DE2804457A1

DE2804457A1 - Immunsuppressive mittel

Info

Publication number: DE2804457A1
Application number: DE19782804457
Authority: DE
Inventors: David Harvey Katz
Original assignee: KATZ DAVID HARVEY
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1977-02-03
Filing date: 1978-02-02
Publication date: 1978-08-10
Also published as: DE2804457C2; BE863656A; US4191668A; NO153419C; DK49178A; JPS53121943A; FI780312A; DK155174C; NO153419B; LU78997A1; AU515181B2; ZA78613B; NL7801220A; NO780366L; SE464616B; JPH0428689B2; FR2379287A1; CH644521A5; MX6266E; CA1118347A

Description

DR. ING. F. WUESTEOFF DR-E. ν. PECHMANN

DR. ING. D. BEHRENS DIPI.. ING. R. GOETZ

PATENTANWÄLTE

80OO Λί UiICHSN .3CHWrIGFRSTHASSE

(08Θ) 68 20 5 21070

ΡΒΟΤΕΟΤΡΑΤΕΝΤ

1Α-50 531

Patentanmeldung

Anmelder: David Harvey Katz

LaJoIIa Rancho Road LaJoIIa, California 92037

Titel:

Immunsuppressive Mittel

809832/0785

DK. ING. F. WUESTHOFK DH. K. ν. PECHM ANN DIl. ING. D. BKHUHNS DIPI... ING. R. GOETZ PATENTANWÄLTE

Be Schreibung

goon MÜNCHEN OC SClIWUGLIlSrilASSE 2 TELEFON (089) TELEX 524070

WU57

PSOTXIOTPATBKT MÜKOHEIC

1A-50 531

Die Erfindung betrifft immunsuppressive Mittel, die Konjugate sind aus einem Antigen, das gebunden ist an ein D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymer, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Konjugate.

Die Erfindung betrifft Konjugate, die geeignet sind, bei einem Lebewesen (Mensch oder Tier) eine immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen hervorzurufen. Die Konjugate wirken, indem sie die Bildung von Antikörpern zu einem spezifischen Antigen unterdrücken. Antigene können definiert werden als Makromoleküle, die, wenn sie in den Körper eines Lebewesens kommen, zur Bildung von Antikörpern durch das Lebewesen führen und spezifisch mit diesen Antikörpern reagierend/Die grundlegende Funktion der Organe, Zellen und Moleküle, die das Immunsystem ausmachen, besteht darin, körperfremde Substanzen zu erkennen und aus dem Körper auszuschalten. Diese körperfremden Substanzen werden ausgeschaltet durch Reaktion zwischen der körperfremden Substanz und Antikörpern, die als Antwort auf diese Substanz gebildet werden. Im allgemeinen wird diese Funktion wirksam ausgeübt und ohne Schaden für das Lebewesen. In bestimmten Fällen können jedoch Störungen zu pathogenen Störungen führen, z.B. einer nicht gesteuerten Reaktion bzw. Antwort (allergische Erkrankungen) oder einer abnormen Reaktion (Autoimmun-Erkrankung). Die Pathogenese der beiden Erkrankungen hängt direkt oder indirekt mit der Bildung von Antikörpern zu Umgebungsantigenen (Allergenen) oder Eigenantigenen zusammen. Da die Funktion des Immunsystems darin besteht, körperfremde Substanzen zu erkennen und zu eliminieren, ist außerdem die Übertragung bzw. Transplantation von gesundem Gewebe oder Organen von einem Spender auf

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einen genetisch nicht identischen (d.h. allogenen) Empfänger schwierig, aufgrund der allogenen Transplantationsreaktion (allograft reaction; Transplantat-Abstoßung).

Wenn ein Lebewesen in einen "veränderten Zustand" ("altered state") kommt aufgrund des Kontaktes mit einem Antigen (und Bildung von Antikörpern dazu), kann der anschließende Kontakt mit dem Antigen oder einer strukturell ähnlichen Substanz zu einer pathologischen Reaktion führen. Derartige Lebewesen werden als überempfindlich ("hypersensitiv") gegenüber einen oder mehreren eine spezifische Reaktion hervorrufenden Antigenen bezeichnet. Wenn diese Lebewesen das entsprechende Antigen inhalieren oder oral aufnehmen, ist eine bekannte und übliche Manifestation Heufieber, Asthma oder NesselauschTag· Die Neigung, eine derartige Allergie ("Atopie")zu entwickeln, ist vererblich.

Die erste Antikörperantwort eines Lebewesens auf ein Antigen führt zu einer geringeren und etwas anderen Antikörperantwort als die bei späterer Berührung auftretende Antwort. Die erste Berührung mit einem Antigen führt zu einer primären Antwort (Reaktion). Nachdem der Antikörpergehalt bei der ersten Antwort abgeklungen ist bis auf einen Punkt, wo er nicht mehr nachweisbar ist, führt ein anschließender Kontakt mit dem gleichen Antigen üblicherweise zu einer verstärkten sekundären(anamnetischen) Antwort.

Das Auftreten dieser Atopie hängt zusammen mit der Bildung einer Art von gewebesensibilisierendem IgE-Antikörper, der Reagin genannt wird. Diese IgE-Antikörper besitzen eine hohe Affinität gegenüber Rezeptoren auf Zellen, die in verschiedenen Körpergeweben vorhanden sind. Die Rezeptoren befinden sich an Mastzellen, die sich in enger Verbindung mit Kapillaren in Bindegewebe im gesamten Körper und auf basophilen Leukozyten (Blutkörperchen) finden. Mastzellen und Basophile enthalten einen hohen Gehalt an pharmakologisch

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aktivenMediatoren, wie Histamin, Serotonin, 5-Hydroxytryptamin und Kinine (basische Peptide), die im Granulat des Cytoplasmas konzentriert sind. Die Berührung von IgE-Antikörpern, die an Mastzellen und Basophile fixiert sind, mit Antigenen kann eine Vernetzung der IgE-Antikörper auslösen, umgekehrt führt diese Vernetzung zu einer Degranulation der Mastzellen und Basophilen, durch die die chemischen Mediatoren freigesetzt werden und die oben erwähnte allergene Reaktion eintritt.

Während das Auftreten der Atopie von der Bildung von zellgebundenen (IgE-) Antikörpern abhängt, gehört eine andere Art von Antikörpern, die für das Immunsystem von Bedeutung sind, zu der IgG-Klasse. Diese IgG-Antikörper werden als zirkulierende Antikörper oder"blockierende" Antikörper bezeichnet. Die IgG-Antikörper sind ebenfalls imstande, mit Antigenen zu reagieren. Diese Reaktion (Kombination) kann Antigene inaktivieren durch "Blockierung" der Fähigkeit des Antigens, mit zellgebundenem IgE zu reagieren und anschließend die IgE-Antikörper zu vernetzen.

Ein übliches Verfahren zur Behandlung von allergenen Störungen besteht in einer Immunisierung ("Desensibilisierung") der Person durch wiederholte Injektionen von kleinen zunehmenden Mengen an Antigen in Intervallen, z.B. wöchentlich, in einer Dosis, die das Auslösen der Degranulation von Mastzellen oder Basophilen vermeidet.

Es wird angenommen, daß wiederholte Injektionen den Gehalt an blockierenden IgG-Antikörpern erhöhen, aber nicht den Gehalt an zellgebundenen IgE-Antikörpern.

Diese Desensibilisierung besitzt jedoch zahlreiche Nachteile. Therapeutische Vorteile sind schwierig gleichmäßig zu erreichen, und die Behandlung ist mühsam. Da außerdem die Berührung mit Umgebungsantigenen zu einer anschließenden Bildung von IgE-Antikörpern führt, ist die Möglichkeit einer IgE-Antigen-Reaktion und anschließenden IgE-Vernetzung immer vorhanden.

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Eine Autoimmun-Krankheit ist ein pathologischer Zustand, der von einer Autoimmun-Antwort kommt, bei der eine Person immunologisch durch Bildung von Antikörpern auf ein Eigenantigen reagiert. Autoimmunität kann nahezu jeden Teil des Körpers "befallen und umfaßt im allgemeinen eine Reaktion zwischen einem Eigenantigen und IgG-Antikörpern.Typische Autoimmun-Krankheit en können die Schilddrüse, die Magenschleimhaut, Nebennieren, Haut, rote Blutkörperchen und Gelenkhäute befallen.

Bei einigen Autoimmun-Krankheiten wurde eine unspezifische Immunsuppressionsbehandlung angewandt, wie eine Ganzkörper-Röntgenbestrahlung oder Verabreichung von cytotoxischen Mitteln, wobei jedoch nur ein geringer Erfolg eintrat. Die Nachteile einer solchen Behandlung umfassen die Toxizität der angewandten Mittel und das vermehrte Auftreten bestimmter Krebsarten, besonders von Lymphomen und Reticulumzellensarcomen nach einer derartigen Therapie. Außerdem erhöht die Anwendung nicht spezifischer Mittel für eine chronische Immunsuppression stark die Empfindlichkeit des Patienten gegenüber einer schweren Infektion von Pilzen, Bakterien und Viren aus der Umgebung, die unter normalen Umständen keine Probleme darstellen würden. Das erfindungsgemäße Mittel ist spezifisch und unterdrückt nur die Antikörper-Antwort auf das angreifende Antigen.

Im Gegensatz zu der blockierenden Desensibilisierung bei der Behandlung von Umgebungsallergien mit Antigenextrakten und der unspezifischen Immunsuppression von Autoimmun-Krankheiten kann mit den erfindungsgemäßen Mitteln ein langanhaltender Zustand einer spezifischen immunologischen Toleranz erreicht werden durch Suppression bzw. Unterdrückung der Bildung von Antikörpern zu spezifischen Antigenen.

Auf dem Gebiet der Immunologie ist die Unterscheidung zwischen einem Antigen und einem Hapten wichtig. Wie oben definiert, führen Antigene zur Bildung von Antikörpern und

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-Jf-

reagieren spezifisch mit dem gebildeten Antikörper. Im Gegensatz dazu sind Haptene definiert als kleine Moleküle, die selbst die Bildung von Antikörpern nicht anregen können, aber mit einem einmal entstandenen Antikörper sich verbinden. Außerdem führen Haptene in der Regel nicht zu einer Zellimmunität, können nicht als Träger für andere Haptene dienen und führen nur zur Bildung von Antikörpern, wenn sie auf immunogenen Trägern eingeführt werden. Eine Antihapten-Antikörper-Antwort besitzt eine strenge Trägerspezifitat. Eine sekundäre Antwort auf das Hapten kann nur eintreten, wenn es auf dem gleichen Träger verabreicht wird. Wenn es auf einem immunologisch nicht verwandten Träger eingeführt wird, zeigt die Person kein immunologisches "Erinnerungsvermögen" an das Hapten und gibt eine: typische . primäre Antwort.

Aufgrund der Fähigkeit einer sekundären Reaktion, viele Jahre bestehen zu bleiben, kann sie zu einer langanhaltenden Immunität führen. Die primäre Reaktion führt zu einem geringeren Schutz, da die Antikörper langsamer auftreten. In zahlreichen Veröffentlichungen konnte ein System einer langanhaltenden haptenspezifischen Knochenmark-Zell-Toleranz gezeigt und charakterisiert werden durch Verwendung von D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymer, an das das entsprechende Hapten gebunden war (siehe J. Exp. Med., Bd. 134, S. 201-223 (1971); Bd. 136, S. 1404-1429 und S. 426-438 (1972); Bd. 138, S. 312-317 (1973); Bd. 139, S. 1446-1463 (1974) und Proc. Natl Acad. Sei. USA, Bd. 71, S. 3111-3114).

Diese Untersuchungen zeigten den Erfolg bei der Induzierung einer Toleranz an aus Knochenmark stammenden Lymphocyt-Vorstufen von Antikörper-bildenden Zellen von Antikörperklassen, die spezifisch sind für das 2,4-Dinitrophenyl-(Dnp)-Hapten. Die Forschungen umfaßten die Anwendung von Konjugaten von Dnp und D-Glutaminsäure-D-Lysin (im folgenden als D-GL bezeichnet).

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-Jfr-

Jüngere Untersuchungen zeigten, daß eine Toleranz gegen Nucleosiddeterminanten erreicht werden konnte, unter Anwendung von Konjugaten von. Nucleosiden und D-GL (s. J. Immunol., Bd. 114, S. 872-876 (1975). Die Nucleosidarbeiten befaßten sich mit der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Gemisch von Nucleosiden aus einer heterocyclischen Base und einem 5 · Kohlenstoff^ enthaltenden Zucker. Diese Arbeit entspricht der Induktion der Toleranz gegenüber DNP-D-GL.

Während diese immunologischen Untersuchungen von Interesse sind, um die Suppression der Antikörper-Antwort auf chemische Gruppen zu zeigen, die als einzelne Determinanten wirken, wenn sie an entsprechende nicht immunogene Träger, wie D-GL-Copolymer gebunden sind, ist nichts über eine immunotherapeutische Verabreichung von Antigenen angegeben.

Die Versuchsergebnisse, die sich auf eine Penizillin- , allergie und die Anwendung der hauptsächlichen Antigenen-Determinante, Benzylpenizilloyl (BPO), beziehen, sind angegeben in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 73, Nr. 6, S. 2091-2095 (1976).

Die Erfindung betrifft ein therapeutisch wirksames immun-suppressives Mittel, das imstande ist, die spezifische Antikörperbildung bei einer Person zu unterdrücken. Das Mittel ist ein Konjugat aus D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymer und einem Antigen. Das Antigen kann entweder ein Allergen oder ein Eigenantigen sein. Antigene sind u.a. Benzylpenizilloyl, Insulin, Eialbumin, Milcheiweiß, Bermudagraspollen, Timotheusgraspollen, Obstgartengraspollen und Kombinationen von Graspollen, Kreuzkrautpollen, Kreuzkrautantigen-E, Birkenpollen, Bienengift, Schlangengift, Pferdehautschuppen, Katzenhaare(-epithel) Schellfisch (Fischeiweiß), Hausstaub, Chrysanthemum leucanthemum, Alternaria tenuis, Trypsin, Chymotrypsin, Trockenfäule, Bäckerhefe, Tetanustoxoid, Diphtherietoxin, Fricin und Derivate davon. Eigenantigene sind u.a. Nucleinsäure, 01igodÄ>xynucleotid, Thyroglobulin, Thyroidzelloberflache oder Cytoplasma, Parietal-

*(-milben)

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zellen, Nebennierenzellen, Epidermiszellen, Uvealzellen, Basalmembranzellen, Oberflächen von roten Blutkörperchen, Oberfläche von Blutplättchen, Muskelzellen, Thymus-Muskelzellen, Mitochondrienzellen, Drüsengangzellen, Desoxyribonucleinsäureprotein, Acetylcholin-Rezeptorsubstanz, Insulin und andere normale Hormon- und Gewebefaktoren.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der therapeutisch wirksamen immunsuppressiven Mittel durch Umsetzung eines D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymers mit einem Antigen. Das gekuppelte Antigen-D-GL-Konjugat wird nach üblichen Reinigungsverfahren gewonnen. Die immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen kann einer Person, bei der eine solche Therapie angezeigt ist, verliehen werden, indem man ihr das oben angegebene Konjugat aus Antigen und D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymer verabreicht..

Die Erfindung betrifft die Erzeugung bzw. Induzierung von immunologischer Toleranz gegen spezifische angreifende Antigene. Das Antigen wird an ein D-GL-Copolymer gekuppelt. Die erreichte immunologische Toleranz kann definiert werden als der Zustand eines spezifischen Nichtansprechens, bei dem die Person keine Antikörper bildet, als Antwort auf die Aufnahme des Antigens durch die Person. Die induzierte Toleranz zeigt sich durch

1. die Unfähigkeit der mit dem Antigen-D-GL behandelten Person, eine primäre Antigen-spezifische Antikörper-Antwort zu entwickeln ;

2. die Fähigkeit des Antigen-D-GL-Konjugats, eine beginnende Anti-Antigen-Antikörper-Reaktion abzubrechen und

3. die Unfähigkeit einer vorher mit einem Antigen in Berührung gekommenen Person, eine sekundäre Anti-Antigen-Antwort nach Behandlung mit dem Antigen-D-GL-Konjugat zu entwickeln.

Die Suppression wird erreicht, indem man der Person eine Menge des Antigen-D-GL-Konjugats verabreicht, das eine deutliche Suppressionswirkung auf die spezifische Antikörperreaktion zeigt.

8098 32/078 5 .

• ./ö

Der Ausdruck "Lebewesen" bzw. "Person" bedeutet im Rahmen dieser Beschreibung einen Menschen oder ein Versuchstier, das ein Modell für einen Menschen darstellt. Medizinische Indikationen zur Anwendung des erfindungsgemäßen Konjugats sind alle

Zustände, bei denen es erwünscht ist, bei einer Person, die Antikörperreaktion auf ein spezifisches Antigen zu unterdrücken. Der Ausdruck "Suppression" bzw. "Unterdrückung der Antikörper-Antwort bzw. Reaktion" bedeutet eine deutliche Zunahme der immunologischen Toleranz gegenüber einem spezifischen Antigen. Diese Suppression wird erreicht durch Verabreichung einer Dosis oder einer Reihe von Dosen an die Person, die ausreichen, die Antikörperreaktion zu unterdrücken oder herabzusetzen. Obwohl die Menge von Person zu Person und von Indikation zu Indikation variiert, kann sie leicht von dem Fachmann bestimmt werden, ohne daß besonders umfangreiche Versuche erforderlich sind .Die subkutane Verabreichung ist bevorzugt. Dosisformen für die Verabreichung des KonQugats können nach in der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden.

Überempfindlichkeitsreaktionen gegenüber Arzneimitteln, wie Penicillin sind eine häufige allergische Störung beim Menschen. Die beteiligten Mechanismen, die an Penicillin gezeigt werden, können als Modelle für Allergien allgemein angesehen werden. Um eine sorgfältige Untersuchung der Suppression von einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion zu ermöglichen, wird als Modell eine Penicillinallergie untersucht.

Penicillin ist verhältnismäßig instabil, und die meisten Lösungen enthalten zumindest kleine Mengen Penicillinat, ein sehr reaktionsfähiges Derivat, das Penicilloyl und andere Substituierungen ^eAmino-und SuIfhydry!gruppen von Proteinen bildet. Penicillin-G, das abgeleitet ist von kristallinem Kaliumbenzylpenicillin-G (KPG) und das am häufigsten angewandte Penicillin ist, besitzt eine Benzylgruppe an der Carboxylgruppe. Die hauptsächliche antigene Determinante von Penicillin-G, d.h. der begrenzte Bereich des Antigenmoleküls, der die Spezifität der Antikörper-Antigen-Reaktion bestimmt, ist Benzylpenicilloyl (im folgenden BPO genannt). .

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--8Γ-

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemaBen Antxgen-D-GL-Konjugate umfaßt ein Lösen des D-GL-Copolymers in einer alkalischen Lösung und Umsetzung dieser alkalischen Lösung mit ungefähr 2 bis 3 Mol Äquivalent Antigen. Das Reaktionsgemisch wird ungefähr 1 Stunde auf einer Temperatur von ungefähr 10 bis 30⁰C gehalten. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird in einem Bereich von ungefähr 10 bis 12 gehalten durch Zugabe einer alkalischen Substanz, z.B. von KOH oder NaOH. Die Antigenkonjugate werden nach bekannten Verfahren, z.B. durch Dialyse gewaschen und gereinigt. Geeignete Copolymere mit einem Molekulargewicht von ungefähr 34 000, ungefähr 50 000 bzw. ungefähr 64 000 und einem Molverhältnis von Glutaminsäure:Lysin von 60:40 sind im Handel erhältlich (Miles Laboratories, Inc.).

Um die immunspezifischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Konjugats zu bestimmen, wurden (high-titered) IgE? IgG- und IgM-Antikörperreaktionen auf ein Antigen bei Mäusen hervorgerufen durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von Antigen "keyhole"Sehnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin) (KLH). Die als Reaktion gebildete Menge Antikörper wurde dann durch die später beschriebenen Testverfahren bestimmt. Die Behandlung derartiger Mäuse mit erfindungsgemäßem Antigen-D-GL entweder vor oder nach der primären Immunisierung führte zu einer deutlichen Suppression der anschließenden Anti-Antigen-Antikörper-Reaktion der IgE-und IgG-Klassen sowohl in Humoralflüssigkeit als auch in Zellen (humoral and cellular level).

Be stimmungsverfahren

1.) BPO-Träger-Konjugate

(a) BPO-KLH und BPO-BSA

BPO wurde art'keyhole"- Schnecken-Hämccyanin (KLH) und an Rinderserumalbumin (BSA) gekuppelt(J. Clin. Invest. Bd. 47, S. 556-567 (1968) und Int. Arch. Allergy, Ed. 39, S. 156-171 (197O)), Die Proteinkonzentration der Konjugate wurde durch Stickstoffanalyse nach Kjeldahl bestimmt (mit einer Korrektur für die von den BPQ-Gruppen gelieferte Stickstoffmenge). Die Konjugate wurden auf den BPO-Gehalt unter-

t*4 τι ν 809832/0785 (Fissurella)

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sucht durch Bestimmung der Penamaldat-Konzentration. Die Penamaldat-Messung umfaßte die spektrophotometrische quantitative Bestimmung des BPO-D-GL-Konjugats (s. Methods in Immunology and Immunochemistry, Academic Press, S. 141-142 (1967)). Das erhaltene Molverhältnis von BPO:KLH und BPO:BSA war
• BPO,c-BSA (10 Äquivalent Kalium-benzylpenicillin ent-

sp re chend ^-NH₂)5

BPO₁₀-KLH (10 Äquivalent Kalium-benzylpenicillin entsprechend £_-NH₂; Molekulargewicht der Untereinheit KLH 100 000, mit geschätzt 50£-NH₂-Gruppen)

(b) BPO-SRBC (Schaf-Erythrocyten)

Zur Anwendung bei der Untersuchung von Serum BPO-spezifischen IgM- und IgG-Antikörpern wurde BPO an SRBC gekuppelt (J. Immunol. Bd. 96, S. 707-718 (1966)).

Die wie oben beschrieben hergestellten BPO-Träger-Konjugate wurden angewandt zur Immunisierung von Mäusen oder zur Messung der Anti-BPO-Antikörper, wie später näher beschrieben.

2.) Immunisierung

Mäuse wurden immunisiert durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 1 /Ug BPO-KLH, das an 4 mg Al(OH)^GeI adsorbiert war in einem Volumen von 0,5 ml steriler Salzlösung. .Verstärkungsinjektionen wurden i.p. 2 bis 4 Wochen nach der ersten Injektion verabreicht. Die Verstärkungsinjektionen bestanden aus 1 /Ug BPO-KLH im Gemisch mit 2 mg Al(OH)₃-GeI.

In verschiedenen Intervallen nach der ersten und zweiten Immunisierung wurde den Mäusen Blut aus dem Plexus der hinteren Augenhöhlenwand entnommen und die Antikörpergehalte in Serum wie unten beschrieben bestimmt.

3.) Messung der Anti-BPO-Antikörper
Serum IgE-Antikörper

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Passive kutane Anaphylaxe (PCA)

Das PCA-Verfahren umfaßt ein Zusammengeben von Sera von einer gegebenen Gruppe von Mäusen und Reihenverdünnung (2-fach) der Sera in 2-i&Lgem normalen Rattenserum. Ein Anteil von 0,1 ml jeder der verschiedenen Verdünnungen wurden intradermal in die rasierte Rückenhaut der Testratten injiziert. Nach einer 4 bis 24 Stunden langen Sensibilisierung wurden die PCA-Reaktionen, die nach diesem Verfahren nur IgE-Antikörper messen, hervorgerufen durch intravenöse (i.v.) Injektion von BPO-BSA (1 mg/250 g Körpergewicht der geschorenen Ratte) in Phosphat gepufferter Salzlösung, enthaltend 1 % Evans¹ Blau Farbstoff. Der PCA-Titer wird ausgedrückt als reziproker Wert der höchsten Serumverdünnung der zu einer Blaufärbung mit einem Durchmesser von 5 mm führte.(s. Life Sciences, Bd. 81, S. 813-820 (1969)).

4.) Messung der Serum Anti-KLH-Antikörper

Serum IgE Anti-KLH-Antikörpergehalte wurden durch die oben beschriebenen PCA-Reaktionen bestimmt. Die IgG Anti-KLH-Antikörper wurden bestimmt durch radioimmunologische Bestimmung unter Verwendung von mit ^J-markiertem Monomeren KLH (J.Immunol. Bd. 114, S. 872-876 (1975).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1
BPO-D-Gl-Konjugat

1 g D-GL-Copolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 50 000 und einem Molverhältnis von Glutaminsäurezu Lysinresten von 60:40 wurde in 0,1m Natriumcarbonatlösung (pH 11,5) gelöst. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1n NaOH auf ungefähr 10 bis 12 gehalten. 2 bis 3 Moläquivalent Kaliumbenzylpenicilloyl wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch ungefähr 1 Stunde auf ungefähr 10 bis 30°C gehalten.

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Das entstehende BPO-D-GL-Konjugat wurde von dem nicht umgesetzten Penicillinsalz durch Dialyse abgetrennt. Die Dialyse umfaßte mehrere Wechsel von O,1m Natriumbicarbonat, enthaltend 1 % Diethylaminoethylcellulose (DEAE), und schließlich mit Phosphat gepufferte Salzlösung.

Die Analyse des BPQ-D-GL-Konjugats nach dem oben angegebenen Verfahren zeigte, daß das Molverhältnis BPO-D-GL

l (2 Äquivalent Kaliumbenzylpenicillin/Äquivalent £₂ war. Das entstehende BPO-D-GL-Konjugat besitzt ein Molverhältnis von Benzylpenicilloyl oder einem Derivat davon zu Copolymer von mindestens 40s1.

IgE-, IgG- und IgM-Antikörperreaktionen mit hohem Titer auf BPO wurden hervorgerufen durch i.p₀ Injektion von BPO-KLH. Die Behandlung solcher Mäuse, wie später näher beschrieben, mit dem BPO-D-GL gemäß der Erfindung entweder vor oder nach der primären Immunisierung führte zu einer deutlichen Suppression der anschließenden Anti-BPO-Antikörperantwort ^der IgE- und IgG-Klassen, sowohl in den Humoralflüssigkeiten als auch in den Zellen gemessen.

Induktion von BPO-spezifischer Toleranz mit BPO-D-GL, wenn die BPO-D-GL-Behandlung der primären Immunisierung vorausgeht

Analyse der humoralen Immunantworten

2 Gruppen von normalen BALB/c-Mäusen erhielten subkutan (s.c.) 4 Dosen entweder von Salzlösung oder von 500 yug BPO-D-GL in 3-Tage-Intervallen injiziert. Dieses Schema wurde aufgrund von Vorversuchen ausgewählt, die zeigten, daß

1. die subkutane Route ebensogut oder besser ist als die intraperitoneale zur Toleranzinduktion mit D-GL-Konjugaten und

2. zwei 500 /Ug Dosen BPO-D-GL zu einer deutlichen aber noch nicht vollständigen Toleranz führten. Eine Woche nach der letzten Dosis wurden die Tiere primär mit 1 /Ug des sensibilisierenden Antigens BPO-KLH₁vermischt mit 4 mg Aluminiumhydroxid ₍ immunisiert, einem Immunisierungsverfahren, von dem es sich zeigte, daß es zu guten IgE-, IgM- und IgG-Primär-

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Anti-BPO-Antikörperreaktionen bei solchen Mäusen führte. Allen Tierenwurde in wöchentlichen Intervallen Blut abgenommen und ihre Sera auf Anti-BPO- und Anti-KLH-Antikörper untersucht. Am 28. Tag nach der primären Immunisierung wurde den Mäusen in beiden Gruppen eine zweite Menge von 1 /Ug BPO-KLH im Gemisch mit 2 mg Aluminiumhydroxid verabreicht und 7 Tage später wurden sie getötet und das Blut entnommen. Die Versuchsanordnung und die Daten für die Serum-Antikörperreaktionen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Vergleichstiere entwickelten gute primäre IgE-Anti-BPO-Antikörperreaktionen am 14. Tag, die am 21. Tag ihre Spitze erreichten. Diese Tiere zeigten eine starke anamnetische Reaktion am 35. Tag nach der zweiten Injektion am 28. Tag. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die mit BPO-D-GL behandelt worden waren, keine nachweisbaren IgE-Anti-BPO-Reaktionen innerhalb der 28 Tage nach der ersten Behandlung und zeigten nur geringe Mengen Antikörper nach der zweiten Injektion. Vergleichbare IgE-Anti-KLH-Antikörpertiter zwischen behandelten und Vergleichsmäusen innerhalb der 35 Tage langen Beobachtungszeit zeigten eine Toleranzspezifität.

Serum BPO-spezifische IgM- und IgG-Antikörper wurden bestimmt durch passive Hämagglutination unter Verwendung von BPO, gekuppelt an Schaf-Erythrocyten (J. Immunol. Bd. 111, S. 638-640 (1973). Die Anti-BPO-Antikörperreaktionen der IgG-und IgM-Klasse waren ähnlich wie die Ergebnisse der IgE-Klasse, die oben beschrieben sind. Mäuse, die mit BPO-D-GL behandelt worden waren, zeigten deutlich geringere Gehalte an IgG-Anti-BPO-Serum-Antikörper über die gesamte Immunisationszeit und nach der zweiten Injektion,verglichen mit Vergleichstieren.

Milzzellen wurden unter sterilen Bedingungen entfernt und auf BPO-spezifische plattenbildende Zellen untersucht (Science Bd. 14O, S. 405-411 (1963). Heterologe adoptive kutane Anaphylaxereaktionen wurden durchgeführt wie in J. Immunol. Bd. 111, S. 638-640 (1973) angegeben. Die Vierte zeigten, daß wesentlich weniger BPO-spezifische Antikörper der IgG- und IgM-Klasse in den Milzzellen von mit BPO-D-GL-behandelten Mäusen vorhanden waren im Vergleich mit nicht behandelten Mäusen. 809832/0785

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Tabelle 1 Sera-Antikörperreaktion

Wirkung der BPO-D-GL-Vorbehandlung auf primäre IgE-Anti-BPO-Antikörperreaktionen von BALB/c-Mäusen auf BPO-KLH (PCA-Titer)

	Protokoll	Tage nach der ersten Injektion	Serum Anti-BPO- Antikörper
Gruppe	Vo rbehandlung	7	IgE
		14	<10
I	(Vergleich)	21	160
	Salzlösung s.c.	28	320
		35	320
		7	2560
		14	<10
		21 28	<10
II	BPO-D-GL s.c. (500 /Ug χ 4)	35	<10 <10
		40

Die zweite Injektion wurde am 28. Tag verabreicht.

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~ vr-

Induzierung von BPO-spezifischer Toleranz bei vorher immunisierten Mäusen durch Verabreichung von BPO-D-GL

3 Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden durch i.p. Injektion von 1 /Ug BPO-KLH im Gemisch mit 4 mg Aluminiumhydroxid-Gel immunisiert. 2 Wochen später wurde den Mäusen Blut abgenommen und sie anschließend entweder mit Salzlösung mit 500 /Ug BPO-D-GL i.p. oder 500 ,ug BPO-D-GL s.c. an 2 verschiedenen Tagen (14·· und 16. Tag) behandelt. Am 18. Tag wurde allen Tieren ein zweites Mal 1 /Ug BPO-KLH im Gemisch mit 2 mg Aluminiumhydroxid injiziert und während der folgenden 3 Wochen in 7-Tage-Intervallen Blut abgenommen. 21 Tage nach der zweiten Immunisierung wurden die Tiere getötet und die Milzzellen auf BPO-spezifische plattenbildende Zellen untersucht.

Das Protokoll und die Daten der Serum Antikörperreaktionen sind in Tabelle 2 angegeben. Alle drei Gruppen von Mäusen zeigten vergleichbare IgE-Anti-BPO-Antikörpergehalte unmittelbar vor der BPO-D-GL-Behandlung. Nach der zweiten Injektion von BPO-KLH zeigten die nicht behandelten Vergleichsmäuse eine deutliche anamnestische IgE-Reaktion, die am 7. und 14. Tag eine gleichmäßige Höhe erreichte und bis zum 21. Tag nach der Injektion etwas abnahm. Im Gegensatz dazu reagierten die beiden mit BPO-D-GL behandelten Gruppen nicht und zeigten darüberhinaus eine Abnahme der Gehalte an zirkulierenden IgE-Anti-BPO-Antikörpern. Das war am deutlichsten in der Gruppe, der BPO-D-GL subkutan verabreicht worden war. Der IgE-Titer in der zuletzt genannten Gruppe nahm zunehmend ab bis am 21. Tag kein Titer mehr nachweisbar war. Vergleichbare IgE-Anti-KLH-Antikörpertiter zwischen behandelten und Vergleichsmäusen innerhalb der 21 Tage langen Beobachtungszeit zeigten eine Toleranzspezifität.

Ähnliche Ergebnisse wurden bezüglich der Anti-BPO-Antikörperreaktionen der IgG-Klasse erhalten. So war^ei Mäusen, die mit BPO-D-GL behandelt worden waren, die IgG-Anti-BPO-Reaktionen im Vergleich zu nicht behandelten Tieren im wesentlichen unterdrückt.

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Tabelle 2

Wirkung der Behandlung mit BPO-D-GL nach der ersten Immunisierung auf sekundäre IgE-Anti-BPO und Anti-KLH-Antikörperreaktionen bei BALB/c-Mäusen auf BPO-KLH

	Protokoll	Tage nach der zweitai In.iektion	Serum Anti-BPO- Antikörper(TCA-Titer)
Gruppe	Zwischen behandlung	-4	IgE
		7	320
	(Vergleich)	14	1280
I	Salzlösung	21	1280
		-4	300
		7 14	320
II	BPO-D-GL i.p. (500 /Ug χ 2 )	21	40 40
		-4 7 14	40
III	BPO-D-GL s.e. (500 /Ug χ 2)	21	320 40 20
		<10

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-.ar-

280U57

Die Milzzellen zeigten, daß der Gehalt an BPO-spezifischen Antikörpern der IgG- und IgM-Klasse in den Milzen von behandelten Mäusen niedriger war als in den Milzen von nicht behandelten Vergleichstieren.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Mittel geeignet sind, einen Zustand immunologischer Toleranz gegenüber einem spezifischen Antigen bei einem Lebewesen zu induzieren durch Verabreichung des entsprechenden Antigen-D-GL-Konjugats. Die Toleranz zeigt sich bei der IgE-sowie der IgG- und IgM-Antikörperklasse. Außerdem zeigen die Versuchsergebnisse, daß eine Toleranz erzielt werden kann, ohne Rücksicht auf den Immunstatus des Tiers zur Zeit der Behandlung.

Beispiel 2
BPO-D-GL-Konjugat

1 g D-GL-Copolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 64 000 und, einem Molverhältnis der Glutaminsäure: Lysinreste von 60:40 und 0,5 g Kaliumbenzylpenicilloyl wurden in 0,1m Natriumcarbonatlösung gelöst. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1n NaOH zwischen 10 und 12 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 1,5 Stunden auf einer Temperatur von ungefähr 30°C gehalten.

Das entstehende BPO-D-GL-Konjugat wurde von nicht umgesetztem Penicillinsalz durch Dialyse gegen 0,1m NaHCO,, enthaltend 1 % DEAE-Cellulose dialysiert. Die Dialyse konnte etwa 1 Woche lang ablaufen.

Die Analyse des erhaltenen BPO-D-GL-Konjugats nach dem oben beschriebenen Verfahren zeigte, daß das Molverhältnis BPO:D-GL BPO₆₃-D-GL betrug.

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Beispiel 3 /.v^n-wf

Insulin-D-GL-Konjugat

50 mg Schweineinsulin wurden in 0,01m Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei einem pH-Wert von 3,1 gelöst. Das gelöste Insulin wurde gegen die gleiche EDTA-Lösung über Nacht dialysiert. Das Dialysemedium wurde gegen eine O,O33m Boratpufferlösung mit einem pH-Wert von ungefähr 9,5, enthaltend 2,5 x 10"⁵m EDTA ausgetauscht. Toluol-2,4-diisocyanat (TDIC) wurde bei O⁰C zu der Insulinlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei O⁰C ungefähr 30 Minuten heftig gerührt und dann 10 Minuten mit 12 000g bei einer Temperatur von ungefähr 2 bis 4⁰C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde in ein Reagensglas dekantiert, dieses mit einem Stopfen verschlossen und in ein Eisbad gegeben. Man lies die Reaktion eine weitere Stunde bei der Temperatur des Eisbades ablaufen.

50 mg D-GL-Copolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von 64 000 und einem Molverhältnis von Glutaminsäure: Lysin von 60:40 wurden in O,O33m Boratpuffer (pH 9,5), enthaltend 2,5x10"⁵m EDTA gelöst. ]
auf ungefähr 10-12 eingestellt.

haltend 2,5x10"⁵m EDTA gelöst. Der pH-Wert wurde mit 2n NaOH

Die D-GL-Lösung wurde zu der Insulinlösung gegeben, wobei das Molverhältnis von Insulin zu dem D-GL

.10:1 betrug. Die Reaktion konnte

1 Stunde bei ungefähr 35 bis 40°C ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 0,1m (NH^)₂C0,-Lösung, enthaltend 2,5x10~^m EDTA dialysiert und über eine Sephadex-675-Säule unter Verwendung von 0,01m NH^HCO,, enthaltend 2,5x10~⁵m EDTA als Eluens fraktioniert. Das Konjugat wurde weiter gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.

Beispiel 4
Nucleotid-D-GL-Konjugat

Oligodesoxynucleotide(Trimere und/oder Tetramere) wurden hergestellt durch DNase-1-Verdauung von KäU>erthymus-DNS und anschließende Fraktionierung über eine DEAE-Sephadex-A25-Säule. Das Verfahren umfaßt die Anwendung eines linearen 0 bis 0,4m LiCl-Gradienten in 5 mMolar Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

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("TRIS") -7m Harnstoffpuffer (pH 7,6). Der Harnstoff wurde von den Oligodesoxynucleotiden entfernt durch Chromatographie unter Anwendung von destilliertem Wasser als Eluens.

Das entstandene Oligodesoxynucleotid wurdemit D-GL-Copolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 64 000 und einem Verhältnis Glutaminsäure:Lysin von 60:40 umgesetzt. Die Reaktion w.urdein destilliertem Wasser durchgeführt unter Anwendung von i-Äthyl-3-diisopropylaminocarbodiimidhydrochlorid (EDC) als Kupplungsmittel.

Das entstandene Konjugat wurde von den Verunreinigungen abgetrennt und nicht umgesetztes Ausgangsmaterial durch ungefähr 1 Woche lange Dialyse bei ungefähr 2 bis 4⁰C (Siehe J. of Immun., Bd. 96, S. 373 (1966)).

Oligonucleotide wurden auch hergestellt durch DNase-1-Verdauung von Kälberthymus DNA und anschließend^urchleiten des Materials durch ein Filter, das Substanzen mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000 abtrennt (having a molecular weight cut-off of about 10 000). Ein geeignetes Filter ist im Handel erhältlich (Amicon, Division of Rohm and Haas Co., Handelsname PM-10). Das Filtrat wurde als Quelle für das Oligodesoxynucleotid angewandt.

Nucleotide bestehen aus einer heterocyclischen Base, einem Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen und Phosphat. Andererseits sind Nucleinsäuren Polymere, die aus 4 verschiedenen Nucleotiden bestehen, die durch Phospho diesterbindungen miteinander verbunden sind. Oligonucleotide sind kleine Polymere, die üblicherweise aus Nucleinsäuren erhalten werden, die aus weniger als 10 Nucleotiden zusammengesetzt sind, die durch Phosph^diesterbindungen miteinander verbunden sind. Die Diesterbindungen machen die Nucleotide zu verhältnismäßig komplexen chemischen Substanzen. Antikörper, die für Nucleinsäuren spezifisch sind, sind nicht nur für die Base und/oder den Zucker spezifisch sondern auch für die diese Nucleotide enthaltende Phosphatkette. So erhält man bei Anwendung eines kleinen Oligonucleotids, das an einen nicht immunogenen Träger (z.B. D-GL) gebunden ist, eine

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O £-1 Π / Δ ^ 7

nucleinsäureartige Umgebung, die direkter Beziehung stent zu dem pathologischen Zustand einer Autoimmunerkrankung. Im Gegensatz dazu ist die bisher übliche Induktion von Toleranz gegenüber Nucleosiden, die keine Phospho diesterbindungen enthalten,nä-

her der Hapten-D-GL-Toleranz, z.B. Dnp-D-GL, verwandt. Die Induktion der Toleranz gegenüber Oligodesoxynucleotiden kann als entsprechend der Induktion der Toleranz gegenüber Nucleinsäuren angesehen werden.

Beispiel 5
Kreuzkraut-Antigen-E-D-GL-Konjugat

50 mg D-GL-Copolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von 64 000 und einem Molverhältnis von Glutaminsäure: Lysin von 60:40 wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde im Eisbad auf O⁰C abgekühlt und gerührt. 50 mg N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (Woodward's Reagens) wurden in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst, zu der D-GL-Lösung zugegeben und ungefähr eine weitere Stunde bei O⁰C gerührt. Der pH-Wert wurde mit 2n NaOH auf 7,5 bis 8,0 erhöht.

5 mg Kreuzkraut-Antigen-E (Worthington Biοchemicals, Inc.) wurden in destilliertem Wasser gelöst und zu der D-GL-Woodward·s Reagens-Lösung gegeben. Das Antigen-Ε besaß ein Molekulargewicht von 37 800, der Stickstoffgehalt betrug 17,1 % und der Kohlenhydratgehalt 0,2 %* Der S-Wert war 3,05 und der Extinktionskoeffizient (280 /um)einer 1-%igen Lösung bei 1 cm war 11,3.

Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 6⁰C gerührt und dann über eine Sephadex-G-100-Säule mit Hilfe von 0,01m NH^HCO,, enthaltend 0,1m NH4HCO, als Eluens, fraktioniert. Die den ersten Peak enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und das Konjugat weiter gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.

Die erfindungsgemäßen Mittel finden Anwendung zur Behandlung von pathologischen Zuständen, umfassend eine Antikörper dysfunktion. Da, wie oben angegeben, eine große Anzahl von

Umgebungs-Personen überempfindlich ist gegenüber verschiedenen antigenen,

1 bf.w > MfId e run g ist ein Verfahren zur Behandlung zur Ausschaltung! dieser aller-

*) (Kohlenstoff)

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TM-

genen Symptome von ungeheuerem therapeutischen Wert. Durch die erfindungsgemäßen Mittel wird die Bildung von IgE- und IgG-Antikörpern als Antwort auf spezifische sensibilisierende Antigene weitgehend unterdrückt.

Die erfindungsgemäßen Antigen-D-GL-Konjugate umfassen eine große Vielzahl von Umgebungsantigenen, die als Allergene bezeichnet werden. Typische Allergene sind z.B. Arzneimittel, wie Penicillin; Hormone, wie Insulin; Pollen von beispielsweise Kreuzkraut, Bermudagras, Obstgartengras und Timotheusgras, Blütenpollen, z.B. von Chrysanthemum leucanthemum, und Baumpollen, z.B. von Birken; tierische Gifte, z.B. von Bienen, Wespen und Schlangen; tierische Hautschuppen, z.B. vom Pferd; tierische Epidermis bzw. Haare, wie von der Katze; Nahrungsmittelproteinallergene, z.B. von Schellfisch und Erdbeeren; Haushaltsstaub; Pilze, wie Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae); Schimmel, wie Alternaria tenuis; Toxine, wie von Diphtherie; Toxoide, wie Tetanus; Proteine, wie Eialbumin; Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin und Ficin; und Derivate derartiger Allergene.

Neben den oben beschriebenen Umgebungsallergenen bzw. exogenen Allergenen, die bei überempfindlichen Personen zu allergischen Symptomen führen, sind die erfindungsgemäßen Mittel auch geeignet zur Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen. Autoimmun-Erkrankungen können nahezu jeden Teil des Körpers befallen. Einige Reaktionen richten sich gegen organspezifische Antikörper und können auf einen speziellen Zelltyp ge-

Parietal—
richtet sein, z.B. zellen der Magenschleimhaut bei perniziöser Anämie. Andere Reaktionen richten sich gegen weitverbreitete Antigene und sind mit ausgebreiteten Erkrankungen verbunden z.B. Antikero-Aitikörper bei systemischem Lupus erythematodes (SLE). Bei noch anderen Erkrankungen liegen die Reaktionen zwischen diesen Extremen, z.B. bei Goodpasture·s Erkrankung, die gekennzeichnet ist durch chronische Glomerulonephritis und pulmonare Hämorrhagen, befinden sich Antikörper auf der Basalmembran der Nierenglomeruli und des Lungenparenchyms,

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Es werden auch Antikörper gegen spezifische Zellrezeptorstellen gebildet, wie bei Myasthenie gravis, bei der Antikörper zu Acetylcholinrezeptorstellen die Transmission von Neuralimpulsen stören. Antikörper können zu Insulinrezeptorstellen gebildet werden, die die Bindung von Insulin an die Zellen stören, wodurch die regulierende Wirkung des Hormons gestört wird.

Typische Autoimmun-Erkrankungen und dafür verantwortliche Antigene sind u.a.

Schilddrüse

Magenschleimhaut
Faktor(1)

Nebennieren
Haut

Rote Blutkörperchen

Blutplättchen

Skelett- und
Herzmuskel

Leber
(Gallen-Trakt)

Speichel- und
Tränendrüsen

Speichelmembranen
etc.

Hashimoti's Thyroiditis (Hypothyroidismus)

Thyrotoxicosis
(Hyperthyroidismus)

Perniciöse Anämie (Vitamin B^₂ Mangel) Addison's-Krankheit Pemphigus vulgaris

Pemphigoid

Sympathetische Ophthalmie

Autoimmune hämolytische Anämie

Thyrοglobulin und

Thyroid-Zelloberflache

Intrinsic

Parietalzellen

Nebennierenzellen

Epidermiszellen und

Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis

Augenhöhle

Oberfläche der roten Blutkörperchen

Idiopathische thrombocyto-Oberfläche der

penische Purpura Myasthenia gravis

Primäre biliäre Cirrhose Sjögren's-Krankheit

Rheumatoide Arthritis Blutplättchen

Muskelzellen und Thymus "myoid"-Zellen

Mitochondria (hauptsächlich)

umfaßt Drüsengänge, Mi tochondri en, Nuclei und IgG

Fc von IgG

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2304457

Mit Hilfß der erfindungsgemäßen Mittel scheint eine

gsjjJTg
Verhinderung\von Autoimmun-Erkrankungen möglich zu werden durch Kupplung von D-GL an das entsprechende Antigen, das bei den verschiedenen oben angegebenen Immunerkrankungen eine Rollenspielt. Die Suppression der Bildung von IgG-Antikörpern zu Eigenantigenen ist von großem therapeutischen Wert.

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Claims

Patentansprüche

1. Therapeutisch geeignete immunsuppressive Mittel, die imstande sind, eine spezifische immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen zu erzeugen durch Suppression der Antikörperreaktion, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus einem Konjugat aus D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymer und einem Antigen bestehen.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Allergen oder ein Eigenantigen ist.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen ein Allergen aus der Gruppe Benzylpenicilloyl, Insulin, Eialbumin, Milcheiweiß, Bermudagraspollen, Timotheusgraspollen, Obstgartengraspollen und Kombinationen von Graspollen, Kreuzkräutpollen, Kreuzkrautantigen-E, Birkenbaumpollen, Bienengift, Schlangengift, Pferdeepithel, Katzenepithel, Katzenhaare, Fischeiweiß (Schellfisch), Hausstaub, Chrysanthemum leucanthemum, Alternaria tenuis, Trypsin, Chymotrypsin, Trockenfäule, Bäckerhefe, Tetanustoxoid, Diphtherietoxin, Ficin und/oder ein Derivat davon ist.

4. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Eigenantigen ist aus der Gruppe Insulin, Nucleinsäure, Oligodesoxynucleotid, Thyroglobulin, Oberfläche von Thyroidzellen oder Cytoplasma, Parletalzellen, Nebennierenzellen, Epidermiszellen, Augenhöhlenzellen, Basalmembranzellen, Oberflächen von roten Blutkörperchen, Piattchenzelloberflachen,Muskelzellen, Thymus myoid-

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SWSPECTED

Zellen, Mitochondrien, Sekretionsgangzellen, Desoxyribonucleinsäureprotein, Acetylcholinrezeptorsubstanz und/oder Derivate davon.

5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymer ein Molekulargewicht von ungefähr 34 000 bis 64 000 und ein Molverhältnis von Glutaminsäure:Lysin von ungefähr 60:40 besitzt.

6. Mittel nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen Benzylpenicilloyl oder ein Derivat davon ist.

7. Mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Konjugat ein Molverhältnis von Benzylpenicilloyl oder einem Derivat davon zu Copolymer von mindestens 40:1 hat.

8. Mittel nach Anspruch 31 dadurch ge k e η η zeichnet, daß das Antigen Insulin oder Kreuzkrautantigen-E ist.

9. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man D-Glutaminsäure-D-Lysin-Copolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 34 000 bis 64 000 und einem Glutaminsäure:Lysin-Verhältnis von ungefähr 60:40 mit einem Antigen umsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 9_f dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsgemisch auf einem pH-Wert von ungefähr 10 bis 12 hält.

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