DE3785038T2 - Monoklonale antikoerper gegen nicht reduzierte, nicht enzymatisch glykolysierte proteine. - Google Patents
Monoklonale antikoerper gegen nicht reduzierte, nicht enzymatisch glykolysierte proteine.Info
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Description
- Ein bei Diabetes Mellitus in menschlichen und tierischen Modellen beobachtete biochemische Schlüssel-Veränderung der Krankheit ist eine Zunahme der chemischen Bindung von Glukose an Proteine, welche ohne die Hilfe von Enzymen stattfindet ("nicht enzymatische Glykation", früher als "nicht enzymatische Glykosylierung" bezeichnet). Dies ergibt sich infolge der erhöhten Glukosekonzentration im Blut von unzureichend kontrollierten Diabetikern. Daher ist die Menge an nicht enzymatischer Glykosylierung eines bestimmten Proteins ein Hinweis dafür, wie gut ein Diabetiker seine oder ihre Glukosekonzentration im Blut einstellt, und kann auch bei der Vorhersage des Fortschreitens von bei Diabetes auftretenden Gewebekomplikationen, zum Beispiel Erkrankungen der Nieren, der Augen, der Mikrogefäße und des Nervensystems, von Nutzen sein.
- Bei vielen Proteinen wie Hämoglobin, Albumin, Fibrinogen, Fibrin, Lipoproteine geringer Dichte (LDL), Augenlinsenproteine, periphere Nervenproteine, interstitielle Kollagene und Basismembrankollagen Typ IV wurde festgestellt, daß sie bei diabetischen Patienten in größerem Ausmaß nicht enzymatisch glykosyliert sind als bei normalen Untersuchungspersonen. Die Glykosylierungsreaktion ergibt über nukleophile Addition eine Bindung von Glukose an Proteine, um eine Schiffsche Base zwischen Glukose und der N-endständigen Aminogruppe eines Polypeptids oder der Epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes in der Polypeptidkette zu bilden. Die Bildung der ursprünglichen Bindung (dem labilen Glukoseaddukt, welches über eine Aldiminbindung gebildet wird) ist reversibel. Daher erreicht die Schiffsche Base einen Gleichgewichtsgrad in vivo, der die vorhandenen Glukosekonzentrationen wiedergibt. Im kaufe der Zeit findet jedoch eine langsame chemische Umlagerung der Schiffschen Base statt (wird als "Amadori-Umlagerung" bezeichnet> , welche in der Bildung eines stabilen Ketoamins resultiert (das 1-Amino-1-deoxy-2-keto-Addukt, welches als "Amadori-Produkt" bezeichnet wird). Die Kinetiken dieser Reaktionen wurden durch Studien anhand der bei der Bildung des glykosylierten Amadori-Produktes, Hämoglobin A1c, involvierten Schritte dokumentiert.
- Im Rahmen der Gewebekomplikationen von Diabetes Mellitus impliziert die nicht enzymatische Glykosylierung verschiedener Proteine eine Anzahl pathologischer "Folgen", unter anderem das Fortschreiten von Nierenerkrankungen, die Bildung von grauem Star, Nervenleiden und Atherosklerose. Zum Beispiel verändert die Glykosylierung von Hämoglobin dessen Affinität zu Sauerstoff. Eine Augenlinsenglykosylierung bewirkt eine Linsentrübung und kann zur Entstehung von grauem Star beitragen. Eine Glykosylierung von Kollagen ändert das Ausmaß und eventuell den Typ der Kollagenvernetzung, was zur Versteifung der Gewebe führt. Eine Glykosylierung von LDL verändert die Aufnahme und den zellularen Abbau dieses Proteins. Die nicht enzymatische Glykosylierung von Fibronektin, Laminin und Kollagen Typ IV verändert die molekulare Assoziation dieser Moleküle untereinander und mit Heparansulfat-Proteoglykan und kann die Zusammensetzung von Basismembranen in Geweben, die von Diabeteskomplikationen betroffen sind, verändern.
- Die Entwicklung quantitativer Verfahren zur Messung der nicht enzymatischen Glykosylierung von Proteinen wurde hauptsächlich an Hämoglobin durchgeführt. Aufgrund der relativ langen Halbwertszeit roter Blutzellen (ungefähr 60 Tage) ergibt bei richtiger Durchführung der glykosylierte Hämoglobin-Assay einen retrospektiven Index der Glukoseeinstellung in Patienten, der mit durchschnittlichen Plasmaglukosekonzentrationen, über 24 Stunden gemessenen Glukosekonzentrationen im Urin und anderen Indexen metabolischer Kontrolle, welche über die vorhergehenden zwei bis drei Monate bestimmt wurden, gut korreliert.
- Die quantitative Bestimmung von Glukosylierungskonzentrationen in anderen Proteinen als Hämoglobin ist jedoch wichtig, da andere, leicht verfügbare Proteine in Plasma-, Urin- oder Gewebebiopsien Informationen über die Einstellung der Glykosylierung innerhalb unterschiedlicher Zeitabschnitte geben können. Zum Beispiel beträgt die Halbwertszeit von Albumin oder Lipoproteinen geringer Dichte 3 bis 5 Tage und die Messung der Glykosylierung dieser Proteine kann den Einstellungsgrad der Glukose über eine sehr kurze Zeitperiode angeben. Andererseits würde beispielsweise die quantitative Bestimmung den Glykosylierungsgrads von Hautkollagen (Halbwertszeit von ca. 2-3 Jahren) zeigen, da diabetische Patienten in der Lage sind, die Glukosekonzentrationen über eine weitaus längere Zeitperiode zu regulieren als diejenige, welche durch Messung von glykosyliertem Hämoglobin bestimmt werden kann.
- Es wurden Assays zur Messung des Gesamt-Glykosylierungsgrades der Hämoglobinform (Hämoglobin A), wie sie in Erwachsenen vorliegt, entwickelt. Diese glykosylierte Fraktion von Hämoglobin A (welche als "Hämoglobin A&sub1;", bezeichnet wird) wird durch Glukose an endständigen Valinresten der β-Kette und an Epsilon- Aminogruppen interner Lysinresten modifiziert und ist stärker negativ geladen als normales Hämoglobin A (nichtmodifiziertes Hämoglobin oder Hämoglobin A&sub0;). Hämoglobin A1c, ein weiteres, klinisch brauchbares Substrat zur Messung nicht enzymatischer Glykosylierung ist andererseits eine Unterfraktion von Hämoglobin A&sub1;, welche aus Hämoglobin A besteht, das durch eine Ketoaminverbindung an nur dem endständigen Valinrest der β- Kette glykosyliert ist.
- Immunologische Ansätze zur Messung des Levels nicht enzymatischer Glykosylierung von Hämoglobin wurden unter Verwendung eines Radioimmunoassays mit ¹²&sup5;I markiertem Antikörper versucht. Der erste dieser Ansätze basiert auf der Beobachtung, daß glykosylierte Produkte nicht in Hämolysaten roter Blutzellen von Schafen nachgewiesen werden können. Dies kann dadurch bedingt sein, daß das Hämoglobin von Schafen nicht die "Diphosphoglycerat-Tasche" aufweist, welche die Glykosylierung der N-endständigen Gruppe der β-Kette von Hämoglobin ermöglicht. Wie es in Brit. J. Haematoloqy, 38, 329 (1978), J. Javid et al., offenbart ist, erkennt das Schaf die N-endständige Gruppe menschlichen Hämoglobins A1c daher als Fremdkörper und erzeugt dagegen einen Antikörper. Dieser polyklonale Antikörper ist jedoch schwierig zu vermehren und er geht auch eine Kreuzreaktion mit Hämoglobin A1a und Hämoglobin A1b ein, welche chromatographisch stabile Komponenten des Hämoglobins A&sub1; sind, die sich von der A1c-Spezies unterscheiden. Die A1c-Antisera müssen ebenfalls, auf Kosten eines beträchtlichen Verlustes von Antikörpertiter, wiederholt mit an Agarose-gebundenem Hämoglobin A&sub0; absorbiert werden. Die Beobachtung, daß der Antikörper gegen menschliches A1c weniger gut mit Hämoglobin A1c von Hunden und Mäusen reagiert, deutet auch auf die Möglichkeit, daß die sterische Struktur des Antikörpers mehr als das Zuckermolekül umfaßt und sich wahrscheinlich auf Oberflächenmerkmale des Proteins in der Nähe der Glukosemodifikation erstreckt.
- In J. Clin. Invest., 72, von L.K. Curtiss et al., 1427 (1983) ist die Bildung monoklonaler Murin-Antikörper offenbart, welche mit nicht enzymatisch glykosyliertem Murin-Lipoprotein geringer Dichte reagieren. Die Glukoseaddukte auf dem Protein mußten jedoch zunächst chemisch mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid reduziert werden, um einen immunogenen Hexosealkohol (Glucitol-Lysin) zu erhalten, da die Autoren keinen Erfolg dabei hatten, monoklonale Antikörper gegen die nicht reduzierten Addukten, welche auf Proteinen in diabetischen Geweben (der labilen Schiffschen Base oder dem Amadori- Produkt) natürlich vorgefunden werden, zu vermehren. Es wäre daher auch erforderlich, die Zielproteine in einer Testprobe auf ähnliche Weise zu reduzieren, um Glucitol-Lysin-Reste zu erzeugen, um eine Reaktion mit dem Antikörper zu erhalten. Die klinische Nutzbarkeit dieses Verfahrens muß erst noch ermittelt werden, besonders, da der Nachweis verschiedener glykosylierter Epsilon-Aminogruppen von Lysin auf einem Protein auf diejenigen beschränkt ist, welche durch chemische Reduziermittel in vitro selektiv reduziert werden können. L.K. Curtis et al. geben keinen Hinweis darauf, daß monoklonale Antikörper gegen nicht reduzierte, glykosylierte Proteinen gezüchtet werden könnten. Die antigenen Eigenschaften solcher nicht reduzierter Proteine sind unerwartet, insbesondere im Hinblick auf die Betonung der Reduktion im Stand der Technik.
- Es besteht daher ein Bedarf an monoklonalen Antikörpern, die die nicht modifizierte Schiffsche Base oder Amadori-Glukoseaddukte erkennen und mit diesen selektiv reagieren, welche aus der nicht enzymatischen Glykosylierung von Proteinen resultieren, zum Beispiel Proteine, die mit physiologischen Flüssigkeiten wie Blut und Lymphflüssigkeit assoziiert sind.
- Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper (MCA) zur Verfügung, welcher sich an ein Epitop auf einem nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Plasmaprotein bindet, und welcher im wesentlichen frei von Kreuzreaktivität mit dem entsprechenden, nicht glykosylierten Plasmaprotein ist. Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Hybridom gerichtet, welches durch ein Verfahren erzeugt wird, das folgendes umfaßt:
- (a) Immunisieren von Säuger-B-Lymphozyten mit einem nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Plasmaprotein,
- (b) Gewinnen der immunisierten B-Lymphozyten;
- (c) Fusion der gewonnenen B-Lymphozyten mit bösartigen Säuger-B-Lymphozyten, um Hybridome zu erzeugen;
- (d) Auswählen eines Hybridoms aus diesen Hybridomen, welche einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der sich an ein Epitop auf einem nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Plasmaprotein bindet, und welcher im wesentlichen frei von Kreuzreaktivität mit dem entsprechenden, nicht glykosylierten Plasmaprotein ist; und
- (e) klonisches Expandieren des ausgewählten Hybridoms.
- Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Maus oder ein anderer Säuger mit einem Immunogen immunisiert, welches ein nicht reduziertes, nicht enzymatisch glykosyliertes Murin-Blutplasmaprotein umfaßt, und die B-Lymphozyten werden aus der Milz des immunisierten Säugers gewonnen. Diese Lymphozyten können mit Murinmyelomzellen fusioniert werden, um Hybridome zu ergeben. Die Hybridome oder die sie umgebenden Wachstumsmedien können auf das Vorhandensein des gewünschten MCAs hin getestet werden, z. B. auf einen, der eine differentielle Reaktion zwischen dem nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Plasmaprotein, welches für die Immunisierung verwendet wurde, und dem entsprechenden, nicht glykosylierten Plasmaprotein aufweist. Die bevorzugten Hybridome scheiden MCAs aus, welche die Fähigkeit zur Differenzierung zwischen den nicht glykosylierten und den nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Formen eines menschlichen Serums oder Plasmaproteinen wie Transferrin, Albumin, Fibronektin und dergleichen aufweisen.
- Daher werden gemäß der vorliegenden Erfindung monoklonale Antikörper zur Verfügung gestellt, welche eine differentielle Reaktivität zwischen nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Plasmaproteinen und den entsprechenden, nicht glykosylierten Plasmaproteinen aufweisen, in dem Ausmaß, daß sie im wesentlichen frei von Kreuzreaktivität mit nicht glykosylierten Plasmaproteinen sind. Im Enzymimmunoassay (ELISA) zum Beispiel, der für das differentielle Screenen von monoklonalen Antikörpern, welche in den oben genannten Hybridomen erzeugt werden, eingesetzt wird, erhöhen monoklonale Antikörper, die mindestens zu 35 %, und bevorzugt mindestens zu 75 % erhalten werden, die Absorptionseinheiten (A), wenn sie mit einem nicht reduzierten, glykosylierten Protein gegenüber dem entsprechenden, nicht glykosylierten, normalen Protein reagieren, wobei sie eine brauchbare differentielle Erkennungsfähigkeit bezüglich dieser Proteine aufweisen können.
- Ferner können sich die vorliegenden MCAs selektiv an das nicht reduzierte, glykosylierte Glied eines zweiten glykosylierten/nicht glykosylierten Proteinpaares binden, und die Bindung kann selektiver sein als die Bindung an das erste glykosylierte Protein, welches in dem Immunisierungsschritt (a) verwendet wurde, gegenüber dem entsprechenden, nicht glykosylierten ersten Protein. Ein MCA zum Beispiel, welcher durch Immunisierung mit einem glykosylierten Murinprotein erzeugt wurde, kann ein größeres Maß an Selektivität bezüglich seiner Bindung an ein menschliches glykosyliertes Protein aufweisen.
- In seiner erfindungsgemäßen Verwendung bezüglich Plasma- oder Serumproteinen bedeutet der Ausdruck "nicht reduziert", daß die Schiffsche Base oder ihr entsprechendes Ketoaminprodukt, welches gebildet wird, wenn Plasmaproteine in vitro oder in vivo nicht enzymatisch glykosyliert werden, keiner weiteren chemischen Reduktion in vitro ausgesetzt wird, d. h. um die Stabilität der Glukose-Protein-Bindung zu erhöhen. Daher erzeugen die vorliegenden Hybridome Antikörper, die Epitope erkennen können, welche mit der ursprünglichen Glukosemodifizierung des Plasmaproteins assoziiert sind. Im Gegensatz zu der Offenbarung von L.K. Curtiss et al., supra, ist eine Reduktion der "natürlichen" Glukose-Protein-Addukte zur Zucker- Alkohol-Form (Glucitol-Lysin) zur Erzeugung von Antikörpern oder zur Messung einer nicht enzymatischen Protein-Glykosylierung nicht notwendig. Daher ist der qualitative oder quantitative Reduktionsgrad des in vitro erzeugten immunogenen Proteins nicht ein Faktor bei der Herstellung der vorliegenden Hybridome oder in der Spezifität der dadurch erzeugten monoklonalen Antikörper.
- Schließlich erhöht sich das Maß der Bindung der MCAs der vorliegenden Erfindung an ein vorhandenes, nicht reduziertes, nicht enzymatisch glykosyliertes Protein im Verhältnis zu der Anzahl glykosylierter Stellen auf dem Zielprotein. Diese Eigenschaft erleichtert die Fähigkeit der MCAs, das Ausmaß sowie das Vorhandensein von Plasmaproteinglykosylierung nachzuweisen.
- Obwohl die vorliegenden monoklonalen Antikörper vorwiegend durch ihre Fähigkeit zur Reaktion mit nicht enzymatisch glykosylierten Proteinen, welche in Blutserum oder -plasma vorhanden sind, gekennzeichnet sind, wird erwartet, daß diese monoklonalen Antikörper die Fähigkeit haben, sich an nicht enzymatisch glykosylierte Proteine, welche in Geweben oder anderen physiologischen Flüssigkeiten wie Speichel, Lymphe, Urin, Sperma, Augenflüssigkeiten und dergleichen vorhanden sind, selektiv zu binden. Daher ist die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Proteins in einer Probe eines Gewebes oder einer physiologischen Flüssigkeit, wie einer Blut- oder Urinprobe, gerichtet, welches das Umsetzen dieser Probe mit einem monoklonalem Antikörper der vorliegenden Erfindung umfaßt, der sich an ein Epitop auf diesem nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Protein bindet, wobei der MCA im wesentlichen frei von Kreuzreaktivität mit dem entsprechenden nicht glykosylierten Serumprotein ist. Das Vorhandensein des MCA-Protein-Komplexes kann durch einen Assay bestimmt werden, der das Umsetzen des MCA- Protein-Komplexes mit einem zweiten Antikörper umfaßt, welcher an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, wobei dieser Antikörper sich an eine Stelle auf dem MCA bindet. Die Einzelheiten eines Enzymimmunoassays (ELISA), der einen zweiten Antikörper, welcher mit einem Enzym markiert ist, verwendet, wird nachstehend vollständig aufgezeigt.
- Die üblichen Verfahren zum Erzeugen monoklonaler Antikörper basieren auf der Fusion immunisierter Säuger-B-Lymphozyten mit bösartigen Säuger-B-Lymphozyten. Zum Beispiel lassen sich Milz-Lymphozyten mit bösartigen Zellen (Myelomen) von primären Knochenmarktumoren fusionieren [C. Milstein, Sci. Am., 243, 66 (1980)]. Die Verfahren ergeben fusionierte Zellhybride oder Hybridome, die durch Klonierung vermehrt werden können, um eine Reihe von Hybridzellinien zu ergeben, von denen jede von einem einzelnen Hybridom oder einem einzelnen Klon abgeleitet wird.
- Jedes Hybridom besitzt Eigenschaften sowohl der Lymphozyten als auch der Myelomzellinien. Wie die von Tieren entnommenen Lymphozyten, die mit roten Blutzellen von Schafen als Antigene behandelt ("primed") wurden, sekretieren die Hybridome Antikörper (Immunoglobuline) ab, welche mit dem Antigen reagieren. Überdies sind die Hybridome, wie die Myelomzellinien, unsterblich. Während Antisera, die geimpften Tieren entnommen wurden, variable Mischungen von Antikörpern sind, die sich nicht identisch reproduzieren lassen, ist insbesondere der einzelne Typ von Immunoglobulin, der von einem Hybridom sekretiert wird, für eine und nur für eine antigene Determinante auf dem Antigen spezifisch, ein komplexes Molekül mit einer Vielzahl von antigenen molekularen Unterstrukturen, oder Determinanten (Epitopen). Wenn zum Beispiel das Antigen ein glykosyliertes Protein ist, dann kann das Epitop eine der vielen molekularen Unterstrukturen sein, welche mit den Glukose-Aminosäuren- Verbindungen assoziiert ist. Somit können sich monoklonale Antikörper, welche gegen ein einziges Antigen gebildet werden, je nach der Determinante, welche ihre Erzeugung bewirkt hatte, voneinander unterscheiden. Alle von einem bestimmten Klon erzeugten Antikörper sind jedoch identisch. Weiterhin können bevorzugte Hybridomzellinien unbestimmt reproduziert werden, lassen sich leicht in vitro oder in vivo vermehren und können monoklonale Antikörper in äußerst hohen Konzentrationen ergeben.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Antigene, die zur Immunisierung des Säugers, welcher die B-Lymphozyten erzeugt, verwendet werden können, aus einer großen Vielzahl nicht reduzierter, nicht enzymatisch glykosylierter Blutplasma-Proteine ausgewählt werden. Derartige Proteine schließen Laminin, Albumin, Immunoglobulin, Transferrin, Lipoproteine geringer Dichte, Fibrinogen, Fibronektin, Plasminogen, Plasmin und Mischungen daraus ein. Es können zum Beispiel nicht reduzierte, nicht enzymatisch glykosylierte Serumproteine als antigenes Präparat verwendet werden.
- Allgemeine Verfahren zur Herstellung nicht enzymatisch glykosylierter Proteine aus verschiedenen Proteinen wurden entwickelt, z. B. von J.F. Tarsio et al., Diabetes, 34, 477 (1985), deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme miteingeschlossen ist. In einem typischen Verfahren wird eine Mischung des Proteins bzw. der Proteine in einer gepufferten, physiologischen Salzlösung wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit D-Glukose 10 bis 20 Tage lang unter Umgebungsbedingungen inkubiert, vorzugsweise in Anwesenheit einer wirkungsvollen Menge von Proteaseinhibitoren und Konservierungsstoffen. Das glykosylierte Protein kann durch Dialyse isoliert, in einer physiologischen Salzlösung wiederaufgelöst werden, um die gewünschte Konzentration zu erhalten, und eine wirkungsvolle Menge dessen kann zur Immunisierung des Säugers verwendet werden. Vorzugsweise wird die Anzahl von Säuger-B-Zellen, welche Antikörper erzeugen, die mit dem Immunogen reagieren können, durch zusätzliche Immunisierungen ("Boosting") erhöht. Es sind auch Verfahren zur in vitro Immunisierung von Säuger-Lymphozyten verfügbar.
- Obwohl nicht reduzierte, nicht enzymatisch glykosylierte Murin-Serumproteine passende Immunogene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, können andere, nicht reduzierte, glykosylierte Säuger-Proteine, wie die von Menschen, Schafen, Ziegen, Kaninchen und dergleichen, ebenfalls verwendet werden. Natürlich abgeleitete oder chemisch synthetisierte immunogene Fragmente derartiger Proteine können ebenfalls im Immunisierungsprotokoll verwendet werden, und derartige Fragmente sollen in dem Begriff "nicht reduziertes, nicht enzymatisch glykosyliertes Plasmaprotein" eingeschlossen sein.
- Somatische Zellen mit dem Potential, Antikörper zu erzeugen, und insbesondere B-Lymphozyten, sind zur Fusion mit einer B- Zellen-Myelom-Linie geeignet. Diejenigen Antikörper erzeugende Zellen, bei denen eine Mitose stattfindet, fusionieren bevorzugt. Lymphknoten und Milz der behandelten ("primed") Tiere sind bequeme lymphatische Organe zur Verwendung in dem vorliegenden Fusionssystem. Einmal behandelte ("primed") oder hyperimmunisierte Tiere können als Quelle von Antikörper produzierenden Lymphozyten verwendet werden. Mäuse- und Rattenlymphozyten ergeben einen höheren Prozentsatz stabiler Fusionen mit den nachstehend beschriebenen Maus-Myelom-Linien. Die Verwendung von Kaninchen-, Menschen-, Primaten- und Froschzellen ist ebenfalls möglich. In den bevorzugten Ausführungsformen werden hyperimmunisierte Mäusemilzzellen dazu verwendet, die fusionierten Zellhybriden oder Hybridome zu erzeugen.
- Spezialisierte Myelomzellinien wurden aus Lymphozytentumoren zur Verwendung in Hybridome-erzeugenden Fusionsverfahren entwickelt [G. Kohler und C. Milstein, Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976); M. Shulman, et al., Nature, 276, 269 (1978)]. Die Zellinien wurde entwickelt, um die Selektion fusionierter Hybridome unter nicht fusionierten und ähnlich sich unbestimmt selbst vermehrenden Myelomzellen zu erleichtern, indem Myelome mit Enzym-Schwächen verwendet werden, welche sie zum Wachstum in gewissen selektiven Medien, die das Wachstum von Hybridomen unterstützen, unfähig machen. Ferner können Myelomzellinien, die zur Erzeugung leichter oder schwerer Immunoglobulinketten unfähig sind, oder solche, die nicht ausreichend Antikörpersekretionsmechanismen haben, verwendet werden. Ein dritter Grund zur Selektion von Zellinien ist ihre Eignung zur und Effizienz bei der Fusion.
- Mehrere Myelomzell-Linien können für die Herstellung fusionierter Zellhybriden verwendet werden, einschließlich P3/X63- AG 8.653, P3/NSI/1-Ag 4.1 ("NS-1"), Sp2/O-Ag14 und S194/5.XXO.BU.1. Die Zellinien P3/X63-Ag 8 und P3/NSI/1-Ag 4.1 wurden von Kohler und Milstein, [Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976)] und von J. Kearney et al, J. Immunol., 123, 1548 (1979) beschrieben. Shulman et al., Nature, 276, 269 (1978), entwickelte die Myelom-Linie Sp2/O-Ag14. Über die Myelom-Linie S194/5.XXO.BU.1 wurde in einem Artikel von Trowbridge [J. Ex-. Med., 148, 313 (1979)] berichtet.
- Verfahren zur Erzeugung von Hybriden von Antikörper-erzeugenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen üblicherweise das Mischen somatischer Zellen mit Myelomzellen in Anwesenheit eines Mittels bzw. Mitteln, welche die Fusion von Zellmembranen fördern. Bevorzugt dienen dieselben Tierspezien als Quelle der somatischen und Myelomzellen, die in dem Fusionsvorgang verwendet werden. Die Fusionsverfahren wurde von Kohler und Milstein in Nature, 256, 495 (1975) und Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976) und von Gafter et al. in Somatic Cell Genet., 3, 231 (1977) beschrieben. Die eine Fusion fördernden Mittel, welche von diesen Forschern verwendet wurden, waren Sendai-Virus bzw. Polyethylenglykol (PEG).
- Allgemein wird die Selektion fusionierter Zellhybride durch Kultivierung der Zellen in Medien bewirkt, welche das Wachstum von Hybridomen unterstützen, aber das Wachstum der nicht fusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unbestimmt weiter teilen würde, verhindern. Im Beispiel der vorliegenden Erfindung wurden Myelomzellen, denen die Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT&supmin;) fehlte, verwendet. Diese Zellen werden im Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-(HAT)-Medium selektiert, einem Medium, in dem die fusionierten Zellhybride aufgrund des HPRT-positiven Phenotyps der Milzzellen überleben. Die Verwendung von Myelomzellen mit unterschiedlichen genetischen Schwächen (z. B. andere Enzymschwächen, Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, und dergleichen), welche in Medien selektiert werden können, die das Wachstum genotypisch kompetenter Hybride unterstützen, ist ebenfalls möglich.
- Mehrere Wochen können erforderlich sein, um die fusionierten Zellhybride selektiv zu kultivieren. In dieser Zeitperiode ist es frühzeitig erforderlich, diejenigen Hybridome zu identifizieren, welche den gewünschten Antikörper erzeugen, so daß sie anschließend kloniert und vermehrt werden können. Der Nachweis von Antikörper produzierenden Hybriden kann durch ein beliebiges der mehreren Standard-Assayverfahren erfolgen, einschließlich indirektem Immunofluoreszenz-Enzymimmunoassay (ELISA) und Radioimmunoassay-Tecbniken, welche in der Literatur beschrieben sind [R. Kennet, T. McKearn und K. Bechtol (Herausgeber), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; a New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, New York (1980), Seiten 376- 384]
- Sind die gewünschten fusionierten Zellhybriden erst einmal selektiert und in die individuellen Antikörper-produzierenden Zellinien kloniert, dann kann jede Zellinie in einem der beiden Standard-Verfahren vermehrt werden. Eine Probe des Hybridoms kann in ein histokompatibles Tier desjenigen Typs injiziert werden, welcher verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion zu erhalten. Bei dem injizierten Tier entwickelt sich ein bösartiger Aszites oder große Tumoren, welche den spezifischen monoklonalen Antikörper ausscheiden, welcher von dem fusionierten Zellhybrid erzeugt wird. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie Serum oder Aszites-Flüssigkeit, können entnommen werden, um monoklonale Antikörper in hoher Konzentration zu erhalten. Alternativ können die individuellen Zellinien in vitro in Labor-Kultivierungsgefäßen vermehrt werden. Das Kulturmedium, welches ebenfalls hohe Konzentrationen eines einzelnen, spezifischen monoklonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantation, Filtrierung oder Zentrifugierung gewonnen und der Antikörper daraus isoliert werden.
- Die Bindungsspezifität der vorliegenden monoklonalen Antikörper bezüglich glykosylierter Proteine kann auch mittels eines differentiellen Enzymimmunoassays bestimmt werden. In diesem Assay wird eine bekannte Menge des glykosylierten Proteins oder des nicht glykosylierten Kontroll-Proteins in den Vertiefungen einer Testplatte physisch immobilisiert und mit einem Überschuß des monoklonalen Antikörpers in Kontakt gebracht, beispielsweise durch Zugabe eines Teils verbrauchten Kulturmediums eines bestimmten Hybridoms. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird der Protein-MCA-Komplex gewaschen, um nicht gebundenen MCA daraus zu entfernen, und der gebundene MCA wird mit einem im Handel erhältlichen Anti-Maus-Antikörper nachgewiesen, welcher an einen nachweisbaren Marker wie Fluorescein-Isothiocyanat oder eine Peroxidase gebunden ist. Das Vorhandensein des Peroxidase-Konjugats kann kolorimetrisch in Absorptionseinheiten gemessen werden, indem es mit einem Entwickler in Kontakt gebracht wird, wie o-Phenylendiamin. Die Differenz der Absorptionswerte (A), falls vorhanden, die für das glykosylierte Protein gegenüber dem nicht glykosylierten Kontroll-Protein beobachtet wird, liefert ein Vergleichsmaß in Bezug auf die Fähigkeit eines bestimmten MCAs, ein Epitop zu binden, welches mit einer Glykosylierungsstelle assoziiert ist.
- Der differentielle ELISA kann auch zum Nachweis des Grades der Glykosylierung eines Proteins oder von Proteinen, die in einer physiologischen Flüssigkeit eines Säugers, der bekannterweise oder vermutlich Diabetiker ist, vorhanden sind, verwendet werden. Eine Probe der dem Säuger entnommenen Flüssigkeit, zum Beispiel Blutserum, kann wie beispielsweise in den Vertiefungen einer Testplatte immobilisiert werden, und das Ausmaß der Bindung an einen MCA der vorliegenden Erfindung kann in Vergleich mit einer immobilisierten Flüssigkeitsprobe eines nicht diabetischen Kontroll-Säugers bestimmt werden. Der relative Grad der Glykosylierung des Zielproteins kann dann empirisch mit dem Ausmaß der verwandten Gewebepathologie korreliert werden.
- Die Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele beschrieben.
- Nicht enzymatisch glykosylierte Mäuse-Proteine wurden erzeugt und als Antigene zur Stimulierung der Antikörper-Erzeugung in Balb/c-Mäusen verwendet. Zwei separate Murin-Protein-Präparate wurden dazu verwendet, nicht enzymatisch glykosyliertes Mäuse- Laminin- und nicht enzymatisch glykosylierte Serum-Proteine zu immunisieren.
- Laminin, ein extrazelluläres Matrixprotein mit einem Molekulargewicht von 850000 wurde zunächst durch das Verfahren von S.L. Palm et al., in J. Cell Biol., 96, 1218 (1983) aus dem Mäuse-EHS-Tumor purifiziert. Das purifizierte Laminin (25 mg) von 1 mg/ml wurde dann 12 Tage lang bei 37ºC mit 500mM D- Glukose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4), welche 1 mM Natriumazid als Konservierungsstoff enthielt, inkubiert. Das Protein wurde über diese lange Zeitperiode der in vitro Inkubation hinweg durch Zugabe von Proteaseinhibitoren auf eine Endkonzentration von 372.2 mg/l Dinatriumethylendiamintetraacetat (Na&sub2;-EDTA), 34,8 mg/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,7 mg/l Pepstatin A, 0,5 mg/l Leupeptin und 4,5 Trypsin-hemmenden Einheiten Aprotinin/ml (alle von Sigina Chemical Co., St. Louis, Missouri, V. St. v. A.) vor einem proteolytischen Abbau geschützt. Nach 12 Tagen der Inkubation wurden nicht reaktive Zucker, Azid und Proteaseinhibitoren durch Dialyse gegen sechs Austauschmengen von 2 1 PBS- Puffer entfernt.
- Das zweite Antigenpräparat bestand aus Maus-glykosylierten Gesamtserumproteinen. Sie wurde hergestellt, indem Blut durch Herzpunktur aus 9 Balb/c Mäusen (16 Wochen alt, männlich oder weiblich) entnommen wurde, das Blut 30 Minuten bei Raumtemperatur (unter mäßiger Hämolyse) zum Gerinnen stehengelassen und das Serum entnommen wurde. Das Serum wurde dann in vitro mit 500 mM D-Glukose und Protease-Inhibitoren inkubiert und wie oben beschrieben einer Dialyse unterzogen, um nicht enzymatisch glykosylierte Serumproteine zu erhalten.
- Nicht enzymatisch glykosyliertes Laminin (25 ug) wurde in 0,1 ml PBS Puffer suspendiert und mit 0,1 ml vollständigem Freundschen Adjuvans gemischt und jeder von fünf weiblichen Balb/c Mäusen (8 Wochen alt) intraperitoneal (i.p.) injiziert. Nicht enzymatisch glykosylierte Gesamtserum-Proteine wurden in PBS suspendiert und zur Verabreichung wie bei nicht enzymatisch glykosyliertem Laminin hergestellt und i.p. 5 anderen Mäusen, wie oben bei Laminin beschrieben, injiziert. Am 22. und 76. Tag wurden den Mäusen, welche die Anfangsinjektion nicht enzymatisch glykosylierten Laminins erhalten hatten, Sekundärinjektionen von 20 ug nicht enzymatisch glykosyliertem Laminins (gLMN) in unvollständigem Freundschen Adjuvans i.p. verabreicht. Ebenso wurden 25 ug nicht enzymatisch glykosylierter Serumproteine (gTSP) zu diesen Zeiten in unvollständigem Freundschen Adjuvans den Mäusen, welche die anfängliche gTSP-Injektion erhalten hatten, i.p. verabreicht. Drei Tage vor der Fusion (83. Tag) wurden den Mäusen i.p. Injektionen von 25 ug gLMN oder gTSP, wie oben für die sekundäre Immunisierung beschrieben, verabreicht.
- Hybridome wurden durch zwei separate Fusionen hergestellt. Eine Fusion wurde durch Inkubation von Milzzellen einer gLMN- immunisierten Maus mit P3/NSI/1-Ag 4,1 Mäusemyelomzellen durchgeführt, und die andere Fusion bestand darin, Milzzellen einer gTSP-immunisierten Maus mit P3/NSI/1-Ag 4,1 Zellen zu mischen. Die Fusionen erfolgten in Anwesenheit von 35 % (Gew./V.) Polyethylenglykol-1000 im Verhältnis von 10 Milzzellen/Myelomzelle (eine Milz ergibt 1·10&sup8; Zellen und wird mit 1·10&sup7; NS-1 Myelomzellen gemischt), wie es von G. Galfre et al., Nature, 266, 550 (1977) beschrieben wurde, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme miteingeschlossen ist. Zellpräparate wurden dann in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen in 1 ml Standard-HAT-Medium (Dulbecco's Minimal Essential Medium mit einem Gehalt von 12 mM Hypoxanthin, 9 uM Aminopterin und 8 mM Thymidin), welches 20 % (vol./vol.) Pferdeserum enthielt, ausplattiert (2·10&sup6; Zellen pro Vertiefung). Dies ergab 72 Vertiefungen mit der gLMN-immunisierten Milz · NS-1 Myelomzellen (als Fusionen 1 bis 72 bezeichnet) und 72 Vertiefungen mit der gTSP-immunisierten Milz · NS-1 Zellen (als Fusionen 73 bis 144 bezeichnet).
- Nach drei Tagen wurden 50 % des Mediums in jeder Vertiefung entfernt, weggeschüttet und durch dieselbe Menge frischen HAT- Mediums mit einem Gehalt von 20 % Pferdeserum ersetzt. Die Zellen wurden dann auf diese Weise am 6., 9. und 12. Tag nach der Fusion genährt und das verbrauchte Medium, welches am 12. Tag entfernt wurde, blieb für das Screening auf spezifische Antikörperproduktion (wie nachstehend beschrieben) gefroren (bei -10ºC). Am und nach dem 14. Tag ab der anfänglichen Fusion wurden die Zellen der Fusionen, welche das beste Wachstum zeigten und im nachstehend beschriebenen differentiellen Screening-Vorgang positiv waren, durch Klonen expandiert. Die Zellen wurden auf eine Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Konzentration von 1 Zelle/Vertiefung in 0,2 ml HAT- Medium, das 20 % Serum und 10 % (V/V) normales, mit Milzzellen aufbereitetes Medium enthielt, ausplattiert [G. Galfre et al., Methods Enzvmol., 73, 1-46 (1981)]. Das Wachstum wurde über die nächsten drei Wochen mikroskopisch verfolgt und die Vertiefungen, die einen Klon pro Vertiefung zeigten, wurden für das Screening auf spezifische Antikörpererzeugung selektiert. Jeder Klon wurde mit der ursprünglichen Fusionsnummer gekennzeichnet (d. h. 1-144), gefolgt von einem Trennstrich und der Buchstaben- und Zahlenbezeichnung derjenigen Vertiefung innerhalb der Mikrotiterplatte, in der der Klon erzeugt wurde. Zum Beispiel bezeichnet 10-C10 die 10. Fusionsvertiefung (wobei auch angezeigt wird, daß gLMN das Antigen war), die eine klonale Zellinie in der Vertiefung C10 der Mikrotiterplatte erzeugte. Als weiteres Beispiel würde 83-D10 die 83. ursprüngliche Fusionsvertiefung (wobei auch angezeigt wird, daß gTSP das Antigen war) und die Stelle des Klons in dieser Mikrotiterplatte (D10) bezeichnen.
- Die Wahl der Klone, welche weiter vermehrt werden würden, erfolgte auf der Grundlage der Ergebnisse eines differentiellen Enzymimmunoadsorptions-Screeningverfahrens, welches einen Klon nachweist, der eine gute Antikörper-Reaktion gegenüber seinem nicht enzymatisch glykosylierten Immunogen (gLMN oder gTSP), aber nicht gegenüber Proteinpräparaten, die nicht nicht-enzymatisch in vitro glykosyliert wurden (cLMN oder cTSP, welche jeweils Kontrollaminin bzw. Kontroll-Gesamtserumproteine bezeichnen), aufweist. Die nicht glykosylierten Kontrollproteine wurden wie für die oben beschriebenen nicht enzymatisch glykosylierten Proteine behandelt, mit der Ausnahme, daß der Inkubationsmischung Glukose zugegeben wurde.
- In den ELISA-Assays wurden 5 ug eines jeden Antigens oder seines jeweiligen Kontrollproteins mit 1 ml PBS-Puffer aufgefüllt und 0,1 ml wurde in jede Vertiefung einer Polystyrol- Mikrotiterplatte enthaltend 96 Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden mit Selbstklebefilm abgedeckt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dann bei 4ºC gelagert, bis sie gebrauchsfertig waren.
- Vor der Verwendung wurden die Platten 5 mal unter Verwendung eines Nunc Immune Wash 12 mit PBS-Tween [hergestellt durch Mischen von 200 ml eines 10 · PBS mit 42,4 g NaCl, Auffüllen des Volumens mit destilliertem Wasser auf 2 l, Zugabe von 10 ml Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat (Tween® 20) und Einstellen des pH-Wertes auf 8,0] gewaschen. Jegliches, in den Vertiefungen verbleibendes PBS-Tween® wurde von der Platte mit absorbierenden Papiertücher trockengeblottet.
- Verbrauchtes Medium (100 ul), das aus einer bestimmten klonierten Zelle entfernt wurde, wurde anschließend in jede Vertiefung gegeben, die das immobilisierte gLMN-Antigen oder das cLMN-Protein für jedes Klon enthielt, welches aus den Fusionen 1 bis 72 erhalten wurde. Gleichfalls wurden 100 ul verbrauchten Mediums aus jedem Klon aus den Fusionen 73 bis 144 einer jeden Vertiefung zugesetzt, welche immobilisiertes gTSP oder cTSP enthielt. Die Platten wurden dann 2 Stunden lang bei 37ºC unter mäßigem Schütteln auf einem Schüttelapparat mit kreisförmiger Plattform inkubiert. Nach 2 Stunden wurde die Platten 5 mal gewaschen, wie oben für PBS-Tween® beschrieben. Peroxidase-konjugierte Ziegen-Antimaus-Immunoglobuline (IgA, IgG und IgM, spezifisch schwer- und leichtkettig) (Cooper Biomedical, West Chester, PA) (100 ul), verdünnt auf 1 : 500 in PBS-Tween®, wurden dann in die Vertiefungen der Mikrotiter-Platte gegeben. Die Platten wurden dann bei 37ºC 2 Stunden wie oben beschrieben inkubiert. Nach 2 Stunden Inkubation mit dem markierten Antikörper wurden die Platten 5 mal mit PBS-Tween® gewaschen und 100 ul der Substratlösung wurden in jede Vertiefung gegeben (Substratlösung bestand aus 50 ul 30 % Wasserstoffperoxid und 20 mg Orthopenylendiamin in 50 ml PBS-Tween®). Ca. 5-10 Minuten nach der Zugabe von Substratlösung begann die Lösung in den positiven Vertiefungen braun zu werden. Nach 10-15 Minuten (bevor die Vertiefungen eine starke Braunfärbung erreichten) wurden 50 ul 2,5 M H&sub2;SO&sub4; in jede Vertiefung gegeben, um die Farbentwicklungsreaktion zum Stillstand zu bringen. Die Platten wurden dann mit einem Micro-ELISA-Ablesegerät bei 490 nm gelesen. Das Ablesegerät wurde dann unter Verwendung von Kontrollvertiefungen, die aufbereitetes Medium eines nicht verwandten Hybridomklons enthielten (die nicht gegen glykosylierten Proteine oder ihre normalen Gegenstücke erzeugt wurden), so nahe wie möglich auf Null eingestellt. Daher wurden IgA-, IgG- oder IgM-ausscheidende Hybridomklone, welche glykosylierte Antigene sehr gut erkannten, in diesem Assay durch Ablesen mit hoher Absorption (ca. 25 bis 150 % mehr glykosylierte Antigene gLMN oder gTSP als bei den entsprechenden Kontrollantigenen cLMN oder cTSP) nachgewiesen.
- Von den 144 plattierten Fusionsvertiefungen ergaben 21 Fusionsprodukte anfangs Hybridome, welche gut wuchsen und in einem Assay mit dem oben beschriebenen, differentiellen Screeningverfahren positive Ergebnisse zeigten (13 für das gLMN-Antigen und 8 für das gTSP-Antigen). Elf dieser 21 Fusionsprodukte wuchsen weiterhin gut, zeigten keine mikrobielle Kontamination und wurde zum Klonieren ausgewählt (Nummern 2, 10, 26 und 49 aus der gLMN-Fusion und Nummern 74, 80, 83, 84, 88, 89 und 100 der gTSP-Fusionen). Mehrere Fusionsvertiefungen erzeugten keine Klone (Nummern 2, 49, 88 und 100). Die Anzahl der erhaltenen Klone pro 96 Vertiefungen für jede der verbleibenden Fusionen schwankte (im Bereich von insgesamt 3 Klone für Fusion Nr. 26 bis zu einer Gesamtzahl von 29 Klone für Fusion Nr. 84). Wurden Klone, die weiterhin ein gutes Wachstum zeigten, mit dem oben beschriebenen, differentiellen Screening-Verfahren gescreent, dann wurden insgesamt 4 positive Hybridome für die gLMN-Fusionen (Tabelle I) und 19 positive Hybridome für die gTSP-Fusionen (siehe Tabelle II) nachgewiesen. Tabelle I Differentielles Screenen verbrauchten Mediums aus klonierten Hybridomen auf Laminin-Antigens Hybridom A&sub4;&sub9;&sub0; von cLMN gLMN % Verändg. ggü. Kontr. Tabelle II Differentielles Screening von verbrauchtem Medium aus klonierten Hybridomen auf Serumproteinantigene Hybridom A&sub4;&sub9;&sub0; von cTSP gTSP % Verändg. ggü. Kontr.
- Verbrauchtes Medium aus den in den Tabellen I und II angeführten Hybridomen wurde gegen Plasma von diabetischen und normalen Ratten unter Verwendung des oben beschriebenen ELISA-Assays getestet. Die Testantigene in dem Assay waren Plasmen aus einer von zwei diabetischen Ratten (Probe Nr. 1 oder Probe Nr. 2).
- Männliche Lewis-Ratten, mit einem Gewicht von 100-125 g entsprechend ihres Alters wurden von den Simonsen Laboratories (Gilroy, GA., V. St. v. A.) gekauft und nach einer 18stündigen Fastenperiode durch Injektion von Streptozotocin (Upjohn Co., Kalamazoo, MI, V. St. v. A.) diabetisch gemacht. Das Streptozotocin wurde in einem Zitronensäurepuffer, pH-Wert 4,5, auf 1,3 g% Lösung zubereitet und eine Dosierung von 65 mg Streptozotocin/kg Gewicht des Tieres wurde intravenös durch Injektion in die Schwanzvene verabreicht. Anschließend erfolgte eine intraperitoneale Injektion von 2 ml einer 30 % (Gew./V.) Lösung von Glukose in Kochsalz. Die Kontrolltiere wurden wie oben beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß sie eine intravenöse Injektion von Zitronensäurepuffer ohne Streptozotocingehalt erhielten. Unter Verwendung dieses Protokolls haben Steffes et al., in Diabetes, 29, 509 (1980) 6-9 Monate nach der Injektion von Streptozotocin eine mangelhafte Glukosekontrolle und erkennbare diabetische Gewebeveränderungen wie erhöhte glomerulare Basismembranenbreite und erhöhte glomerulare und mesangiale Volumen nachgewiesen.
- Jede Plasmaprobe wurde 22 Monate nach der Verabreichung von Streptozotocin entnommen. Die Kontrollprobe war Plasma einer Kontrollratte (22 Monate nach der Injektion von Zitratpuffer entnommen). Die Absorptionen bei 490 nm, die im ELISA-Assay für die Bindung eines monoklonalen Antikörpers eines bestimmten Hybridoms an die Kontroll- oder diabetischen Plasmaproben erhalten wurden, sind in Tabelle III zusammen mit der prozentualen Veränderung der Absorption gegenüber der Kontrollproben, sie für jede der diabetischen Proben erhalten wurde, aufgeführt. Die Medien von sechs Hybridomen enthielten monoklonale Antikörper, welche eine erhebliche Zunahme der Absorption der diabetischen Proben gegenüber der der Kontrollproben ergaben. Tabelle III Differentielles Screening von verbrauchtem Medium aus klonalen Zellinien gegen das Plasma ausgewachsener Ratten Medium aus Hybridom A&sub4;&sub9;&sub0; mit Kontroll-Rattenplasma diabetischem Rattenplasma (Probe Nr. 1) % Verändg. gegenüber Kontrolle:
- Verbrauchtes Medium aus den Hybridomen in Tabellen I und II wurde ebenfalls unter Verwendung des ELISA-Assays auf die Fähigkeit von Antikörpern aus jeder Zellinie, nicht enzymatisch glykosyliertes menschliches Plasma-Fibronektin zu erkennen, getestet. Der Anstieg der Absorption in dem ELISA- Assay, wenn das verbrauchte Medium eines bestimmten Hybridoms auf nicht enzymatisch glykosyliertes Fibronektin als Antigen getestet wurde, über die Absorption, welche gefunden wurde, wenn das Medium auf Fibronektin getestet wurde, das nicht in vitro glykosyliert war, wurde ausgewertet.
- Zwölf Tage altes, nicht enzymatisch glykosyliertes menschliches Fibronektin und sein normales Gegenstück wurden durch die Inkubation von 25 mg des Proteins (1 mg/ml) bei 37ºC mit 500 mM D-Glukose in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH-Wert 7,4), welche 1 mM Natriumazid als Konservierungsstoff enthielt, hergestellt. Proteaseinhibitoren wurden ebenfalls dem Inkubationspuffer zugesetzt, um eine Endkonzentration von 372,2 mg/l Dinatrium-Ethylendiamin-Tetraacetat (Na&sub2;-EDTA), 34,8 mg/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,7 mg/l Pepstatin A, 0,5 mg/l Leupeptin und 4,5 Trypsininhibitoreneinheiten Aprotinin/ml (alle von Sigma, St. Louis, Missouri, V. St. v. A.) zu erhalten. Nach 12 Tagen Inkubation wurde nichtreaktiver Zucker durch ausgiebige Dialyse gegen PBS-Puffer entfernt. Kontrollproben eines jeden Proteins wurden ebenfalls jeweils in PBS und Proteaseinhibitoren wie oben angegeben inkubiert, jedoch ohne Zugabe von Glukose.
- Von den 23 getesteten Hybridomen zeigten fünf eine differentielle Erkennungsfähigkeit von nicht enzymatisch glykosylierten menschlichen Plasmafibronektin und seinem normalen Gegenstück aufgrund eines erheblichen Unterschiedes zwischen den erhaltenen Absorptionswerten. Diese Daten sind in der nachstehenden Tabelle IV summarisch aufgeführt. Tabelle IV Differentielles Screening von verbrauchtem Medium von Hybridomen gegen menschliches Plasma-Fibronektin Hybridom A&sub4;&sub9;&sub0; von cFN gFN % Änderung ggü. Kontr.
- Verbrauchtes Medium aus mehreren der in Tabellen I und II angegebenen Klone (10-H9, 26-B5, 74-D10, 74G-11, 83-D10, 84-C11 und 89-G4) wurden in dem oben beschriebenen differentiellen ELISA-Assay auf die Fähigkeit der Antikörper aus jedem klonierten Hybridom, die nicht enzymatisch glykosylierte Form der Hauptplasmaproteine Albumin, Immunoglobulin G und Transferrin spezifisch zu erkennen, getestet. Die Erkennungsfähigkeit war nachgewiesen, wenn ein erheblicher Anstieg der Absorption in dem ELISA-Assay beobachtet wurde, wenn das verbrauchte Medium der Klone auf nicht enzymatisch glykosyliertes menschliches Plasmaalbumin, IgG oder Transferrin getestet wurde gegen denjenigen, die gefunden wurden, wenn das Medium auf die normalen Gegenstücke dieser Proteine getestet wurde.
- MCA einer der getesteten Klone, 83-D10, zeigte die Fähigkeit, zwischen den normalen und nicht enzymatisch glykosylierten Formen dieser menschlichen Proteine zu unterscheiden. Klon 83- D10 erkannte nicht enzymatisch glykosyliertes menschliches Albumin mit einem Absorptionsmeßwert von 1,16 gegenüber einem Absorptionsmeßwert von 0,60 für normales menschliches Kontrollalbumin (eine Änderung von 93,3 % der Absorption über dem Kontrollevel). Da Albumin die Hauptkomponente menschlichen Plasmas ist, und seine Ausscheidung in den Urin menschlicher Diabetiker bei diabetischer Nierenerkrankung erhöht ist, können durch den Klon 83-D10 erzeugte Antikörper in einem Diagnosetest zur quantitativen Bestimmung der Konzentrationen nicht enzymatischer Glykosylierung dieses leicht verfügbaren Proteins in Plasma, Urin, anderen Körperflüssigkeiten oder in Gewebeproben nützlich sein.
- Des weiteren erkannte der Klon 83-D10 auch den Unterschied zwischen normalem und nicht enzymatisch glykosyliertem menschlichen Transferrin, einem weiteren Hauptplasmaprotein. Das Medium dieses Klons ergab einen Absorptions-Meßwert von 1,11 für nicht enzymatisch glykosyliertes Transferrin gegenüber einem Absorptions-Meßwert von 0,56 für Kontrolltransferrin (eine Änderung von 98,2 % in der Absorption über dem Kontrollevel). 83-D10 erkannte jedoch nicht den Unterschied zwischen nicht enzymatisch glykosyliertem IgG und Kontroll- IgG.
- Gemäß dem vorliegenden Verfahren wurden Murinhybridoma erzeugt, welche monoklonale Antikörper ausscheiden, die sich an Epitope binden können, welche mit nicht enzymatisch glykosyliertem Murinlaminin (gLMN) und nicht enzymatisch glykosyliertem Murinserumprotein (gTSP) assoziiert sind. Die in Tabelle I angeführten Hybridome scheiden MCAs aus, welche gLMN von normalem Laminin (cLMN) unterscheiden können. Die von zwei dieser Hybridome, 26-BS und 10-C10, ausgeschiedenen MCAs weisen eine selektive Reaktivität mit Serumproteinen in dem Maße auf, da sie zwischen (a) Plasma von zwei diabetischen Ratten und (b) Plasma von einer normalen Ratte unterscheiden können (Tabelle III). Der MCA von 26-B5 bindet sich offensichtlich nicht an nicht enzymatisch glykosyliertes menschliches Fibronektin (gFN), während der Antikörper von 10-C10 mit gFN eine starke Kreuzreaktion eingeht (Tabelle IV). Der Antikörper von 10-C10, sowie der Antikörper von Hybridom 74- G11 zeigen ebenfalls eine differentielle Unterscheidung von gFN und normalem Fibronektin.
- Die in Tabelle II aufgeführten Hybridome scheiden MCAs aus, welche zwischen nicht enzymatisch glykosyliertem Murinserumprotein (gTSP) und normalem Murinserumproteinen (cTSP) unterscheiden können. Zum Beispiel die von den Hybridomen 83- D10 und 84-F9 ausgeschiedenen MCAs sind auf gTSP gegenüber cTSP selektiv und weisen auch eine selektive Bindung an Serumproteine in dem Maße auf, als daß sie leicht normales Rattenplasma von dem Plasma einer diabetischen Ratte unterscheiden können. Weder 83-D10 noch 84-F9 scheinen mit nicht enzymatisch glykosyliertem menschlichen Plasma-Fibronektin eine Kreuzreaktion einzugehen. Der MCA jedoch, welcher von 83- D10 ausgeschieden wurde, hatte nachweislich hohe Selektivität bezüglich seiner Bindung an die glykosylierten und nicht glykosylierten Formen zweier menschlicher Hauptplasmaproteine, Albumin und Transferrin. Weiterhin kann ein bestimmter MCA, wie im Fall von MCA 10-C10 und 83-D10 zu sehen ist, der eine differentielle Bindung bezüglich des glykosylierten Proteins aufweist, welches als das Immunogen verwendet wurde, dieselbe oder eine sogar höhere Reaktivität bezüglich eines zweiten nicht reduzierten glykosylierten Proteins.
- Proben der Hybridome 26-B5 und 83-D10 wurden bei der American Type Culture Association, Rockville, MD, V.St.v.A. hinterlegt und erhielten die Zugriffsnummern HB9124 bzw. HB9125.
- Eine Kultur der hinterlegten Mikroorganismen wird bei Erteilung eines Patentes auf der Grundlage der vorliegenden Anmeldung der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden. Es versteht sich, daß die Verfügbarkeit einer hinterlegten Kultur keine Lizenz zur Durchführung der vorliegenden Erfindung unter Beeinträchtigung der von der Regierung der Vereinigten Staaten gewährten Patentrechte darstellt.
- Weiterhin soll die Erfindung in ihrem Umfang nicht durch den hinterlegten Mikroorganismus begrenzt sein, da die hinterlegten Hybridome als spezifische Darstellungen bestimmter Aspekte der Erfindung gedacht sind.
Claims (22)
1. Hybridzelle, in einem Verfahren hergestellt, das folgende
Schritte umfaßt:
(a) Immunisieren von Säuger-B-Lymphozyten mit einer
wirkungsvollen Menge nicht reduziertem, nicht
enzymatisch glykosyliertem Protein, das aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus Plasmaproteinen und Laminin
besteht;
(b) Gewinnen der immunisierten B-Lymphozyten;
(c) Fusion der gewonnenen B-Lymphozyten mit bösartigen
Säuger-B-Lyinphozyten, um Hybridzellen herzustellen;
(d) Auswählen einer Hybridzelle aus den Hybridzellen,
welche einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der
sich an ein Epitop in einem nicht reduzierten, nicht
enzymatisch glykosylierten Protein bindet, welches
ein Serumprotein, Fibronektin, Transferrin oder
Laminin ist, und welches im wesentlichen frei von
Kreuzreaktivität mit dem entsprechenden nicht
glykosylierten Protein ist, wenn es durch
enzymverbundenen Immunadsorptionsassay getestet wird; und
(e) klonisches Expandieren der ausgewählten
Hybridzellen.
2. Hybridzelle nach Anspruch 1, worin die immunisierten B-
Lymphozyten aus der Milz eines immunisierten Säugers
gewonnen werden.
3. Hybridzelle nach Anspruch 2, worin der immunisierte
Säuger eine Maus ist.
4. Hybridzelle nach Anspruch 2, worin die B-Lymphozyten mit
Murinmyelomzellen fusioniert sind.
5. Hybridzelle nach Anspruch 1, worin der Säuger mit einem
Murinprotein immunisiert ist.
6. Hybridzelle nach Anspruch 1, worin der Säuger mit einer
Menge nicht reduziertem, nicht enzymatisch glykosyliertem
Gesamtserumprotein immunisiert ist, das die Immunisierung
des Säugers bewirkt.
7. Hybridzelle nach Anspruch 6, worin der Säuger mit einem
Murinprotein immunisiert ist.
8. Verfahren zur Herstellung einer Population von
Hybridzellen, umfassend:
(a) Immunisieren von Säuger-B-Lymphozyten mit einer
effektiven Menge nicht reduziertem, nicht
enzymatisch glykosyliertem Protein, welches ein
Plasmaprotein oder Laminin ist;
(b) Gewinnen der immunisierten B-Lymphozyten;
(c) Fusion der gewonnenen B-Lymphozyten mit bösartigen
Säuger-B-Lymphozyten, um Hybridzellen herzustellen;
(d) Auswählen einer Hybridzelle aus den Hybridzellen,
welche einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der
sich an ein Epitop in einem nicht reduzierten, nicht
enzymatisch glykosylierten Plasmaprotein bindet und
welches im wesentlichen frei von Kreuzreaktivität
mit dem entsprechenden, nicht glykosylierten
Plasmaprotein ist, was durch enzymverbundenen
Immunadsorptionsassay getestet wird; und
(e) klonisches Expandieren der ausgewählten
Hybridzellen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die immunisierten B-
Lymphozyten aus der Milz eines immunisierten Säugers
gewonnen werden.
10. Verfahren nach Anspruch 8, worin der immunisierte Säuger
eine Maus ist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, worin die immunisierten B-
Lymphozyten mit Murinmyelomzellen fusioniert sind.
12. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Säuger mit einem
Murinprotein immunisiert ist.
13. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Säuger mit einer
Menge nicht reduziertem, nicht enzymatisch glykosyliertem
Gesamtserumprotein immunisiert ist, das die Immunisierung
des Säugers bewirkt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Säuger mit
Murinprotein immunisiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 8, worin der monoklonale
Antikörper sich an ein Epitop in einem nicht reduzierten,
nicht enzymatisch glykosylierten menschlichen Protein
bindet.
16. Monoklonaler Antikörper, der sich an ein Epitop in einem
nicht reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten
Protein bindet, welches ein Transferrin oder Laminin ist,
wobei das glykosylierte Protein Glukose umfaßt, welche an
eine Epsilon-Aminogruppe eines Lysinrests in der
Polypeptidkette des Proteins gebunden ist, und wobei der
Antikörper im wesentlichen keine Kreuzreaktion mit dem
entsprechenden, nicht glykosylierten Protein eingeht, wie
es durch enzymverbundenen Immunadsorptionsassay getestet
wird.
17. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 16, welcher ein
monoklonaler Murin-Antikörper ist.
18. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 16, worin das
glykosylierte Protein ein menschliches Protein ist.
19. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines nicht
reduzierten, nicht enzymatisch glykosylierten Proteins in
einer Gewebeprobe oder einer Probe einer physiologischen
Flüssigkeit, welches das Umsetzen der Probe mit einem
monoklonalen Antikörper umfaßt, der von der Hybridzelle
nach einem der Ansprüche 1 oder 16 erzeugt wurde, sowie
das Bestimmen des Vorhandenseins der Protein-Antikörper-
Komplexe durch Umsetzen des Komplexes mit einem
Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper, worin der
Antikörper an eine nachweisbare Markierung gebunden ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Flüssigkeit Blut
ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Flüssigkeit Urin
ist.
22. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Flüssigkeit
Speichel ist.
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