DE2325299A1 - Aus mikroorganismen von der art der mycobakterien erhaltene, nicht-spezifische reizmittel, die eine antitumorimmunitaet hervorrufen und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

AGENCE NATIONALE'DE VALORISATION DE LA RECHERCHE.(AHTAR)

15? rue Madeleine Michelis, 92200

"Aus Mikroorganismen von der Art der Mycobakterien erhaltene ₉ nicht=spezifische Reizmittel^ die eine Antitumorimmunität her= vorrufen und Verfahren zu deren Herstellung"

Die Erfindung betrifft aus Mikroorganismen von der Art der Mycobakterien oder der Nocardia erhaltene nicht-spezifische Reizmittelρ die eine Antitumorimmunität hervorrufen_s diese Mittel enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung dieser Mittel_o

Es ist bekannt, daß die' vollständigen Mycobakteriensellen und insbesondere der Bazillus Calmette-Guerin (BCG) als Hilfsars- neimittel wirken und in der Lage, sind₉ die Tumorre.sistenz zu steigerno Diese Mikroorganismen steigern jedoch die Empfind-

ο y ö © ^f 5ju

lichkeit des mit-ihnen behandelten Patienten für die letale Wirkung der bakteriellen Endotoxine (Lipopolysaccharide) der gram-negativen Keime. Diese "Wirkung kann der Ursprung einer Vielzahl.von physiopathologischen Störungen sein_s wenn man die weitverbreitete ,Anwesenheit gram-negativer Keime in der Darmflora berücksichtigt. Andererseits ruft der BCG-Bazillus neben einer Reizung des retikulo-endothelialen Systems eine beträchtliche Hypertrophie der lymphoiden Organe und insbesondere der Milz hervor. Beispielsweise sei daran erinnert, daß es genügt, der Maus 100 /ug BCG zu verabreichen^ um nach 14 Tagen die Empfindlichkeit dieses Tieres gegenüber Lipopolysacchariden um den Faktor 100 bis 1000 zu steigern,, Die gleiche Dosis ruft eine 50 %±ge Erhöhung des Milzgewichtes hervor, während 300 /Ug dieses Organ um 200 bis 400 % anwachsen lassen» Weiterhin besteht eine direkte Beziehung zwischen der Überempfindlichkeit gegenüber Endotoxinen und der Hypertrophie des retikulo-endothelialen Systems nach der Injektion von BCG₈

Diese toxischen Wirkungen stellen somit erhebliche Nachteile dar, die bis heute die ernstesten Hoffnungen gedämpft haben₂ ausgehend von Mycobakterien und verwandten Mikroorganismen Wirkstoffe für gegen Tumoren wirkende Medikamente zu erhalten, die in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden können®

Ziel der Erfindung ist es daher₉ diese Nachteile zu überwin= den und aus Mikroorganismen gewonnene Produkte bereitzustel·= IeH₁, die - obwohl sie eine immunostimulierende.Wirkung entfalten, die gleich oder größer ist als die bekannten Mittel und die mindestens in ausreichendem Maße frei von toxischen Stoffen sind, die bis zum heutigen Tage die Verwendung dieser Materialien als Wirkstoffe.in gegen Tumoren wirkenden Medikamenten verhindert haben sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Mittel anzugeben,,

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Das erfindungsgemäße. Verfahren zur Herstellung eines nichtspezifischen Mittels₈ das seine Immunität gegen Tumoren her** vorruft, ist dadurch gekennzeichnet _v daß man einen Mikroorganisiaenstainm von der Art der Mycobakterien oder der Nocardia züchtet₉ die Zellen des gezüchteten Stammes gewinnt, diese abtötet und anschließend die abgetöteten Zellen einer Extraktionsbehandlung mit Aceton^ absolutem Alkohol und Äther unterzieht und den festen Rückstand gewinnt,. Man erhält in dieser Weise einen festen Rückstand_fl der als solcher bereits ein wertvolles therapeutisches Mittel darstellt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unterzieht man die genannten Bakterienzellen vorzugsweise einer Extraktionsbehandlung mit Chloroform., .

Zunächst extrahiert man die abgetöteten Zellen mit Aceton^ dann mit einer Mischung aus absolutem Alkohol und Äther und schließlich mit Chloroform₀

Der mit Hilfe der oben angegebenen vier Lösungsmitteln von Lipiden befreite Rückstand stellt als solcher.ein therapeutisches Mittel von beträchtlichem Wert dar_ö das eine erhebliche - stimulierende Wirkung nicht-spezifischer Art auf die Antitumorimmunität entfaltet und praktisch frei ist von unerwünschten Nebenwirkungen^ wie sie oben angegeben sind*

Man erhält schließlich besonders interessante Produkte^ wenn man die erhaltenen^ von Lipiden befreiten Zellen einer Behandlung unterziehtρ mit der man insbesondere nach der Extraktion mit Chloroform ein Aufbrechen der Zellwände der lipidfreien Zellen hervorruft^ worauf man die aufgebrochenen Zellwände abtrennt^ mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen behandelt und den festen Rückstand gewinnt^, der das

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genannte Reizmittel darstellte Die erfindungsgemäßen Mittel sind somit teilchenförmige Produkte, die jeweils am Ende . einer der folgenden Behandlungsstufen a)_s b)■, c) und d) des weiter unten angegebenen Verfahrens zur Behandlung von ■ Mikroorganismen aus Mycobakterienkultüren erhalten werden,, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) die Zellen abtötet^ die abgetöteten Zellen, insbesondere durch Filtration abtrennt und nach dem Waschen einer Extraktionsbehandlung mit zunächst Aceton und dann einer Mischung aus absolutem Alkohol und Äther, die insbesondere in einem Volumenverhältnis von "lsi verwendet wird, unterzieht , worauf man die überstehende Flüssigkeit abtrennt und die erhaltenen festen Fraktionen gewinnt,,

b) die genannten festen Fraktionen mit Chloroform behandelt_f die überstehende Flüssigkeit abtrennt und die festen Produkte, die im wesentlichen aus von Lipiden befreiten Zellen bestehen^ gewinnt^

c) die von Lipiden befreiten Zellen aufbricht und die aufgebrochenen Zellwandungen gewinnt,

d) die aufgebrochenen Zellwände, vorzugsweise nach der Zugabe von DNase in ausreichender Menge um eine Zerstörung der beim Aufbrechen der Zellwände freigesetzten Desoxyribonukleinsäuren sicherzustellen^ mit proteolytisehen Enzymen behandelt und die erhaltenen festen Produkte gewinnt,,

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens tötet man die zunächst erhaltenen Zellen, indem man sie mit geeigneten Lösungen oder Lösungsmitteln, insbesondere mit einer Lösung von Phenol behandelt» Es versteht sich,, daß jedes andere an sich bekannte Verfahren, wie z.B. ein Erhitzen dieser Zellen im Autoklaven zur Erzielung dieser Wirkung

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angewandt werden kann_o

Eine "bevorzugte Kategorie von Produkten_P die am Ende der Stufe d) des oben angegebenen Verfahrens erhalten werden^ ■umfaßt diejenigen Materialien die man bei der Behandlung der genannten Zellwände mit Trypsin und/oder Chymotrypsin erhält^ wobei man die teilchenförmigen Produkte gexirtinschtenfalls einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym wie dem unter dem Namen ⁵ⁱPronase^!t bekannten untersiehto

Ganz allgemein besitzen die am Ende einer jeden der genann·= ten Stufen erhaltenen Produkte in charakteristischer Weise gleichzeitig eine ebenso große ₅ wenn nicht verstärkte anti·= tumorale Wirkung^ verglichen mit den ganzen^ lebenden oder toten Zellen^ von denen sie abgeleitet sind und bei Dosie= rungen₀ bei denen diese Antitumorwirkung deutlieh sichtbar istj, eine erheblich verminderte^ wenn nicht vollständig beseitigte Toxizitäto Mit anderen Worten besitzen die erfin= dungsgemäßen Produkte einen günstigen therapeutischen Index₉ den die lebenden oder getöteten Mikrobakterien nicht auf-

Die Verbesserung des therapeutischen Inde5c_ö der sich bei den ©rfindungsgemäßen Mitteln feststellen IaBt₉ ist um so be= merkenswerters da die Behandlung von unter den oben angegebenen Bedingungen abgetöteten und mit lediglich Aceton ■behandelten Mikrobakterien zu Produkten führt ₉ die wie aus den weiter unten angegebenen Untersuchungsergebnissen hin= sichtlich der Produkte^ die aus Zellen von Mycobacterium tuberculosisj, var₀ hominis oder bovis (BCG) oder Mjrcobacterium smegmatis₀ extrahiert wurden^ ersichtlich ist, eine noch merkliche Toxizität besitzen oder eine geringe antitumorale Wirkung entfalten^, wie es. bei Extrakten von Zellen von Myeobaeterium kansasii beobachtet werden konnte _o

Die erfindungsgemäßen Mittel erhält man ausgehend von pathogenen oder nicht-pathogenen Mycobakterien- oder Nocardia-Zellen_e

Als Beispiele für Mycobakterien_p die als Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungs gemäß en Mittel sur Reizung der Anti tumor Immunität verwendet werden können , seien die

folgenden genannte

Maeobacterium tuberculosis _$ Varietät hominis oder boviSj, .Insbesondere Bazillus Calraette~Guerin (BCG);

iycobacterium kansasiii

Hycobacterium smegmatis oder andere zur Familie der Myco-"bakterien gehörende Organ!smen_o

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Bakterien^ die Z₀B₀ auf einem Medium nach Sauton in Roux-Schalen kultiviert wurden, zunächst durch 48-stündige Behandlung mit einer Phenollösung mit einer Endkonzentration von 2 % abgetötet,, was dadurch erfolgen kann, daß man eine wäßrige Phenollösung zu der Kultur zusetzt, die man anschließend während 48 Stunden bei/ Raumtemperatur hält, worauf man die Bazillen abfiltriert und mehrfach mit destilliertem Wasser wäscht«, Es versteht sich von selbst, daß die verwendeten Bakterien auf allen anderen klassischen bekannten Medien gezüchtet sein können.

Man kann insbesondere_s wenn die Bakterien in einem Fermenter gezüchtet werden, die Bakterienzellen auch durch Filtration oder Zentrifugation gewinnen und sie erneut mit einer Potter-Mischeinrichtung_i mit Teflonkolben oder durch Rühren, das in Gegenwart von großen Glaskugeln (mit einem Durchmesser von 3 bis 5 mm) erfolgt, in einer 2 %igen Phenollösung in Suspension bringen^ die etwa 50 g -Zellen pro Liter enthält, und

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die Zellen während 48 Stunden in dieser Suspension halten,, worauf man.sie abfiltriert ader abzentrifugiert und mehr= fach durch wiederholtes in Suspension bringen und Abfiltrieren oder Zentrifugieren wäscht_o

Die nach Durchführung dieser Verfahrensmaßnahmen erhaltenen Zellen werden dann unter den im folgenden angegebenen Be= dingungen mit. Lösungsmitteln von Lipiden befreit„

Die für die Entfernung der Lipide angewandten Lösungsmittel werden in der folgenden Reihenfolge angewandt! Aceton,, eine Mischung aus absolutem Alkohol und Äther in einem Volumenverhältnis von 1s1_P Chloroform₀ Diese Entfernung der Lipide erfolgt bei Raumtemperatur;, in= dem man die Zellen in dem Lösungsmittel _ΰ das in einer Menge die dem dreißigfachen Gewicht der Zellen entspricht^ in Suspension bringt und mit einem magnetischen Rührer während 24 Stunden rührt_o Anschließend werden die Zellen abf11triert_c Diese Maßnahmen werden dreimal wiederholt Die Zellen können auch am Rückfluß in einem Soxhlet·= oder Kumagawa=Extraktor unter Anwendung der genannten Lösungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel von Lipiden befreit werden_o Diese Extraktion wird so. lange fortgesetzt^ bis die Extrak= tion mit dem entsprechenden Lösungsmittel oder der.Lösungs= ffiitteimischung keine x^eitere Wirkung mehr zeigt_a was dadurch festgestellt werden kann₉ daß nach dem Verdampfen des oder der Lösungsmittel^ die bei der Extraktion verwendet wurden₉ kein Rückstand mehr verbleibt₀

Die Gesamtmenge der mit Hilfe der nacheinander verwendeten Lösungsmittel extrahierten Lipide macht etwa 30 bis 40 % des Trockengewichtes der anfangs eingesetzten Zellen -aus₉ eine Menge, die je nach dem Stamm und den verwendeten Kultur= bedingungen«, sich ändert_Q Die mit Aceton extrahierten Lipide sind Glyceride und in geringerer Menge Glycolipide und Lipo·=

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peptide» Trehalose-6₉6'-dimycolat (Cord-Faktor) wird teilweise mit Aceton extrahiert^ wobei der Rest dieses Materials durch die anderen Lösungsmitteln entfernt wir-d_o Die Alkohol/ · .Ä'ther-Mischung extrahiert im wesentlichen die Phospholipide und die Wachse A,- Mit Chloroform werden die Wachse B₉ C und' D extrahierte Die Wachse A₉ B₉ C und D können durch ihre Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln bei verschiedenen Temperaturen charakterisiert werden (vergl_o J₀ Asselineau«,

Les Lipides BacterienSj, Hermann Editeurj, Paris 1962)_O

Die bevorzugten erfindungsgemäßen Mittel können somit als von Lipiden befreite Mycobakterienzellen betrachtet werden^ die im wesentlichen frei sind von freien Lipidenc, insbesondere von Glyceriden^ Glycolipiden .und Lipopeptiden_p von Cord-Paktor, Phospholipiden und den Wachsen A₅ B₅ C und D₀

Die nach Durchführung dieser Verfahrensschritte erhaltenen, von Lipiden befreiten Zellen können anschließend als solche verwendet werden oder können noch weiteren Behandlungen zum Aufbrechen der Zellwände unterzogen werden^ die gegebenen·=· falls zusätzlich einer Proteolysej, insbesondere unter den im folgenden angegebenen Bedingungen unterworfen werden«

Die Zellwände der in dieser Weise von Lipiden befreiten Bakterien werden durch Aufbrechen der Zellen_P Behandlung mit einer DNase und anschließender fraktionierter Zentrifugation gewonnen., die dazu dient_s die nicht aufgebrochenen Zellwände und die löslichen Bestandteile der Zelle oder die Zellen geringerer Größe zu trennen_o Dieses Aufbrechen kann ZsB. durch Rühren in Gegenwart von kleinen Glaskugelchen (Durchmesser 0_s1 bis 0„2 mm)₉ durch Verreiben in Gegenwart von Aluminiumoxydj mit Hilfe von Ultraschall oder durch irgendein anderes geeignetes Verfahren erfolgen«,

Die Zellwände werden anschließend mit proteolytischen Enzymen,

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ZoBo Trypsin^ Chymotrypsin oder Pronase oder einem ande= ren proteolytisehen Enzym behandelt^ die als solche oder in Fora von Mischungen oder gegebenenfalls nacheinander verwen= det werden können_o Diese Enzyme beseitigen die Proteine _ΰ - die die Zellwände verunreinigen könnten_s machen jedoch auch die Peptide oder den Zeilwänden zugehörende Proteine löslich_p die 20 bis 30 Gewo-tf der" Zellwände ausmachen,, Schließlich erhält man in dieser Weise teilchenförmige Produkte^ die den Produkten entsprechen die man nach Ablauf der oben an-

Die vorstehenden Ausführungen befassen sich im wesentlichen mit AusfühFiangsformen des erfindungs gemäß en Verfahrens₉ die dazu dieaen₉ die bevorzugten festen ©rfindungsgemäßen Produkte su l±e£em₀ fiohc die Produktes dia man nach Durch= führung der Stufe "b) einerseits ■ und der Stufe d) anderer·= seits erhalte. Es versteht sich von selbst^ daß man das oben angegebene Terfahren auch nach Ablauf der bereits be° sehriebenea Stufen a) und c). unterbrechen kann_o

Insbesondere kann man die Behandlung zur Entfernung der

len mit Aceton und der Alkohol/Äth@r~Misehung b@schränken_o Bis in dieser Weise erhaltenen^ von Lipiden befreiten Zellen enthalten demzufolge noch, wesentlich© Mengen der Wachse B₉ .C und Do

In gleicher Weise kann man. die Behandlung der von Lipiden befreiten Zellen nach dem Aufbrechen dar' Zellwände unterbrechen und dies© gewinnen^ wobei diese Zellwände als sol= ehe das erfindungsgemäße therapeutische Mittel ausmachen könneno

Die folgenden Beispiel© sollen genauer die Behandlungsarten beschreiben^ "dl© Eur Herstellung der sieh nacheinander erge-

lbenden erfindungsgemäßen Fraktionen dienen und die insbe=* sondere auf Zellen des Stammes Mycobacterium kansasii Po 21 Runyonj, angewandt werden und bei denen sich auch Zwischenfraktionen (Beispiel 1 und 2) ergeben*, Weiterhin sind pteraakologisehe Untersuchungen angegeben^ aus denen mit Hilfe voii Tergleichsversuchen ersichtlich ist_p daß die er= findungsgemäßen Mittel zu besonders günstigen Ergebnissen

ρ i e 1

Herstellung von mit Phenol behandelten Zellen von Myeo=

Die Zellen von M₀ kansasii werden in Roux=Schalen in einem Sauton-Medium während 39 Tagen bei 37°C gezüehteto Am- @©fLLi©ßend werden sie durch Zugabe von Phenol _s das"bis zu ©iner EndROnzentr&tion von 2 % zugesetzt wird_s abgetötete luseiiließend wird die Roux-Schale geschüttelt^ damit der Bakterienschleier vollständig mit dem Phenolmedium in Be-

kommt β Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur werden Bakterienzellen mit Hilfe eines Büchner·= Trichters über ©in Papierfilter abfiltriert und dann mit viel destilliertem Wasser gewaschen, das über den Bakterienkuchen gegossen wird, übt von dem Filter zurückgehalten wirdo Anschließend kann das Material gewünsentenfalls so wie es ist gewonnen werden_o

ispiel

Herstellung der Zellen von $L kansasii ₉ die mit Aceton von Lipiden befreit sind (M₀k. a)

Der genannte Bakterienkuchen wird (in etwa dem 30-fachen Yoliameng, bezogen, auf den. Bakterienkuchen) ,in Aceton in Suspen-

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sicm gebrachte Die Suspension wird mit Hilfe eines magnetischen Stabes _s der'mit einem Magnetrührer bewegt wird₀' während 24 Stimden bei Raumtemperatur gerührt₀ Die Bakterien werden ■anschließend erneut mit Hilfe eines Büchner-Filters ab= filtriert _s dann in frischem Aceton suspendiert und erneut "bei Raumtemperatur gerührt_o Das Abfiltrieren und Extrahieren der Lipide wird anschließend ein drittes Mal wiederholt^ worauf die Bakterienkörper durch Verdampfen des· verbliebenen Aeetons an der Luft und dann im.Vakuum getrocknet werden_o Die in dieser Weise hergestellten Bakterienkorper werden an°. se&Ließexxd bei Raumtemperatur von Licht geschützt aufbewahrt,.

©ispiel 5

^stellung von. Zellen von M₀ kansasii₉ die mit Aceton einer Alkohol/iither-Mischung von Lipiden befreit sind

(Moko B.g ae)

Bi® Bakterienzellen des Beispiels 1 werden wie in Beispiel 2 "beschrieben mit.Aceton behandelt« worauf sie jedoch statt getrocknet "zu werden in einer Mischung aus absolutem Alkohol üjad Äther (die in einem Volumenverhältnis von 1s1 verwendet werden) suspendiert und 24 Stunden bei ■ Raumtemperatur magne-= tisch gerührt werden ₀ worauf das Material über ein Büchner-Filter abfiltriert wird und der gesamte Vorgang zwei weiter© Male wiederholt wird« Die in dieser Weise erhaltenen Zellen köjmen dann abgetrennt (Fraktion M₀k_o a_p ae)_s in Aceton in Suspension gebracht^ getrocknet und von Licht geschützt auf-

Bei s_pi el 4

Herstellung von Zellen von M₀ kansasii_P die mit den "vier Lösungsmitteln" von Lipiden befreit worden sind (M₀k_o a_s ae,, c)

Man verfährt wie in Beispiel 3 beschrieben,, wobei die Bakterienkörper nach der Behandlung mit der Alkohol/Äther-Mischung unter den angegebenen Bedingungen der gleichen Behandlung mit Chloroform unterzogen werden^ die dreimal wiederholt wird., Die Zellen werden anschließend in Aceton suspendiert,; getrocknet und so lange wie erforderlich im Dunklen aufbewahrt. .

Beispiel

Herstellung von Zellwänden von M₀ kansasii_p die mit Trypsin und Chymotrypsin behandelt worden sind (M₀k_o par₀)

Die oben genannten_s von Lipiden befreiten Zellen werden in Wasser ρ das in einer Menge von 25 ml/g von Lipiden befreiten Zellen verwendet wird₂ mit Hilfe einer Zerkleinerungseinrichtung vom Typ Potter mit einem Teflonkolben in Suspension gebracht und dann in Fraktionen von 30 ml während 25 Minuten (5x5 Minuten) mit Ultraschall _ΰ der mit einer Vorrichtung^ die bei 250 Watt und 10 kHz betrieben, wird, entwickelt wird„ behandelt_p wobei das Material αμ^ΐι Zirkulation mit Wasser gekühlt wird_o Diese Behandlung zerstört die Hüllen der Mehrzahl der Bakterien,, worauf die Zellwände durch fraktioniertes Zentrifugieren gewonnen werden können,» Nach der Zugabe von DNase (O₃1 mg/100 ml der Suspension), die dazu dient«, die'bei dem Aufbrechen der Zellen freigesetzten Deso3cyribonukleinsäuren zu zerstören,, werden die intakten Zellen durch dreimaliges aufeinanderfolgendes Zentrifugieren bei 200 g während 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge abgetrennt» Die zuletzt erhaltene überstehende Flüssigkeit

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wird dann 1 Stunde bei 2? 500 g zentrifugiert₉ worauf die abgeschiedenen Feststoffe₉ die im wesentlichen aus den ZeIl-•wandungen bestehen^ erneut mit Hilfe einer Potter=Zerkleinerungseinrichtung mit Teflonkolben in dem 50-fachen Volumen eines O₉066 m Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von Y₉ 8₉ der O₉3 % Trypsin und Chymotrypsin enthält₉ in Suspension gebracht und über Nacht bei Raumtemperatur nach Zugabe einiger Tropfen Toluol inkubiert werden,,

Die durch Einwirkung der Enzyme gereinigten Zellwände wer= den anschließend durch 1°stündiges Zentrifugieren bei 27 500 g gewonnen^ in dem bereits beschriebenen Phosphatpuffer erneut in Suspension gebracht und wieder' zentrifugierte Diese letztere Maßnahme _ΰ die dazu dient₉ die proteo·= lytisehen'Enzyme und die durch diese Enzyme löslich gemachten Substanzen zu entfernen₉ wird zweimal mit dem Phosphatpuffer und dreimal mit destilliertem Wasser wiederholte Die in dieser Weise gewaschenen Zellwände werden anschließend in einem möglichst geringen Acetonvolumen suspendierto Die Zellwände werden über eine Glasfritte Nr₀ 4 ab=- filtriert und an der Luft sowie im Vakuum getrocknete Nach dem Zerkleinern im Mörser kann das erhaltene Produkt (Mo ko par_o) beliebig lange bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt werden«

Die Analyse des in dieser Weise erhaltenen teilchenförmigen Produktes stellt sich wie folgt dars

Elementaranalyse s. C = ■ 51*93 %l H s Q₀ 01 % ι N % 4_s08 %

Zusammensetzung ^v

Aminosäuren^ 12₀5 ⁰M Alanin^ Glutaminsäure₉ meso°a_st- Di=

aminopimelinsäure in einem Verhältnis von 1s1sO₉6 sowie Asparaginsäure _s Glycin'j,' Threonin_s Serin_s VaIIn₉ Leucin_£

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Isoleucin und Phenylanalin in einem Yerhältnis von weniger als 0^3? bezogen auf Glutaminsäureο

Amino zucker % 10

Vor der Hydrolyse N~acetyliertes Glucosamin und vor der Hydrolyse N=" glycolysierte Muraminsäure in einem Yerhältnis von 1:1«

Neutral zucker: 38 %% Ärabinose₈ Galactose und Glucose,,

Lipide: 30 Ms 40 %% Mehr als 90 % dieser Lipide sind Kan=

samycolinsäuren₀

Beispiel

Herstellung von Zellwänden von M₀ kansasiij, die mit Trypsin^ Chymotrypsin und Pronase behandelt worden sind (M₀ k„ par«, pr_o)

500 mg von Lipiden befreite Zellwände von M₃ kansasii, die wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben,, mit Trypsin und Chymotrypsin behandelt"worden.sind, werden mit Hilfe einer Potterzerkleinerungseinrichtung mit Teflonkolben in 100 ml eines 0,02 m Natriumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,8 suspendiert und dann mit 50 mg Pronase P versetzt und 8 Stunden bei 37°C in Gegenwart einiger Tropfen Toluol in·= kubierte Anschließend werden die Zellwände 1 Stunde bei 27 500 g abzentrifugiert und dann durch erneutes in Suspension bringen und Abzentrifugieren dreimal mit einem.0,02'm Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7^8 und dreimal mit Wasser gewaschen«, Dann wird das Material dadurch von Lipiden befreit _ΰ daß man es mit der Potter= Zerkleinerungseinrichtung in dem 30-=-fachen Volumen des Lösungsmittels in Suspension bringtj, 24.Stunden bei Raumtemperatur mit einem mag-

/11··

¹⁵ " 232529«

netischen Rührer rührt und anschließend über eine Glasfritte Nr₀ 4 filtrierte Diese Maßnahmen werden zweimal mit Aceton,, zweimal mit einer Älkohol/Äther-Mischung und zweimal, mit Chloroform durchgeführte Anschließend werden die Zellwände in Aceton suspendiert_s erneut abfiltriert_s an der Luft ge= trocknet und im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrte

Beispiel 7

In gleicher Weise wie in den Beispielen 1 bis 5 beschrieben,, werden stufenweise Extrakte erhalten^ ausgehend von Zellen

der folgenden Stammes

Mycobacterium tuberculosos var_o boviss Bazillus Calmette=» Guerin (BCG)₅ Stamm Institut Pasteur? ·

Mycobacterium smegmatis_P Stamm der bei der -"American Type . Culture Collection" unter der Kr₀ NBR 21732 hinterlegt ist_o

Pharmakologische Eigenschaften der erfindungs gemäß en Mittel_o

Die erfindungsgemäßen Mittels, die in der oben beschriebenen Weise erhalten werden können,, sind bei Dosierungen^ bei denen sie verwendet werden solleng frei von den erheblichen Mach= teilen der vollständigen Mycobakterienzellen (insbesondere der Hyperreaktivität gegenüber Endotoscinen und der Hyper= trophie des retikuLo-endothelialen Systems);, die die Verwendung der Mycobakterien in der Therapie beschränken _ΰ wo=- ■ bei die erfindungsgemäßen Mittel eine starke antitumorale Wirkung entfalten Diese 'günstigen Eigenschaften werden durch die im folgenden angegebenen pharmakologischen Untersuchungen deutliche Im folgenden, ist daher eine Zusammenstellung der untersuchten Produkte zusammen mit den abgekürzten Bezeichnun@sL,die im weiteren verwendet. werden₉ angegeben?

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ο. 16 -

BCG mit.Phenol abgetötet (BCG)?

BCG mit Phenol abgetötet und mit Aceton von Lipiden befreit (BCG a); '

BCG mit Phenol abgetötet und mit Aceton* einer Alkohol/Äther-Mischung und Chloroform von Lipiden befreit (BCG a, ae, c)j

M. smegmatis mit Phenol abgetötet (M₀ sm„);

M. smegmatis mit Phenol abgetötet und mit Aceton von Lipiden befreit (M, sm. a)5

M, kansasii mit Phenol abgetötet (M.k_o);

M. kansasii mit Phenol abgetötet und mit Aceton von Lipiden befreit (M.k. a) ; .

M. kansasii mit Phenol abgetötet,, mit Aceton und einer Alkohol/Äther-Mischung von Lipiden befreit (M₀ k« a, ae);

M. kansasii mit Phenol abgetötet^ mit Aceton^ einer Alkohol/ Äther-Misehung und Chloroform von Lipiden befreit (M. k. a, ae₉ c)i

Mo kansasii, von Lipiden befreite Zellwände, die mit Trypsin und Chymotrypsin behandelt worden sind (M₁, k„ par_o);

M. kansasii, Zellwände die von Lipiden befreit imd mit Trypsin, Chymotrypsin und Pronase behandelt worden sind (M.k„ par. pr·).

Die verwendeten Tests waren die folgendens Sensibilisierung der Maus gegenüber Endotoxinen?

Hypertrophie der Milz und der Leber der Maus 14 Tage nach der Injektion der Macobakterienpräparate; ,

Wirkung dieser Präparate auf die auf die Maus übertrage-, ne Lymphleukämie (lymphatische Leukämie) oder auf das Ehrlich¹ sehe Wassersuchtcarcinom.

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In gewissen Fällen wurde die Tuberkulinreaktion am Meer= schweinchen und die pyrogene Wirkung am Kaninchen bestimmt,.

Mit Ausnahme der Untersuchungen _s die sich auf die Sensibili= sierung mit Histamin beziehen_s wurden alle an der Maus durch= geführten Untersuchungen unter Anwendung von Hybriden F^ durchgeführt _g die aus blutsverwandten Stämmen stammten und deren physiologisches Verhalten somit homogener ist₀ Die in den Tabellen I bis III und V bis VIII angegebenen Ergeb·= nisse beziehen sich auf mehr als 5000 Mäuse_o

A) Nachweis der Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen^ von . Mycobakterien herstammenden Substanzen

Ie Hyperreaktivität der Maus gegenüber EndotoxinensVergleich der Wirkung abgetöteter Mycobakterien mit denen der er·= findungsgemäßen Mittel_o

Es ist gut bekanntp daß die Mycobakterien die Empfindlichkeit auf die Letalwirkung der Endotoxine steigern (verglo Suter und CoIl₀₉ 1958₉ ProcoSoCoExpoBiolo Med_o» 1958_P 99₉ 167) und Halpern₉ B₀N₀₃ C₀R₀ SocoBiolo Paris_s 1958_D 1^52,, 899). Es wurde festgestellt^ daß diese Wirkung mit dem "Cord-Faktor" zusammenhängt (verglo E_Q Suter und CoIl_{0 ΰ} Proc_e Soco Ε3φ_ο BiOl₀ Med_{o g} 1958_S 99» )

Die.bei den folgenden Untersuchungen verwendeten Mäuse wa~ ren -Hybriden (C57B1/6 X AICR)F₁ mit einem Alter von etwa 6 Wochen. Die Toxisitätsuntersuchung erfolgte durch Injizieren eines aus,Salmonella enteriditis extrahierten Endotoxins an Mäuse in wachsenden Dosierungen gemäß dem geometrischen Verfahren 3 (raison geometrique 3)₀ die sich von O₉5 bis 150 /Ug erstreckten^ wobei gewisse Mäuse selbst mit 300 /Ug dieses Endotoxins behandelt wurden₀ All® Injektionen er= folgen auf intravenösem Wege« Die Mortalität wurde 48 Stunden

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später be stimmt,. worauf die DL 50 gemäß dem Verfahren von Reed und Muench (Amer₀ Jo of Hyg₀ 1938_S 27₈ 493) ermittelt wurde» Es ist bekannt^ daß die DL 50 an der normalen Maus 230 /Ug beträgt (vergl_o Tabelle II)„

In der folgenden Tabelle I sind die DL 50 von Mäusen ange~ gebenj, die δ Tage zuvor (J-8) und 14 Tage zuvor (J-14) mit durch Phenol abgetötetem BCG (BCG) in den in der ersten Spalte der Tabelle I angegebenen Dosierungen behandelt worden waren«

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Hyperreaktivität	gegenüber3	Endotoxinen	von mil	; BCG behandelten Mäusen	2 ■ 22	DL 50 (/Ug)
		d = O				< 1,5
BCG=Dosis icVo	Anzahl der Tiere	Anzahl der Unter-= ■ suchungen	DL 50 (/Ug)
100 /Ug 300 " ,ug	32 548		56·	Anzahl Anzahl der Tiere der Unter·= . suchungen
59 938

1 mg

30

1,5

CaD KD OT] KJ

" ²⁰ " - 2325293

Wie aus der Tabelle I ersichtlich ist, sind die Mäuse 8 Ta ge nach der Injektion von BCG empfindlich geworden,, Die DL 50 betragen weniger als 4.j3 /Ug bzw« 56 /Ug bei Mäusen,, die mit 300 ,ug bzw«, 100 /Ug BCG behandelt wurden,, Die Empfindlichkeit ist 14 Tage später noch größer gewordene Die DL 50 liegen für die beiden genannten BCG~Dosierungen unterhalb 1

Aus diesen Gründen wurden bei den folgenden Untersuchungen die Tiere 14 Tage nach der Injektion von BCG oder den zu untersuchenden Mycobakterienpräparaten untersucht» Die Produkte wurden als Suspension entweder in einer 0_s85 %igen Natriumchloridlösung (isotonische Lösung) oder in einer Emulsion von Ölj, das unter der Bezeichnung Bayol F bekannt ist, in Wasser verabreichte. Die verwendeten Mycobakterienpräparate wurden in 0^2 ml einer 10 %igen Emulsion von Bayol in Wasser im Fall der Dosis 300/Ug und in einer 3 %igen Emulsion für die Dosis 100/Ug verabreichte Im folgenden wird der Einfachheit halber häufig auf Suspensionen der zu untersuchenden Produkte in "Bayol" bezug genommen., Es handelt sich jedoch in allen diesen Fällen um Suspensionen in Emulsionen von Bayol in Wasser_s. die- in'den oben angegebenen Mengenverhältnissen angewandt werden«.

Die in der folgenden Tabelle II angegebenen Ergebnisse stellen die Mittelwerte mehrerer Untersuchungen dar„

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TABELLE II

Hyperreaktivitätgegenüber^Endotoxinen Vergleich zwischen BCG und anderen Mycobakterien-Produkten

Injizierte Produkte

Mycobakterien Dosis Trägerstoff

BCG

BCG a

BCG Sl₃ ae_s c

MoSIBo

Mo sm₀ a
Mo ko
M₀ ko a

100 300

1 ⁷Hg

300 300

300

300 /Ug 300 Vug

300 1

•300

isotonische Lösung Bayol

isotonische Lösung

isotonische Lösung

isotonißche Lösung

isotonische Lösung Bayol

isotonische Lösung

mg isotonische Lösung isotonische Lösung

Anzahl der Tiere	Anzahl der Unter·= suchungen	DL 5Ü
62 21	3 2	230 > 50
59 938 32	2 22 1	< 1,5 < 1,4 V5
59 87	3 3	26 9
24	1	>50
92 72	3 2	41,4 < 2
118	4,	>39
26	1	■ 239
87 31	3 1	>135 6

era ro

TABELLE II (Fortsetzung)j

Inj1giert©_|Produkte Iftrcobakterien Dosis

ω	Msk« a, ae,- c'	100 300	/Ug /ug	isotonische	Lösung
ο		100	/Ug	Bayol
<Χ>
■•c-· IO		100 300	/Ug ^Ug	isotonische	Lösung
	M@k9 para	1	'mg
1 30		100 ■300	/Ug yug	Bayol „
	M.k« par«, pr	300	/Ug	isotonische	Lösung

der Tiere

27 80

46

27

160

58

58

Anzahl der

IMtersuchungen

1
3
1

1
5

2
2

DL 50

>300 290

180

>300

140

< 50

240

>50

Es ist .festzustellen daß die DL 50 bei der normalen Maus etwa 230/Ug beträgt und daß_s wenn man das Material in Bayol injiziert^ kein Todesfall bei der stärksten verwendeten Do= siSg doho 50/Ug festgestellt wird₀ Von den drei verwendeten mit Phenol abgetöteten Stämmen ist BCG derjenige _v der die stärkste Empfindlichkeit hervorruft^ während Mo smegmatis die geringste Sensibilisierungswirkung entfaltet_o Nichts= destoweniger bringt die Verabreichung von Bayol _s das '300 /Ug Mo smegmatis enthält ₉ den Wert DL 50 von 41_P 4 auf einen Wert unterhalb 2/Ug_o

Die mit Aceton von Lipiden befreiten Zellen (BCG a_s M_osm_o a und Moko a) machen die Maus weniger empfindlich« So ist-BCG ä weniger toxisch als Original-BCGp. während die Toxizi·= tat von M₀ko a geringer ist als die von

Es ist bemerkenswert festzustellen daß nach der Behandlung mit mehreren Lösungsmitteln die gleichen Zellen (M₀k_o a_P ae? Moko Q-s ae₉ c und BCG ä_s ae.p c) die Empfindlichkeit gegenüber Endotoxinen nicht steigern_o Die Sensibilisierungswirkung dieser Produkte ist bei Dosierungen von 100 bzw_o 300yUg um den Faktor 200 geringer als die von BCGo

Das gleiche trifft für. die Zellwände _s insbesondere von Mo kansasii zu, die in isotonischer Lösung verabreicht wur-

den_o

Es ist festzustellen_p daß die zuletzt erwähnten Präparate von Mo" kansasii die zusammen mit Bayol in Mengen von 100/Ug des Produktes verabreicht wurden^ im Vergleich zu der sich durch die Injektion von 100/Ug BCG ergebenden Wirkung eine sehr viel geringere Empfindlichkeit gegen Endotoxine hervorrufto .

QS849/1 130

Bei M„k_o par₀, das in Suspension in Bayol in Mengen von 300/Ug verabreicht wurde j wird die- Endotoxinresistenz vermindert«, Es ist jedoch festzuhalten^ daß - wie weiter unten aufgezeigt wird — die Emulsion der Zellwände in Bayol die antituniorale Wirkung bei Dosen von 100/Ug oder weniger steigert*,

II. Hypertrophie der Leber und der MIzϊ Vergleich von BCG mit den erfindungsgemäßen Mitteln

Es ist festzustellen^ daß die Mycobakterien₉ wenn sie auf intravenösem Wege verabreicht werden? eine Hypertrophie der Leber und insbesondere der Milz hervorrufen^ die durch die Gewichtszunahme dieser Organe 8 oder 14 Tage nach der Injektion bestimmt werden kann_o

Bei diesen Untersuchungen wurden die gleichen Mäusehybriden verwendet«, Die Produkte wurden (in Suspension in isotonischer Lösung oder in gewissen Fällen in 3 ?aigem oder 10 tigern Bayol) auf intravenösem Wege in Dosierungen von 100 oder 300/Ug an Mäuse verabreicht._g die 14 Tage später getötet wurden«, -

In der folgenden Tabelle III sind die Ergebnisse dieser Untersuchung zusammengefaßt _o ■ /

309849/1130

TABELLE /III

Hypertrophie der Leber und der Milz Vergleich zwischen BCG und anderen Mycobakterien-Produkten

Injizierte Produkte

Dosis Trägerstoff

BCG a

isotonische Lösung

Bayol

300 /Ug isotonische 1 'mg Lösung Anzahl Anzahl
der der
Tiere Unter-=·

suchun·=

gen

Körper=
gewicht
in g

,1
6

23,3
ρ 4

22_Ρ3

22_Ρ6
23

Gewicht der
Leber in mg

1290 1300

1275 2067 2216

1495 1699

Gewicht der MIz in mg

117 149

170 350 453

171 246

Gewichts-= zunähme der Milz

45,5 200 279

46 110

SV3 VJl

300

isotonische

300 /ug isotonische 1 'mg Lösung

500 '/Ug isotonische

1
1
1

19,7
18p5

20_P5

22,7
24

23,7
20_s5

1.11.9. 1215 1435

1092 1867

1210 1394

1236 1234

139 194 237

156 383

179

186

117 183

19

66

102

4,8* 157 *

53 59

0 56

TABELLE III (Fortsetzung):

Injizierte Produkte

%sofeakt©r.ien Dosis Trägetstotf

300 /Ug isotonische 1 'mg Lösung

100

300

Anzahl der Tier©	Anzahl der Unter suchun gen	Körper gewicht in g	Gewicht der Leber in mg	Gewicht der Milz in mg	Gewichts zunahm© der Milz %
5 5	1 1	25f6 26f9	1282 1426	95 146	0 25
10 15' 10	Μ 2 1	24f3 24 23,8	1169 1109 1379	119 137 191	2 17 63
10 10	1 1	24P5 23S6	1287 1338	159 191	6P8* 28 ·
10 20 20	1 3 ' 3	23S6 25 24,2	1129 1333 1433	133 148 149	13,8 26,5 27p2
10 15	1 ' 2 :	2492 24„8	1432 1670	200 228	3491* 53 *

Die Gewichtszunahme in Prozent wurde mit Hilfe von Vergleichstieren, denen lediglich Bayol verabreicht wurd©^ ermittelte

CJl CD

In der Tabelle-III sind, die Mittelwerte mehrerer Untersuchungen angegeben^ die für jeden Fall und für jede Dosis an 5 oder 10 Tieren durchgeführt wurden₀ Es ist zu ersehen, daß die von Lipiden befreiten Zellen insbesondere diejenigen₉ die mit den "vier Lösungsmitteln" behandelt wurden und die Zellwände selbst diejenigen,, die in Bayö'l suspendiert verabreicht wur~ den₉ eine sehr viel geringere Hypertrophie hervorrufen als die sich durch die Verabreichung von BCG ergebende _o ·

IXIo Empfindlichkeit für Tuberkulin

Die Meerschweinchen werden durch subkutane Injektionen des vollständigen Freund⁸sehen Adjuvans (ACF) oder des unvoll· ständigen Freund⁸sehen Adjuvants _s das BCGj, M._osm_o oder M₀k₀ (vollständige Zellen^ die durch Phenol abgetötet worden sind) enthalten_P sensibilisiertc

»o

Die Empfindlichkeit der Meerschweinchen wird 21 Tage später dadurch bestimmt ₉ daß man ihnen über die Haut entweder Tuberculin (100 oder 300 internationale Einheiten) oder verschiedene Mycobakterien-Präparate (10^ 30 oder 100/Ug) verabreichte Es wurde festgestellt₉ daß die durch Lösungsmittel von Lipiden befreiten Zellen oder die Zellwände sehr viel geringere Reaktionen hervorrufen als die vollständigen Zellen^ oder das vollständige Freund⁵sehe Adjuvans_o

IV₀ Pyrogene Wirkung,,

Es ist bekannt^ daß eine Vielzahl von Bakterien bei geringsten Dosierungen die' Temperatur des Kaninchens erhöhen,. Es genügt zum Beispiel 1/100 mg Endotoxin zu injizieren^ um ein signifikantes und konstantes Ansprechen des Tieres zu erreichen«, Unter diesen Bedingungen zeigen sich die in Dosierungen von 5/Ug verabreichten Zellwände frei von einer pyrogenen Wirkung,, wobei festgestellt wurde_s daß eine Dosis

3 0 3 8 4 9/1130

von 100/Ug zu einer Reaktion führt, aus der ersichtlich ist;₉ daß die erfindungs gemäß en Produkte um den Faktor 10 000 weniger pyrogen sind als ein aus Escherichia coli extrahiertes Endotoxin_ffl

V® Empfindlichkeit gegen Histamine

Es ist eine anerkannte Tatsache ₉ daß Tiere_s denen die Nebennieren entfernt wurden sowie Tiere^ die zuvor mit Bordetella pertussis behandelt wurden_s sehr empfindlich gegen Endotoxine und Histamin sind₀ Von AdIaTn₅, Broughton und Scott wurde gezeigt^ daß ein Stamm von Corynebacterium parvunij, der eine Hilfswirkung zeigt und der in der Lage ist₉ die Resistenz der Tiere gegen Tumore und parasitäre oder bakterielle Infektionen zu steigern^ die Maus für Histamin empfindlich macht "(Nature New Biology_P 1972₉ 255, 219)„ Diese Resistenz= verminderung zeigt sich sehr deutlich 7 Tage nach der Injektion der Bakterien, was einen erheblichen Nachteil bei therapeutischen Anwendungen dieser Produkte darstellte Munoz und Suter (Proc_o Soc_o 63φ₀ BIoI₀ Med„ ₉ 1963_S 114₉ 211) haben demgegenüber beobachtet^ daß BCG zusammen mit Bordetella pertussis die Tiere nicht gegenüber Histamin und" dem passi= •wen anaphylaktisehen Schock empfindlich macht_o Es wurde _s wie im folgenden weiter erläutert werden wirdj, festgestellt ₉ daß diese günstige Eigenschaft bei den erfindungs gemäß en I«^rco= bakterien-Präparaten beibehalten ist₀

Hierzu wurden Histamine in wachsenden Dosierungen an Gruppen von 8 oder 10 Mäusen des Stammes Swiss verabreicht _v die 7 Tage zuvor "(J-7) mit BCG und in der folgenden Tabelle IV angegebenen Macobakterien-Präparaten in Dosierungen von 1 mg "behandelt wurden_o Alle Injektionen §rfolgten auf intravenösem Wege«, Unter den gleichen Bedingungen wurde eine Gruppe von normalen Vergleichstieren und eine Gruppe von Tieren, denen

3098AS/1130

die Nebennieren entfernt worden waren;, 48 Stunden vor der Testinjektion behandelt,. Wie aus der folgenden Tabelle IV ersichtlich ist₉ sind die Tiere^ die mit den erfindiangsge= mäßen Mycobakterien=Präparaten behandelt worden waren ₅ für Histamin nicht empfindlicher geworden, obwohl die DL 50 sich nach der Entfernung der Nebennieren um'den Faktor 30 verringert hat_o In der Tabelle ist das Verhältnis der Anzahl der gestorbenen Tiere ₉ bezogen auf die Gesamtanzahl der Tiere jeder Gruppe für jede Histamindosis angegebene

TABELLE IV

-

Behandlung

' 1 mg Iv

0,25

Histamindosis

0,5

1

2 ·

(mg)

8

I

16

DL 50 (mg)

0

1 mg Iv

5/8

■12/15

13/15

7/8

JL--

3/8

8/8

•9,2 ■

O 0

O C© OO -P- CO

Normale Vergleichstiere Mäuse, denen die Nebennieren entfernt worden waren

1 mg Iv

0/10.

0/18

0/8

1/5

^8

—*

BCG

1 mg Iv

0/6

4/7

7/7

7,4

BCG a, ae8 c

1 mg Iv

0/8

1/8

8/8

10

M.sm. a, aes e

0/10

0/9

1/8

0/8

7/8

13

Mak. a9 ae9 c

0/10

0/10

0/8

2/6

6/6

9,2

2325299

Niko par«

0/6

B) Nachweis der Antitumorwirkung der erfindungsgemäßen Sub= stanzen_o .

Es ist "bekannt ₉ daß die Mycobakterien die Resistenz des Or« ganismus gegenüber der Lymphleukämie der Maus und des Ehrlich⁸ sehen Wassersuchtcarcinoms steigern,,

Die folgenden Untersuchungen zeigen, die unterschiedlichen Wirkungen von Mycobakterien-Präparaten gegen eine Lymphleukämie und gegen das Ehrlich⁵sehe Carcinom_o

Ig Experimentelle Lymphleukämie₀

Die antitumorale Wirkung wurde gegenüber einer Lymphleukämie bestimmt,, die auf intraperitonealem Wege auf Hybride F1 (C57B1/6 X AKR) übertragen worden war₀ Diese Leukämie,,die spontan auf eines dieser Hybriden übertragen worden ist₉. ist isogen und nicht auf andere Mäusestämme übertragbar einschließlich der verwandten Stämme„ Die im folgenden erläuterten Untersuchungen wurden unter besonders strengen Bedingungen durchgeführt derart _ΰ daß die angegebenen Ergebnisse als "besonders signifikant bezeichnet werden können_o Bei diesen Untersuchungen wurden die Tiere 8 Tage vor der Inoku-

lation mit 2» 10 Milzzellen_s die von an Leukämie ericrankten Tiere stammten,, auf intraperitonealem Wege (mit einer einzigen Injektion) der Mycobakterien-Produkte in verschiedenen Dosierungen behandelt,, Dann wurde die Anzahl der überlebenden Tiere während 60 -Tagen festgestellte In gewissen Fällen wurden die Tiere während mehrerer'Monate beobachtet ₉ was zeigt _ΰ daß die Tiere _s die 60 Tage überlebt haben_p vollständig geschützt sindo

In der folgenden Tabelle V ist in der ersten Spalte der Tag (J 50 %) angegeben^ bei dem 50 % der Mäuse gestorben waren_s in der zweiten Spalte ist die mittlere Überlebenszeit der be-

handelten Tiere. angegeben, wobei die Dauer von 60 Tagen den Tieren zugeschrieben wurden^ 'die nach Ablauf der Untersuchung noch lebten; in der dritten. Spalte ist die Anzahl der überlebenden Tiere am 60„ Tag nach der Übertragung der Leukämie und in der vierten Spalte der Abstand zwischen dem Tag des ersten und des letzten beobachteten Todesfalls der Mäuse angegeben, die weniger als 60 Tage überlebt haben_e

Aus dieser Tabelle ist zu ersehen_P daß die Bakterienprodukte, die durch Behandlung der abgetöteten Mycobakterien erhalten wurden, insbesondere aus Mycot)acterium kansasii_s eine Wirkung entfalten^ die mindestens in der gleichen Größenordnung liegt wie die der ganzen Zellen^ derart_P daß sie einen erheblich besseren-therapeutischen Index aufweisen«, wenn man die erheblichen, weiter oben angegebenen Unterschiede der Toxizität der erfindungsgemäßen Mittel und der der voll- . ständigen abgetöteten Zellen in Betracht zieht_o

Das gleiche trifft auf die Zellwände zu_r die aus Bakterienprodukten gewonnen, wurden^ die durch Behandlung der vollständigen Zellen unter den oben angegebenen Bedingungen mit den "vier Lösungsmitteln" erhalten wurden«, · Es ist insbesondere festzustellen,. daß die Zellwände, die einem weitaus reineren Produkt entsprechen^ ihre antitumorale Wirkung in wäßriger Phase nicht verloren haben«, Diese Wirkung wird beträchtlich verstärkt^ wenn diese Zellwände in Suspension in Bayol (das, wenn es als solches an die Vergleichstiere verabreicht wird, keinerlei Wirkung entfaltet) verabreicht werden. Festzuhalten ist^ daß die maximale Wirkung bei Dosierungen von 100/Ug beobachtet wird, welches Dosierungen sind, bei denen die Zellwände praktisch frei von toxischen Wirkungen sind, wie sich aus den oben angegebenen Untersuchungen ersehen läßt.

309849/1130

TABELLE V

Schutz gegen die auf die Maus übertragende Lymphleukämie

mit Bayol behandelte Ver=

BCG

Me

J 50' %

25

24

35 51 42

51

30 /Ug 37 100 Vug 34 300 Vug 31

10

30 Vug
100 Vug
300 '-"β"

100 /Ug >60

3Ö0 Vug 48

1 /_mg 54·

10

30

100 300

io J*-ο

10 /Ug

30 Vug

100 Vug

29 30 39 44

27 44

mittlere

Uberlebungs-

zeit

46₉2 44,4 46,5

>46,3

> 43V1

>54₉8

>34_P7 >35₉7 1

>38_S6 >5O_P6

36

Tiere, die mehr als 60 Tage überlebt haben

1/58,

0/7

7/26 ■
/49
16/48
12/28

5/10
3/10
1/10

8/10

3/9

4/9

4/20
3/20
8/20
1/10

1/10
5/10
8/10

Zeitraum

21-30

16=29

22=46 21=53 23-53 26-60

25-37 30-50 26-48

32-36 23-50 32-54

24-34 25·-48 25-51 32-46

24-58 32-44 27-29

TABELLE V (Portsetzung):

J 50 %

mittlere

Uberlebungs-

zelt

Tiere» di® mehr als 60 Tage überlebt haben

Zeitraum

	M Ir	a pare	--	10 yUg	28	29	0/10	22-41
				30 yUg	29	?33,1	3/20	24-36
				100 yug	33	>34S2	2/20	22-42
ca	Mek	.. paro		300 yUg	. 29	>31,7	2/20	'22-41
CD
co				30 /ug	>60	?52g1	6/10	31-44
.E--		Bayol*	100 yUg	>60	>57	9/10	30
.9/113			- 300 yug	40		4/10	28-41

* In allen anderen Fällen wurden die Produkte in Form einer -Suspension in isotoni=
scher Lösung verabreicht«, '

ΧΧ_β Wirkung auf das Ehrlich-Cäreinom in der Wassersucht-

Untersuchung erfolgte an Hybridmäusen F^ (C57B1/6 X AER) gleichen Geschlechts mit einem Alter von etwa 8 Wochen,, Die Quelle des Ehrlich-Carcinoms wurde durch wöchentliche Übertragung auf diese Hybriden überführte Die Inokulationen er=» folgten auf intraperitonealem Wege in Mengen von iCr Zellen in einem Volumen von O₅ 5 ml ο Diese Behandlungen erfolgten auf gleichem Wege 14 Tage vor der Inokulation_o In gewissen Fällen erfolgte jedoch die Behandlung am 8_O Tage vor der Inokulationo Jede Tiergruppe'- umfaßte 10 Tiere«

Wie bei dem Leukämieexperiment wurden die Untersuchunten am 60_o- Tage nach der Inokulation beendet₉ wobei die gleichen-Kriterien angewandt wurden«, Die mit verschiedenen Bakterien·» produkten erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen YI₃ VII und VIII zusammengefaßte

In den Tabellen VI und VII sind die Ergebnisse angegeben^ die mit vollständigen abgetöteten Zellen (BCG₅ M₀Sm₀₉ M₀k_o) sowie mit den festen Produkten;, die durch Behandeln dieser abgetöteter Zellen mit Aceton erhalten wurden ₉. ermittelt

■wurden« " .

309849/1130

TABELLE VI

J 50 % mittlere über- Tiere, die mehr % Überlebenszeit als 60 Tage über- lebende

lebt haben

Vergleichstiere 18 *2T,1 . 1/40 2,5.

10 /Ug >60 >50„5 7/10 70

" ™ ' 30 W >58 · >52_P8 13/20 65

S 100 W >57 >48,7 16/30 53,3

ο» 200 ^Ug >60 ^54,1 16/20 60

"^ 30 /Ug 44- >46*3 4/10 40

^ Ma sm. 100 '/Ug 50 s>52 4/10 40

300 vug >60 >52p3 6/10 6a

10 /Ug >55 >49,9 12/20 60

30 W >60 >54₉8 19/30 63_S3

M_esm_s a 100 Vug >60 >55_$7 ■ 12/20 6θ

300 Vug >60 >57₉7 14/20 70

Vergleichstiere

Ca) Q

to

BCG a

M₀

	J 50 %	TABELLE VII	Tiere, die mehr als 60 Tage überlebt haben	% Über lebende
Dosis	17	mittlere Über» lebenszeit	0/38	0
	50 49 ■	18,7	5/19 16/39	26,3 41
100/Ug 300^rUg	40	Hill	2/8 4/7	25 5751
300/Ug . 1'mg	31 32	>40P5	5/39 0/27	12,8 0
400/Ug	35 35· 43	30*	1/9 3/18 11/37	11*1 16,6 . 29p7
10OyUg	>46Ρ 95

0 VjJ

OvS CJH CD

CD

TABELLE VIII

Injizierte Produkte Mycobakterien Dosis Trägerstoff

BCG

LO
O
(D

M.k, a_$

par«

k_# par c

M₉ k„ par* pr„

100

300

0 · W

1 ⁷mg

100

300 W

1 'mg

10 /Ug

30 ⁷/Ug

100 ^ug

300 W

1 'mg

10 /Ug 30 W

100

300 y 1 'mg

30
100
300

100 g 300/ug

isotonische Lösung

isotonische Lösung

isotonische Lösung

Bayol

isotonische Lösung

Bayol

J 50 %	mittlere	Tiere, die	% Über
	Überle	mehr als	lebende
	benszeit	δθ Tage über
		lebt haben
20	>21,7	1/78	.1.3
>60	- >51,8	7/10	70
>60	>56	• 9/10	90
>59	>51J7	.23/37	62,2
>52	>52,4	29/50	58
54	>52,1	18/39	, 46,1
>6θ	? 54,7	7/10	70
>60	>56*5	8/10	80
>60	■?57>7	8/10	80
>6θ	>56?8 ·	16/20	80
>60	>56S9	25/30	83,3
20	>25 7	1/10	10
44	>45?8	8/19	42,1
47	>48j2	16/40	40
51	>48,4	23/49	46,9
48	>44?5	12/29	4194
40	>44f6	4/10	40
^60	>47?8	6/10	60
' >60	> 55 j. 3	13/18	72,2
>60	>59,1	9/10	90
VJl	>49?9	4/10	40
19	21	0/10	0
- 23	26,7	0/20	. 0
37	>40,3	6/20	30
32	- >34,3	2/19	10,5
26	>37,4	3/9	33,3
48	>47,6	3/10	30 .
>6θ	758,6	9/10	90

Die'Untersuchungen mit ganzen abgetöteten Zellen zeigen mindestens bei den verwendeten Dosierungen eine gute anti= tumorale Wirkung für BCG und für M₀ sm₀ und eine deutlich ge° ringere Wirkung für M₀ k_o Die mit Aceton behandelten Produkte zeigen^ verglichen mit Keimen^ die nicht mit Aceton behandelt wurden,, eine geringfügig verbesserte Wirkungo Dies ist be= sonders der Fall für die Bakterienprodukte _v die ausgehend von Mycobaterium kansasii erhalten wurden_o Die abgetöteten Zellen sind wenig aktiv_o Die mit Aceton behandelten Zellen führen zu etwas besseren Ergebnissen,, die jedoch noch.nicht zufriedenstellend- sind«,

Aus, der Tabelle VIII läßt sich im Gegensatz dazu entnehmen,, daß die mit den "vier Lösungsmitteln" behandelten Keime in wäßrige Phase von selbst in äußerst geringen Dosierungen eine sehr starke Wirkung entfalten_o Es ist in diesem Zusammenhang von Interesse,, die Ergebnisse zu vergleichen^ die mit aus Mycobacterium kansasii erhaltenen Produkten erzielt wurdeno Bei Dosen von 300/ug führen die abgetöteten Bakterienkorper (Moko) nur zu 12 _ΰ 8 % überlebenden Tieren und die mit Aceton gewaschenen Bakterienkörper ergeben nur 16j,6 % Überlebende bei den Tieren,, die 60 Tage zuvor mit Zellen des Ehrlich= Wassertumors behandelt wurden_o Im Gegensatz dazu überleben 80 % der inokulierten Tiere unter den gleichen Bedingungen 60 Tage^ wenn sie zuvor mit M₀k₀ a^ ae,, C₂ behandelt wurden«,

'In gleicher Weise behalten die Zellwände .von M₀ k₀ in wäßriger Phase ihre Wirkungo Diese Wirkung wird in Gegenwart von Bayol deutlich verstärkt;, was aus der Tabelle VHI zu ersehen ist_o Bei Dosierungen von 100/Ug ergeben sich 72_S2 % Überlebende unter den Tieren,, die zuvor mit den genannten Tumorzellen inokuliert worden sind₀

3 0 9 8 4 9/1130

C) Vergleich der Antitumorwirkung und der Toxizität der verschiedenen untersuchten Mycobakterien-Präparate.

Die verschiedenen oben angegebenen experimentellen Ergebnisse lassen wichtige und überraschende Veränderungen des Verhaltens von Produkten und Extrakten erkennen, die nach Durchführung der oben angegebenen aufeinanderfolgenden Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden.

Wenn man zunächst die mit Hilfe von Phenol abgetöteten Mycobakterienzellen betrachtet, so ist selbst bei sehr geringen Dosierungen eine erhebliche Antitumorwirkung festzustellen. Jedoch ist die Toxizität dieses Produktes, wie die der lebenden Mycobakterien sehr groß, insbesondere im Fall der mit Phenol abgetöteten BCG-Zellen.

Die ausgehend von Mycobakterien unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahrensweisen erhaltenen Produkte zeigen wie es insbesondere aus den pharmakologischen Untersuchungen, die mit dem aus Mycobacterium kansasii extrahierten Produkt durchgeführt wurden, ersichtlich ist,, gleichzeitig eine kaum vorhandene Toxizität und selbst bei sehr geringen Dosierungen eine erhebliche Antitumorwirkung«, So besitzt M„k<, a, ae^ c eine Wirkung gegen die Lymphleukämie (Tabelle V) und gegen das Ehrlich-Carcinom (Tabelle VIII)₅, die gleich oder größer ist als die von BCG, während die Hypertrophie der Milz sehr viel geringer ist als die„ die man beobachtet,, wenn man BCG In gleichen Dosierungen verabreicht (Tabelle III). Gleichzeitig ist die Fähigkeit, die Tiere gegenüber Endotoxinen empfindlicher zu machen, um den Faktor 200 geringer als die von BGG (Tabelle H)₀ Der therapeutische Index von M.k. a₉ ae, C₉ verglichen mit dem von BCG₅, ist damit um 200 größer/

Die gereinigten Zellwandpräparate, die man durch Zerstören der Zellwände und deren Behandlung mit proteolytischen Enzymen erhält, zeigen eine verminderte Toxizität* Diese Derivate von

309849/113

', ZdZoZBB

Mycobacterium kansasil sind etwa 200 mal weniger toxisch als BCG (-Tabelle II) _o Sie "behalten trotz dieser Behandlungen ihre antitumorale -Wirkung beiρ selbst wenn diese auf etwa die Hälfte verkleinert ist (therapeutischer Index von etwa 100)_s Sie erlangen jedoch ihre vollständige Wirkung wieder₉ wenn, man sie in Suspension in einer Emulsion von geringen Mengen Bayol In Wasser verabreichte Die Wirkung dieses Materials wird dann vergleichbar mit der von BCGj, sowohl hinsichtlich der Lymphleukämie (Tabelle Y) wie hinsichtlich des Ehrlich= Carclnoms (Tabelle VIII)_P wobei sie in einer Dosis von 100/Ug in Gegenwart von Mineralöl die Tiere sehr viel weniger empfindlich gegenüber Endotoxinen machen als 100/Ug BCG _P das ohne Öl verabreicht wurde_o

Die durch Behandlung der von Lipiden befreiten zerbrochenen Zellwände der genannten Zellen mit Pronase erhaltenen' Pro= dukte_s finden besonderes Interesse ₉ da sie frei von jeder Tuberkulinwlrkung sind_o Es wurde festgestellt _v daß die Behandlung der Zellwände von Mycobakterien mit Pronase die antitumorale Wirkung dieser Produkte nicht verschwinden läBto In diesem Fall führt die Zugabe von Bayol in sehr ge» ringen Dosierungen (1 bis 10 %) zu einer beträchtlicher Stei= gerung der antltumoralen Wirkung der mit Pronase behandelten Zellwände (Tabelle TIII)₀

Erfindungsgemäß werden damit besonders Interessante Arznei= mittelwlrkstoffe bereitgestellt_p die als Heilmittel oder als prophylaktische Mittel für die folgenden Indikationen .ver= wendet werden können?

Ί) Heilbehandlung g

Alle malignenTumorens, gleichgültig welchem Ursprungs (EpI= ■thellal-j, Bindegewebstumorenj, gemischte Tumor&₉ hämatopoetl= ache Tumore etc) und welchen.Entwicklungsstadiumss

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Vor jeder Behandlung,

nach einer klassischen Behandlung (Chirurgie„ Bestrahlung oder Chimiotherapie) durch die die Hauptmenge des Tumors' vermindert oder zum Verschwinden gebracht wurde ₉

nach Rückfällen oder Metastasenbildung und

in jedem anderen Zustand« = .'

Außer den "festen" Tumoren können alle malignen Hämopathien und Lymphoreticulosen im allgemeinen Sinne des Wortes und unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben behandelt werden, gleichgültig ob sie leukämisch oder aleukämisch sind oder ob ein Tumor der hämatopoetischen Organe vorliegt oder nicht* Hierunter fallen auch alle ähnlichen Erkrankungen, wie Hodgkin^ssche Krankheit, die Brill-Symmers-Krankheit_s die Kaposi-Krankheity die Kahler-Krankheit^ die Waldenström-Krankheit, Macroglobulinämien etc

2) Vorbeugende Behandlung - .-

Die vorbeugenden Behandlungen erfolgen insbesondere an Pa-'tieirfcen, die aus verschiedenen Gründen einem Befall durch maligne Tumors!besonders stark ausgesetzt sind_s wie Z₀B₀

starken Rauchern„

chronischen,Alkoholikern (Lebercirrhosen und Leberkrebs^ Speiseröhrenkrebs etc»)

Träger von präcancerösen Schaden (z_oB_o von Epitärwucherungenj, von gewissen Haut Schädigung en ₉ von Polypbildungen im Rektum

Personeng die aus beruflichen Gründen Strahlungen_s Asbest= staub etc«, ausgesetzt sind_o

Die Durchführung dieser vorbeugenden Behandlung kann in brei tem Maßstab durchgeführt werden^. Z₀B₀ beginnend mit einem ge

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.wissen Alter oder wenn die Xmmunbarrieren (insbesondere die Zellenimmunität) nicht mehr ausreichte

Die Erfindung "betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen _P die aus sterilen Suspensionen der Produkte bestehen_P die durch Behandlung von Zellen von abgetöteten Mycobakterien oder analogen Bakterien mit den oben angegebenen "vier Lösungsmitteln" erhalten wurden und die in den angegebenen Do= sierungen in einem sterilen pharmazeutischen verträglichen wäßrigen Medium,, das frei von jedem: Öl ist«, mit der Impf= pflanzette oder durch intradermale₉ subkutane oder parenteral« Injektion verabreicht werden,, ' '

Die Erfindung betrifft insbesondere pharmazeutische Zusammen= Setzungen^ die sterile Suspensionen der Produkte enthalten«, die durch Behandlung von aufgebrochenen Zellwänden von My eobakterien oder analogen Bakterien mit proteolytischen Enzymen insbesondere Chymotrypsin^. Trypsin oder gegebenen=· falls' Pronase erhalten wurde und die die Wirkstoffe in Ekaul·= sionen. von pharmazeutisch verträglichen Ölen in ebenfalls pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Trägermaterialien eat° halten^ wobei die erhaltenen Suspensionen auf den oben amge~ gebenen Verabreichungswegen an die Patienten verabreicht den

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Produkte in Dosi©- rimgen verwendet werden^ die den Dosierungen entsprechen«, die sich ergeben^ wenn man von 0₉1 bis 20 mg₀ insbesondere, von 2 bis 10 mg lebenden'Zellen von Hycobakterlenj, Hocardia oder analogen Bakterien ausgehto ·

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   lly Verfahren zur Herstellung eines nicht-spezifischen Mittels zur Reizung der Antitumorimmunitätj dadurch gekennzeichnetj, daß man einen Mikroorganismenstanim vom Typ der Mycobakterien oder Nocardia züchtet^ die Zellen des gezüchteten Stammes abtrennt,,, diese Zellen abtötet, die abgetöteten Zellen einer Extraktionsbehandlung mit Aceton, absolutem Alkohol und Äther unterzieht und den festen Rückstand

   2β Verfahren gemäß Anspruch 1 „ dadurch gekennzeichnet«, daß man die Zellen weiterhin einer Extraktionsbehandlung mit Chloroform unterzieht«,

   3o Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2_ff dadurch gekennzeichnet«, daß die abgetöteten Zellen zunächst ©iner Extraktionsbehandlung mit Aceton und dann mit einer Mischung aus absolutem Alkohol und Äther unterworfen werden«,

   4o Verfahren gemäß Anspruch 3₉ dadurch gekennzeichnet _s daß der absolute Alkohol und der Äther in der genannten Mischung in einem Volupenverhältnis von 1 % 1 verwendet werden«

   5«, Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3_S dadurch gekennzeichnetρ daß man als Mikroorganismen Mycöbacterium tuberculosis, var₀ hominis oder bovis_P Mycobacterium. kansasii oder Mycobacterium smegmatis verwendet«,

   6. Verfahren gemäß Anspruch 5_S dadurch gekennzeichn.et_s daß die genannten Mikroorganismen aus dem Stamme Pasteur des Bazillus Calmette-Guerin stammen₀

   y_e Verfahren gemäß Anspruch 6 ₉, dadurch gekennzeich- netg daß die genannten Mikroorganismen dem Stamm 1%-cobacterium smegmatis angehören₀ .

   8. Verfahren gemäß Anspruch 7₉ dadurch gekennzeichnet ₀ daß man den Mikroorganismen-Stamm verwendet₉ der unter der Mr» HBR 21 732 "bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist₀

   9» Verfahren gemäß Anspruch 5_g dadurch gekennzeichnet₉ daß die Mikroorganismen dem Stamm Mycobacterium kansasii an·=

   Verfahren gemäß Anspruch 9₉ dadurch gekennzeichnetj, daß die Mikroorganismen dem Stamm Mycobacterium kansasii P 21 Runyon angehören_o

   11 ο Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10_s dadurch gekennzeichnet^ daß man den erhaltenen festen Rückstand^ der aus von Lipiden befreiten Zellen besteht _ΰ einer Behändlung unterzieht^ bei der die Zellwände dieser Zellen aufgebrochen werden^ worauf man die aufgebrochenen Zellwände mit ©Inem oder mehreren proteolytischen Enzym behandelt und den festen Rückstand gewinnt^ der das genannte Reizmittel aus= machtο

   12o Verfahren gemäß Anspruch 11 ₀ dadurch gekennzeichnet _p daß die aufgebrochenen Zellwände mit Trypsin_p Chymo=

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   trypsin öder beiden Enzymen zugleich behandelt werden,, worauf man das erhaltene feste Produkt gewinnt ₈ das den Wirkstoff darstellte

   13» Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12_S dadurch gekennzeichnet daß man das nach der Behandlung mit den genannten .proteolytischen Enzymen erhaltene Produkt noch alt Pronase behandelt^ worauf man den festen Rückstand gewinntj der den genannten Reizmittelv/irkstoff darstellt₀

   14«, Pharmazeutische Zusammensetzungen^ die mit Hilfe der Impflanzettej auf intradermalem, subkutanem oder parenteralem Wege verabreicht werden können_p dadurch gekennzeichnet ₉ daß sie als Wirkstoff ein Mittel, erhältlich gemäß einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 13 in Suspension in einem "wäßrigen pharmazeutisch verträglichen^ und für die Verabreichung geeigneten Medium enthalten,,

   15s.'- ' Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 13* dadurch .gekennzeichnet, daß der Wirkstoff das Mittel ist_s das man ausgehend von MikroOrganismen des Stammes Mycobacterium kansasii erhalten hat_e

   1βο Pharmazeutische Zusammensetzungen^ die ,mit Hilfe der Impflanzette^ auf intradermalem _t subkutanem oder parenteralera Wege verabreicht werden können_p dadurch gekennzeichnet<, sie als Wirkstoff ein Mittel erhältlich gemäß einem der Sprüche 11 bis 13 in Suspension in einem wäßrigen^ sterilen pharmazeutisch verträglichen Medium enthalten^, das mit einem sterilen^. ebenfalls pharmazeutisch verträglichen Öl emulgiert ist, wobei das Medium und das Öl für den entsprechenden Ver~ abreichungsweg geeignet sind₀

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   17o Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 14j dadurch gekennzeichnet;, daß man als Öl Bayol F verwendet_P das in Mengen von etwa 1 bis etwa 10 %_s bezogen auf das Gesamtvolumen der Emulsion eingesetzt wird₀

   18_e Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17_S dadurch gekennzeichnet^, daß man-als ,Wirkstoff das Mittel verwendet^, das man gemäß einem Ver~ fahren der Ansprüche 1 bis 13 unter Verwendung eines Mikroorganismus des Stammes Mycobacterium kansasii P 21 Runjon erhalten hat_o

   19o Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17_S dadurch gekennzeichnet ₉ daß man, als Wirkstoff das Mittel verwendet^ das bei Durchführung eines Yarfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 unter Einsatz ©ines Mikroorganismus des Stammes Mycobacterium smeginatis erhalten hat_o"

   20_o Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 11 Ms 17_P dadurch gekennzeichnet₉. daß man als Wirkstoff das Mittel venriendet_p. das man gemäß einem ¥er= fahren gemäß der Ansprüche 1 Ms 13 unter Einsatg eines Mikroorganismus eines Stammes des Bazillus Calmette^Guerin erhalten hat_o . - - . ■

   21 ο Baarmazeutisehe Zusammensetzungen gemäß einem öer -. Ansprüche 14 bis 20_s dadurch gekennseichaeti, daß sie Einheits= dosierungeis, iron O₈I bis. 10 mg des Wirkstoffs enthalten-.

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   22. Von .Lipiden befreite Mycobakterienzellen, die Xm wesentlichen frei sind von freien Lipiden, insbesondere· von Glyceriden, Glycolipiden und Lipopeptiden, von Cord-Faktor, Phospholipiden und von Wachs A₀ .

   23» Von Lipiden befreite Mycobakterienzellen, die im wesentlichen frei sind von freien lipiden, insbesondere von Glyceriden, Glycolipiden und Lipopeptiden, von Cord-Faktor, Phospholipiden und von den Wachsen A₉ B₉ C und D„

   24» Pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend als Wirkstoffe von Lipiden befreite Mycobakterienzellen, die im wesentlichen frei sind von freien Lipiden, insbesondere van Glyeeriden, Glycolipiden und Lipopeptiden₉ von Cord-Faktor, Phospholipiden und von Wachs A₀

   25. ' Pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend als Wirkstoffe von Lipiden befreite Mycobakterienzellen, die im wesentlichen frei sind von freien Lipiden, insbesondere von Glyceriden, Glycolipiden und Lipopeptiden, von Cord-Faktor, Phospholipiden und von den Wachsen A, B, C und D.

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