DE2710455C2 - N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-alpha-methylamid, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

OH

NH—COCH₃
H₃C-CH-CO—NH-CH- CO—NH- CH-CONHCH₃

COOH

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise Benzyl^-acetamido-^o-O-benzyliden-S-O-iD-l-carboxyätnyO^-desoxyjJ-D-glucopyranosid mit dem entsprechenden Dipeptid, dessen gamma-Carboxylgruppe geschützt ist, umsetzt und die Schutzgruppen abspaltet.

3. Arzneimittel, enthaltend den Wirkstoff nach Anspruch 1 zusammen mit üblichen pharmazeutischen Zusatz- und Verdünnungsmitteln oder Impfstoffzubereitungen.

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Die Erfindung betrifft N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-alpha-methylamid, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung sowie diese Substanz als Wirkstoff enthaltende Arzneimittel.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist in Wasser löslich und kann als wirksames immunologisches Adjuvans dazu verwendet werden, in einem Organismus die Immunreaktion zu stimulieren.

Bei dem erfindungsgemäßen Adjuvans handelt es sich um N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäurealpha-methylamid [2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-O-D-glucopyranoxyI)-D-propionyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-(alpha-methylamid)] der Formel I

CH₂OH

OH

NH-COCH₃
H₃C-CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH-CONHCH₃

(CH₂J₂
COOH

das im folgenden der Einfachheit halber abgekürzt als MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH₁) bezeichnet wird.

Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die die genannte Verbindung enthalten und insbesondere dazu dienen, die Wirkung der schwachen Immunogene zu verstärken. Insbesondere betrifft die Erfindung Arzneimittel, die die genannte Verbindung enthalten und die dazu verwendet werden können. Menschen und Warmblüter gegen Bakterien-, Virus- und Parasiten-Infektionen und gegen verschiedene Gewebeantigene normalen oder pathologischen Ursprungs zu immunisieren.

Ein besonderes Interesse an der erfindungsgemäßen Verbindung beruht auf der Tatsache, daß es nicht erforderlich ist, auf besondere Verabreichungsmedien zurückzugreifen, von denen die Adjuvanswirkung abhängt, so daß die Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe, mit denen der Wirkstoff kombiniert wird, lediglich dazu· verwendet werden, die Anwendung des Produktes zu erleichtern. Insbesondere ist es

nicht erforderlich, bei der Injektion des genannten Produktes eine Zubereitung zu verwenden, die eine Ölphase aufweist

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Adjuvans auf oralem oder parenieralem Wege, insbesondere durch Injektion oder mit Hilfe der Impflanzette, oder über die Schleimhäute verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft insbesondere Arzneimittel, die MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH₃) zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel, Trägermaterial und/oder Hilfsstoff enthalten. Die besonders bevorzugten Zubereitungen dieser Art umfassen injizierbare Lösungen, die eine wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten. Zu diesem Zweck verwendet man vorteilhafterweise sterile Lösungen in einer wäßrigen, vorzugsweise isotonischen Phase, wie in einer isotonischen Salzlösung oder einer isotonischen Glucoselösung. Die Erfindung ist jedoch hierauf nicht beschränkt, so daß man auch ejnfache Lösungen in destilliertem Wasser verwenden kann. Es ist femer möglich, Injektionsmedien mit einer Ölphase zu verwenden, insbesondere Wasser-in-Öl-Emulsionen. Diese Emulsionen erhält man insbesondere mit pflanzlichen Ölen, die vom Stoffwechsel abgebaut werden können, wie sie beispielsweise in der FR-PS 23 13 078 beschrieben sind.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in den verschiedenartigsten Formen vorliegen, wobei man zu ihrer Herstellung Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet, die fur den angestrebten Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise verwendet man die Arzneimittel in Form von Cachets, Tabletten oder Gelkügelchen für die orale Verabreichung und in Form von Aerosolen oder Gelen bei der Verabreichung über die Schleimhäute.

Das erfindutigägemäße Adjuvans kann auch in gefriergetrockneter Form vorliegen, so daß man unmittelbar vor der Verwendung Lösungen bereiten kann, die man durch Injektion oder mit Hilfe der Jmpfpflanze verabreichen kann.

Eine pharmazeutische Zubereitung, die zur Herstellung von injizierbaren Lösungen unmittelbar vor ihrer Verwendung geeignet ist, umfaßt eine Dosis von etwa 2 mg des erfindungsgemäßen Adjuvans in gefriergetrocknetem Zustand und etwa 10 mg Lactose als Trägermaterial. Die Erfindung ist ferner auf Arzneimittel gerichtet, die MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH₃) zusammen mit einem immunogenen Mittel enthalten, insbesondere zusammen mit einem schwachen impfenden Antigen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH₃), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise BenzyW-acetamido^.ö-O-benzyliden-S-O-iD-l-carboxyäthyU^-desoxy-jS-D-glucopyranosid mit dem entsprechenden Dipeptid, dessen gamma-Carboxj ??ruppe geschützt ist, umsetzt und die Schutzgruppen abspaltet.

Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung, die insbesondere ein Beispiel zur Herstellung des erfindungsgemaßen Produktes sowie Versuche umfaßt, anhand derer die pharmakologischen Eigenschaften dieses Produktes ersichtlich sind.

Beispiel 1
N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-alpha-methylamid

In der ersten Stufe synthetisiert man die Peptidkette, worauf man in einer zweiten Stufe diese Kette an den Muramylrest bindet. Bei dieser Synthese sind die funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, durch Schutzgruppen geschützt, die anschließend wieder abgespalten werden.

Die im folgenden angegebenen Abkürzungen besitzen die folgenden Bedeutungen:

Mur*NAc	= 2-Acetamido-2-desoxy-3-0-(D-2-propionyl)-D-glucopyranose
AIa	= Alanin
GIu	= Glutaminsäure
iso-Gln	= Isoglutamin
4,6-O-bzi	= 4,6-O-Benzyliden
ß-bz\	= jS-Benzyl
BOC	= tert.-Butyloxycarbonyl
OBzI	= Benzylester
OSu	= Succinimidester
BzI	= Bezyläther

Stufe A: BOC-D-GluiNHCHjJ-OBzl

Man löst 3,36 g (lOmMol) des y-Benzylesters von BOC-D-GIu (E.Schröder, E. Klieger, Justus Liebig's Ann. Chem. 673 (1964) 196) in 50 ml Tetrahydrofuran. Zu der auf -IS⁰C abgekühlten Lösung gibt man unter Rühren 1,1 ml (10 mMol) N-Methylmorpholin und 1,3 ml (10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester. Nach IO Minuten bei etwa O⁰C leitet man einen Strom von trockenem Methylamin in die Suspension ein. Nach 60 Minuten verdünnt man die Reaktionsmischung mit Äthylacetat auf 150 ml, worauf man die organische Phase mit Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert wäscht und anschließend über Magnesiumsulfat trocknet. Nach dem Abfiltrieren engt man die Äthylacetatphase zur Trockne ein und fällt das Produkt mit Äther aus. Man erhält 2,8 g des Produktes (Ausbeute = 80%). Das Produkt besitzt folgende physikalische Kenndaten:

^ F 124 bis 126°C

ί Mb + 1,4° (absol. Methanol)

T Analyse: C₁₈H₂₆O₅N₂ (350,42)

5 berechnet: C 61,69% H 7,48% N 7,99%;
gefunden: C 62% H 7,6% N 8,2%.

Stufe B: Hydrochlorid von D-GIu(NHCH₃)OBz] (B)

Man behandelt 1,4 g (4 mMol) der in Stufe A erhaltenen Verbindung A während 30 Minuten mit 12 ml einer etwa 1 n-Chlorwas£erston*säurelösung in Essigsäure. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein und erhält das Produkt in Form eines Öls. Es erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel in einer n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/20/6/24, VoL/VoI.) als homogen.

BOC-L-AIa-D-GIu(NHCHO-OBzI (C)

Man gibt 1 g (3,5 mMol) des Succinimidesters von BOC-AIa (G. W. Anderson, J. E. Zimmermann, F. M. CaI-lahan, J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 1839) zu einer auf 0⁰C abgekühlten Lösung von 3,7 mMol der in Stufe B erhaltenen Verbindung B und 0,4 ml (3,7 πιΜοΐ) N-Methylrnorpholin in Dimethylformamid. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei Raumtempuatur engt man die Reaktionsmischung zur Trockne ein und nimmt mit 100 ml Äthylacetat auf. Man wäscht die organische Phase nacheinander mit einer 10%igen Lösung von Zitronensäure in Wasser, mit einer 1 n-Natriumbicarbonatlösung und dann bis zur Neutralität mit Wasser. Man trocknet die Äthylacetatphase während 30 Minuten über Magnesiumsulfat, filtriert und engt zur Trockne ein. Man kristallisiert das Produkt aus einer Methanol/Petroläther-Mischung um. Man erhält 1,04 g (Ausbeute = 71%) des Produktes, das die folgenden physikalischen Kenndaten besitzt:

F 145 bis 147°C
[a]jl + 6,4° (Eisessig)

Analyse: C₂IH₃₁O₆N₃ (421,50)

berechnet: C 59,84% H 7,41% 0 22,77% N 9,97%:
gefunden: C 60,2% H 7,4% 0 22,82% N 10,01%.
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Hydrochlorid von L-AIa-D-GIu(NHCH₃M)BzI (D)

Man behandelt 842 mg (2 mMol) der in Stufe C erhaltenen Verbindung C während 30 Minuten mit 5 ml einer etwa 1 n-Chlorwasserstofflösung in Essigsäure. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein und reinigt den Rückstand durch Chromatographie über einCi, mit Kieselgel (35 g) beschickten Säule (Chlorform/ Methanol-Mischung, 5/5, Vol./Voi.). Man vereinigt die erhaltenen reinen Fraktionen, engt sie ein und erhält 614 mg (Ausbeute = 86%) des Produktes in Form eines Öls.

GS-bzKO-bzO-Mur-NAc-L-Ala-D-GluiNHCHjJ-OBzl (E)

Man gibt 377 mg (0,8 mMol) (/?-bzl-4,6-bzi>Mur-NAc zu einer Lösung von 0,86 Mol der in Stufe D erhaltenen Verbindung D und 0,1 ml (0,86 mMol) N-Methylmorpholin in 10 ml Dimethylformamid.

so Man gibt 108 mg (0,8 mMol) Hydroxybenzotriazol und 165 mg (0,8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu. Nach Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur fällt man das Produkt und den gebildeten Dicyclohexylharnstoifmit Wasser aus, filtriert ab und trocknet. In dieser Weise erhält man 767 mg eines Niederschlages, was einer Ausbeute von 96% entspricht.
Man reinigt 380 mg des Niederschlages über einer mit 30 g Kieselgel beschickten Säule. Man eluiert die Säule zunächst mit Chloroform und dann mit einer Chloroform/Methaaoi-Mischung (5/5, Vol/vcl.). Man vereinigt die reinen Fraktionen und engt sie ein. In dieser Weise erhält man 250 mg des Produktes (Ausbeute = 80%) mit den folgenden physikalischen Kenndaten:

Drehwert [a]% - 17° (Dimethylformamid)

Analyse: C₄₁H₅₀O_nN₄ 0,75 H₂O (792,88)

berechnet: C 62,46% H 6,65% N 7,10%;
gefunden: C 62,7% H 6,69% N 6,92%.

& MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH.,) (F)

Man hydriert 198,22 mg (0,25 mMol) der in Stufe E erhaltenen Verbindung E in 15 ml Eisessig während 10 Stunden in Gegenwart eines Palladiumkatalysators (Palladium auf Kohlenstoff). Nach dem Abfiltrieren

des Katalysators und dem Einengen der Reaktionsmischung zur Trockne erhält man das Produkt durch Ausfällen aus einer Äthanol/Aceton/Äther-Mischung. Man erhält 180 mg des Produktes (Ausbeute = 85%) mit folgenden physikalischen Kenndaten:

F 157 bis 161°C S

Ia])! + 49° (Eisessig).

Das Produkt erweist sich als homogen bei der Chromatographie über mit Kieselgel beschichteten Platten unter Verwendung einer n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/20/6/24, Vol/Vol.) und einer n-Butanol/Essigsäure/Wasser-Mischung (4/1/5, Vol./Vol. - obere Phase). lü

Analyse: C₂₀H₁₄OnN₄ (506,52)

berechnet: C 47,42% H 6,76% N 11,06%; gefunden: C 47,5% H 6,8% N 11,0%.

Beispiel 2
Fharmakoiogische Eigenschaften vuii N-Auciyimuraruyi-L-aiariyl-D-giiitarriirisaurcri-alpha-rncthyiarnid

Die Toxizität des erfindungsgemäßen Produktes untersucht man durch intravenöse Injektion an Mäusen mit einem Alter von 2 Monaten. Durch progressive Steigerung der verabreichten Dosierungen bestimmt man jene, bei der die Mortalität der Mäuse einer gleichen Gruppe 50% erreicht (DL₅₀).

Es konnte gezeigt werden, daß die DL₅₀ des untersuchten Produktes oberhalb 1 g/kg Körpergewicht der Tiere liegt, was einer Dosis entspricht, die wesentlich größer ist als die Dosis, bei der das Produkt seine Adjuvanseigenschaften entfaltet.

Adjuvanswirkung in wäßriger DL-dung

Bei den Untersuchungen, deren Ergebnisse im folgenden angegeben sind, wird der Einfluß des erfindungsgemäßen Wirkstoffes auf den Gehalt der Antialbumin-Antikörper unter den folgenden Dsdingungen ermittelt.

Man verabreicht Gruppen von jeweils acht Mäusen des Stammes Swiss mit einem Alter von 2 Monaten durch subcutane Injektion 0,5 mg des Antigens, das in Form von Rinderserumalbumin (BSA) verabreicht wird, und 0,1 mg der untersuchten Substanz in einer isotonischen Salzlösung. Diese hohe Antigendosis führt, da sie an der Grenze der paralysierenden Dosis bezüglich der Immunreaktion liegt, aufgrund dieser Tatsache bei den KontroUtieren nur zu einer geringen oder keiner Reaktion auf das Antigen und stellt daher ein strenges Kriterium zum Nachweis der Wirkung eines Adjuvans dar. 30 Tage später behandelt man die Mäuse erneut mit 0,1 mg des gleichen Antigens.

Der Antikörpergehalt wird durch passive Hämagglutination bestimmt, wozu man rote Blutkörperchen von Schafen verwendet, welche Blutkörperchen mit Formaldehyd behandelt, mit Antigen bedeckt worden sind, das nach der von A. A. Hirata und M.W. Brandiss (J. Immunol. 100 (1968) 641 bis 648) beschriebenen Methode untersucht worden ist. Die Probennahme erfolgt 14, 28, 34 und 36 Tage nach der ersten Injektion.

Zu Vergleichszwecken behandelt man die Mäuse statt mit MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH₃) entweder mit Lipopolysacchariden (LPS) (die man mit der Wasser/Phenol-Methode aus S. enteritidis extrahiert hat) oder mit dem Adjuvans, das unter der Bezeichnung »WSA« bekannt ist und von Adam und KoH. (Infect. Immun. 7 (1973) 855 bis 861) beschrieben wurde. Die Kontrollmäuse werden nur mit dem Antigen behandelt.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I

Die Ergebnisse verdeutlichen, daß das in Form einer isotonischen Salzlösung verabreichte Produkt Mur-NAc-L-AIa-D-GIu-(NHCH₃) einen starken Anstieg des Gehalts der gebildeten Antikörper verursacht, während unter den gleichen Bedingungen das Produkt »WSA« praktisch inaktiv ist. Di« mit Mur-NAc-L-Ala-D-GIu(NHCH₃) erzielten Reaktionen können ganz allgemein als vergleichbar mit jenen angesprochen werden, die man mit »LPS« erzielt, wobei jedoch festzustellen ist, daß das erfindungsgemäße Produkt im Gegensatz zu diesem vorbekannten Material frei ist von toxischen Wirkungen.

	Antikörpertiter	28. Tag	34. Tag	36. Tag
	14. Tag	<3	<3	<3
Kontrolle - BSA	<3	6	50	1310
BSA + LPS (100 (ig)	<3	<3	<3	6
BSA + WSA (300 ag)	<3	12	1600	1600
BSA + MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH3) (!00 tig)	6

Adjuvanswirkung in Gegenwart einer Ölphase

Wie bei den oben genannten Untersuchungen verfolgt man das Ansteigen des Antikörpergehalts, das durch die Injektion des Antigens und der erfindungsgemäßen Verbindung verursacht wird, wobei in diesem Fall das injizierte Material eine Ölphase enthält, die das unvollständige Freund'sche Adjuvans umfaßt (Wasser-in-Öt-Emulsion).

Für diese Untersuchungen verwendet man Meerschweinchen (Hartley) mit einem Gewicht von 350 g. Den K cn trol !tieren verabreicht man in jede Hinterpfote 0,1 ml einer Emulsion entweder des unvollständigen f'reynd'schen Adjuvans (FlA) oder des vollständigen Freund'schen Adjuvans (FCA), die 500 μg Ovalbumin (Antigen) enthält. Das untersuchte Produkt wird in einer Dosis von 100 pg in einer Emulsion des unvollständigen Freund'schen Adjuvans verabreicht.

24 Tage nach der Injektion bestimmt man den Antikörpergehalt durch passive Hämagglutination (PHA), wie es oben angegeben ist, und durch Ausfallen nach der Methode von Folin.

Die gleichen Meerschweinchen unterzieht man 18 Tage nach der Injektion einer Untersuchung zur Bc- Stimmung der Hypersensibilität der Haut. Hierzu verabreicht man den Tieren intradermal 5 μ% Ovalbumin.

48 Stunden nach dieser Injektion bestimmt man den Durchmesser und die Verhärtung der Injektionsstellc.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle H angegeben. Tabelle II Injektion Antikörpertiter Hauttest Ausfällung Agglutination (Durchmesser in mm)

Ovalbumin + HA <500 900 0,0,0,0,0,0

Ovalbumin + FCA 2100 3600 12, 13, 12, 14, 11, 19 Ovalbumin +FIA +Mur-N Ac-L-AIa-D-GIu(NI ICH,) 5500 6100 8,9,14,15,15 Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß das in Gegenwart einer Ölphase verabreichte erfindungs-

femäße Produkt MUr-NAc-L-AIa-D-GI(NHCH₃) in sehr starkem Maße das Ansteigen des Antikörpergehalts begünstigt und zu einer Verzögerung der Hypersensibilitätsreaktion gegenüber dem gleichen Antigen fuhrt.

Die Erfindung stellt somit Adjuvanspräparate zur Verfügung, die frei sind von toxischen Nebenwirkungen

und die dazu verwendet werden können, die Wirksamkeit von Impfstoffen bakteriellen oder viralen Ursprungs zu verbessern, insbesondere jener Impfstoffe, die schwach immunogen sind.

Sie können insbesondere dazu verwendet werden, die Immunisierung des Organismus (menschliche oder tierische Patienten) gegenüber Infektionen, die durch Bakterien oder Viren oder Tumorantigene etc. verursacht werden, zu begünstigen. Sie sind ebenfalls geeignet zur Herstellung von Seren, die Antikörper enthalten, die bezüglich dieser Antigene aktiv sind.

Claims (1)

10 15 20 25 30

Patentansprüche:

I. N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-alpha-methylamid der Formel I
CH₂OH