensuspension wird durch Passage über eine Kartusche (Fig. 1) bei einer Ionenstärke von 0,5 bis 0,7 M NaCl effizient von zellulärer DNA befreit. Das Bettvolumen des porösen Anionenaustauschers ist so zu wählen, daß die Kapazität der aus den lysierten Zellen freigesetzten zellulären DNA entspricht (ca. 200 mg poröse Matrix pro 100 ml Lysat).
Das Filtrat wird mit EDTA (200 mM) behandelt. Bei gleichzeitigem Zusatz von 4 M Harnstoff wird die DNA der Phagen freigesetzt und mittels einer weiteren Filtration durch die Kartusche spezifisch am Anionenaustauscher adsorbiert. Anschließend wird die Kartusche mit 0,8 M NaCl, 50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,5, 1 mM EDTA gewaschen, und die DNA wird mit ca. 1 ml 1,2 M NaCl, 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5, 1 mM EDTA eluiert.
Die auf diese Weise erhaltene Phagen-DNA kann mit Ethanol, PEG oder Isopropanol gefällt werden. Es ist auch möglich, die Phagen-DNA durch eine Dialyse zu entsalzen (siehe Maniatis, T. et al.). Man erhält eine DNA hoher Reinheit.

Beispiel 3

Die Präparation von M13-Phagen-DNA geschieht wie folgt (zur Präparation von einzelsträngiger DNA wird analog gearbeitet):
Das Phagenlysat wird auf herkömmliche Weise (siehe Beispiel 2) durch Aufschluß der Zellen gewonnen. Nach Entfernung der Zelltrümmer, beispielsweise durch Zentrifugation bei 5000 U/min für die Dauer von 5 Minuten, wird RNase A bis zu einer Endkonzentration von 10 ug/ml hinzugefügt, und man beläßt 30 Minuten bei 37ºC zum Inkubieren. Falls das Lysatvolumen zu groß ist, wird eine PEG-(Polyethylenglycol-)Fällung des Phagen empfohlen. Es werden 0,3 Vol.-% 30% PEG und 1,5 M Natriumchlorid hinzugefügt, gut gemischt, und die Mischung wird 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Die präzipitierten Bakteriophagenteilchen werden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 10 000 g von der Lösung getrennt. Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt, und das Phagenpellet wird in 20 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5, gelöst. Ein weiteres Volumenteil Extraktionspuffer (2% Triton X-100®, 7 M Harnstoff, 100 mM EDTA, pH 7,5) wird hinzugefügt, und die Mischung wird für 15 min auf 50ºC erwärmt, um die einzelsträngige DNA freizusetzen.
Die Kartusche wird mit einem Puffer niedriger Ionenstärke, umfassend 400 mM Natriumchlorid, 50 mM MOPS (3-N-Morpholinopropansulfonsäure), 15% Ethanol und 1 mM EDTA, bei pH 7,0 äquilibriert. Die Probe wird durch die Kartusche gegeben. Dann wird die Kartusche sorgfältig mit einem Puffer gewaschen, der eine Natriumchlorid-Konzentration von 750 mM aufweist, ansonsten aber die obenerwähnte Zusammensetzung besitzt. Die einzelsträngige M13-DNA kann mittels eines Elutionspuffers mit einer Zusammensetzung von 1,1 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol und 1 mM EDTA bei pH 7,0 eluiert werden.

Beispiel 4

Die Isolierung von zellulärer DNA aus Sperma geschieht wie folgt:
100 ul Sperma werden in 1 ml 500 mM NaCl, 10 mM EDTA, 40 mM DTE, 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 1% Triton, 4 M Harnstoff und 20 ug/ml Proteinase K suspendiert und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei ca. 5000 g wird der Überstand in einer Kartusche über das Trenngel geführt. Die Fließgeschwindigkeit des Überstandes durch die Kartusche beträgt ca. 1 ml/min.
Alternativ kann auch das "Batch"-Verfahren angewandt werden. Bei diesem Verfahren wird der Überstand 15 bis 30 Minuten in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß durch Rotation innig mit dem Trenngel gemischt. Der nächste Schritt umfaßt das 5malige Waschen des Gels im Batch-Verfahren oder das Waschen des Gels in der Kartusche mit 5 ml Waschpuffer (800 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 1 mM EDTA), gefolgt von einer Elution mit ca. 1 ml von 1,2 M NaCl, 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 1 mM EDTA. Die Elutionsausbeute ist größer als 80%. Anschließend kann die DNA durch Dialyse oder durch Präzipitation (siehe Beispiel 1) entsalzt werden. Die DNA ist mit Restriktionsenzymen schneidbar und eignet sich zur Analyse im Southern-Blot-Verfahren (siehe T. Maniatis et al.).

Beispiel 5

Die Präparation genomischer DNA aus Leberbiopsiematerial wird wie folgt durchgeführt:
Leberbiopsiematerial wird mechanisch homogenisiert nach dem Potter- oder irgendeinem vergleichbaren Verfahren. Das Homogenat wird mit dem 10fachen Volumen Proteinase K-Lysepuffer (siehe Beispiel 3), vergesetzt und für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die weiteren Aufarbeitungsschritte sind in Beispiel 4 beschrieben.

Beispiel 6

Die Präparation von Papillom-Virus-DNA aus Warzenbiopsie- Gewebe wird wie folgt durchgeführt:
Nach mechanischem Aufschluß (flüssiger Stickstoff, Kugelmühle, mechanisches Zerquetschen) von Warzenbiopsiematerial wird, in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 beschrieben, die 10fache Menge an Lysepuffer zugesetzt, für 6 Stunden bei 37ºC inkubiert und die DNA wie in Beispiel 4 beschrieben aufgearbeitet. Das Verfahren liefert hochmolekulare DNA, wobei es sich um ein Gemisch von zellulärer DNA der menschlichen Zellen und Papillom-Virus-DNA aus den proteolytisch aufgeschlossenen und lysierten Papillomvirionen handelt.

Beispiel 7

Die Präparation von CMV(Cytomegalie-Virus)-DNA aus Urin wird wie folgt durchgeführt:
CMV-Viren werden in situ nach Zusatz von 4 M Harnstoff, 1% Triton, 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, lysiert. Die DNA (130 bis 150·10&sup6; Dalton) wird freigesetzt über Adsorption an der porösen Matrix, in der in Abbildung 1 dargestellten Kartusche konzentriert und wie in Beispiel 5 beschrieben gewaschen. Anschließend wird die DNA eluiert wie in Beispiel 4 beschrieben. Da sich für gewöhnlich ein Dot-Blot- Verfahren an diese Arbeitsgänge anschließt, das zur Bindung der DNA an eine Membran (Nitrocellulose, Nylon) ohnehin hohe Salzkonzentrationen erfordert, ist die eluierte DNA-Lösung mit Natronlauge auf 0,1 M und mit NaCl auf ca. 2 M einzustellen. Dann ist direkt ein Dot-Blot in den gewöhnlich verwendeten Vorrichtungen, zum Beispiel Minifold I und II von Schleicher & Schüll, Bundesrepublik Deutschland, möglich.

Beispiel 8

Abtrennung von Nucleinsäuren aus Proteinlösungen:
Zu 5 ml einer BSA-(Rinderserumalbumin)-Lösung (1 mg/ml) wurden 50 ng pBR 322-Plasmid, das eine Tetracyclin-Resistenz trägt, (Transformationsäquivalent ca. 800 Kolonien) gegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf 0,3 M NaCl eingestellt, um eine Bindung des BSA an das Chromatographiematerial zu verhindern, und anschließend zweimal über eine Kartusche mit 250 mg Chromatographiematerial gereinigt (Fließgeschwindigkeit 5 ml/h). Die Kartusche wurde dann mit 1 M NaCl und 50 mM MOPS, pH 7,0, gewaschen, und die gebundene DNA wurde mit 1,5 M NaCl, 15% Ethanol, 1 mM EDTA und 50 mM MOPS pH 7,0 eluiert, mit Isopropanol gefällt und in E. coli transformiert. Es wurden 800 Kolonien gezählt. Parallel wurde der Durchlauf dialysiert und anschließend 100 ul ebenfalls transformiert.
Es konnten keine resistenten Kolonien festgestellt werden. Ein Vergleich der Transformationsraten der Ausgangslösung und des Eluates läßt jedoch den Schluß zu, daß annähernd 100% der vorhandenen DNA durch die Kartusche entfernt wurde.

Beispiel 9

Abtrennung von Nucleinsäuren aus therapeutischen Protein- Präparationen:
10 ml Human-IgG (5 mg/ml) wurden mit 500 pg Eco-RI-linearisierter pBr 322-Plasmid-DNA (10 pg DNA/mg Protein) markiert. Das linearisierte pBR 322 wurde mit ³²P auf eine Aktivität von 5.106 Zählungen/min markiert.
Die Lösung wurde eingestellt auf 0,3 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, um das Binden von IgG an das chromatographische Harz zu verhindern. Die Protein/Nucleinsäure-Lösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durch eine Chromatographie-Säule (1 cm mal 5 cm) gepumpt, die mit 2 g des Anionenaustauscherharzes gefüllt war. Die Durchflußfraktion wurde aufgefangen, und die Radioaktivität wurde gezählt.
Die Säule wurde mit 50 ml 0,3 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min gewaschen. Die gebundene Nucleinsäure wurde eluiert mit 1,5 M NaCl, 25 mM Na-phosphat, pH 7. Die Eluatfraktion wurde aufgefangen und mit 1 Vol. Isopropanol gefällt. Die gefällte Nucleinsäure wurde gelöst in 0,3 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, und die Radioaktivität wurde gezählt.

Ergebnis:

Anfangsaktivität: 500 000 cpm
Durchflußfraktion: 15 000 cpm
Waschfraktion: 10 000 cpm
Eluatfraktion: 475 000 cpm
Ein Vergleich der Radioaktivität führte zu dem Schluß, daß sich mit diesem Anionenaustauscher > 95% der in einer therapeutischen Proteinprobe vorhandenen Nucleinsäuren abtrennen lassen, wodurch sich der Nucleinsäure-Gehalt auf unter 1 pg verringert.

Beispiel 10

Isolierung von Nucleinsäuren aus Proteinlösungen für die Analyse des Nucleinsäure-Gehalts:
Geringe Nucleinsäure-Gehalte (< 2 pg/ml) in konzentrierten Proteinlösungen (> 2 mg/ml) verursachen Probleme bei der quantitativen Analyse des Nucleinsäure-Gehalts therapeutischer Proteinpräparate. Für die empfindliche Analyse mit dem Dot-Hybridisierungsverfahren muß das Protein von der Nucleinsäure abgetrennt werden. Das klassische Verfahren der Spaltung mit Proteinase K, Phenol/Chloroform-Extraktion führte zu nichtreproduzierbaren Ergebnissen und Verlust an Nucleinsäuren und macht die quantitative Analyse unmöglich.
Die Extraktion mit dem Anionenaustauscher auf der Grundlage Silicagel ergibt ein reproduzierbares Ergebnis - mit Gewinnung der isolierten Nucleinsäure ohne Verunreinigung durch Protein - das für die quantitative Analyse geeignet ist.
10 mg Mäuse-IgG mit unbekanntem Nucleinsäure-Gehalt wurden in 5 ml 0,3 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, gelöst. Eine Kartusche (0,4 ml) wurde mit 200 mg Anionenaustauscher auf Silicagel-Basis gefüllt, mit 0,3 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, äquilibiriert, und die IgG-Lösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgepreßt. Die Kartusche wurde mit 10 ml 0,3 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min gewaschen. Die gebundene Nucleinsäure wurde eluiert mit 1,5 M NaCl, 0,025 M Na-phosphat, pH 7,0, und mit 0,8 Vol. Isopropanol gefällt. Die Nucleinsäure wurde gelöst in 50 ul 1 mM Tris-HCl, pH 7,0, und die Analyse wurde durchgeführt mittels eines Dot-Hybridisierungsverfahrens mit einem speziellen Mäuse-cDNA-Klon. Das wirksame Binden und die quantitative Gewinnung der Nucleinsäure unter den obigen Bedingungen ermöglichen die quantitative Analyse des Nucleinsäure-Gehalts in Proteinlösungen auch bei extrem niedrigen Nucleinsäure-Gehalten und sehr hohen Proteinkonzentrationen.

Claims

1. Verfahren zur Trennung von langkettigen Nucleinsäuren von anderen Substanzen aus Lösungen, die Nucleinsäuren und andere Stoffe enthalten, unter Vermeidung des Schrittes einer Chloroform- und/oder Phenol-Extraktion und/oder einer Dichtegradientenzentrifugation,

wobei die langkettigen Nucleinsäuren an einem porösen Anionenaustauscher fixiert werden und der Anionenaustauscher eine Teilchengröße von 15 bis 250 um und einen Porendurchmesser von 50 bis 2500 nm aufweist,

während die davon zu trennenden Substanzen aus dem Anionenaustauschermaterial ausgewaschen werden mittels einer Waschlösung mit einer Ionenstärke, die unterhalb des Elutionspunkts der abzutrennenden langkettigen Nucleinsäuren liegt,

und die fixierten Nucleinsäuren anschließend vom Anionenaustauscher mittels einer Waschlösung hoher Ionenstärke abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse Anionenaustauscher aus einem Material für die Chromatographie besteht auf der Grundlage von Kieselgel, Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Titanoxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der genannten Trägermaterialien, die bezüglich ihrer Oberfläche modifiziert wurden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße des Materials auf Kieselgel-Basis 15 bis 250 um und der Porendurchmesser etwa 50 bis 2500 nm beträgt.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die langkettigen Nucleinsäuren in Gegenwart von Ethanol enthaltenden Pufferlösungen abgetrennt werden.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Materialien mit hydrophilen Oberflächen eingesetzt werden.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß unter milden Bedingungen durch enzymatische Proteolyse und/oder in Gegenwart von Detergentien und/oder in Gegenwart denaturierender Agenzien oder in Kombination mit mechanischen Verfahren erfolgt.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die langkettigen Nucleinsäuren in einer Menge von mehr als 99% vom Protein abgetrennt werden.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung der langkettigen Nucleinsäuren im Batch-Verfahren erfolgt.

9. Verwendung eines Anionenaustauschers zur Abtrennung langkettiger Nucleinsäuren in einem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Verwendung Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Matrix aus einem Material für die Chromatographie besteht auf der Grundlage von Kieselgel, Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Titanoxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der genannten Trägermaterialien, die bezüglich ihrer Oberfläche modifiziert wurden.

11. Verwendung nach den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße des Materials auf Kieselgel-Basis 15 bis 250 um und der Porendurchmesser etwa 50 bis 2500 nm beträgt.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße des Materials auf Kieselgel-Basis 25 bis 40 um und der Porendurchmesser etwa 400 nm beträgt.

13. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die langkettigen Nucleinsäuren in einer Menge von mehr als 99% vom Protein abgetrennt werden.

14. Verwendung einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 8, bestehend aus einem porösen Anionenaustauscher in einer Kartusche (1) mit mindestens einer Einlaß- (3) und mindestens einer Auslaßöffnung (4) und Seitenwänden (2) bestehend aus Kunststoffmaterial, wobei der Anionenaustauscher aus einem Material für die Chromatographie besteht auf der Grundlage von Kieselgel, Diatomeenerde, Aluminiumoxid, Titanoxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der genannten Trägermaterialien, die bezüglich ihrer Oberfläche modifiziert wurden, wobei der Anionenaustauscher eine Teilchengröße von 15 bis 250 um und einen Porendurchmesser von 50 bis 2500 nm aufweist.

15. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Kunststoffmaterial der Seitenwand (2) PTFE ist.

16. Verwendung einer Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenwände (2) der Kartusche (1) aus einem hydrophilen Material bestehen.

17. Verwendung einer Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die die Kartusche (1) abschließenden Filter (5a) und (5b) aus einem hydrophilen Material bestehen.