JPH08311100A - ヒト肺腺癌に関するモノクローナル抗体および抗原、及びそれを用いた免疫測定方法 - Google Patents
ヒト肺腺癌に関するモノクローナル抗体および抗原、及びそれを用いた免疫測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ヒト肺腺癌細胞分泌成分で免疫したマウスの脾
臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られたハ
イブリドーマ細胞株ＴＲＤ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３が産
生するモノクローナル抗体は、分子量２００Ｋｄ以上
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でヒト肺腺癌細胞中に存在する糖
タンパクである抗原と特異的に反応する。 【効果】肺腺癌の診断に有効に使用できる。
臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られたハ
イブリドーマ細胞株ＴＲＤ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３が産
生するモノクローナル抗体は、分子量２００Ｋｄ以上
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でヒト肺腺癌細胞中に存在する糖
タンパクである抗原と特異的に反応する。 【効果】肺腺癌の診断に有効に使用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ヒト肺癌は、４つの主な組織学的
タイプに分けられる。すなわち、肺腺癌、扁平上皮癌、
小細胞癌、大細胞癌である。本発明は、ヒト肺腺癌に対
して反応性を有するモノクローナル抗体、さらにこの抗
体が認識する糖タンパ質抗原およびこのモノクローナル
抗体を用いるヒト肺腺癌の検出法、治療薬に関する。ま
た、本発明はヒト肺腺癌の診断、治療に使用することが
でき、肺腺癌の診断薬、治療薬の分野での利用が可能で
ある。
タイプに分けられる。すなわち、肺腺癌、扁平上皮癌、
小細胞癌、大細胞癌である。本発明は、ヒト肺腺癌に対
して反応性を有するモノクローナル抗体、さらにこの抗
体が認識する糖タンパ質抗原およびこのモノクローナル
抗体を用いるヒト肺腺癌の検出法、治療薬に関する。ま
た、本発明はヒト肺腺癌の診断、治療に使用することが
でき、肺腺癌の診断薬、治療薬の分野での利用が可能で
ある。
【０００２】
【従来の技術】従来、肺腺癌の検出法としては、腫瘍マ
ーカーとして知られる癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＳＬＸ
に対する抗体を用いて測定することにより、ヒト肺腺癌
を検出する方法が知られている。しかしながら、これら
の腫瘍マーカーを検出する診断法では、肺腺癌に対する
陽性率が４０−５０％であるばかりでなく、肺癌の他の
組織型、肺良性疾患および大腸癌、胃癌、乳癌をはじめ
他の臓器癌においても検出される。一方、Maimonis P.
ら（Cancer Res.50,6738(1990)）は、肺腺癌組織を免疫
源として得られたモノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を報告
している。しかしながら、この抗体を用いて検出する抗
原もまた、肺腺癌のほか肺扁平上皮癌、乳癌等の患者血
清中にも存在する。
ーカーとして知られる癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＳＬＸ
に対する抗体を用いて測定することにより、ヒト肺腺癌
を検出する方法が知られている。しかしながら、これら
の腫瘍マーカーを検出する診断法では、肺腺癌に対する
陽性率が４０−５０％であるばかりでなく、肺癌の他の
組織型、肺良性疾患および大腸癌、胃癌、乳癌をはじめ
他の臓器癌においても検出される。一方、Maimonis P.
ら（Cancer Res.50,6738(1990)）は、肺腺癌組織を免疫
源として得られたモノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を報告
している。しかしながら、この抗体を用いて検出する抗
原もまた、肺腺癌のほか肺扁平上皮癌、乳癌等の患者血
清中にも存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このように、これまで
開発されてきたモノクローナル抗体は、肺腺癌に特異的
な診断方法とは言いがたく、肺腺癌のスクリーニング、
確定診断および転移、再発などのモニタリングに対して
は十分とはいえない。また、肺癌は、各肺癌の組織型の
違いによって、細胞増殖、進展などの性質が異なってい
る。このため、これに伴う治療方法も各組織型において
異なっている。従って、肺腺癌特有の抗原、抗体を見出
すことは、肺腺癌の診断、ひいては肺腺癌の治療上極め
て重要である。
開発されてきたモノクローナル抗体は、肺腺癌に特異的
な診断方法とは言いがたく、肺腺癌のスクリーニング、
確定診断および転移、再発などのモニタリングに対して
は十分とはいえない。また、肺癌は、各肺癌の組織型の
違いによって、細胞増殖、進展などの性質が異なってい
る。このため、これに伴う治療方法も各組織型において
異なっている。従って、肺腺癌特有の抗原、抗体を見出
すことは、肺腺癌の診断、ひいては肺腺癌の治療上極め
て重要である。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】上記実情に鑑み、本発
明者らは、肺腺癌細胞について鋭意研究した結果、肺腺
癌樹立細胞Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）培養液中に存
在し、かつMaimonis P.ら（Cancer Res. 50,6738(199
0)）によって作製されたモノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１
と交差反応する糖タンパクの中に、肺腺癌樹立細胞Ｃａ
ｌｕ−３（ATCC HTB-55）培養液中および肺腺癌患者血
清中に特有に存在するが、正常人血清中に殆ど検出され
ない高分子量の糖タンパクを見出した。さらに、この糖
タンパクを免疫源として用いて作製したハイブリドーマ
ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２、ＴＲＤ−Ｌ３を樹立し、
この細胞が産生する抗体を得た。さらに該モノクローナ
ル抗体を用いれば肺腺癌由来の抗原が単離でき、さらに
該抗原を正確に測定できることを見出し、本発明を完成
した。
明者らは、肺腺癌細胞について鋭意研究した結果、肺腺
癌樹立細胞Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）培養液中に存
在し、かつMaimonis P.ら（Cancer Res. 50,6738(199
0)）によって作製されたモノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１
と交差反応する糖タンパクの中に、肺腺癌樹立細胞Ｃａ
ｌｕ−３（ATCC HTB-55）培養液中および肺腺癌患者血
清中に特有に存在するが、正常人血清中に殆ど検出され
ない高分子量の糖タンパクを見出した。さらに、この糖
タンパクを免疫源として用いて作製したハイブリドーマ
ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２、ＴＲＤ−Ｌ３を樹立し、
この細胞が産生する抗体を得た。さらに該モノクローナ
ル抗体を用いれば肺腺癌由来の抗原が単離でき、さらに
該抗原を正確に測定できることを見出し、本発明を完成
した。
【０００５】上記本発明とは以下の通りである。 （１）２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分子量を
有し、ヒト肺腺癌の細胞中に存在し、かつヒト肺腺癌に
より分泌される糖タンパク抗原に結合するモノクローナ
ル抗体である。 （２）該糖タンパク抗原がさらにＭＡＡレクチンおよび
ＰＮＡレクチンとは反応するが、ＧＮＡレクチン、ＳＮ
ＮレクチンおよびＤＡＳレクチンとは反応しないもので
ある上記（１）のモノクローナル抗体である。 （３）アイソタイプがＩｇＭである上記（１）または
（２）のモノクローナル抗体である。 （４）ヒト肺腺癌細胞分泌成分で免疫したマウスの脾臓
細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られたハイ
ブリドーマ細胞株ＴＲＤ−Ｌ１（工業技術院生命工学工
業技術研究所受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７８）、
ＴＲＤ−Ｌ２（工業技術院生命工学工業技術研究所受託
番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７９）、またはＴＲＤ−Ｌ
３（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号 ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４８８０）が産生する上記（１）〜（３）
いずれかのモノクローナル抗体である。 （５）抗体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２またはＦｖフラグ
メントである上記（１）または（２）のモノクローナル
抗体である。 （６）検知可能なシグナルを発することができる標識物
を結合させた上記（１）〜（５）いずれかのモノクロー
ナル抗体である。 （７）前記標識物が酵素、放射性物質、蛍光物質、金属
コロイド発光物質である上記（６）のモノクローナル抗
体である。
有し、ヒト肺腺癌の細胞中に存在し、かつヒト肺腺癌に
より分泌される糖タンパク抗原に結合するモノクローナ
ル抗体である。 （２）該糖タンパク抗原がさらにＭＡＡレクチンおよび
ＰＮＡレクチンとは反応するが、ＧＮＡレクチン、ＳＮ
ＮレクチンおよびＤＡＳレクチンとは反応しないもので
ある上記（１）のモノクローナル抗体である。 （３）アイソタイプがＩｇＭである上記（１）または
（２）のモノクローナル抗体である。 （４）ヒト肺腺癌細胞分泌成分で免疫したマウスの脾臓
細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られたハイ
ブリドーマ細胞株ＴＲＤ−Ｌ１（工業技術院生命工学工
業技術研究所受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７８）、
ＴＲＤ−Ｌ２（工業技術院生命工学工業技術研究所受託
番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７９）、またはＴＲＤ−Ｌ
３（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号 ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４８８０）が産生する上記（１）〜（３）
いずれかのモノクローナル抗体である。 （５）抗体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２またはＦｖフラグ
メントである上記（１）または（２）のモノクローナル
抗体である。 （６）検知可能なシグナルを発することができる標識物
を結合させた上記（１）〜（５）いずれかのモノクロー
ナル抗体である。 （７）前記標識物が酵素、放射性物質、蛍光物質、金属
コロイド発光物質である上記（６）のモノクローナル抗
体である。
【０００６】（８）２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）の分子量を有し、ヒト肺腺癌の細胞中に存在し、か
つヒト腺癌により分泌される糖タンパク抗原である。 （９）ＭＡＡレクチンおよびＰＮＡレクチンとは反応す
るが、ＧＮＡレクチン、ＳＮＮレクチンおよびＤＡＳレ
クチンとは反応しないものである上記（８）の糖タンパ
ク抗原である。
Ｅ）の分子量を有し、ヒト肺腺癌の細胞中に存在し、か
つヒト腺癌により分泌される糖タンパク抗原である。 （９）ＭＡＡレクチンおよびＰＮＡレクチンとは反応す
るが、ＧＮＡレクチン、ＳＮＮレクチンおよびＤＡＳレ
クチンとは反応しないものである上記（８）の糖タンパ
ク抗原である。
【０００７】（１０）上記（１）〜（７）いずれかのモ
ノクローナル抗体を用いる肺腺癌診断の免疫測定方法で
ある。 （１１）上記（１）〜（７）いずれかのモノクローナル
抗体を用いて上記（８）または（９）の糖タンパク抗原
を測定する上記（１０）の肺腺癌診断の免疫測定方法で
ある。 （１２）上記（１）〜（７）いずれかのモノクローナル
抗体を用いた肺腺癌および転移部位を特定する肺腺癌体
内診断免疫測定キットである。 （１３）肺腺癌ワクチンである上記（８）または（９）
の糖タンパク抗原である。 （１４）上記（１）〜（７）のモノクローナル抗体に、
肺腺癌治療のための薬剤を結合させたモノクローナル抗
体である。
ノクローナル抗体を用いる肺腺癌診断の免疫測定方法で
ある。 （１１）上記（１）〜（７）いずれかのモノクローナル
抗体を用いて上記（８）または（９）の糖タンパク抗原
を測定する上記（１０）の肺腺癌診断の免疫測定方法で
ある。 （１２）上記（１）〜（７）いずれかのモノクローナル
抗体を用いた肺腺癌および転移部位を特定する肺腺癌体
内診断免疫測定キットである。 （１３）肺腺癌ワクチンである上記（８）または（９）
の糖タンパク抗原である。 （１４）上記（１）〜（７）のモノクローナル抗体に、
肺腺癌治療のための薬剤を結合させたモノクローナル抗
体である。
【０００８】以下に本発明について詳細に説明する。ま
ず、肺腺癌樹立細胞Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）培養
液中に存在し、モノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１と交差反
応する糖タンパクを免疫源としたマウス脾臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作製
し、正常人血清中に存在するＤＦ−Ｌ１により認識され
るタンパクに反応性が弱く、Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-5
5）培養液中に存在するタンパクに反応性の高いモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。さ
らにこのハイブリドーマを培地中で培養するか、マウス
腹腔内に投与し、腹水を産生させる。本発明は、この培
養液または腹水より得られたモノクローナル抗体および
この抗体が認識する抗原を提供する。また、該モノクロ
ーナル抗体を用いて該抗原を測定する方法を提供する。
ず、肺腺癌樹立細胞Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）培養
液中に存在し、モノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１と交差反
応する糖タンパクを免疫源としたマウス脾臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作製
し、正常人血清中に存在するＤＦ−Ｌ１により認識され
るタンパクに反応性が弱く、Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-5
5）培養液中に存在するタンパクに反応性の高いモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。さ
らにこのハイブリドーマを培地中で培養するか、マウス
腹腔内に投与し、腹水を産生させる。本発明は、この培
養液または腹水より得られたモノクローナル抗体および
この抗体が認識する抗原を提供する。また、該モノクロ
ーナル抗体を用いて該抗原を測定する方法を提供する。
【０００９】さらに具体的には、ハイブリドーマＴＲＤ
−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２、ＴＲＤ−Ｌ３により産生され、
ＩｇＭクラスに属し、肺腺癌細胞と反応するモノクロー
ナル抗体であり、該モノクローナル抗体は分子量２００
Ｋｄ以上の糖タンパクを認識する。以下に本発明のモノ
クローナル抗体の製造方法について詳細に説明する。
−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２、ＴＲＤ−Ｌ３により産生され、
ＩｇＭクラスに属し、肺腺癌細胞と反応するモノクロー
ナル抗体であり、該モノクローナル抗体は分子量２００
Ｋｄ以上の糖タンパクを認識する。以下に本発明のモノ
クローナル抗体の製造方法について詳細に説明する。
【００１０】（１）免疫源の調整 肺腺癌樹立細胞、例えばＣａｌｕ−３（ATCC HTB-55）
をＲＰＭＩ １６４０培地、ＭＥＭ培地中で培養した
後、培養上清を回収する。回収した培養上清を遠心、あ
るいはフィルターを用いて不溶物を除去した後、モノク
ローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を結合させたアフィニテイクロ
マトカラムに添加し、培養上清中の抗原を結合させる。
次いで、ＰＢＳにて洗浄した後、３Ｍ ＫＳＣＮで溶出
させる。溶出後、透析、濃縮を行い、ゲルクロマトカラ
ムを用い分子量２００Ｋｄ以上の分画の糖タンパクから
なる肺腺癌樹立細胞由来抗原を回収し、免疫源とする。
をＲＰＭＩ １６４０培地、ＭＥＭ培地中で培養した
後、培養上清を回収する。回収した培養上清を遠心、あ
るいはフィルターを用いて不溶物を除去した後、モノク
ローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を結合させたアフィニテイクロ
マトカラムに添加し、培養上清中の抗原を結合させる。
次いで、ＰＢＳにて洗浄した後、３Ｍ ＫＳＣＮで溶出
させる。溶出後、透析、濃縮を行い、ゲルクロマトカラ
ムを用い分子量２００Ｋｄ以上の分画の糖タンパクから
なる肺腺癌樹立細胞由来抗原を回収し、免疫源とする。
【００１１】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３−１０週令、望ましくは６週令のマウスに上記肺腺癌
樹立細胞由来抗原を免疫源として免疫し、脾臓リンパ
節、抹消血中の抗体産生細胞を調製する。免疫の方法
は、動物の皮下あるいは腹腔内に、適当なアジュバン
ド、例えばフロインドの完全アジュバンド、フロインド
の不完全アジュバンドまたは百日咳菌ワクチンととも
に、免疫源を（１−１００μg/匹）を投与する。以後１
−２週間おきに免疫を２−５回投与する。細胞融合に供
するにあたって、融合処理３−４日前に、免疫源を免疫
化マウスに投与（１−１００μg/匹）し、脾臓細胞を摘
出し、脾細胞を調製する。
樹立細胞由来抗原を免疫源として免疫し、脾臓リンパ
節、抹消血中の抗体産生細胞を調製する。免疫の方法
は、動物の皮下あるいは腹腔内に、適当なアジュバン
ド、例えばフロインドの完全アジュバンド、フロインド
の不完全アジュバンドまたは百日咳菌ワクチンととも
に、免疫源を（１−１００μg/匹）を投与する。以後１
−２週間おきに免疫を２−５回投与する。細胞融合に供
するにあたって、融合処理３−４日前に、免疫源を免疫
化マウスに投与（１−１００μg/匹）し、脾臓細胞を摘
出し、脾細胞を調製する。
【００１２】（３）骨髄腫細胞 骨髄腫細胞としてはマウスから得られた株化細胞を使用
する。特に限定はしないが、例えば８−アザグアニン耐
性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ
８−Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ４、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
などが望ましい。
する。特に限定はしないが、例えば８−アザグアニン耐
性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ
８−Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ４、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
などが望ましい。
【００１３】（４）細胞融合 細胞融合は、通常ＲＰＭＩ １６４０培地、ＭＥＭ培地
などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合する
ことによって得られる。細胞数が抗体産生細胞：骨髄腫
細胞＝５−１０：１になるように混合し、遠心した後、
沈殿した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながらポリエ
チレングリコールを用いてまたは電気融合装置にて融合
を行う。使用されるポリエチレングリコールは、分子量
１０００−６０００のものが望ましい。融合細胞の選択
はＨＡＴ培地にて行う。
などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合する
ことによって得られる。細胞数が抗体産生細胞：骨髄腫
細胞＝５−１０：１になるように混合し、遠心した後、
沈殿した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながらポリエ
チレングリコールを用いてまたは電気融合装置にて融合
を行う。使用されるポリエチレングリコールは、分子量
１０００−６０００のものが望ましい。融合細胞の選択
はＨＡＴ培地にて行う。
【００１４】（５）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、ハイブリドーマの培養上清を
採取し、以下に示す酵素免疫測定法などで確認する。こ
の方法は、確認方法の一例にすぎず、本発明はこの方法
に限定されるものではなく、種々の変更及び改変を実施
することが可能である。
採取し、以下に示す酵素免疫測定法などで確認する。こ
の方法は、確認方法の一例にすぎず、本発明はこの方法
に限定されるものではなく、種々の変更及び改変を実施
することが可能である。
【００１５】酵素免疫測定法：９６Ｆアミノプレートに
上述のＣａｌｕ−３癌細胞由来抗原（タンパク量０．５
−５μｇ／ｍｌ）を５０−２００μl/穴分注し、同様に
正常人血清由来抗原（タンパク量０.５−５μg/ml）を
５０−２００μl/穴分注し、それぞれグルタールアルデ
ヒドを用いて常法に従い結合させる。両者とも上清を吸
引除去した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した、１
％ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μl加え結合残基のブロック
（ブロッキング）を行う。上清を吸引除去した後、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。このプレートにハイブ
リドーマ培養上清を４０−１００μl/穴分注し、４℃、
一晩あるいは３７℃において１時間反応させる。上清を
吸引除去した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。
洗浄後、抗マウスイムノグロブリン抗体−ペルオキシダ
ーゼ結合物を１００μl/穴分注し、３７℃において１時
間反応させる。反応後、再度洗浄を行った後、Ｏ−フェ
ニレンジアミン・２塩酸塩あるいはテトラメチルベンジ
ジンおよび過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４.２）を１００μl/穴分注し、室温にて３０分
間放置する。２Ｎの硫酸５０μl/穴に分注し、酵素反応
を停止させた後、ＯＤ４９２nmあるいはＯＤ４５０nmを
測定する。この時、正常人血清由来抗原より癌細胞株由
来抗原により反応性の高いハイブリドーマを選択する。
上述のＣａｌｕ−３癌細胞由来抗原（タンパク量０．５
−５μｇ／ｍｌ）を５０−２００μl/穴分注し、同様に
正常人血清由来抗原（タンパク量０.５−５μg/ml）を
５０−２００μl/穴分注し、それぞれグルタールアルデ
ヒドを用いて常法に従い結合させる。両者とも上清を吸
引除去した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した、１
％ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μl加え結合残基のブロック
（ブロッキング）を行う。上清を吸引除去した後、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。このプレートにハイブ
リドーマ培養上清を４０−１００μl/穴分注し、４℃、
一晩あるいは３７℃において１時間反応させる。上清を
吸引除去した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。
洗浄後、抗マウスイムノグロブリン抗体−ペルオキシダ
ーゼ結合物を１００μl/穴分注し、３７℃において１時
間反応させる。反応後、再度洗浄を行った後、Ｏ−フェ
ニレンジアミン・２塩酸塩あるいはテトラメチルベンジ
ジンおよび過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４.２）を１００μl/穴分注し、室温にて３０分
間放置する。２Ｎの硫酸５０μl/穴に分注し、酵素反応
を停止させた後、ＯＤ４９２nmあるいはＯＤ４５０nmを
測定する。この時、正常人血清由来抗原より癌細胞株由
来抗原により反応性の高いハイブリドーマを選択する。
【００１６】得られた抗体産生ハイブリドーマを、限界
希釈法等によるクローニングを行うことにより、本発明
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得ら
れる。得られたハイブリドーマを利用して、本発明のモ
ノクローナル抗体を大量に製造するには、まず、細胞を
大量に培養する、あるいはマウス腹腔内にプリスタン等
の鉱物油を投与した後、該ハイブリドーマを腹腔内投与
し、数日後に腹水を採取する。次いでこの培養液あるい
は腹水中から常法の抗体分離精製操作方法に従い、モノ
クローナル抗体を分離精製する方法などが挙げられる。
得られた本発明のモノクローナル抗体は、ヒト肺腺癌由
来糖タンパクと反応し、ヒト正常人由来糖タンパクと
は、殆ど反応しない。
希釈法等によるクローニングを行うことにより、本発明
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得ら
れる。得られたハイブリドーマを利用して、本発明のモ
ノクローナル抗体を大量に製造するには、まず、細胞を
大量に培養する、あるいはマウス腹腔内にプリスタン等
の鉱物油を投与した後、該ハイブリドーマを腹腔内投与
し、数日後に腹水を採取する。次いでこの培養液あるい
は腹水中から常法の抗体分離精製操作方法に従い、モノ
クローナル抗体を分離精製する方法などが挙げられる。
得られた本発明のモノクローナル抗体は、ヒト肺腺癌由
来糖タンパクと反応し、ヒト正常人由来糖タンパクと
は、殆ど反応しない。
【００１７】上述のようにして得られたハイブリドーマ
ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２およびＴＲＤ−Ｌ３が産生
する本発明のモノクローナル抗体はＩｇＭアイソタイプ
に分類できるが、細胞の産生する抗体そのままである必
要はなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２，Ｆｖフラグメント等
の有用なフラグメントであっても良い。この有用なフラ
グメントは、パパインまたはペプシンを用いる抗体のペ
プチダーゼ分解によりもとの抗体から得られる。有用な
フラグメントとは、その同一起源の抗原上の結合部位に
おいてもとの抗体と競合的に結合できることを意味す
る。しかし、本発明のモノクローナル抗体の上記の例
は、それぞれの抗原上の特異的決定部位に結合し、かつ
マウス由来の特異なアイソタイプの抗体であるが、これ
らに何ら限定されるものではない。従って、本発明のモ
ノクローナル抗体は、マウス、ヒトなどの哺乳動物由来
もしくはそれ以外の由来、またはこれらの組合せのいず
れかからの由来の抗体であっても、同等に特定の抗原上
の特定の特異的決定部位に結合する機能を有する抗体で
あれば使用できる。また、アイソタイプがＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ等の他のクラスの抗体であっても同様に使用
できる。
ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２およびＴＲＤ−Ｌ３が産生
する本発明のモノクローナル抗体はＩｇＭアイソタイプ
に分類できるが、細胞の産生する抗体そのままである必
要はなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２，Ｆｖフラグメント等
の有用なフラグメントであっても良い。この有用なフラ
グメントは、パパインまたはペプシンを用いる抗体のペ
プチダーゼ分解によりもとの抗体から得られる。有用な
フラグメントとは、その同一起源の抗原上の結合部位に
おいてもとの抗体と競合的に結合できることを意味す
る。しかし、本発明のモノクローナル抗体の上記の例
は、それぞれの抗原上の特異的決定部位に結合し、かつ
マウス由来の特異なアイソタイプの抗体であるが、これ
らに何ら限定されるものではない。従って、本発明のモ
ノクローナル抗体は、マウス、ヒトなどの哺乳動物由来
もしくはそれ以外の由来、またはこれらの組合せのいず
れかからの由来の抗体であっても、同等に特定の抗原上
の特定の特異的決定部位に結合する機能を有する抗体で
あれば使用できる。また、アイソタイプがＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ等の他のクラスの抗体であっても同様に使用
できる。
【００１８】（６）抗原の調製 本発明で得られるヒト肺腺癌由来抗原は、例えば上記の
ようにして得られる本発明のモノクローナル抗体を利用
して製造することができる。すなわち、肺腺癌患者血清
中あるいは、肺腺癌樹立細胞中より製造することができ
る。例えばＣａｌｕ−３（ATCC HTB-55）をＲＰＭＩ
１６４０培地、ＭＥＭ培地中で培養した後、培養上清を
回収する、あるいは肺腺癌患者血清を常法により得る。
回収した培養上清あるいは肺腺癌患者血清を遠心、ある
いはフィルターを用いて不溶物を除いた後、本発明のモ
ノクローナル抗体を結合させたアフィニテイクロマトカ
ラムに添加し結合させる。適当な緩衝液で（例えばＰＢ
Ｓ）洗浄後、３Ｍ ＫＳＣＮ等で溶出させる。溶出後、
透析、濃縮を行い、さらにゲル濾過クロマトカラムを用
い分子量２００Ｋｄ以上の分画を回収する。得られた抗
原は、分子量約２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
で、ＰＡＳ染色にて染色されることから糖鎖を含む糖タ
ンパクである。
ようにして得られる本発明のモノクローナル抗体を利用
して製造することができる。すなわち、肺腺癌患者血清
中あるいは、肺腺癌樹立細胞中より製造することができ
る。例えばＣａｌｕ−３（ATCC HTB-55）をＲＰＭＩ
１６４０培地、ＭＥＭ培地中で培養した後、培養上清を
回収する、あるいは肺腺癌患者血清を常法により得る。
回収した培養上清あるいは肺腺癌患者血清を遠心、ある
いはフィルターを用いて不溶物を除いた後、本発明のモ
ノクローナル抗体を結合させたアフィニテイクロマトカ
ラムに添加し結合させる。適当な緩衝液で（例えばＰＢ
Ｓ）洗浄後、３Ｍ ＫＳＣＮ等で溶出させる。溶出後、
透析、濃縮を行い、さらにゲル濾過クロマトカラムを用
い分子量２００Ｋｄ以上の分画を回収する。得られた抗
原は、分子量約２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
で、ＰＡＳ染色にて染色されることから糖鎖を含む糖タ
ンパクである。
【００１９】（７）抗原の検出 本発明の抗原に特異的な抗体を利用して、本発明の抗原
を測定するには、公知の免疫測定に従って実施すること
ができ、例えば、肺組織において悪性状態の存在を測定
するものである。悪性状態とは、癌を同時に含む形成異
常の腫瘍細胞等の存在を意味する。検体の腫瘍の存在
は、検体を本発明のモノクローナル抗体と反応させ、検
体上に結合した免疫複合体を検出する事によって確認さ
せる。本発明の１例は、切除組織における腫瘍細胞の検
知方法である。切除によって得られた腫瘍の断片を、常
法に従いスライドグラス上に固定化する。得られた腫瘍
の断片を、本発明のモノクローナル抗体と反応させる。
反応条件については、例えばペトリ皿のような適当な容
器において反応させる。非特異的に結合した抗体を洗浄
にて除いた後に、該抗体と反応する検知可能な標識物で
標識された第２の抗体を反応させる。標識物は、検知可
能な信号を発し得るものであり、例えば放射性元素、蛍
光体、酵素等が挙げられる。抗体の結合は、悪性物の存
在は反映しているので、検知可能なシグナルを検知する
ことによって悪性物の存在が確認され得る。また、検体
への該モノクローナル抗体の結合は、放射性物質、酵素
などの検知可能な信号を発し得る標識物を共有結合した
モノクローナル抗体を用いても測定され得る。抗体のお
よび抗体フラグメントへの標識物の共有結合方法は、周
知のものである。また、本方法は切断された組織のみに
限定されず、例えば、客痰中、肺胞洗浄液中等の癌細胞
の検出に用いることが可能である。
を測定するには、公知の免疫測定に従って実施すること
ができ、例えば、肺組織において悪性状態の存在を測定
するものである。悪性状態とは、癌を同時に含む形成異
常の腫瘍細胞等の存在を意味する。検体の腫瘍の存在
は、検体を本発明のモノクローナル抗体と反応させ、検
体上に結合した免疫複合体を検出する事によって確認さ
せる。本発明の１例は、切除組織における腫瘍細胞の検
知方法である。切除によって得られた腫瘍の断片を、常
法に従いスライドグラス上に固定化する。得られた腫瘍
の断片を、本発明のモノクローナル抗体と反応させる。
反応条件については、例えばペトリ皿のような適当な容
器において反応させる。非特異的に結合した抗体を洗浄
にて除いた後に、該抗体と反応する検知可能な標識物で
標識された第２の抗体を反応させる。標識物は、検知可
能な信号を発し得るものであり、例えば放射性元素、蛍
光体、酵素等が挙げられる。抗体の結合は、悪性物の存
在は反映しているので、検知可能なシグナルを検知する
ことによって悪性物の存在が確認され得る。また、検体
への該モノクローナル抗体の結合は、放射性物質、酵素
などの検知可能な信号を発し得る標識物を共有結合した
モノクローナル抗体を用いても測定され得る。抗体のお
よび抗体フラグメントへの標識物の共有結合方法は、周
知のものである。また、本方法は切断された組織のみに
限定されず、例えば、客痰中、肺胞洗浄液中等の癌細胞
の検出に用いることが可能である。
【００２０】本発明の抗原に特異的な抗体を用いれば、
ヒト由来分泌物（血液、尿、喀痰等）中の本発明の抗原
を測定し得る。この測定は、公知の免疫測定方法によっ
て実施することができる。本発明に特異的な抗原として
は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両者が
挙げられ、それぞれ単独でも組合せでも使用できる。免
疫測定法の例としては、酵素免疫測定法、ラジオイムノ
アッセイ、蛍光免疫測定法、化学発光・生物発光免疫測
定法、ラテックス凝集免疫測定法等が挙げられる。酵素
免疫測定法の例としては、任意の公知の変法を用いるこ
とができる。例えば、均一相での酵素免疫測定法、固相
法、不均一酵素免疫測定法、サンドイッチ酵素免疫測定
法等を用いて抗原を直接または競合的に測定を行うこと
ができる。上記の方法のうち、サンドイッチ酵素免疫測
定法が特に好ましい。この方法は、モノクローナル抗体
を固相化した担体と試験溶液を反応させ、洗浄し、そし
て次に抗原と反応性を有する酵素でラベルしたモノクロ
ーナル抗体溶液あるいはポリクローナル抗体の溶液を分
注する。洗浄後、酵素−基質反応により検体中の抗原量
を測定する。なお、この時に用いられるモノクローナル
抗体は、担体に固相化されたモノクローナル抗体によっ
て認識される特定結合部位と異なる部位と結合すること
のできる抗体が望ましいが、抗原中に固相化されたモノ
クローナル抗体の結合できる部位が複数存在する場合
は、この限りではない。また、用いれらる担体として
は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、もしくはポリ
ビニルクロライド製のマイクロプレート、試験管、ビー
ズ、もしくは微粒子、もしくはガラス製の試験管、ビー
ズもしくは濾紙、またはデキストラン、酢酸セルロース
もしくはセルロースのシート、あるいはこれらに類似す
るものが挙げられる。また、本発明の酵素免疫測定法に
おいて好ましい酵素は、西洋ワサビ由来ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼおよびβーガラクトシダ
ーゼ等が挙げられる。本発明の他の測定方法としては、
放射性物質標識物を用いるラジオイムノアッセイ、蛍光
物質標識物を用いる蛍光免疫測定法、発光物質標識化学
発光・生物発光免疫測定法、ラテックス標識物を用いる
ラテックス凝集免疫測定法等が挙げられる。
ヒト由来分泌物（血液、尿、喀痰等）中の本発明の抗原
を測定し得る。この測定は、公知の免疫測定方法によっ
て実施することができる。本発明に特異的な抗原として
は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両者が
挙げられ、それぞれ単独でも組合せでも使用できる。免
疫測定法の例としては、酵素免疫測定法、ラジオイムノ
アッセイ、蛍光免疫測定法、化学発光・生物発光免疫測
定法、ラテックス凝集免疫測定法等が挙げられる。酵素
免疫測定法の例としては、任意の公知の変法を用いるこ
とができる。例えば、均一相での酵素免疫測定法、固相
法、不均一酵素免疫測定法、サンドイッチ酵素免疫測定
法等を用いて抗原を直接または競合的に測定を行うこと
ができる。上記の方法のうち、サンドイッチ酵素免疫測
定法が特に好ましい。この方法は、モノクローナル抗体
を固相化した担体と試験溶液を反応させ、洗浄し、そし
て次に抗原と反応性を有する酵素でラベルしたモノクロ
ーナル抗体溶液あるいはポリクローナル抗体の溶液を分
注する。洗浄後、酵素−基質反応により検体中の抗原量
を測定する。なお、この時に用いられるモノクローナル
抗体は、担体に固相化されたモノクローナル抗体によっ
て認識される特定結合部位と異なる部位と結合すること
のできる抗体が望ましいが、抗原中に固相化されたモノ
クローナル抗体の結合できる部位が複数存在する場合
は、この限りではない。また、用いれらる担体として
は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、もしくはポリ
ビニルクロライド製のマイクロプレート、試験管、ビー
ズ、もしくは微粒子、もしくはガラス製の試験管、ビー
ズもしくは濾紙、またはデキストラン、酢酸セルロース
もしくはセルロースのシート、あるいはこれらに類似す
るものが挙げられる。また、本発明の酵素免疫測定法に
おいて好ましい酵素は、西洋ワサビ由来ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼおよびβーガラクトシダ
ーゼ等が挙げられる。本発明の他の測定方法としては、
放射性物質標識物を用いるラジオイムノアッセイ、蛍光
物質標識物を用いる蛍光免疫測定法、発光物質標識化学
発光・生物発光免疫測定法、ラテックス標識物を用いる
ラテックス凝集免疫測定法等が挙げられる。
【００２１】本発明を実施するのに当たっては、予め本
発明のモノクローナル抗体、本発明の抗原およびその他
の付属品を組み合わせてなる測定キットを作製すること
が望ましい。例えば、サンドイッチ酵素免疫測定法にお
いては、適当な担体に結合させたモノクローナル抗体、
酵素で標識されたモノクローナル抗体と同じ抗原上に結
合できるモノクローナル抗体もしくは同様に酵素標識さ
れたポリクローナル抗体の凍結乾燥品もしくは溶液、精
製抗原標準液、緩衝液、洗浄液、ピッペット、反応容器
等を含むものである。なお、本発明の測定法において使
用されるポリクローナル抗体は、本発明の抗原で免疫さ
れた動物から常法によって容易に採取することができ
る。例えば、本発明の抗原を用いてウサギに数回免疫
し、該抗原に対する抗体価が最高に達した時、採血を行
い常法により抗体分画を分離精製することによって得
る。
発明のモノクローナル抗体、本発明の抗原およびその他
の付属品を組み合わせてなる測定キットを作製すること
が望ましい。例えば、サンドイッチ酵素免疫測定法にお
いては、適当な担体に結合させたモノクローナル抗体、
酵素で標識されたモノクローナル抗体と同じ抗原上に結
合できるモノクローナル抗体もしくは同様に酵素標識さ
れたポリクローナル抗体の凍結乾燥品もしくは溶液、精
製抗原標準液、緩衝液、洗浄液、ピッペット、反応容器
等を含むものである。なお、本発明の測定法において使
用されるポリクローナル抗体は、本発明の抗原で免疫さ
れた動物から常法によって容易に採取することができ
る。例えば、本発明の抗原を用いてウサギに数回免疫
し、該抗原に対する抗体価が最高に達した時、採血を行
い常法により抗体分画を分離精製することによって得
る。
【００２２】（８）体内診断 本発明の抗体は、悪性メラノーマに関する公知の技術
（Larson S.M.ら J.Clin.Invest.72,2101(1983)）に準
じて、肺腺癌を患者中の原発層、転移層を画像化する方
法を利用して得ることができる。抗体またはそのフラグ
メントは、放射性標識され、そして患者へ静脈内投与さ
れ、その後、患者はＰＥＴ法などを用いて画像化され
る。放射性標識するための物質として、例えば９９−Ｔ
ｃ、１３１−Ｉ、１２５−Ｉが挙げられる。
（Larson S.M.ら J.Clin.Invest.72,2101(1983)）に準
じて、肺腺癌を患者中の原発層、転移層を画像化する方
法を利用して得ることができる。抗体またはそのフラグ
メントは、放射性標識され、そして患者へ静脈内投与さ
れ、その後、患者はＰＥＴ法などを用いて画像化され
る。放射性標識するための物質として、例えば９９−Ｔ
ｃ、１３１−Ｉ、１２５−Ｉが挙げられる。
【００２３】また本発明のモノクローナル抗体は、上記
に述べた方法を実施するための診断キットとして用いて
もよい。例えば、モノクローナル抗体および抗体が検知
可能な標識結合体の組合せ、あるいは検知可能な標識体
で標識したモノクローナル抗体が挙げられる。該診断キ
ットには、検出方法に必要な緩衝液やポリサッカライド
類のようなタンパク質安定剤が含まれ、必要に応じて測
定におけるバックグラウンド干渉を低減するための作用
物質、対象試薬、試験を行うための装置等を用いてもよ
い。
に述べた方法を実施するための診断キットとして用いて
もよい。例えば、モノクローナル抗体および抗体が検知
可能な標識結合体の組合せ、あるいは検知可能な標識体
で標識したモノクローナル抗体が挙げられる。該診断キ
ットには、検出方法に必要な緩衝液やポリサッカライド
類のようなタンパク質安定剤が含まれ、必要に応じて測
定におけるバックグラウンド干渉を低減するための作用
物質、対象試薬、試験を行うための装置等を用いてもよ
い。
【００２４】（９）治療法 本発明のモノクローナル抗体は肺腺癌の治療に対しても
使用でき、例えば、癌細胞に毒性を持つ各種毒素、抗ガ
ン剤、あるいは放射性物質を公知の方法により製剤的に
結合させ用いることが可能である。また、免疫的抗腫瘍
活性を付与させる方法として、患者に精製形態の本発明
の抗原、該抗原のフラグメントあるいは該抗原の修飾形
態で免疫させる方法が挙げられる。
使用でき、例えば、癌細胞に毒性を持つ各種毒素、抗ガ
ン剤、あるいは放射性物質を公知の方法により製剤的に
結合させ用いることが可能である。また、免疫的抗腫瘍
活性を付与させる方法として、患者に精製形態の本発明
の抗原、該抗原のフラグメントあるいは該抗原の修飾形
態で免疫させる方法が挙げられる。
【００２５】
【実施例】次に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明
する。 （実施例１） モノクローナル抗体の調整 肺腺癌樹立細胞、Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）を５％
ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した
後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心し、
０.４５μmのフィルターを用いて不溶物を除去した後、
モノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を結合させたアフィニテ
イクロマトカラムに添加し抗原を結合させた。リン酸緩
衝液（pH７.４）で洗浄した後、３Ｍ ＫＳＣＮで溶出
させた。溶出後、透析、濃縮を行い、さらにＳｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ−３００（ファルマシア社製）でゲルクロ
マトグラフィーを用い分画し、分子量２００Ｋｄ以上の
分画を回収し、濃縮した。得られたこの糖タンパクを免
疫源とした。フロインド完全アジュバンド、フロインド
不完全アジュバンドでエマルジョンを作り、これを６週
令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮内に１μg投与した。この
免疫操作を２週間隔で３回行い、最終免疫は上記糖タン
パクを同量静注した。三日後に、脾臓を無菌的に摘出
し、脾臓細胞２.５×１０7個を調整した。混入した赤血
球をＧｅｙ'ｓＳｏｌｕｔｉｏｎで溶血した後、ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地で２回洗浄した。
する。 （実施例１） モノクローナル抗体の調整 肺腺癌樹立細胞、Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）を５％
ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した
後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心し、
０.４５μmのフィルターを用いて不溶物を除去した後、
モノクローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を結合させたアフィニテ
イクロマトカラムに添加し抗原を結合させた。リン酸緩
衝液（pH７.４）で洗浄した後、３Ｍ ＫＳＣＮで溶出
させた。溶出後、透析、濃縮を行い、さらにＳｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ−３００（ファルマシア社製）でゲルクロ
マトグラフィーを用い分画し、分子量２００Ｋｄ以上の
分画を回収し、濃縮した。得られたこの糖タンパクを免
疫源とした。フロインド完全アジュバンド、フロインド
不完全アジュバンドでエマルジョンを作り、これを６週
令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮内に１μg投与した。この
免疫操作を２週間隔で３回行い、最終免疫は上記糖タン
パクを同量静注した。三日後に、脾臓を無菌的に摘出
し、脾臓細胞２.５×１０7個を調整した。混入した赤血
球をＧｅｙ'ｓＳｏｌｕｔｉｏｎで溶血した後、ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地で２回洗浄した。
【００２６】細胞融合には、抗体非産生細胞ＳＰ２／０
−Ａｇ４マウス骨髄腫細胞を用いた。ＳＰ２／０−Ａｇ
４細胞は培養フラスコ（住友ベークライト社製）におい
て、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｆｌｏｗ社製）を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地で培養維持し、細胞融合には対
数増殖期にある細胞を用いた。この骨髄腫細胞を回収
し、５×１０6個に調整した後、ＲＰＭＩ １６４０培
地で２回洗浄した。洗浄した脾臓細胞と骨髄腫細胞をＦ
ｕｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ内で十分混和し、１０００rp
m×５分間の遠心を行って培養液を除去した。ペレット
を再度Ｆｕｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに再浮遊させた。細
胞融合は、細胞融合装置（島津社製、ＳＳＨ−２）を用
いた電気融合法により行った。細胞融合後、３０mlの１
０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地の入った容器
で細胞を回収し、３７℃、５％ＣＯ2／９５％Ａｉｒの
条件下で３０分間培養した。１０００rpm、５分間遠心
した後、１０％ＦＣＳ、１０％ＨＣＦ（ＯＲＩＧＥＮ社
製）を含むＲＰＭＩ １６４０培地に再浮遊させ９６Ｆ
プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に０.１mlずつ分注し
た。これを３７℃、５％ＣＯ2／９５％Ａｉｒの条件下
で培養し、翌日、０.１mlのＨＡＴ培地（１０％ＦＣ
Ｓ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む
ＲＰＭＩ １６４０培地）を加え、ＨＡＴ選択を行っ
た。融合後、４日目に培地の半量、ＨＡＴ培地と交換
し、１０日後、培養上清を採取し、その抗体活性を酵素
免疫法を用いて測定した。
−Ａｇ４マウス骨髄腫細胞を用いた。ＳＰ２／０−Ａｇ
４細胞は培養フラスコ（住友ベークライト社製）におい
て、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｆｌｏｗ社製）を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地で培養維持し、細胞融合には対
数増殖期にある細胞を用いた。この骨髄腫細胞を回収
し、５×１０6個に調整した後、ＲＰＭＩ １６４０培
地で２回洗浄した。洗浄した脾臓細胞と骨髄腫細胞をＦ
ｕｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ内で十分混和し、１０００rp
m×５分間の遠心を行って培養液を除去した。ペレット
を再度Ｆｕｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに再浮遊させた。細
胞融合は、細胞融合装置（島津社製、ＳＳＨ−２）を用
いた電気融合法により行った。細胞融合後、３０mlの１
０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地の入った容器
で細胞を回収し、３７℃、５％ＣＯ2／９５％Ａｉｒの
条件下で３０分間培養した。１０００rpm、５分間遠心
した後、１０％ＦＣＳ、１０％ＨＣＦ（ＯＲＩＧＥＮ社
製）を含むＲＰＭＩ １６４０培地に再浮遊させ９６Ｆ
プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に０.１mlずつ分注し
た。これを３７℃、５％ＣＯ2／９５％Ａｉｒの条件下
で培養し、翌日、０.１mlのＨＡＴ培地（１０％ＦＣ
Ｓ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む
ＲＰＭＩ １６４０培地）を加え、ＨＡＴ選択を行っ
た。融合後、４日目に培地の半量、ＨＡＴ培地と交換
し、１０日後、培養上清を採取し、その抗体活性を酵素
免疫法を用いて測定した。
【００２７】酵素免疫測定法は、下記のように行った。
すなわち、９６Ｆアミノプレートに癌細胞株由来抗原お
よび正常人血清由来抗原を同量（タンパク量１μg/ml含
有する抗原）を１００μl／穴ずつ分注し、グルタール
アルデヒドを用いて常法に従い結合させた。上清を吸引
除去したのち、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μl加え結合残基をブロッ
ク（ブロッキング）を行った。上清を吸引除去した後、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。このプレートにハ
イブリドーマ培養上清を５０μl／穴分注し、３７℃、
１時間反応させた。上清を吸引除去した後、再度ＰＢＳ
−Ｔｅｅｗｎ２０で洗浄した。洗浄後、抗マウスイムノ
グロブリン抗体−ペルオキシダーゼ結合物を１００μl
／穴分注し、３７℃、１時間反応させた。洗浄後、Ｏ−
フェニレンジアミン・２塩酸塩あるいはテトラメチルベ
ンジジンおよび過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ４.２）を１００μl／穴分注し、室温にて３０
分間放置した。２Ｎの硫酸５０μl／穴を分注し酵素反
応を停止させた後、ＯＤ４９２ｎｍを測定した。この
時、正常人血清由来抗原より癌細胞株由来抗原により反
応性の高いハイブリドーマを選択した。
すなわち、９６Ｆアミノプレートに癌細胞株由来抗原お
よび正常人血清由来抗原を同量（タンパク量１μg/ml含
有する抗原）を１００μl／穴ずつ分注し、グルタール
アルデヒドを用いて常法に従い結合させた。上清を吸引
除去したのち、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μl加え結合残基をブロッ
ク（ブロッキング）を行った。上清を吸引除去した後、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。このプレートにハ
イブリドーマ培養上清を５０μl／穴分注し、３７℃、
１時間反応させた。上清を吸引除去した後、再度ＰＢＳ
−Ｔｅｅｗｎ２０で洗浄した。洗浄後、抗マウスイムノ
グロブリン抗体−ペルオキシダーゼ結合物を１００μl
／穴分注し、３７℃、１時間反応させた。洗浄後、Ｏ−
フェニレンジアミン・２塩酸塩あるいはテトラメチルベ
ンジジンおよび過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ４.２）を１００μl／穴分注し、室温にて３０
分間放置した。２Ｎの硫酸５０μl／穴を分注し酵素反
応を停止させた後、ＯＤ４９２ｎｍを測定した。この
時、正常人血清由来抗原より癌細胞株由来抗原により反
応性の高いハイブリドーマを選択した。
【００２８】得られた抗体産生ハイブリドーマを限界希
釈法等によりクローニングすることにより、本発明のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られ
た。このようにして得られたハイブリドーマを利用し
て、本発明のモノクローナル抗体を大量に製造するため
に、細胞を大量に培養した。次いでこの培養液中から常
法の抗体分離精製操作方法に従い、本発明のモノクロー
ナル抗体を分離精製することができた。得られた本発明
のモノクローナル抗体は、ヒト肺腺癌と反応し、ヒト正
常人とは、殆ど反応しない。アイソタイプキット（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製）を用いてアイソタイプを確認したとこ
ろ該抗体はＩｇＭアイソタイプに分類された。
釈法等によりクローニングすることにより、本発明のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られ
た。このようにして得られたハイブリドーマを利用し
て、本発明のモノクローナル抗体を大量に製造するため
に、細胞を大量に培養した。次いでこの培養液中から常
法の抗体分離精製操作方法に従い、本発明のモノクロー
ナル抗体を分離精製することができた。得られた本発明
のモノクローナル抗体は、ヒト肺腺癌と反応し、ヒト正
常人とは、殆ど反応しない。アイソタイプキット（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製）を用いてアイソタイプを確認したとこ
ろ該抗体はＩｇＭアイソタイプに分類された。
【００２９】（実施例２） 抗原の精製 肺腺癌樹立細胞、Ｃａｌｕ−３（ATCC HTB-55）を５％
ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した後、培
養上清を回収した。回収した培養上清を遠心し、０.４
５μmのフィルターを用いて不溶物を除去した後、モノ
クローナル抗体ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２、ＴＲＤ−
Ｌ３を結合させたアフィニテイクロマトカラムにアプラ
イし、抗原を結合させた後、リン酸緩衝液（ｐＨ７.
４）で洗浄した。洗浄後、３Ｍ ＫＳＣＮで溶出させ
た。溶出後、透析、濃縮を行い、さらにＳｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−３００（ファルマシア社製）でゲルクロマト
グラフィーを用い分画し、抗体と反応する分画を回収
し、濃縮した。
ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した後、培
養上清を回収した。回収した培養上清を遠心し、０.４
５μmのフィルターを用いて不溶物を除去した後、モノ
クローナル抗体ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２、ＴＲＤ−
Ｌ３を結合させたアフィニテイクロマトカラムにアプラ
イし、抗原を結合させた後、リン酸緩衝液（ｐＨ７.
４）で洗浄した。洗浄後、３Ｍ ＫＳＣＮで溶出させ
た。溶出後、透析、濃縮を行い、さらにＳｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−３００（ファルマシア社製）でゲルクロマト
グラフィーを用い分画し、抗体と反応する分画を回収
し、濃縮した。
【００３０】（実施例３） 抗原の生化学的性質 ＴＲＤ−Ｌ１、ＴＲＤ−Ｌ２およびＴＲＤ−Ｌ３反応抗
原を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエ
スタンイムノブロット分析、レクチン分析、ＰＡＳ染色
にて分析した。精製抗原を常法に従い、Ｌａｅｍｍｌｉ
法により、４％ゲルで分離した。ゲルの一部は、ＰＡＳ
染色を行った。また、レクチン分析については、正常人
血清よりＤＦ−Ｌ１を用いて同様に抗原精製を行ったも
のについても、同様に分析した。
原を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエ
スタンイムノブロット分析、レクチン分析、ＰＡＳ染色
にて分析した。精製抗原を常法に従い、Ｌａｅｍｍｌｉ
法により、４％ゲルで分離した。ゲルの一部は、ＰＡＳ
染色を行った。また、レクチン分析については、正常人
血清よりＤＦ−Ｌ１を用いて同様に抗原精製を行ったも
のについても、同様に分析した。
【００３１】なお、ウエスタンイムノブロットは以下の
ようにして行った。すなわち、分離タンパクを常法によ
りＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にトランスファー
させた。トランスファー後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで、室
温で６０分間ブロッキングした。ブロッキング後、モノ
クローナル抗体を４℃、一夜反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ２０にて洗浄後、アルカリ性フォスファターゼ標
識ウサギ抗マウスイムノグロブリンを、室温で１時間反
応させた。反応後、再度洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液
を加え、発色させた。また、レクチン分析はウエスタン
ブロットと同様にＰＶＤＦ膜にトランスファーした後、
ブロッキングを行い、ジゴキシゲニン標識レクチン（ベ
ーリンガーマンハイム株式会社製）を室温にて２時間反
応させた後、洗浄を行い、さらにアルカリ性フォスファ
ターゼ標識ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガーマンハイ
ム株式会社製）を室温において１時間反応させた後、洗
浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を加え、発色させた。
ようにして行った。すなわち、分離タンパクを常法によ
りＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にトランスファー
させた。トランスファー後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで、室
温で６０分間ブロッキングした。ブロッキング後、モノ
クローナル抗体を４℃、一夜反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ２０にて洗浄後、アルカリ性フォスファターゼ標
識ウサギ抗マウスイムノグロブリンを、室温で１時間反
応させた。反応後、再度洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液
を加え、発色させた。また、レクチン分析はウエスタン
ブロットと同様にＰＶＤＦ膜にトランスファーした後、
ブロッキングを行い、ジゴキシゲニン標識レクチン（ベ
ーリンガーマンハイム株式会社製）を室温にて２時間反
応させた後、洗浄を行い、さらにアルカリ性フォスファ
ターゼ標識ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガーマンハイ
ム株式会社製）を室温において１時間反応させた後、洗
浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を加え、発色させた。
【００３２】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびウエスタンブロットの結果より抗原の分子量は、
２００Ｋｄ以上であり、ＰＡＳ染色により強く染色され
ることから糖タンパクであると言える。また、レクチン
分析からＭＡＡレクチン、ＰＮＡレクチンとは強く反応
するがＧＮＡレクチン、ＳＮＮレクチン、ＤＡＳレクチ
ンとは反応しない糖タンパクである。レクチンとの反応
性から、この抗原の糖鎖の末端構造は、ＮｅｕＡｃ（２
−３）Ｇａｌ，Ｇａｌ（１−３）ＧａｌＮＡｃ構造を持
つが、Ｍａｎｎｏｓｅ，ＮｅｕＡｃ（２−６）Ｇａｌ，
Ｎｅｕ（２−６）ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌ（１−４）Ｇｌ
ｃＮＡｃ構造は存在しないことが予想される。
およびウエスタンブロットの結果より抗原の分子量は、
２００Ｋｄ以上であり、ＰＡＳ染色により強く染色され
ることから糖タンパクであると言える。また、レクチン
分析からＭＡＡレクチン、ＰＮＡレクチンとは強く反応
するがＧＮＡレクチン、ＳＮＮレクチン、ＤＡＳレクチ
ンとは反応しない糖タンパクである。レクチンとの反応
性から、この抗原の糖鎖の末端構造は、ＮｅｕＡｃ（２
−３）Ｇａｌ，Ｇａｌ（１−３）ＧａｌＮＡｃ構造を持
つが、Ｍａｎｎｏｓｅ，ＮｅｕＡｃ（２−６）Ｇａｌ，
Ｎｅｕ（２−６）ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌ（１−４）Ｇｌ
ｃＮＡｃ構造は存在しないことが予想される。
【００３３】一方、ＤＦ−Ｌ１反応抗原はＭＡＡレクチ
ン、ＳＮＮレクチンおよびＤＡＳレクチンとは強く反応
し、ＰＮＡレクチンとは弱く反応するが、ＧＮＡレクチ
ンとは反応しない糖タンパクであり、ＤＦ−Ｌ１反応抗
原の糖鎖の末端構造は、ＮｅｕＡｃ（２−３）Ｇａｌ，
Ｇａｌ（１−３）ＧａｌＮＡｃ，ＮｅｕＡｃ（２−６）
Ｇａｌ，Ｎｅｕ（２−６）ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌ（１−
４）ＧｌｃＮＡｃ構造であると予想される。
ン、ＳＮＮレクチンおよびＤＡＳレクチンとは強く反応
し、ＰＮＡレクチンとは弱く反応するが、ＧＮＡレクチ
ンとは反応しない糖タンパクであり、ＤＦ−Ｌ１反応抗
原の糖鎖の末端構造は、ＮｅｕＡｃ（２−３）Ｇａｌ，
Ｇａｌ（１−３）ＧａｌＮＡｃ，ＮｅｕＡｃ（２−６）
Ｇａｌ，Ｎｅｕ（２−６）ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌ（１−
４）ＧｌｃＮＡｃ構造であると予想される。
【００３４】（実施例４） 免疫組織化学的測定法 肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌および正常組織の凍結ブ
ロックをクライオスタットを用いて、９ミクロンの厚さ
で切片としてスライドグラス非固定凍結切片を作製し
た。この凍結切片を０.５％過酸化水素で１０分間反応
させ、内在性のペルオキシダーゼをブロックした。０.
１５４ＭのＮａＣｌを含む２０mMリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した後、１０％ウサギ血清を含むＰＢＳを１
０分間反応させた。再度、ＰＢＳで洗浄し、モノクロー
ナル抗体を添加し、６０分間反応させた。ＰＢＳで再度
洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫
グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ社製）をＰＢＳで２００倍希
釈し反応させた。６０分反応させ、ＰＢＳで希釈後、基
質としてジアミノベンジジン（Diaminobenzidin）、過
酸化水素を含む発色キット（フナコシ社製）を加え、１
５分間反応させた。再度、洗浄後、ヘマトキシリン溶液
で核を染色し、脱水を行い、包理した。なお反応は、す
べて室温にて行った。この切片を１００倍の倍率で検鏡
し、茶褐色に染色された細胞が１０％以上存在するもの
を陽性とした。結果を表１に示す。その結果、本発明の
モノクローナル抗体は、肺腺癌に対して、高い陽性を示
した。
ロックをクライオスタットを用いて、９ミクロンの厚さ
で切片としてスライドグラス非固定凍結切片を作製し
た。この凍結切片を０.５％過酸化水素で１０分間反応
させ、内在性のペルオキシダーゼをブロックした。０.
１５４ＭのＮａＣｌを含む２０mMリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した後、１０％ウサギ血清を含むＰＢＳを１
０分間反応させた。再度、ＰＢＳで洗浄し、モノクロー
ナル抗体を添加し、６０分間反応させた。ＰＢＳで再度
洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫
グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ社製）をＰＢＳで２００倍希
釈し反応させた。６０分反応させ、ＰＢＳで希釈後、基
質としてジアミノベンジジン（Diaminobenzidin）、過
酸化水素を含む発色キット（フナコシ社製）を加え、１
５分間反応させた。再度、洗浄後、ヘマトキシリン溶液
で核を染色し、脱水を行い、包理した。なお反応は、す
べて室温にて行った。この切片を１００倍の倍率で検鏡
し、茶褐色に染色された細胞が１０％以上存在するもの
を陽性とした。結果を表１に示す。その結果、本発明の
モノクローナル抗体は、肺腺癌に対して、高い陽性を示
した。
【００３５】
【表１】
【００３６】（実施例５） 酵素免疫測定 正常人血清、肺腺癌患者血清、及び肺腺癌樹立細胞Ｃａ
ｌｕ−３（ATCC HTB-55）の培養上清を遠心し、０.４５
μmのフィルターを用いて不溶物を除去した後、モノク
ローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を結合させたアフィニテイクロ
マトカラムにアプライし、結合させた後、リン酸緩衝液
（pH７.４）で洗浄した。洗浄後、３ＭＫＳＣＮで溶出
させた。溶出後、透析、濃縮を行い、ＤＦ−Ｌ１結合抗
原を得た。得られた抗原を９６Ｆアミノプレート（住友
ベークライト社製）に同量（タンパク量１μg/ml含有す
る抗原）を１００μl／穴ずつ分注し、グルタールアル
デヒドを用いて常法に従い結合させた。上清を吸引除去
した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ３００μlを加え結合残基のブロック（ブ
ロッキング）を行った。再度上清を吸引除去した後、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。このプレートにモノ
クローナル抗体溶液（１μg/ml）を１００μl/穴分注
し、４℃において一晩反応させた。
ｌｕ−３（ATCC HTB-55）の培養上清を遠心し、０.４５
μmのフィルターを用いて不溶物を除去した後、モノク
ローナル抗体ＤＦ−Ｌ１を結合させたアフィニテイクロ
マトカラムにアプライし、結合させた後、リン酸緩衝液
（pH７.４）で洗浄した。洗浄後、３ＭＫＳＣＮで溶出
させた。溶出後、透析、濃縮を行い、ＤＦ−Ｌ１結合抗
原を得た。得られた抗原を９６Ｆアミノプレート（住友
ベークライト社製）に同量（タンパク量１μg/ml含有す
る抗原）を１００μl／穴ずつ分注し、グルタールアル
デヒドを用いて常法に従い結合させた。上清を吸引除去
した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ３００μlを加え結合残基のブロック（ブ
ロッキング）を行った。再度上清を吸引除去した後、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。このプレートにモノ
クローナル抗体溶液（１μg/ml）を１００μl/穴分注
し、４℃において一晩反応させた。
【００３７】上清を吸引除去した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ２０で洗浄した。洗浄後、抗マウスイムノグロブリン
抗体−ペルオキシダーゼ結合物を１００μl/穴分注し、
室温にて２時間反応させた。洗浄後、Ｏ−フェニレンジ
アミン・２塩酸塩過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩
衝液（pH４.２）を１００μl/穴分注し、室温にて３０
分間放置した後、２Ｎの硫酸５０μl/穴分注した後、最
終的にＯＤ４９２nmを測定し、抗原の存在を確認した。
結果を表２に示す。本発明の抗原は、肺腺癌患者血清
中、肺腺癌細胞株の培養上清中に分泌されており、また
本発明のモノクローナル抗体は、この抗原と最も強く反
応した。
ｎ２０で洗浄した。洗浄後、抗マウスイムノグロブリン
抗体−ペルオキシダーゼ結合物を１００μl/穴分注し、
室温にて２時間反応させた。洗浄後、Ｏ−フェニレンジ
アミン・２塩酸塩過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩
衝液（pH４.２）を１００μl/穴分注し、室温にて３０
分間放置した後、２Ｎの硫酸５０μl/穴分注した後、最
終的にＯＤ４９２nmを測定し、抗原の存在を確認した。
結果を表２に示す。本発明の抗原は、肺腺癌患者血清
中、肺腺癌細胞株の培養上清中に分泌されており、また
本発明のモノクローナル抗体は、この抗原と最も強く反
応した。
【００３８】
【表２】
【００３９】（実施例６） サンドイッチ酵素免疫測定法 正常人血清１０検体、肺腺癌患者血清５検体、肺良性疾
患患者血清５検体およびその他の癌患者血清５検体を用
いて、サンドイッチ酵素免疫測定法にて、各患者の血清
中の抗原量を測定した。すなわち、９６Ｆイムノプレー
ト（Ｎｕｎｃ社製）にモノクローナル抗体溶液（５μg/
ml，０.０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９.６））を１００μl/
穴、分注し、４℃で一夜反応させた。溶液を吸引除去
後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを分注し、ブロッキングを
行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて洗浄した後、
５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で２０倍希釈した血清検体
を１００μl/穴、分注し、室温にて１時間反応させた。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて洗浄した後、ペルオキ
シダーゼ標識ＤＦ−Ｌ１抗体を１００μl/穴、分注し
た。室温において１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ２０溶液で洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン・２塩
酸塩および過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩衝液（p
H４.２）を１００μl/穴分注し、室温にて３０分間放置
した後、２Ｎの硫酸を５０μl/穴分注した。最終的にＯ
Ｄ４９２nmを測定し、抗原の存在を確認した。結果を図
１に示す。本発明の抗原は、肺腺癌患者血清中に最も多
く分泌されており、また、本発明のモノクローナル抗体
を用いて、該抗原を測定することは、肺腺癌の診断に有
用であると言える。
患患者血清５検体およびその他の癌患者血清５検体を用
いて、サンドイッチ酵素免疫測定法にて、各患者の血清
中の抗原量を測定した。すなわち、９６Ｆイムノプレー
ト（Ｎｕｎｃ社製）にモノクローナル抗体溶液（５μg/
ml，０.０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９.６））を１００μl/
穴、分注し、４℃で一夜反応させた。溶液を吸引除去
後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを分注し、ブロッキングを
行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて洗浄した後、
５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で２０倍希釈した血清検体
を１００μl/穴、分注し、室温にて１時間反応させた。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて洗浄した後、ペルオキ
シダーゼ標識ＤＦ−Ｌ１抗体を１００μl/穴、分注し
た。室温において１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ２０溶液で洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン・２塩
酸塩および過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸緩衝液（p
H４.２）を１００μl/穴分注し、室温にて３０分間放置
した後、２Ｎの硫酸を５０μl/穴分注した。最終的にＯ
Ｄ４９２nmを測定し、抗原の存在を確認した。結果を図
１に示す。本発明の抗原は、肺腺癌患者血清中に最も多
く分泌されており、また、本発明のモノクローナル抗体
を用いて、該抗原を測定することは、肺腺癌の診断に有
用であると言える。
【００４０】
【発明の効果】本発明によってモノクローナル抗体、抗
原が得られ、また、該モノクローナル抗体および抗原を
用いた免疫測定法によって組織中の肺腺癌細胞の検出、
ヒト体液、例えば血中の抗原量を測定することによって
肺腺癌の確定診断及び予後の判定が可能となる。
原が得られ、また、該モノクローナル抗体および抗原を
用いた免疫測定法によって組織中の肺腺癌細胞の検出、
ヒト体液、例えば血中の抗原量を測定することによって
肺腺癌の確定診断及び予後の判定が可能となる。
【図１】図１は、実施例６において、正常人、肺腺癌、
肺良性疾患患者、その他の癌患者の血清中の抗原を吸光
度４９２nmによって測定した結果を示す。
肺良性疾患患者、その他の癌患者の血清中の抗原を吸光
度４９２nmによって測定した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/00 39/395 Ｄ 39/395 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Claims (9)
- 【請求項１】２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分
子量を有し、ヒト肺腺癌の細胞中に存在し、かつヒト肺
腺癌により分泌される糖タンパク抗原に結合することを
特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項２】２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分
子量を有し、ＭＡＡレクチンおよびＰＮＡレクチンとは
反応するがＧＮＡレクチン、ＳＮＮレクチンおよびＤＡ
Ｓレクチンとは反応せず、ヒト肺腺癌の細胞中に存在
し、かつヒト腺癌により分泌される糖タンパク抗原に結
合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】抗体のアイソタイプがＩｇＭである請求項
１または２に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】ヒト肺腺癌細胞分泌成分で免疫したマウス
の脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られ
たハイブリドーマ細胞株ＴＲＤ−Ｌ１（工業技術院生命
工学工業技術研究所受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７
８）、ＴＲＤ−Ｌ２（工業技術院生命工学工業技術研究
所受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７９）、またはＴＲ
Ｄ−Ｌ３（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８８０）が産生する請求項１〜３
のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】抗体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２またはＦｖ
フラグメントである請求項１または２に記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項６】２００Ｋｄ以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分
子量を有する糖タンパクで、ヒト肺腺癌の細胞中に存在
し、かつヒト肺腺癌により分泌される糖タンパク抗原。 - 【請求項７】ＭＡＡレクチンおよびＰＮＡレクチンとは
反応するがＧＮＡレクチン、ＳＮＮレクチンおよびＤＡ
Ｓレクチンとは反応しないものである請求項６に記載の
糖タンパク抗原。 - 【請求項８】請求項１〜５のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体を用いることを特徴とする肺腺癌診断の免疫
測定方法。 - 【請求項９】請求項１〜５のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体を用いて請求項６または７に記載の糖タンパ
ク抗原を測定する請求項８に記載の肺腺癌診断の免疫測
定方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7094071A JPH08311100A (ja) | 1995-03-13 | 1995-04-20 | ヒト肺腺癌に関するモノクローナル抗体および抗原、及びそれを用いた免疫測定方法 |
| ES96905993T ES2233965T3 (es) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Anticuerpo monoclonal y antigeno relativo al adenocarcinoma pulmonar humano y metodo de inmunoensayo con el uso de los mismos. |
| DE69633976T DE69633976T2 (de) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Monoklonale antikörper und antigene mit bezug zum menschlichen lungenadenokarzinom und immunoassay-verfahren unter verwendung desselben |
| PCT/JP1996/000613 WO1996028569A1 (fr) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Anticoprs monoclonal et antigene relatifs a l'adenocarcimome pulmonaire humain et methode du dosage immunologique au moyen de cet anticorps et de cet antigene |
| EP96905993A EP0845540B1 (en) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Monoclonal antibody and antigen relating to human pulmonary adenocarcinoma and immunoassay method with the use of the same |
| AT96905993T ATE283927T1 (de) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Monoklonale antikörper und antigene mit bezug zum menschlichen lungenadenokarzinom und immunoassay- verfahren unter verwendung desselben |
| US08/913,315 US6015680A (en) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Human lung adenocarcinoma-related monoclonal antibody and immunoassay method which uses the same |
| US09/350,899 US6919435B1 (en) | 1995-03-13 | 1999-07-12 | Human lung adenocarcinoma-related monoclonal antibody and antigen and immunoassay method which uses the same |
| US11/165,348 US20050238652A1 (en) | 1995-03-13 | 2005-06-24 | Human lung adenocarcinoma-related monoclonal antibody and antigen and immunaossay method which uses the same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5226095 | 1995-03-13 | ||
| JP7-52260 | 1995-03-13 | ||
| JP7094071A JPH08311100A (ja) | 1995-03-13 | 1995-04-20 | ヒト肺腺癌に関するモノクローナル抗体および抗原、及びそれを用いた免疫測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08311100A true JPH08311100A (ja) | 1996-11-26 |
Family
ID=26392856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7094071A Pending JPH08311100A (ja) | 1995-03-13 | 1995-04-20 | ヒト肺腺癌に関するモノクローナル抗体および抗原、及びそれを用いた免疫測定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6015680A (ja) |
| EP (1) | EP0845540B1 (ja) |
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