-
Technisches
Gebiet
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung und Reinigung
von RNA aus einer Nucleinsäuremischung,
die RNA und DNA enthält.
-
Stand der Technik
-
Die
Nucleinsäure
wird in verschiedenen Gebieten in verschiedenen Formen verwendet.
Beispielsweise wird die Nucleinsäure
im Gebiet rekombinanter Nucleinsäuretechnologie
benötigt,
um in der Form einer Sonde, einer genomischen Nucleinsäure und
einer Plasmid-Nucleinsäure
verwendet zu werden.
-
Im
Gebiet der Diagnostik wird die Nucleinsäure auch bei verschiedenen
Verfahren verwendet. Beispielsweise wird normalerweise eine Nucleinsäuresonde
bei der Detektion und Diagnose eines Humanpathogens verwendet. Ähnlich wird
die Nucleinsäure
bei der Detektion von genetischen Krankheiten verwendet. Die Nucleinsäure wird
außerdem
bei der Detektion einer Nahrungsmittel-kontaminierenden Substanz
verwendet. Zusätzlich
wird die Nucleinsäure
aus verschiedenen Gründen,
wie z.B. der Herstellung einer Genkarte, Klonierung und Expression
von rekombinantem, normalerweise bei der Positionierung, Identifikation
und Isolierung einer interessanten Nucleinsäure verwendet.
-
In
vielen Fällen
kann die Nucleinsäure
in einer sehr kleinen Menge erhalten werden und eine komplizierte
und zeitaufwändige
Tätigkeit
ist zur Isolierung und Reinigung erforderlich. Diese oft zeitaufwändige und komplizierte
Tätigkeit
verursacht leicht einen Verlust der Nucleinsäure. Bei der Reinigung von
Nucleinsäure, erhalten
aus Serum, Urin und bakterieller Kultur, kommen Risiken, wie das
Auftreten von Kontamination und pseudopositivem Ergebnis hinzu.
-
Eines
von gut bekannten Reinigungsverfahren ist beispielhaft gezeigt durch
Reinigung durch Adsorption der Nucleinsäure an die Oberfläche von
Siliciumdioxid, Silicapolymer oder Magnesiumsilicat, gefolgt von Tätigkeiten,
wie z.B. Waschen und Desorbieren (untersuchte Japanische Patentanmeldungs-Publikations
Nr. 1995-51065). Dieses Verfahren ist ausgezeichnet bei der Trennungsleistung
bzw. -durchführung,
jedoch bestehen die Probleme, dass (1) es schwierig ist, das Adsorptionsmedium
einer vergleichbaren Leistung in einem großen Maßstab industriell zu produzieren,
(2) die Handhabung des Mediums unbequem ist und (3) es schwierig
ist, das Medium in verschiedenen Formen zu prozessieren.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Beschreibung beschreibt ein Verfahren zur Trennung und
Reinigung einer Nucleinsäure
durch Adsorbieren der Nucleinsäure
in einer Testprobe an eine Oberfläche einer festen Phase und Desorbieren
der Nucleinsäure
durch Waschen und dergleichen. Sie beschreibt ein Verfahren zur
Trennung und Reinigung der Nucleinsäure unter Verwendung einer
festen Phase, die ausgezeichnet bei der Trennungsleistung und Wascheffizienz
ist, leicht prozessiert werden kann und für jene, die im Wesentlichen
die gleiche Trennungsleistung aufweisen, massen produziert werden
kann. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
einer Methode zum Auftrennen und Reinigen von DNA aus einer Nucleinsäuremischung,
die RNA und DNA enthält.
-
Die
vorliegenden Erfinder haben intensive Studien angestellt, um die
oben beschriebenen Aufgaben zu lösen.
Als ein Ergebnis haben sie gefunden, dass bei einem Verfahren zur
Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure, das die Schritte des Adsorbierens
und Desorbierens der Nucleinsäure
an eine und von einer feste(n) Phase umfasst, RNA von der Nucleinsäuremischung,
die RNA und DNA enthält,
unter Verwendung eines organischen Makromoleküls als feste Phase und außerdem der
Verwendung einer Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, welche
die feste Phase in einem Behälter
enthält,
der zwei Öffnungen
aufweist, getrennt werden kann. Die Erfindung wurde auf Basis dieser
Ergebnisse vervollständigt.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von RNA
aus einer Nucleinsäuremischung,
umfassend einen Schritt von:
Adsorbieren und Desorbieren einer
Nucleinsäure
in der Nucleinsäuremischung,
die RNA und DNA enthält,
an und von eine/einer feste(n) Phase von Triacetylcellulose.
-
Vorzugsweise
Triacetylcellulose, die einen Oberflächen-Verseifungsgrad von 0
bis 50% aufweist, und stärker
bevorzugt einen Oberflächen-Verseifungsgrad
von 0 bis 20% aufweist.
-
Vorzugsweise
ist Triacetylcellulose ein poröser
Film oder ein nicht-poröser
Film. Vorzugsweise ist Triacetylcellulose auf Perlen bzw. Kügelchen
aufgetragen.
-
Vorzugsweise
wird beim Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung die Nucleinsäure
in einer Probenlösung
an die feste Phase aus Triacetylcellulose adsorbiert und von der
festen Phase aus Triacetylcellulose desorbiert.
-
Vorzugsweise
ist die Probenlösung
eine Lösung,
hergestellt durch Zugeben eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels
zu einer Lösung,
die durch das Behandeln einer Zell- oder Virus-enthaltenden Testprobe
mit einem Nucleinsäure-solubilisierenden
Reagens erhalten wurde.
-
Vorzugsweise
ist das Nucleinsäure-solubilisierende
Reagens ein Guanidinsalz, ein Tensid und ein proteolytisches Enzym.
-
Vorzugsweise
erfasst das erfindungsgemäße Verfahren
die Schritte:
Adsorbieren der Nucleinsäure an die feste Phase aus
Triacetylcellulose;
Waschen der festen Phase unter Verwendung
eines Nucleinsäure-Waschpuffers;
und
Desorbieren der an die feste Phase adsorbierten Nucleinsäure unter
Verwendung einer Flüssigkeit
bzw. flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase adsorbierten Nucleinsäure imstande
ist.
-
Vorzugsweise
ist der Nucleinsäure-Waschpuffer
eine Lösung,
die 20 bis 100 Gew.-% Methanol, Ethanol, Isopropanol oder n-Propanol
enthält.
-
Vorzugsweise
ist die flüssige
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase adsorbierten Nucleinsäure imstande
ist, eine Lösung,
die eine Salzkonzentration von 0,5 M oder weniger aufweist.
-
Vorzugsweise
wird die Adsorption und Desorption der Nucleinsäure unter Verwendung einer
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, bei der ein Behälter, der
wenigstens zwei Öffnungen
aufweist, die feste Phase aus Triacetylcellulose enthält, durchgeführt.
-
Stärker bevorzugt
werden Adsorption und Desorption der Nucleinsäure unter Verwendung einer
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, die (a) eine feste Phase
aus Triacetylcellulose, (b) einen Behälter, der wenigstens zwei Öffnungen
aufweist und der die feste Phase enthält, und (c) eine eine Druckdifferenz
erzeugende Vorrichtung, die mit einer Öffnung des Behälters verbunden
ist, umfasst, durchgeführt.
-
Vorzugsweise
kann das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung durch die folgenden Schritte durchgeführt werden:
- (a)
Vorbereiten einer Probenlösung,
die eine Nucleinsäure
enthält,
durch Verwendung einer Testprobe und Einbringen einer Öffnung einer
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure in die Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält;
- (b) Ansaugen der Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
durch Erzeugen eines Zustands mit reduziertem Druck im Inneren des
Behälters,
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Kontaktieren der Probenlösung
mit einer festen Phase aus Triacetylcellulose;
- (c) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der Probenlösung,
die die angesaugte Nucleinsäure
enthält,
aus dem Behälter;
- (d) Einbringen einer Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure in den
Nucleinsäure-Waschpuffer;
- (e) Ansaugen des Nucleinsäure-Waschpuffers
durch Erzeugen des Zustands mit reduziertem Druck im Inneren des
Behälters
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung,
verbunden mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Kontaktieren des Nucleinsäure-Waschpuffers
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose;
- (f) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen des angesaugten Nucleinsäure-Waschpuffers aus dem Behälter;
- (g) Einbringen einer Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure in die
flüssige
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist;
- (h) Erzeugen eines Zustands mit reduziertem Druck im Inneren
des Behälters
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung,
verbunden mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ansaugen der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist, um die flüssige
Phase mit der festen Phase zu kontaktieren; und
- (i) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist, aus dem Behälter.
-
Alternativ
kann das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung durch die folgenden Schritte durchgeführt werden:
- (a)
Vorbereiten einer Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
unter Verwendung einer Testprobe und Injizieren der Probenlösung, die
Nucleinsäure
enthält,
in eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure;
- (b) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der einen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der injizierten Probenlösung, die die Nucleinsäure enthält, aus
der anderen Öffnung,
um die Probenlösung
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose zu kontaktieren;
- (c) Injizieren des Nucleinsäure-Waschpuffers
in die eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure;
- (d) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der einen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen des injizierten Nucleinsäure-Waschpuffers aus der anderen Öffnung,
um den Nucleinsäure-Waschpuffer
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose zu kontaktieren;
- (e) Injizieren der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist, in die eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure; und
- (f) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der einen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der injizierten Nucleinsäure imstande ist,
aus der anderen Öffnung,
um die an die feste Phase aus Triacetylcellulose adsorbierte Nucleinsäure zu desorbieren
und die Nucleinsäure
aus dem Behälter
auszubringen.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 zeigt
ein konzeptionelles Diagramm einer Einheit zur Trennung und Reinigung
von Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung;
-
2 ist
ein Beispiel der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung, wobei die eine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung,
die mit der Öffnung 21 verbunden
werden soll, nicht dargestellt ist. In 2 bezeichnet 1 einen
Behälter,
bezeichnet 10 einen Hauptkörper, bezeichnet 101 eine Öffnung,
bezeichnet 102 eine Unterseite, bezeichnet 103 einen
Rahmen („frame"), bezeichnet 104 eine
Wand, bezeichnet 105 eine Stufe, bezeichnet 121 einen
Raum, bezeichnet 122 einen Raum, bezeichnet 123 einen
Raum, bezeichnet 13 ein Druckteil, bezeichnet 131 ein
Loch, bezeichnet 132 einen Vorsprung, bezeichnet 20 einen
Deckel, bezeichnet 21 eine Öffnung, und bezeichnet 30 eine
feste Phase;
-
3 ist
ein schematisches Diagramm eines Einsatzes („cartridge") zur Reinigung von Nucleinsäure, das
im Beispiel verwendet wird;
-
4 zeigt
das Ergebnis der Messung einer Sammlungsrate der Nucleinsäure, welche
gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung getrennt und gereinigt wurde; und
-
5 zeigt
das Beispiel von Elektrophorese der Nucleinsäure, welche aus einer Mischung
von Nucleinsäuren
gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung getrennt und gereinigt wurde.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden unten erklärt werden.
-
Das
Verfahren zur Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von
RNA aus einer Nucleinsäuremischung,
die RNA und DNA enthält,
welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verfahren die Schritte
des Adsorbierens und Desorbierens der Nucleinsäure in der Nucleinsäuremischung,
welche RNA und DNA enthält,
an und von eine/einer feste(n) Phase aus Triacetylcellulose.
-
Der
Ausdruck „Nucleinsäure" in der Erfindung
kann ein Einzelstrang oder Doppelstrang sein und weist keine Beschränkung eines
Molekulargewichts auf.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete Nucleinsäuremischung
bedeutet eine Mischung, die RNA und DNA enthält. Die Art der Nucleinsäure in der
Nucleinsäuremischung
kann nicht beschränkt
sein, solange DNA und RNA darin enthalten sind. Die Anzahl der Arten
der Nucleinsäuren,
die in der Mischung enthalten sind, ist außerdem nicht beschränkt.
-
Die
Längen
individueller Nucleinsäuren
sind außerdem
nicht besonders beschränkt,
und Nucleinsäuren
mit beliebigen Längen,
die von einigen Basenpaaren bis einigen Mega-Basenpaaren reichen, können verwendet
werden. Hinsichtlich der Handhabung ist die Länge von Nucleinsäuren im
Allgemeinen von einigen Basenpaaren bis einigen hundert Kilo-Basenpaaren.
-
Triacetylcellulose
wird als eine feste Phase verwendet. Bei der vorliegenden Erfindung
kann Oberflächen-verseifte
Triacetylcellulose als die feste Phase verwendet werden, jedoch
wird Triacetylcellulose, welche nicht Oberflächen-verseift ist, vorzugsweise
verwendet. Wenn Oberflächenverseifte
Triacetylcellulose verwendet wird, ist es bevorzugt, dass der Oberflächen-Verseifungsgrad geringer
ist. Insbesondere kann eine Triacetylcellulose, die einen Oberflächen-Verseifungsgrad von
0 bis 50% aufweist, und stärker
bevorzugt eine Triacetylcellulose, die einen Oberflächen-Verseifungsgrad
von 0 bis 20% aufweist, verwendet werden.
-
Wie
in den Beispielen unten gezeigt, ist gefunden worden, dass sowohl
RNA als auch DNA unter Verwendung einer Triacetylcellulose, die
einen hohen Oberflächen-Verseifungsgrad
(100% Oberflächen-Verseifungsgrad
im Beispiel) hat, wiedergewonnen werden, während nur RNA selektiv wiedergewonnen
werden kann, wenn eine Triacetylcellulose verwendet wird, die einen
niedrigen Oberflächen-Verseifungsgrad
(0% Oberflächen-Verseifungsgrad
in dem Beispiel) aufweist. Die vorliegende Erfindung stellt ein
Verfahren zur Rückgewinnung
von RNA, selektiv aus einer Mischung, die RNA und DNA enthält, durch
Verwenden dieser Eigenschaft, bereit.
-
Die
Oberflächen-Verseifung
bedeutet, dass nur die Oberfläche,
an die ein Verseifungsmittel (z.B. NaOH) kontaktiert, verseift wird.
Bei der vorliegenden Erfindung ist es vorzuziehen, dass ein struktureller
Körper der
festen Phase als Triacetylcellulose beibehalten wird und nur die
Oberfläche
der festen Phase verseift wird. Auf diese Weise kann eine Menge
von Hydroxylgruppen (Dichte) auf der Oberfläche der festen Phase gemäß dem Grad
an Oberflächen-Verseifungsbehandlung
(Oberflächen-Verseifungsgrad)
kontrolliert werden.
-
Um
den Oberflächenbereich
von Triacetylcellulose zu erhöhen,
ist es vorzuziehen, Triacetylcellulose in eine Membran zu formen.
Weiterhin kann Triacetylcellulose eine poröse Membran oder eine nicht-poröse Membran
sein. Jedoch ist die poröse
Membran stärker
bevorzugt.
-
Beispielsweise
wird die Membran aus Triacetylcellulose als Handelsname TAC base
von Fuji Photo Film K.K. vermarktet. Als die poröse Membran von Triacetylcellulose
gibt es Mikrofilter FM45 (Fuji Photo Film K.K.).
-
Zusätzlich ist
es beispielsweise außerdem
vorzuziehen, die Triacetylcellulosemembran auf der Oberfläche von
aus Polyethylen hergestellten Perlen bzw. Kügelchen zu bilden. In diesem
Fall wird Triacetylcellulose auf die Perlen aufgetragen. Das Material
der Perlen kann ein beliebiges Material sein, welches Nucleinsäure nicht
kontaminiert und ist nicht auf Polyethylen beschränkt.
-
Bei
der vorliegenden Erfindung kann RNA selektiv aus einer Mischung
von Nucleinsäuren
getrennt und gereinigt werden, indem eine feste Phase aus Triacetylcellulose,
beispielsweise Mikrofilter FM45 (Fuji Photo Film K.K.) als feste
Phase verwendet wird, und die Nucleinsäure in einer Nucleinsäuremischung,
die RNA und DNA enthält,
an und von der benannten feste(n) Phase adsorbiert und desorbiert
wird. Es wurde noch nicht berichtet und wurde zuerst von den vorliegenden
Erfindern gefunden, dass RNA wie oben erwähnt selektiv unter Verwendung
einer festen Phase aus Triacetylcellulose getrennt und gereinigt
werden kann.
-
Bei
dem Verfahren zur Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung kann Adsorption und Desorption der Nucleinsäure vorzugsweise
durchgeführt
werden, indem eine Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure verwendet
wird, bei welcher ein Behälter,
der wenigstens zwei Öffnungen
aufweist, die feste Phase aus Triacetylcellulose enthält.
-
Weiter
bevorzugt können
Adsorption und Desorption der Nucleinsäure unter Verwendung einer
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, die (a) eine feste Phase
aus Triacetylcellulose, (b) einen Behälter, der wenigstens zwei Öffnungen
aufweist und die feste Phase enthält, und (c) eine eine Druckdifferenz erzeugende
Vorrichtung, die mit einer Öffnung
des Behälters
verbunden ist, umfasst, durchgeführt
werden.
-
In
diesem Fall kann eine erste Ausführungsform
des Verfahrens zur Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung die folgenden Schritte umfassen:
- (a)
Vorbereiten einer Probenlösung,
die eine Nucleinsäure
enthält,
durch Verwendung einer Testprobe und Einbringen einer Öffnung einer
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure in die Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält;
- (b) Ansaugen der Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
durch Erzeugen eines Zustands mit reduziertem Druck im Inneren des
Behälters,
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Kontaktieren der Probenlösung
mit einer festen Phase aus Triacetylcellulose;
- (c) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters durch
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der Probenlösung,
die die angesaugte Nucleinsäure
enthält,
aus dem Behälter;
- (d) Einbringen einer Öffnung
in die Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure in den
Nucleinsäure-Waschpuffer;
- (e) Ansaugen des Nucleinsäure-Waschpuffers
durch Erzeugen eines Zustands mit reduziertem Druck im Inneren des
Behälters
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung,
verbunden mit dem anderen Ende der Einheit zur Trennung und Reinigung
von Nucleinsäure
und Kontaktieren des Nucleinsäure-Waschpuffers
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose;
- (f) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen des angesaugten Nucleinsäure-Waschpuffers aus dem Behälter;
- (g) Einbringen einer Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure in die
Flüssigkeit bzw.
flüssige
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist;
- (h) Erzeugen eines Zustands mit reduziertem Druck im Inneren
des Behälters
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung,
verbunden mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ansaugen der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist, um die flüssige
mit der festen Phase zu kontaktieren; und
- (i) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der anderen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist, aus dem Behälter.
-
Eine
zweite Ausführungsform
des Verfahrens zur Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure gemäß der Erfindung
kann die folgenden Schritte umfassen:
- (a) Vorbereiten
einer Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
unter Verwendung einer Testprobe und Injizieren der Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält,
in eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure;
- (b) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der einen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der injizierten Probenlösung, die die Nucleinsäure enthält, aus
der anderen Öffnung,
um die Probenlösung
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose zu kontaktieren;
- (c) Injizieren des Nucleinsäure-Waschpuffers
in die eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure;
- (d) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit einer Öffnung
zur Einheit der Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen des injizierten Nucleinsäure-Waschpuffers aus der anderen Öffnung,
um den Nucleinsäure-Waschpuffer
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose zu kontaktieren;
- (e) Injizieren der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase aus Triacetylcellulose
adsorbierten Nucleinsäure
imstande ist, in die eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure; und
- (f) Erzeugen eines Druckzustands im Inneren des Behälters unter
Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden
mit der genannten einen Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, und
Ausbringen der flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der injizierten Nucleinsäure imstande
ist, aus der anderen genannten Öffnung,
um die an die feste Phase aus Triacetylcellulose adsorbierte Nucleinsäure zu desorbieren
und die Nucleinsäure
aus dem Behälter
ausbringen.
-
Das
Verfahren zur Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure unter
Verwendung von Triacetylcellulose wird im Detail unten beschrieben
werden. Vorzugsweise wird bei der vorlie genden Erfindung die Nucleinsäure in der
Probenlösung
an die feste Phase durch Kontaktieren der Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält,
mit der festen Phase aus Triacetylcellulose adsorbiert, und dann
wird die an die feste Phase adsorbierte Nucleinsäure von der festen Phase unter
Verwendung einer geeigneten unten beschriebenen Lösung desorbiert.
Wünschenswerter
ist die Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
eine Lösung,
die erhalten wird durch Addieren eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels
zu einer Lösung,
erhalten durch Behandeln einer Zell- oder Virus-enthaltenden Testprobe mit
einer Lösung,
fähig,
eine Zellmembran und eine Kernmembran zu solubilisieren, um die
Nucleinsäure
in die Lösung
zu dispergieren.
-
Die
Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist
nicht beschränkt,
jedoch sind beispielsweise in diagnostischen Gebieten die Subjektlösungen die
Körperflüssigkeit,
wie z.B. Gesamtblut, Serum, Plasma, Urin, Stuhl, Sperma und Speichel,
welche als eine Testprobe gesammelt wurden, oder Lösungen,
hergestellt aus biologischen Materialien, wie z.B. einer Pflanze (oder
einem Teil davon) und einem Tier (oder einem Teil davon), oder ihre
aufgelösten
Materialien und Homogenate.
-
Zuerst
werden diese Testproben mit einer wässrigen Lösung behandelt, die ein Reagens
enthält,
das zum Lysieren der Zellmembran und Solubilisieren der Nucleinsäure imstande
ist. Durch diese Behandlung werden die Zellmembran und die Kernmembran
lysiert und die Nucleinsäure
wird in die wässrige
Lösung
dispergiert.
-
Für das Lysieren
der Zellmembran und Solubilisieren der Nucleinsäure sind beispielsweise, wenn
die Subjekt-Probe Gesamtblut ist, die nötigen Schritte (1) Entfernen
von Erythrozyten, (2) Entfernen verschiedener Proteine und (3) Lysieren
von Leukozyten und Lysieren der Kernmembran. (1) Entfernen von Erythrozyten
und (2) Entfernen verschiedener Proteine sind erforderlich, um nicht-spezifische
Adsorption an die feste Phase und Verstopfen der porösen Membran
zu verhindern, und (3) Lysieren von Leukozyten und Lysieren der
Kernmembran ist erforderlich, um die Nucleinsäure zu solubilisieren, welche
ein Objekt der Extraktion ist. Insbesondere ist (3) Lysieren von
Leukozyten und Lysieren der Kernmembran ein wichtiger Schritt. Bei
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, die Nucleinsäure in diesem
Schritt zu solubilisieren. Beispielsweise können die oben genannten (1),
(2) und (3) gleichzeitig erreicht werden, indem die Probe 10 Minuten
lang bei 60°C
unter der Bedingung, bei welcher Guanidinhydrochlorid, Triton X-100
und Protease K (von Sigma hergestellt) zugegeben werden, inkubiert
wird.
-
Das
Reagens zum Solubilisieren der Nucleinsäure, welches bei der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, wird durch die Lösung, enthaltend das Guanidinsalz,
ein Tensid und eine Protease, exemplifiziert.
-
Das
Guanidinsalz ist vorzugsweise Guanidinhydrochlorid, aber andere
Guanidinsalze (Guanidinisothiocyanat und Guanidinthiocyanat) können auch
verwendet werden. Die Konzentration von Guanidinsalzen in der Lösung ist
0,5 M bis 6 M, vorzugsweise 1 M bis 5 M.
-
Als
das Tensid kann Triton X-100 verwendet werden. Alternativ können auch
ein anionisches Tensid, wie z.B. SDS, Natriumcholat und Natriumsarcosinat,
ein nichtionisches Tensid, wie z.B. Tween 20 und Megafac, und verschiedene
andere Arten amphoterer Tenside verwendet werden. Bei der vorliegenden
Erfindung wird das nichtionische Tensid, wie z.B. Polyoxyethylenoctylphenylether
(Triton X100), vorzugsweise verwendet. Die Konzentration des Tensids
in der Lösung
ist normalerweise 0,05 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere vorzugsweise
0,1 Gew.-% bis 5 Gew.-%.
-
Als
die Protease kann Protease K verwendet werden, aber andere Proteasen
können
auch den gleichen Effekt ergeben. Die Protease ist ein Enzym und
folglich ist Inkubation vorzuziehen. Die Protease wird vorzugsweise
bei 37°C
bis 70°C,
insbesondere vorzugsweise bei 50°C
bis 65°C,
verwendet.
-
Ein
wässriges
organisches Lösungsmittel
wird zu der wässrigen
Lösung
zugegeben, in welcher die Nucleinsäure dispergiert ist, um die
Nucleinsäure
mit Triacetylcellulose zu kontaktieren. Durch diesen Vorgang wird
die Nucleinsäure
in der Probenlösung
an Triacetylcellulose adsorbiert. Um die Nucleinsäure, welche
durch den Vorgang, wie oben beschrieben, solubilisiert worden war,
an die feste Phase aus Triacetylcellulose zu adsorbieren, wird es
notwendig, dass ein wässriges
organisches Lösungsmittel
mit der solubilisierten Nucleinsäuremischungs-Lösung gemischt
wird und ein Salz in der erhaltenen Nucleinsäuremischung-Lösung vorhanden
ist.
-
Durch
Brechen einer Hydratstruktur von um die Nucleinsäure herum vorhandenen Wassermolekülen wird
die Nucleinsäure
in einen instabilen Zustand solubilisiert. Es wird angenommen, dass,
wenn die Nucleinsäure
in einem solchen Zustand mit der festen Phase aus Triacetylcellulose
kontaktiert wird, die eine Hydroxylgruppe auf der Oberfläche aufweist,
eine polare Gruppe auf der Oberfläche der Nucleinsäure mit
der polaren Gruppe auf der Oberfläche der festen Phase wechselwirkt
und die Nucleinsäure
an die Oberfläche
der festen Phase adsorbiert wird. Bei dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung kann der Zustand der Nucleinsäure durch Mischen des wässrigen
organischen Lösungsmittels
mit der solubilisierten Nucleinsäuremischungs-Lösung und
durch die Gegenwart des Salzes in der erhaltenen Mischungs-Lösung der
Nucleinsäure
instabil werden.
-
Die
Zuckergruppierung von DNA ist Desoxyribose, während die von RNA Ribose ist.
Folglich hat RNA eine Hydroxylgruppe mehr pro Base, wenn verglichen
mit DNA, und folglich neigt Wechselwirkung zwischen RNA und einer
polaren Gruppe auf der Oberfläche
der festen Phase dazu, stattzufinden. Durch Verwenden der Intensität dieser
Wechselwirkung wird RNA aus einer Mischung von Nucleinsäuren, die
RNA und DNA enthält,
getrennt und gereinigt.
-
Das
wässrige
organische Lösungsmittel,
das hierin verwendet wird, wird durch Ethanol, Isopropanol oder
Propanol exemplifiziert. Unter diesen ist Ethanol vorzuziehen. Die
Konzentration des wässrigen
organischen Lösungsmittels
ist vorzugsweise 5 Gew.-% bis 90 Gew.-% und wünschenswerter 20 Gew.-% bis
60 Gew.-%. Es ist insbesondere vorzuziehen, die Konzentration des
zuzugebenden Ethanols in einem Grad, bei welchem kein Koagulans
vorkommt, so hoch wie möglich
zu machen.
-
Als
das in der erhaltenen Mischungs-Lösung der Nucleinsäure vorhandene
Salz sind verschiedene chaotrope Substanzen (Guanidiumsalz, Natriumiodid
und Natriumperchlorat), Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid,
Natriumbromid, Kaliumbromid, Calciumbromid, Ammoniumbromid und dergleichen
vorzuziehen. Insbesondere hat ein Guanidiumsalz sowohl die Wirkung
der Lyse der Zellmembran als auch Solubilisierung der Nucleinsäure und
ist deshalb besonders vorzuziehen.
-
Nachfolgend
wird Triacetylcellulose, an welche die Nucleinsäure adsorbiert ist, mit der
Nucleinsäure-Waschpufferlösung kontaktiert.
Diese Probenlösung
weist die Funktion auf, Verunreinigungen in der Probenlösung, welche
an Triacetylcellulose zusammen mit der Nucleinsäure adsorbiert sind, herauszuwaschen. Konsequenterweise
sollte die Lösung
eine Zusammensetzung aufweisen, die keine Befähigung aufweist, die Nucleinsäure von
Triacetylcellulose zu desorbieren, und eine Befähigung aufweist, die Verunreinigungen
zu desorbieren. Die Nucleinsäure-Waschpufferlösung ist
eine wässrige
Lösung,
umfassend ein Hauptmittel, ein Puffermittel und, wenn erforderlich,
ein Tensid. Das Hauptmittel wird durch eine wässrige Lösung von etwa 10 bis 100 Gew.-%
(vorzugsweise etwa 20 bis 100 Gew.-% und stärker bevorzugt etwa 40 bis
80 Gew.-%) Methanol,
Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, Butanol, Aceton und dergleichen
exemplifiziert. Das Puffermittel und das Tensid werden durch die
zuvor beschriebenen Puffermittel und Tenside exemplifiziert. Unter
diesen ist eine Lösung,
enthaltend Ethanol, Tris und Triton X100, vorzuziehen. Die vorzuziehenden
Konzentrationen von Tris und Triton X100 sind 10 bis 100 mM bzw.
0,1 bis 10 Gew.-%.
-
Dann
wird mit der Lösung,
die zum Desorbieren der an Triacetylcellulose adsorbierten Nucleinsäure imstande
ist, die gewaschene Triacetylcellulose kontaktiert. Diese Lösung enthält die Zielnucleinsäure und folglich
wird sie gesammelt und einer Amplifizierung der Nucleinsäure durch
einen nachfolgenden Arbeitsgang, z.B. PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion),
unterzogen. Es ist vorzuziehen, dass die Lösung, die zum Desorbieren der
Nucleinsäure
imstande ist, eine niedrige Salzkonzentration aufweist und besonders
bevorzugt wird die Lösung
mit einer Salzkonzentration von 0,5 M oder niedriger verwendet.
Für diese
Lösungen
können
gereinigtes destilliertes Wasser, TE-Puffer und dergleichen verwendet
werden.
-
Die
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, welche erfindungsgemäß verwendet
wird, ist eine Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, wobei
die feste Phase aus Triacetylcellulose in dem Behälter, der
wenigstens zwei Öffnungen
aufweist, enthalten ist.
-
Das
Material des Behälters
ist nicht besonders beschränkt,
solange Triacetylcellulose darin enthalten ist und wenigstens zwei Öffnungen
bereitgestellt werden können.
Hinsichtlich der Leichtigkeit der Herstellung ist ein Kunststoff
bevorzugt. Beispielsweise werden durchsichtige oder undurchsichtige
Harze, wie z.B. Polystyrol, Polymethacrylatester, Polyethylen, Polypropylen,
Polyester, Nylon oder Polycarbonat, vorzugsweise verwendet.
-
1 zeigt
ein konzeptuelles Diagramm des Behälters. Im Wesentlichen weist
der Behälter
einen Abschnitt zur Aufnahme bzw. zum Rückhalt der festen Phase auf,
und die feste Phase ist in dem Aufnahme-Abschnitt enthalten. Die
feste Phase bewegt sich während
des Ansaugens und Ausbringens der Probenlösung und dergleichen nicht
aus dem Aufnahme-Abschnitt heraus. Eine eine Druckdifferenz erzeugende
Vorrichtung, z.B. eine Spritze, wird mit der Öffnung verbunden. Zu diesem
Zweck ist es vorzuziehen, dass der Behälter anfänglich in zwei Abschnitte geteilt
ist, und diese Anteile zusammengefasst werden, nachdem die feste
Phase aufgenommen ist. Zusätzlich
kann, um zu verhindern, dass die feste Phase aus dem Aufnahme-Abschnitt
heraustritt, ein Netz, hergestellt aus einem Material, welches DNA
nicht kontaminiert, auf das obere Ende und das untere Ende der festen
Phase platziert werden.
-
Bei
der Form der Triacetylcellulose, welche in dem Behälter wie
oben beschrieben enthalten ist, besteht keine Beschränkung. Die
Form kann eine beliebige Form sein, wie z.B. diskoid, quadratisch,
rechteckig oder ellipsoid; und in der Membran, zylindrisch, Rolle
oder Perlen, beschichtet mit Triacetylcellulose, welche eine Hydroxylgruppe
auf der Oberfläche
aufweisen. Im Hinblick auf Herstellungseignung ist die Form, die
symmetrische Isolierung aufweist, wie z.B. diskoid, quadratisch,
zylindrisch und Rolle sowie Perlen bevorzugt.
-
Die
eine Öffnung
des oben beschriebenen Behälters
wird in die Probenlösung
eingebracht, die die Nucleinsäure
enthält,
und die Probenlösung
wird durch Ansaugen von der anderen Öffnung mit Triacetylcellulose kontaktiert.
Die Probenlösung
wird ausgebracht und dann wird die Nucleinsäure-Waschpuffer-Lösung angesaugt
und ausgebracht. Dann wird die Lösung,
die zum Desorbieren der an Triacetylcellulose adsorbierten Nucleinsäure imstande
ist, angesaugt und ausgebracht. Diese ausgebrachte Lösung wird
gesammelt, um die Zielnucleinsäure
zu erhalten.
-
Alternativ
kann die Zielnucleinsäure
durch Eintauchen von Triacetylcellulose in die Probenlösung, die die
Nucleinsäure
enthält,
die Nucleinsäure-Waschpuffer-Lösung und
die Lösung,
die zum Desorbieren der an Triacetylcellulose adsorbierten Nucleinsäure imstande
ist, in dieser Reihenfolge, erhalten werden.
-
Die
erfindungsgemäß verwendete
Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure umfasst vorzugsweise (a)
eine feste Phase aus Triacetylcellulose, (b) einen Behälter, der
die feste Phase enthält
und wenigstens zwei Öffnungen
aufweist, und (c) eine eine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung,
verbunden mit einer Öffnung
des Behälters.
Die Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure wird
unten beschrieben werden.
-
Der
Behälter
wird normalerweise in einer geteilten Form aus einem Hauptkörper gemacht,
der die feste Phase aus Triacetylcellulose enthält, und einem Deckel, wobei
jeder wenigstens eine Öffnung
aufweist. Der eine wird als ein Einlass und ein Auslass der Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält,
der Nucleinsäure-Waschpuffer-Lösung, einer
flüssigen
Phase, die zum Desorbieren der an die feste Phase adsorbierten Nucleinsäure imstande
ist (nachfolgend als „Probenlösung und
dergleichen" bezeichnet)
verwendet; und der andere mit der eine Druckdifferenz erzeugenden
Vorrichtung, die in der Lage ist, im Inneren des Behälters einen Druckzustand
oder einen Zustand mit reduziertem Druck zu erzeugen, verbunden.
Es gibt keine Beschränkung der
Form des Hauptkörpers.
Um die Herstellung leicht zu machen und außerdem die gesamte Diffusion
der Probenlö sung
auf der festen Phase leicht zu machen, ist es vorzuziehen, dass
der Querschnitt eine zirkuläre Form
ist. Um einen einschneidenden Verlust des Feststoffs zu verhindern,
ist außerdem
vorzuziehen, dass der Querschnitt eine quadratische Form ist.
-
Es
ist notwendig, den Deckel mit dem Hauptkörper zu verbinden, um im Inneren
des Behälters
unter Verwendung der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung
einen Zustand mit reduziertem Druck oder den Druckzustand zu erzeugen.
Sofern dieser Zustand erreicht wird, kann das Verbindungsverfahren
frei ausgewählt
werden. Beispielsweise werden die Verwendung eines Klebstoffs, Verschrauben,
Einpassen, Sichern und Verschmelzen durch Ultraschallerhitzen exemplifiziert.
-
Ein
inneres Volumen des Behälters
wird nur durch eine Menge der zu behandelnden Probenlösung bestimmt.
Normalerweise wird es durch das Volumen der festen Phase, die darin
enthalten sein sollte, ausgedrückt.
Es ist vorzuziehen, eine Größe zu verwenden
die geeignet ist, 1 bis 6 Blätter
der festen Phase mit einer Dicke von etwa 1 mm oder kleiner (z.B.
ungefähr
50 bis 500 μm)
und einem Durchmesser von etwa 2 mm bis 20 mm aufzunehmen. Es ist
vorzuziehen, ein Ende der festen Phase eng mit einer Innenwandfläche des
Behälters
kontaktieren zu lassen, um zu verhindern, dass die Probenlösung und
dergleichen durchgelassen werden.
-
Die
untere Oberfläche
der festen Phase, die gegenüberliegend
zur als Einlass der Probenlösung
und dergleichen verwendeten Öffnung
lokalisiert ist, wird nicht eng mit der Innenwand des Behälters kontaktiert, und
ein Raum wird bereitgestellt. Dadurch kann eine Struktur gebildet
werden, die geeignet ist, die Fusion der Probenlösung und dergleichen, wenn
möglich
gleichmäßig auf
der gesamten Oberfläche
der festen Phase, zu erreichen.
-
Es
ist vorzuziehen, ein Teil, das ein Loch, im Allgemeinen in einem
Zentrum davon, aufweist, auf der festen Phase, lokalisiert gegenüberliegend
zu der anderen Öffnung,
d.h. der Öffnung,
verbunden mit der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, bereitzustellen.
Dieses Teil drückt
die feste Phase und hat einen wirksamen Effekt auf das Ausbringen
der Probenlösung
und dergleichen. Dieses Teil weist vorzugsweise eine Form, die eine
Steigung aufweist, wie z.B. einen Trichter oder eine Schale, auf
eine derartige Weise auf, dass die flüssige Phase in dem zentralen
Loch gesammelt wird. Die Größe dieses
Lochs, der Winkel der Steigung und die Dicke des Teils können vom
Fachmann unter Berücksichtigung
der Menge der Probenlösung
und dergleichen, die behandelt werden soll, und der Größe des Behälters zum
Enthalten der festen Phase, richtig bestimmt werden. Zwischen diesem
Teil und der Öffnung
ist vorzugsweise ein Raum bereitgestellt, um die übergelaufene
Probenlösung
und dergleichen aufzubewahren und zu verhindern, dass die Probenlösung in
die eine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung eingesaugt wird.
Das Volumen dieses Lochs kann vom Fachmann auf diesem Gebiet richtig
ausgewählt
werden. Um die Nucleinsäure
effizient zu sammeln, ist es vorzuziehen, die Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält,
in einer Menge anzusaugen, die ausreichend ist zum Eintauchen der
ganzen festen Phase. Um zu verhindern, dass die Probenlösung und
dergleichen nur unterhalb der Öffnung,
durch welche das Ansaugen durchgeführt wird, konzentriert werden
und um zu erlauben, dass die Probenlösung oder dergleichen durch
die feste Phase geleitet werden, wird zwischen der festen Phase
und diesem Teil vorzugsweise ein Raum bereitgestellt. Zu diesem
Zweck ist es vorzuziehen, eine Vielzahl von Vorsprüngen von
dem Teil der festen Phase bereitzustellen. Die Größe und Anzahl
dieses Vorsprungs kann vom Fachmann in dem Gebiet richtig ausgewählt werden.
Es ist vorzuziehen, einen Öffnungsbereich
der festen Phase so groß wie
möglich
zu machen, während
der Raum beibehalten wird.
-
Wenn
der Behälter
drei oder mehr Öffnungen
aufweist, muss nicht gesagt werden, dass die überschüssige Öffnung vorübergehend geschlossen werden
sollte, um das Ansaugen und Ausbringen der flüssigen Phase durch Druck-reduzierende
und Druck-auferlegende Tätigkeiten
möglich
zu machen.
-
Die
eine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung reduziert zunächst den
Druck des Inneren des Behälters,
welcher die feste Phase enthält,
um die Probenlösung,
die die Nucleinsäure
enthält,
anzusaugen. Die eine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung wird
durch eine Spritze, einen Pipettierer oder eine Pumpe, fähig zum Ansaugen
und Unterdrucksetzen, wie z.B. eine peristaltische Pumpe, exemplifiziert.
Unter diesen ist die Spritze für
manuelle Bedienung geeignet und die Pumpe für automatische Bedienung geeignet.
Der Pipettierer hat den Vorteil der Einhand-Bedienung. Vorzugsweise wird die eine
Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung ablösbar mit der einen Öffnung des
Behälters
verbunden.
-
Als
Nächstes
wird das Reinigungsverfahren der Nucleinsäure unter Verwendung der Einheit
zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, wie oben beschrieben,
beschrieben werden. Als Erstes wird in die Probenlösung, die
die Nucleinsäure
enthält,
eine Öffnung
der Einheit zur Trennung und Reinigung von Nucleinsäure, wie
oben beschrieben, eingebracht. Dann wird, unter Verwendung der eine
Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung, verbunden mit der anderen Öffnung,
der Druck des Inneren der Reinigungseinheit reduziert, um die Probenlösung in
den Behälter
zu saugen. Durch diese Tätigkeit
wird die Probenlösung
mit der festen Phase kontaktiert, um die in der Probenlösung vorhandene
Nucleinsäure
an die feste Phase zu adsorbieren. Zu dieser Zeit ist es bevorzugt,
die Probenlösung
in einer solchen Menge anzusaugen, dass die Lösung mit fast der gesamten
festen Phase kontaktiert werden kann. Jedoch verursacht das Ansaugen
der Lösung
in die eine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung Kontamination
der Vorrichtung und folglich wird die Menge in geeigneter Weise
eingestellt.
-
Nachdem
eine geeignete Menge der Probenlösung
angesaugt ist, wird das Innere des Behälters der Einheit unter Verwendung
der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung unter Druck gesetzt
und die angesaugte flüssige
Phase wird ausgebracht. Für
diesen Vorgang ist kein Zeitabstand erforderlich und das Ausbringen
kann unmittelbar nach dem Ansaugen durchgeführt werden.
-
Nachfolgend
wird die Nucleinsäure-Waschpuffer-Lösung durch
Druck-reduzierende und Druck-erhöhende
Vorgänge,
wie oben beschrieben, in den Behälter
angesaugt und daraus ausgebracht, um das Innere des Behälters zu
waschen. Diese Lösung
hat Funktionen des Auswaschens der in dem Behälter verbleibenden Probenlösung und
außerdem
des Auswaschens von Verunreinigungen in der Probenlösung, die
zusammen mit der Nucleinsäure
an die feste Phase adsorbiert sind. Folglich muss die Lösung eine
Zusammensetzung aufweisen, die die Funktionen des Desorbierens von
Verunreinigungen, nicht aber von Nucleinsäure, aus der festen Phase aufweist.
Die Nucleinsäure-Waschpuffer-Lösung ist
eine wässrige
Lösung,
die ein Hauptmittel, ein Puffermittel und, wenn erforderlich, ein
Tensid enthält.
Das Hauptmittel wird durch etwa 10 bis 90% (vorzugsweise etwa 50
bis 90%) einer wässrigen
Lösung
von Methylalkohol, Ethylalkohol, Butylalkohol, Aceton und dergleichen
exemplifiziert; und das Puffermittel und das Tensid werden durch
zuvor beschriebene Puffermittel und Tenside exemplifiziert. Unter
diesen ist eine Lösung,
die Ethylalkohol, Tris und Triton X100 enthält, vorzuziehen. Die vorzuziehenden
Konzentrationen von Tris und Triton X100 sind 10 bis 100 mM bzw.
0,1 bis 10%.
-
Als
Nächstes
wird durch Druck-reduzierende und Druck-erhöhende Tätigkeiten, wie oben beschrieben,
eine Lösung
in das Innere des Behälters
eingebracht und aus dem Behälter
ausgebracht, die zum Desorbieren der an die feste Phase adsorbierten
Nucleinsäure
imstande ist. Diese ausgebrachte Lösung enthält die Zielnucleinsäure und
folglich kann die Zielnucleinsäure
gesammelt werden, um einer Amplifizierung der Nucleinsäure durch
eine nachfolgende Tätigkeit,
z.B. PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) unterzogen zu werden.
-
2 ist
eine Schnittansicht eines Beispiels der Einheit zur Trennung und
Reinigung von Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung, vorausgesetzt, dass keine Druckdifferenz erzeugende Vorrichtung
dargestellt ist. Ein Behälter 1,
der die feste Phase enthält,
umfasst einen Hauptkörper 10 und
einen Deckel 20 und ist aus durchsichtigem Polystyrol hergestellt.
Der Hauptkörper 10 enthält eine
verseifte Triacetylcellulosemembran als eine feste Phase 30.
Zusätzlich
weist er eine Öffnung 101 zum
Ansaugen der Probenlösung
und dergleichen auf. Eine Unterseite 102, die sich von
der Öffnung
erstreckt, ist in einer Trichterform geformt, und ein Raum 121 wird
zwischen dieser und der festen Phase 30 gebildet. Um die
feste Phase 30 zu unterstützen und den Raum 121 zu
halten, wird ein Rahmen 103, der mit der Unterseite 102 gebildet
ist, bereitgestellt.
-
Der
Hauptkörper
hat einen inneren Durchmesser von 20,1 mm, eine Tiefe von 5,9 mm
und eine Länge von
der Unterseite 102 bis zur Öffnung 101 von etwa
70 mm. Die feste Phase, die enthalten ist, hat einen Durchmesser
von 20,0 mm. Die Dicke eines Blattes der festen Phase ist etwa 50
bis 500 μm
und ein Beispiel der Dicke ist 100 μm.
-
In 2 wird
ein trichterförmiges
Druckteil 13 auf der oberen Seite der festen Phase bereitgestellt.
Ein Loch 121 ist in einem Zentrum des Druckteils 13 angefertigt,
und eine Gruppe von Vorsprüngen 132 wird
abwärts
bereitgestellt, und ein Raum 122 wird zwischen dieser und
der festen Phase 30 gebildet. Um das Lecken der Probenlösung und
dergleichen aus einem Raum zwischen der festen Phase 30 und
einer Wand 104 des Hauptkörpers 10 zu verhindern,
ist der innere Durchmesser des oberen Anteils der Wand 104 größer als
der Durchmesser der festen Phase. Die Peripherie des Druckteils 13 ist
auf einer Stufe 105 befestigt.
-
Ein
Deckel 20 ist mit dem Hauptkörper 10 durch Ultraschallerhitzen
verbunden. Im nahezu zentralen Teil des Deckels 20 ist
eine Öffnung 21 zum
Anschließen
der eine Druckdifferenz erzeugenden Vorrichtung bereitgestellt.
Zwischen dem Deckel 20 und dem Druckteil 13 ist
ein Raum 123 zum Halten der Probenlösung und dergleichen bereitgestellt,
die aus dem Loch 121 fließen. Ein Volumen des Raums 123 ist
etwa 0,1 ml.
-
Die
vorliegende Erfindung wird in größerem Detail
unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben werden. Jedoch ist die
vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
(1) Herstellung eines
Einsatzes („cartridge") zur Reinigung von
Nucleinsäure
-
Ein
Einsatz zur Reinigung von Nucleinsäure, der einen Teil aufweist,
welcher 7 mm Innendurchmesser und 2 mm Dicke zur Aufnahme einer
festen Phase zum Adsorbieren einer Nucleinsäure aufweist, wurde aus hochschlagzähem bzw.
-festem Polystyrol hergestellt. 3 zeigt
eine Struktur des hergestellten Einsatzes zur Reinigung von Nucleinsäure. Dieser
Einsatz zur Reinigung von Nucleinsäure weist eine Öffnung zum
Ansaugen einer Probe, einen Teil zur Aufnahme einer Nucleinsäure-adsorbierten
festen Phase und eine Öffnung zum
Ausbringen der Probe auf. Eine Ansaugpumpe wird mit der Öffnung zum
Ausbringen der Probe verbunden, um die Probe anzusaugen.
-
(2) Herstellung einer
festen Phase zur Reinigung von Nucleinsäure
-
Fuji
Mikrofilter FM45 (Fuji Photo Film K.K.) wurde als eine feste Phase
zum Adsorbieren von Nucleinsäure
verwendet. Diese feste Phase ist aus Triacetylcellulose (nicht verseift)
zusammengesetzt. Als eine vergleichende feste Phase, Fuji Mikrofilter
FR25 (Fuji Photo Film K.K.; Triacetylcellulose, die eine Porengröße von 2,5 μm und einen
Oberflächen-Verseifungsgrad
von 100% aufweist). Diese festen Phasen werden in dem Teil zur Aufnahme
einer Nucleinsäure-adsorbierenden festen
Phase des Einsatzes zur Reinigung von Nucleinsäure, welcher beim obigen (1)
hergestellt wurde, aufgenommen bzw. zurückgehalten.
-
(3) Herstellung von Adsorptionspuffer-Lösung und
Waschpuffer-Lösung
zur Reinigung von Nucleinsäure
-
Eine
Adsorptionspuffer-Lösung
und eine Waschpuffer-Lösung
zur Reinigung von Nucleinsäure,
deren Zusammensetzungen in Tabelle 1 gezeigt sind, wurden hergestellt.
-
-
(4) Prozess der Nucleinsäurereinigung
-
Eine
wässrige
Lösung,
die 1,3 kbp DNA (50 ng/μl)
enthielt, und eine wässrige
Lösung,
die menschliche Gesamt-RNA (50 ng/μl) enthielt, wurden hergestellt.
Zu 200 μl
jeder der wässrigen
DNA-Lösungen
wurden 200 μl
des Adsorptionspuffers und 200 μl
Ethanol gegeben und die Mischung wurde gerührt. Nach dem Rühren wurde
jede Flüssigkeit
unter Verwendung von Einsätzen
zur Reinigung der Nucleinsäure,
die die feste Phase zur Reinigung von Nucleinsäure aufwiesen, welche bei den
obigen (1) und (2) hergestellt wurden, aufgesaugt und ausgebracht.
-
Ferner
wurden Verunreinigungen auf dem Einsatz und der adsorbierenden festen
Phase durch Ansaugen und Ausbringen von 500 μl des Waschpuffers ausgewaschen.
-
Schließlich wurden
200 μl destilliertes
Wasser angesaugt um diese flüssige
Phase zu sammeln.
-
(5) Quantifizierung der
Menge gesammelter Nucleinsäure
-
Durch
Messen einer optischen Absorption jeder der gesammelten flüssigen Phasen
bei 260 nm wurde die Menge der gesammelten DNA quantifiziert. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 4 gezeigt.
Das Ergebnis von Agarosegelelektrophorese unter Verwendung der gesammelten
flüssigen
Phasen ist in 5 gezeigt.
-
-
Wie
von den Ergebnissen aus Tabelle 2 und 4 und 5 verstanden
wird, ist gefunden worden, dass RNA selektiv rückgewonnen werden kann, indem
man der Nucleinsäure
erlaubt, an die feste Phase aus Triacetylcellulose gemäß der vorliegenden
Erfindung adsorbiert zu werden.
-
Industrielle Anwendbarkeit
-
Durch
das Verfahren zur Trennung und Reinigung einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung, welche eine feste Phase verwendet, die ausgezeichnet
bei der Trennleistung, gut bei der Wascheffizienz, leicht zu prozessieren
und fähig
zur Massenproduktion von jenen, die im Wesentlichen dieselbe Trennleistung
aufweisen, ist, kann RNA aus der Nucleinsäure, die RNA und DNA enthält, getrennt
und gereinigt werden. Außerdem
werden die Arbeitsprozesse durch Verwendung der Einheit zur Trennung
und Reinigung von Nucleinsäure,
welche in der vorliegenden Beschreibung beschrieben wurde, einfach.
