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Die Erfindung betrifft das Gebiet der Krebsimmunologie. Im
besonderen betrifft es für Krebs-assoziierte Antigene
spezifische monoclonale Antikörper, die die Antikörper produzierenden
Hybridomzellinien und die Verwendung der Antikörper.
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Das Pigmentations-assoziierte Antigen, für das der offenbarte
und hierin beanspruchte Antikörper spezifisch ist, wird in der
gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Nr. 481 379
beschrieben; deren Offenbarung ist durch Bezugnahme
eingeschlossen. Siehe auch Mattes et al., Int. J. Cancer
32:717-721 (1983); darin ist gezeigt, daß dieses Antigen nicht
auf Tumore beschränkt ist. Das Antigen unterscheidet sich von
anderen Melanocyten-Differenzierungs-Antigenen, wie beschrieben
durch Watanabe et al., J. Exp. Med. 156 (1982), 1884-1889;
Hershey et al. Brit. J. Cancer 40 (1979), 615-624; Leong et al.,
J. Surg. Res. 24 (1978), 245-252; Gupta et al., J. Natl. Cancer
Inst. 70 (1984), 83-92; Naughton et al., J. Exp. Med., 158
(1983), 246-251; Hougthon et al. PNAS USA 77 (1980), 4260-4264.
Das Antigen ist jedoch mit dem von Tai, et al., Cancer Res. 43
(1983), 2773-2779 beschriebenen gp75-Antigen identisch und von
Melanin und Tyrosinase verschieden. Hearing et al., Cancer Res.
37 (1977), 1519-1524 beschreiben ein gp70-Melanosom-Protein,
Untersuchungen von Hearing zeigten jedoch, daß dieses Protein
nicht mit dem monoclonalen Antikörper TA99 reagiert. Heany-
Kierds et al. Cancer Res. 42 (1982), 2310-2316 beschreiben ein
gp75-Melanom-Antigen, das jedoch nicht Pigmentations-assoziiert
ist.
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Wie ersichtlich, gibt es eine weitgehende Literatur über
Melanomassoziierte Antigene. Im Stand der Technik gibt es jedoch keine
Lehre über monoclonale Antikörper, die für das
Pigmentationsassoziierte Antigen gp70-80 spezifisch sind und einen
isoelektrischen Punkt von etwa 5,2-5,6 besitzen, wie durch Mattes et
al. vorstehend beschrieben. Gegenstand dieser Erfindung ist ein
monoclonaler Antikörper, der für dieses Antigen spezifisch ist.
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Pigmentierte Melanomzellen und kultivierte Melanocyten
exprimieren ein mit der Differenzierung zusammenhängendes
Glycoprotein mit einem Gewicht von etwa 70-80 Kilodalton und
einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2-5,6; Mattes, vorstehend.
Das Antigen wird als Pigmentations-assoziiertes Antigen oder
"PAA" bezeichnet. Das Antigen wurde zuvor durch Präzipitation
polyclonaler Antikörper aus Seren eines Melanom-Patienten
isoliert. Die so präzipitierten Antikörper reagierten mit
autologen Tumorzellen, pigmentierten Melanomzellen und mit
normalen Melanocyten. Es wurde keine Reaktion mit
nichtpigmentierten Melanomen oder anderen Arten maligner oder normaler
Zellen beobachtet.
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Auf der früher beschriebenen Arbeit basierend wurde nun ein
monoclonaler Maus-Antikörper hergestellt, der für das
Pigmentations-assoziierte Antigen gp70-80 spezifisch ist. Die Herstellung
dieses monoclonalen Antikörpers und seine Verwendung zur
genaueren Untersuchung der Verteilung und Eigenschaften
Pigmentations- assoziierter Antigene werden beschrieben.
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Fig. 1 ist ein Audiogramm einer Acrylamidgelelektrophorese von
Immunpräzipitaten, die unter Verwendung der mit ¹²&sup5;I (Bahnen 1-4,
Exponierung 1 Tag) oder ³&sup5;S-Methionin (Bahnen 5-7, Exponierung
2 Monate) markierten Zellinie SK-MEL 23 erhalten wurde.
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Fig. 2 zeigt Präzipitation von Pigmentations-assoziiertem
Antigen unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers TA99. Das
Audiogramm zeigt die Analyse einer Acrylamidgelelektrophorese
von mit ¹²&sup5;I markierten SK-MEL 23-Immunpräzipitaten.
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Fig. 3 zeigt die Reaktion des monoclonalen Antikörpers TA99 mit
der Basalschicht der Epidermis, in Photographien von 5 um-
Kryoschnitten von normaler Vorhaut von Weißen, die mit A)
Hematoxylin; B) Immunperoxidase mit Antikörper MG144, der als
Kontroll-IgG verwendet wurde; oder C) Immunperoxidase mit TA99
gefärbt wurden.
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Fig. 4 zeigt experimentelle Ergebnisse, die beweisen, daß das
Pigmentations-assoziierte Antigen nicht Tyrosinase ist. Extrakte
von SK-MEL-173 wurden mit Verdünnungen von Maus-anti Mensch-
Tyrosinase-Antiserum oder monoclonalem Antikörper TA99, und
nachfolgend mit Kaninchen-anti Maus-IgG inkubiert. Nach dem
Pelletieren wurden der Überstand und das Pellet auf Tyrosinase-
Aktivität hin untersucht. Die Ordinate gibt die ³H Freisetzung
aus ³H-Tyrosin an.
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Fig. 5 zeigt Audiogramme von 2-dimensionalen Gelen von ³H-
Glucosamin-markierten SK-MEL-23, die die Identität des
Pigmentations-assoziierten Antigens mit gp75 zeigen. Für Einzelheiten der
dies betreffenden Experimente siehe die folgende Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen.
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Hybridomzellinien, die in dieser Anmeldung beschrieben werden,
und die den monoclonalen Antikörper TA99 produzieren, wurden in
der American Type Culture Collection, Bethesda, Maryland
hinterlegt und tragen die Bezeichnung HB8704.
Zellinien und Gewebe
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Die verwendeten Tumorzellinien sind in Tabelle I aufgeführt, und
wurden wie in Mattes et al., Int. J. Cancer 32 (1983), 717-721
beschrieben, kultiviert. Maus-Myelomzellen NS-1 wurden wie in
Mattes et al., Hybridoma 2 (1983), 253-264 beschrieben
gehalten. Normale menschliche Gewebe wurden zum Zweck der
Immunperoxidasestudien in flüssigem Stickstoff eingefroren und
bei -70ºC aufbewahrt.
Seren
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Seren gemäß der Charakterisierung in Mattes et al., Int. J.
Cancer 32 (1983), 717-721 wurden verwendet. Mäuse wurden mit
Zellinien durch intraperitoneale Injektion immunisiert, wobei
etwa 10&sup7; Zellen, die von Gewebekulturflaschen abgekratzt und
zweimal mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
(DPBS, GIBCO, Grand Island, NY) gewaschen worden waren,
verwendet wurden. Zwei bis vier Injektionen wurden in
Intervallen von zwei Wochen verabreicht. Ein Kaninchen-Antiserum
gegen gereinigte Hamster-Tyrosinase wurde verwendet, das mit
menschlicher Tyrosinase kreuzreagiert, wie in Halaban et al.,
J. Gell. Biol. 97 (1983), 480-488 beschrieben. Maus-Antiseren,
die mit Tyrosinase reagieren, wurden durch Immunisierung von
Mäusen mit solubilisierten Melanosom Rohpräparationen, die
nachfolgend beschrieben sind, erhalten. Ungefähr 0,3 mg Protein
wurden mit Freund's-complete-Adjuvans emulgiert und subkutan
injiziert. Zwei Monate später wurden die Mäuse in ähnlicher
Weise, außer daß Freund's-incomplete-Adjuvans verwendet wurde,
geboostet.
Herstellung monoclonaler Antikörper
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Milzzellen einer immunisierten Maus, von der bekannt war, daß
sie Antikörper gegen Pigmentations- assoziiertes Antigen
produziert, wurden mit NS-1 Zellen mit Polyethylenglycol fusioniert,
wie in Dippold, et al., PNAS USA 77 (1980), 6114-6118
beschrieben. Nach der Fusion wurde die Zellen in 20 Costar 3424-Platten
mit 24 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) ausplattiert, und der
Kulturüberstand nach anti-Pigmentations-assoziiertes Antigen-
Antikörper mittels Immunpräzipitation, wie nachfolgend
beschrieben,
abgesucht. Clonierung wurde durch limitierende
Verdünnung in Costar 3596-Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt.
Die Hybridome wurden nachfolgend in nu/nu Mäusen herangezogen
und das Serum wie zuvor in Dippold et al., obenstehend
beschrieben, erhalten.
Radiomarkierung
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¹²&sup5;I-Markierung von in Detergenzien solubilisierten Zellextrakten
wurde verwendet, wie in Mattes et al., Int. J. Cancer 32 (1983),
717-721. Metabolische Markierung mit [³&sup5;S]-Methionin wie in
Cairncross et al., PNAS USA 79 (1982), 5641-5645 beschrieben,
oder [³H]-Glucosamin, wie in Ogata et al., PNAS 78 (1981), 770-
774 beschrieben, und Con A-Sepharose-Fraktionierung von
markierten Extrakten nach Mattes et al., Hybridoma 2 (1983), 253-264
wurden verwendet. Zur Markierung mit [³H]-Tyrosin wurden die
Zellen 16 Stunden lang mit 0,5 mCi [³H]-Tyrosin (54,6 Ci/mMol,
New England Nuclear, Boston MA) in tyrosinfreiem Medium, das mit
5% dialysiertem fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt war,
inkubiert.
Immunpräzipitation
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Immunpräzipitation von mit ¹²&sup5;I-markierten Proben wurde wie in
Mattes et al. Int. J. Cancer 32 (1983), 717-721 beschrieben
durchgeführt. Immunpräzipitation von metabolisch markierten
Proben wurde in einer ähnlichen Art und Weise durchgeführt und
wurde von Mattes et al., Hybridoma 2 (1983), 253-264 beschrieben.
Gele mit ¹²&sup5;I-markierten Proben wurden getrocknet und auf einem
Kodak XAR-Film bei -70ºC unter Verwendung eines
Verstärkungsschirmes (DuPont Lightning Plus) exponiert. Gele mit metabolisch
markierten Proben wurden für die Fluorgraphie vorbereitet, wie
in Ogata, vorstehend, beschrieben. Zweidimensionale
Gelelektrophorese wurde gemäß O'Farrell und O'Farrell, Methods in Cell
Biology, Band 16, Seiten 407-420 (1977) durchgeführt.
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Für die sequentielle Immunpräzipitation erfolgte die erste
Immunpräzipitation wie beschrieben, außer daß das pelletierte
SA zur Vermeidung von Verdünnung mit der Probe vermischt wurde.
Nach einer Zentrifugation wurden die Pellets verworfen und die
Überstände mit dem zweiten Maus-Antikörper und Kaninchen-anti-
Maus-IgG inkubiert. Nach 4 Stunden wurde SA zugegeben, und die
nachfolgenden Schritte wurden wie vorstehend beschrieben
durchgeführt.
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Zur Inhibierung der Immunpräzipitation wurden die zu
untersuchenden Zellen von 75 cm²-Flaschen abgekratzt, dreimal mit PBS
gewaschen und mit dem vierfachem Pelletvolumen Lyse-Puffer, wie
oben beschrieben, extrahiert. Die Extrakte wurden entweder
sofort verwendet oder bei -20ºC eingefroren. Die Extrakte wurden
über Nacht bei 4ºC mit 0,5 ml verdünntem Hybridom-Überstand
inkubiert. SA-vorgereinigte ¹²&sup5;I-markierte Proben (10&sup5; cpm) von einer
Con A-Eluatfraktion von SK-MEL-23, wurden zugegeben und die
Mischung 1 Stunde inkubiert. Kaninchen-anti-Maus-IgG (0,015
ml) wurde zugegeben, und nach 2 Stunden 0,015 ml SA-Suspension
zugegeben, und wie oben verfahren. Eine solubilisierte SK-MEL-23-
Membranfraktion wurde hergestellt, wie in Mattes et al.,
Hybridoma 2:253-264 (1983) beschrieben.
Serologische Tests an Zellinien und Geweben
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Zellinien wurden in Falcon 3034-Mikrotestplatten angezogen. Der
Rosetten-Versuch für Zelloberflächenantigene wurde in Mattes et
al., vorstehend, beschrieben. Um intrazelluläre Antigene
nachzuweisen, wurden die Platten dreimal mit DPBS gewaschen und für
45 Minuten mit 2% gepuffertem Formaldehyd fixiert, nach der
Methode von Farr et al., J. Immunol. Meth. 47 (1981) 129-144.
Die Platten wurden dann dreimal mit DPBS gewaschen, 30 Minuten
mit 0,5% NP40 in PBS inkubiert, und zweimal mit 5% FCS
enthaltendem PBS gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurde Antikörper (0,01
ml) zugegeben, und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platten wurden zweimal mit PBS, 5% FCS, gewaschen und die
Vertiefungen 1 Stunde mit 0,01 ml Peroxidase-konjugiertem
Kaninchen-anti-Maus-IgG (DAKO, Accurate Chemicals, Westbury, NY)
inkubiert, das 1:50 in PBS verdünnt war. Die Platten wurden
zweimal mit PBS gewaschen und mit dem Substrat
3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma) [9] in 0,01 ml 15 Minuten inkubiert, dann
zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen.
Immunfluoreszenz an Zellinien wurde in ähnlicher Weise unter
Verwendung von Fluorescein-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG
(Cappel) in einer 1:40 Verdünnung durchgeführt. Unter Verwendung
einer 100W-Quecksilberlampe und des Filtereinsatzes 12 wurde mit
einem Leitz-Orthoplan-Mikroskop beobachtet. Gewebeschnitte
wurden mittels Immunperoxidase gefärbt, wobei 0,005
nm-Kryoschnitte verwendet wurden. Mattes et al., Hybridoma, vorstehend.
Melanosom-Präparation und Tests auf Tyrosinase und Melanin
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Eine angereicherte Präparation von Melanosomen wurde aus
verbrauchtem Medium von Kulturen einer stark pigmentierten
Melanom-Zellinie (SK-MEL-173) erhalten. Nach dem Verwerfen eines
Pellets, das durch Zentrifugation bei langsamer Geschwindigkeit
(10 Minuten, 600 g) erhalten worden war, wurden die Melanosomen
durch 30-minütige Zentrifugation bei 100000 g pelettiert. Die
Anreicherung von Melanosomen in diesen Proben wurde durch
Elektronenmikroskopie bestätigt. Die Melanosomen-Präparationen
wurden mit 0,1% Desoxycholat, 0,1 M Tris-HCL, pH 7,4, 1 mM PMSF
und 20 U/ml Aprotinin (Sigma) extrahiert. Unlösliches Material
wurde mittels Zentrifugation (100000 g, 30 Minuten) entfernt und
der Extrakt auf Tyrosinaseaktivität untersucht.
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Die Enzymaktivität wurde durch Modifizierung des
³H-H&sub2;O-Freisetzungstests bestimmt, der in Pomerantz und Li, Meth. Enzymol. 17A
(1970), 620-626 beschrieben wurde. Die Proben wurden mit 0,15
ml Reaktionsmischung inkubiert, die 1 mM L-Tyrosin, 0,1 mM L-
DOPA, 1,25 uCi (3,5)-[³H]-Tyrosin, 0,1 mg/ml Gelatine, 0,1 M Na-
Phosphat, pH 7,3 enthielt. Nach 20 Minuten bei 37ºC wurde die
Reaktion durch Überführen der Gefäße auf Eis gestoppt, gefolgt
von der Zugabe von 0,8 ml 0,1 N HCl und 200 mg Holzkohle. Man ließ
die Gefäße bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden unter
gelegentlichem Mischen stehen, zentrifugierte bei 1000 Upm für 10 Minuten,
und zählte 0,1 ml des Überstandes in 10 ml Liquiscint (National
Diagnostics, Somerville, NJ). Radioaktivität in den
Negativkontroll-Gefäßen, die Puffer enthielten, wurde von den gezählten
Zerfällen der Probe abgezogen. Um Antikörper gegen Tyrosinase
nachzuweisen, wurde ein solubilisierter Melanosomen-Extrakt, der
eine bekannte Menge Enzymaktivität aufwies mit verschiedenen
Mengen Maus- oder Kaninchen-Serum, oder dem Antiköper TA99 plus
0,015 ml Kaninchen-Antiserum gegen Maus-IgG (Cappel) inkubiert.
Nach Inkubation bei 4ºC über Nacht wurde 0,015 ml gepacktes SA
zugegeben, bei 4ºC 1 Stunde inkubiert und bei 600 g 10 Minuten
zentrifugiert. Die in den Überständen verbleibende
Enzymaktivität sowie immunpräzipitierte Enzymaktivität in den
Pellets wurde untersucht.
Herstellung eines monoclonalen Antikörpers gegen PAA
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In vorläufigen Experimenten wurden Seren von Mäusen, die mit
ganzen Zellen eines dunkel-pigmentierten Melanoms (SK-MFL-23)
immunisiert worden waren, auf Imunpräzipitationsaktivität nach
Absorption solcher Antiseren mit Zellen eines
nicht-pigmentierten Melanoms getestet. Bemerkenswerterweise waren die Seren im
wesentlichen spezifisch für Pigmentations-assoziiertes Antigen
(Fig. 1). Derartige Reaktivität wurde durchgehend in Seren von
Mäusen entdeckt, die mit mehreren verschiedenen pigmentierten
Melanomzellinien immunisiert worden waren, und nicht in Seren
von Mäusen, die mit nicht-pigmentierten Melanomen oder
Carcinomen immunisiert worden waren.
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Die Identität der präzipitierten Komponente mit
Pigmentationsassoziierter Antigen, das durch Präzipitation durch humanes Serum
definiert ist, wurde auf verschiedenen Wegen nachgewiesen. Die
Komponente mit einem Molekulargewicht von 70000 wurde durch das
absorbierte Maus-Antiserum nur aus pigmentierten Melanom-
Zellinien präzipitiert. Sequentielle
Immunpräzipitations-Experimente zeigten, daß das Pigmentations-assoziierte Antigen durch
die absorbierten Mausseren präzipitiert wurde, da Vorreinigung
("preclearing") der Antigenpräparationen mit den Maus-Antiseren
das durch das humane Serum erkannte Antigen entfernte (nicht
gezeigt, aber siehe Fig. 2 für ein vergleichbares Experiment mit
TA99). Die absorbierten Mausseren präzipitierten eine viel
stärkere Bande als das humane Serum, wobei ¹²&sup5;I-markierte
Extrakte wie vorstehend beschrieben, verwendet wurden. Es
präzipitierte auch eine ähnliche Komponente nach Markierung der
Zellen mit [³&sup5;S]-Methionin (Fig. 1), die mit humanem Serum nicht
sichtbar ist, wahrscheinlich da die Bande zu schwach war um sich
gegen den Hintergrund abzuheben.
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Der Grund dafür, daß Antikörper gegen Pigmentationsassoziiertes
Antigen so einfach gefunden wurden, ist nicht vollständig
verstanden, mehrere Faktoren spielen jedoch eine Rolle. PAA scheint
eine ziemlich oft vorkommende zelluläre Komponente zu sein, da
es in einer ¹²&sup5;I-markierten Antigenpräparation als eines der
Hauptproteine entdeckt wurde, wie nachstehend beschrieben. Da
die ¹²&sup5;I-markierte Antigenpräparation außerdem eine Con A-Eluat-
Fraktion war, wären Antikörper gegen Komponenten, die Con A
nicht binden, nicht entdeckt worden.
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Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Experiment geplant,
um zu versuchen, für Pigmentations-assoziiertes Antigen
spezifische monoclonale Antikörper aus einer Fusion zu isolieren, wobei
eine mit intakten SK-MEL-Zellen immunisierte Maus verwendet
wurde. Überstände von Vertiefungen, die sichtbare Kolonien
enthielten, wurden mittels Immunpräzipitation von ¹²&sup5;I-markierten
Extrakten aus SK-MEL-23 und SK-MEL-37, einem nicht pigmentierten
Melanom, abgesucht. Überstände, die signifikant mehr Zerfälle
aus SK-MEL-23 als aus SK-MEL-37 ausfällten, wurden nachfolgend
erneut getestet und die Immunpräzipitate mittels PAGE
untersucht. Drei Überstände von 293 getesteten präzipitierten eine
Komponente mit einem Molekulargewicht von 70000 aus SK-MEL-23;
aber nicht aus SK-MEL-37-Zellextrakten. Nach Clonierung stellte
nur noch ein Hybridom einen spezifischen Antikörper, TA99, ein
IgG2a, her. Der monoclonale Antikörper TA99 ist ein äußerst
wirksamer präzipitierender Antikörper, da intensive Banden, die
nach Exponierung des Films für 5 Tage zu sehen waren, durch 100
nl eines Überstandes der Hybridomkultur oder durch 0,5 nl Serum
von nackten Mäusen, die das Hybridom trugen, präzipitiert wurden.
Die Selektion auf einen derart wirksamen präzipitierenden
Antikörper ist wahrscheinlich eine Folge der Tatsache, daß das
anfängliche Absuchen mittels Immunpräzipitation durchgeführt
wurde. Nur ein anderer Antikörper von vielen in diesem Labor auf
verschiedene Antigene untersuchten präzipitiert bei derart
niedrigen Konzentrationen stark, und dieser wurde ebenso
anfänglich durch Immunpräzipitation selektiert.
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Es wurde gezeigt, daß das TA99-Antigen mit dem
Pigmentationsassoziierten Antigen, das durch humanes Serum durch sequentielle
Immunpräzipitation erkannt wurde, identisch ist. TA99 entfernt
die mit AU-Serum präzipitierbaren Moleküle vollständig aus ¹²&sup5;I-
markierten SK-MEL-23-Extrakten. Vorreinigung mit einem nicht
verwandten monoclonalen Antikörper der gleichen Subklasse
aus der Maus zeigte keine Auswirkungen auf die
Immunpräzipitation von PAA durch humanes Serum (Fig. 2). Humanes Serum
präzipitiert relativ schwach und entfernt sein eigenes Antigen
in nachfolgenden Präzipitationsexperimenten nur schwach, so daß
die umgekehrte sequentielle Präzipitation nicht durchgeführt
werden konnte. Es ist daher möglich, daß humanes Serum mit nur
einem Teil von Molekülen, die durch TA99 präzipitiert werden,
reagiert. Die beschriebenen und weitere nachstehend gezeigte
Daten weisen stark darauf hin, daß das TA99-Antigen mit dem
Pigmentations-assoziierten Antigen identisch ist.
Verteilung von PAA
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Die Verteilung von Pigmentations-assoziiertem Antigen in
Zelllinien verschiedener Typen und in Kryoschnitten von normalem
Gewebe wurde untersucht. Frühere Daten mit humanem Serum
deuteten darauf hin, daß die Expression von
Pigmentationsassoziiertem Antigen mit der Pigmentierung von Zellinien
einhergeht; Mattes et al., Int. J. Cancer 32 (1983) 717-721.
Gewebeschnitte konnten nicht mit humanem Serum untersucht
werden, da sich noch viele andere Antikörper in dem Serum befanden.
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Bei Verwendung des sensitiven Rosetten-Tests, der dazu dient,
Zelloberflächen-Antigene nachzuweisen, reagierte der Antikörper
TA99 nicht mit gezüchteten SK-MEL-Zellen. Daraus wurde
geschlossen, daß, wie in vorhergehenden Studien in Mattes,
vorstehend, vorgeschlagen, das Pigmentations-assoziierte Antigen
nicht auf der Zelloberfläche lokalisiert ist. Immunfluoreszenz
und Immunperoxidasefärbung von pigmentierten Melanomzellen, die
mit Formaldehyd fixiert und mit einem Detergenz durchlässig
gemacht worden waren, zeigten Reaktivität von TA99 mit
intrazellulären, perinuclear lokalisierten Komponenten. Keine Reaktion
wurde mit nicht pigmentierten Melanomzellen oder
Nicht-Melanomzellen beobachtet. Die Verteilung von Pigmentations- assoziiertem
Antigen innerhalb der Zelle war identisch mit der Verteilung von
Melanosomen, was darauf schließen läßt, daß
Pigmentationsassoziiertes Antigen ein Melanosom-Antigen sein könnte. Diese
Lokalisation widersprach jedoch etwas der Beobachtung, da das
Melanin in stark pigmentierten Melanomen so dicht ist, daß es
teilweise die Färbung durch Immunfluoreszenz oder
Immunoperoxidase überdeckt.
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Um eine große Gruppe von Zellinien auf Reaktivität mit dem
Antikörper TA99 abzusuchen, wurde ein Versuch entwickelt, der
auf der Inhibierung der Immunpräzipitation markierter SK-MEL-23
mit unmarkierten, mit Detergenz solubilisierten Zellextrakten
basiert.
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Achtundsechzig Zellinien, einschließlich Melanome, Astrocytome,
Carcinome, Lymphome und Leukämien wurden untersucht. Positive
Extrakte wurden in zweifachen Reihenverdünnungen
getestet, um eine Einschätzung der Menge an Antigen-Aktivität
(Tabelle I) zu ermöglichen. Audioradiogramme von Gelen eines
ähnlichen PAA-Präzipitationsinhibierungsversuchs unter
Verwendung humanen Serums wurden zuvor in Mattes et al., Int. J.
Cancer 32 (1983), 717-721, gezeigt. Nur Extrakte von
pigmentierten Melanomzellen inhibierten die Reaktivität des Antikörpers
TA99. Die relative Menge an Antigen in diesen Zellen wurde ohne
Ausnahme mit einer visuellen Schätzung des Ausmaßes der
Pigmentierung der Zellpellets verglichen. Melanin wurde nicht
quantifiziert, da vier Verfahren zur Quantifizierung von Melanin
(Halaban et al., vorstehend, Wittaker et al., Dev. Biol. 8
(1963), 99-127; Meyshens et al., Cancer Res. 40 (1980), 2194-
2196; Oskawa et al., Yale J. Biol. Med. 46 500-507) nur eine
teilweise Solubilisierung von Melanin in stark pigmentierten
Melanomen zur Folge hatten.
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Die intrazelluläre Lokalisierung von Pigmentations-assoziiertem
Antigen wurde in mehreren vorläufigen Experimenten untersucht.
Eine Membranpräparation war im Inhibierungsversuch so aktiv wie
ganze Zellen, was zeigt, daß der Großteil oder das gesamte
Antigen membrangebunden vorliegt. Melanosompräparationen wurden
sowohl von aufgeschlossenen Zellen als auch von verbrauchtem
Medium erhalten. Diese waren in dem Inhibierungsversuch aktiv,
sowohl mit als auch ohne Solubilisierung durch Detergenz. Diese
Daten stimmen mit der Möglichkeit überein, daß das Antigen ein
Melanosom-Antigen ist, aber Versuche mit einer hochgereinigten
Melanosom-Präparation oder Immun-Elektronenmikroskopie sind zur
Bestätigung notwendig.
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In Kryoschnitten von 19 getesteten normalen menschlichen
Geweben, reagierte der Antikörper TA99 nur mit der Basalschicht
der Epidermis (Fig. 3) und den pigmentierten Zellen des Auges
einschließlich der Chorioidea als auch des pigmentierten
Retinalepithels. Die Substantia nigra wurde ebenso untersucht,
wobei jedoch die Ergebnisse keinen Schluß zuließen, da das
Melanin so dicht war, daß zusätzliche Peroxidasefärbung
schwierig nachzuweisen wäre. Aus der Tatsache, daß die
Epithelzellen der Basalschicht in der Epidermis gefärbt wurden, wird
geschlossen, daß das Antigen wahrscheinlich zusammen mit
Melanosomen von Melanocyten auf diese Zellen transferiert wird.
Melanosomen kommen in der Basalschicht ebenfalls in hoher
Konzentration vor. Haut von Schwarzen wurde durch TA99 dunkler
gefärbt als Haut von Weißen, einhergehend mit der Dichte von
Melanosomen, obwohl das dichte Melanin in der Haut von Schwarzen
die Immunperoxidasefärbung teilweise überdeckte. Andere
überprüfte Gewebe, die negativ für TA99 waren, sind die
Schilddrüse, Hoden, Niere, Leber, Pankreas, Darm, Gehirn, Milz,
Thymus, Gebärmutter, Eierstöcke, Lunge und Lymphknoten.
Biochemische Charakterisierung von Pigmentations-assoziiertem
Antigen
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Der monoclonale Antikörper TA99 präzipitierte ein Molekül mit
Molekulargewicht 70000 aus SK-MEL-23-Zellen, die metabolisch mit
[³&sup5;S]-Methionin, [³H]-Tyrosin, [³H]-Glucosamin oder [³H]-Fucose
markiert worden waren, zusätzlich zu dem Standard, ¹²&sup5;I-markierten
Zellextrakt. Die Schätzung des Molekulargewichts des Antigens
variierte im Verlauf der Experimente; in früheren Experimenten
wurde es als 70000 berechnet; Mattes, vorstehend, während es in
späteren Experimenten mit 75-80000 berechnet wurde.
Unbekannte Variationen in der Acrylamidgelzusammensetzung, die zu
unterschiedlicher Wanderungsgeschwindigkeit des Glycoprotein-
Antigens im Vergleich zu den nicht-glycosylierten
Molekulargewichtsstandards Rinderalbumin und Phosphorylase führten, wurden
dafür verantwortlich gemacht. Siehe z. B. Segrest et al., Meth.
Enzymol. 28B (1972), 54-63. Zweidimensionale Analyse von mit
jedem der drei Isotopen markiertem, immunpräzipitiertem PAA
zeigte einen isoelektrischen Punkt in dem pH-Bereich von 5,2-
5,6. Daten zeigen, daß das Pigmentations-assoziierte Antigen ein
ziemlich oft vorkommendes Molekül in pigmentierten Melanomen
ist. In der Con-A-Sepharose-eluierten Fraktion von Zellextrakten
war dieses Antigen, nach Markierung mit ¹²&sup5;I, einer der Haupt-
Flecke, die in zweidimensionaler PAGE sichtbar waren.
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Dies wurde durch Vorreinigung von Zellextrakten mit dem
Antikörper TA99 zur selektiven Entfernung von PAA vor dem
Auftragen auf das Gel nachgewiesen (nicht gezeigt).
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Zwei andere Marker pigmentierter Zellen, Tyrosinase, wie in
Dippold et al., vorstehend, und Nishioka et al., Eur. J.
Biochem. 85 (1978), 137-146, und gp75, wie in Tai et al., Cancer
Res. 43 (1983), 2773-2779 beschrieben, sind dem
Pigmentationsassoziierten Antigen in vielerlei Hinsicht ähnlich, aber sie sind
nicht identisch. Der Antikörper TA99 besaß keine Aktivität in
einem Immunpräzipitationsversuch, der dazu ausgelegt war, Anti-
Tyrosinase-Antikörper nachzuweisen (Fig. 4). Zwei Antiseren gegen
menschliche Tyrosinase waren als Positivkontrolle in diesen
Versuchen aktiv; sie konnten Tyrosinaseaktivität präzipitieren,
was TA99 nicht konnte.
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Gp75 wurde in anderen Studien als eine Hauptkomponente in
Melanomzellinienextrakten, die mit [³H]-Glucosamin markiert waren,
identifiziert, und seine Menge wurde mit dem Grad der
Pigmentierung in Beziehung gesetzt, z. B. Tai et al., vorstehend. Zur
Bestimmung, ob es mit dem Pigmentations-assoziierten Antigen
übereinstimmt, wurden Vorreinigungsexperimente mit dem
monoclonalen Antikörper TA99 zur Entfernung von
Pigmentations-assoziiertem Antigen durchgeführt. Der verbleibende Überstand wurde
mittels zweidimensionaler PAGE überprüft, die die
Identifizierung von gp75 erlaubt. Wie aus Fig. 5 ersichtlich, entfernte
diese Vorbehandlung fast das ganze gp75 aus der Probe. Deshalb
kann daraus geschlossen werden, daß das durch Tai, vorstehend,
beschriebene gp75-Antigen mit dem hier beschriebenen gp70-80-
Antigen identisch ist, und der monoclonale Antikörper TA99 daran
spezifisch bindet.
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Die gleichzeitig anhängige U.S.-Anmeldung Nr. 481.379 beschreibt
ein Differenzierungsantigen, das für pigmentierte Zellen
charakteristisch ist. Diese Anmeldung beschreibt einen
monoclonalen Antikörper TA99, der spezifisch damit reagiert, sowie
Verfahren zu dessen Herstellung und die Verwendung sowohl der
Hybridom-Zellinie als auch des so hergestellten Antikörpers.
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Obwohl beschrieben wurde, was gegenwärtig als bevorzugte
Ausführungsformen dieser Erfindung angesehen wird, ist es für den
Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und
Modifizierungen, ohne von der Erfindung abzugehen, vorgenommen
werden können, und es wird deshalb darauf abgezielt, daß all
diese Änderungen und Modifizierungen innerhalb des wahren
Gedankens und der Zielrichtung der Erfindung fallen.