DE3750774T2 - Chaotropisches verfahren zur schätzung von nukleinen säuren in einer biologischen probe. - Google Patents

Chaotropisches verfahren zur schätzung von nukleinen säuren in einer biologischen probe.

Info

Publication number
DE3750774T2
DE3750774T2 DE3750774T DE3750774T DE3750774T2 DE 3750774 T2 DE3750774 T2 DE 3750774T2 DE 3750774 T DE3750774 T DE 3750774T DE 3750774 T DE3750774 T DE 3750774T DE 3750774 T2 DE3750774 T2 DE 3750774T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
probe
nucleic acid
dna
hybridization
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE3750774T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3750774D1 (de
Inventor
David Gillespie
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HAHNEMANN, University of
Hahnemann University
Original Assignee
HAHNEMANN, University of
Hahnemann University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HAHNEMANN, University of, Hahnemann University filed Critical HAHNEMANN, University of
Application granted granted Critical
Publication of DE3750774D1 publication Critical patent/DE3750774D1/de
Publication of DE3750774T2 publication Critical patent/DE3750774T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der analytischen Chemie und Medizin und bezieht sich insbesondere auf ein neues Verfahren zum Untersuchen von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe, wobei die Nukleinsäuren zur Untersuchung durch chaotropes Löslichmachen zur Verfügung gestellt werden. Die Nukleinsäuren werden mittels molekularer Hybridisierung mit einer komplementären Nukleinsäuresonde in der chaotropen Lösung untersucht.
  • Die US-A-4 483 920 bezieht sich auf die Immobilisierung von Boten-RNA auf Filtermaterial durch Löslichmachen von Zellbestandteilen mit einem chaotropen Salz und Hindurchführen der sich daraus ergebenden Bestandteile durch ein Filter.
  • D. Gillespie et al., BioEssays 1 (6): 272-275 bezieht sich auf die Rolle chaotroper Salze bei der Zwei-Phasen-Gendiagnose.
  • R. A. Cox und N. J. Smulian, FEBS Letters 155 (1): 73-79 (Mai 1983) bezieht sich auf ein Ein-Schritt-Verfahren zur Isolierung einzelner mRNA-Arten aus rohen Lysaten von Physarum polycephalum.
  • J. Bresser et al., DNA 2 (3): 243-253 (1983) bezieht sich auf Quick-Blot-Verfahren zum Immobilisieren von mRNA oder DNA auf Nitrocellulose.
  • J. Bresser und D. Gillespie, Analytical Biochemistry 129 : 357-364 (1983) bezieht sich auf ein Verfahren zum quantitativen Binden kovalent geschlossener, zirkulärer DNA an Nitrocellulose.
    • 1. Allgemeine Betrachtungen
  • Gewebe von Patienten werden gebräuchlicherweise auf "Marker" untersucht, welche einen Krankheitszustand anzeigen können. Die Markeruntersuchung kann sowohl ein wichtiger Teil der Anfangsdiagnose eines Patienten sein, als auch eine fortlaufende Messung des Ansprechens eines Patienten auf eine Behandlung und die zukünftige Prognose liefern. Herkömmliche Gewebemarker schließen die Zellmorphologie und den Stoffwechsel, die Anwesenheit gewisser Enzymaktivitäten oder Proteine oder andere Moleküle von biologischer Bedeutung, die Anreicherung oder das Verschwinden derartiger Moleküle usw., ein. Kürzlich hat die Genstruktur einen Marker für gewisse Erkrankungen geliefert (Geever et al., PNAS 78 : 5081-5085, 1981; Orkin et al., N. Eng. J. Med. 299 : 166-172, 1981; Chang und Kan, PNAS 76 : 2886-2889, 1979; Philips et al., PNAS 77 : 2853-2856, 1980).
  • Bis zu dieser Erfindung ist es jedoch verhältnismäßig schwierig gewesen, eine primäre Genaktivierung, d. h. die Anreicherung spezieller Boten-RNA-Moleküle (RNA-Transkription), einfach und wirtschaftlich zu messen. Die bestehenden Verfahren setzen im allgemeinen eine geeignete "Sonde" ein, üblicherweise ein radiomarkiertes DNA-Molekül mit bekannter Nukleotidsequenz, um die Menge einer speziellen (komplimentären) Boten-RNA-Sequenz durch einen "molekulare Hybridisierung" genannten Vorgang zu messen (Gillespie, D., Methods Enzymology 12 B: 641-668, 1968). Derartige Verfahren erfordern üblicherweise zuerst das Reinigen von Boten-RNA aus Zellen oder Geweben, ein teures und mühsames Verfahren. Anschließend wird die molekulare Hybridisierung der gereinigten RNA mit der Sonde bewirkt und kann durch Immobilisieren der RNA an einer festen Oberfläche unterstützt werden (Gilham, P. T., Biochemistry 7 : 2809-2813, 1968; Ponian, M. S. et al., Biochemistry 10 : 424-427, 1971; Wagner, A. F. et al., BBRC 45 : 184-189, 1971; Sheldon, R. et al., PNAS 69 : 417-421, 1972; Saxinger, W. C. et al., PNAS 69: 2975-2978, 1972; Noyes, B. E. und Stark, G. R., Cell 5 : 301 - 310, 1975; Alwine, J. C. et al., PNAS 74 : 5350-5354, 1977; Thomas, P. S., PNAS 77 : 5201-5205). In jedem Fall wird, abgesehen von einer Immobilisierung, von diesen Verfahren eine RNA- Reinigung gefordert.
  • Wahlweise können Zellen auf Mikroskop-Objektträgern oder einer ähnlichen Oberfläche abgeschieden werden und die molekulare Hybridisierung kann an der Boten-RNA in den Zellen ausgeführt werden, eine "molekulare in-situ-Hybridisierung" genannte Technik (Pardue, M. L. und Gall, J. G., PNAS 64 : 600-604, 1969; Brahic, M. und Haase A. T., PNAS 75; 6125-6129, 1978; Angerer, L. M. und Angerer, R. C., Nuc. Ac. Res. 9 : 2819-2840 (1981). Dieses Verfahren kann jedoch zeitraubend und unzuverlässig sein und ist nur brauchbar, wenn der Test an einzelnen Zellen ausgeführt werden kann.
    • 2. Beschreibung der Hintergrundmaterialien A. DNA-Immobilisierung in NaCl
  • Das Folgende ist eine kurze Übersicht der Geschichte der Versuche, DNA auf festen Trägern zu immobilisieren.
  • Seit 1977 hat sich unsere Fähigkeit, DNA zu manipulieren, und unser Wissen von ihrer Struktur in riesigen Sprüngen vermehrt. Dies ist vor allem aufgrund der Technologie der DNA-Immobilisierung und seit kurzem wegen der Fähigkeit, DNA zu sequenzieren, möglich gemacht worden. Seit der ursprünglichen Arbeit über das Binden gereinigter, einzelsträngiger DNA an Nitrocellulose(NC-Membranen durch Nygaard und Hall (Biophys. Biochem. Res. Comm. 12 : 98-104, 1963) und durch Gillespie und Spiegelman (J. Mol. Biol. 12 : 829-842, 1965) ist die DNA-NC auf eine Reihe einfallsreicher und eleganter Wege ausgenützt worden.
  • Eine der einfallsreichsten Erweiterungen wurde von Grunstein und Hogness (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 : 3961-3965, 1975) ersonnen, die entdeckten, wie man Kolonien ganzer Zellen auf NC in einer solchen Weise ausstreicht, daß nur ihre DNA an der Membran haftet, wodurch ein DNA-Abbild der ursprünglichen Kolonie der Membran geliefert wird. Diese "Kolonien-Anhebe"-Technik gestattete das rasche Durchmustern rekombinanter Organismen und brachte den gegenwärtigen Stand des Genklonierens um etwa 5-10 Jahre voran. Dieses Verfahren und andere auf demselben Prinzip beruhende (z. B. Scotto et al., Hepatology 3 : 279-284, 1983) sind jedoch nicht quantitativ, weil die zum Bewirken einer DNA-Denaturierung verwandten Bedingungen (NaOH) die DNA- Immobilisierung stören.
  • Eine der elegantesten Ausdehnungen der DNA-Immobilisierung wurde von Southern (J. Mol. Biol. 98 : 503-517, 1975) erfunden. Er leitete ein Mittel zum Überführen von DNA auf NC her, welche gereinigt wurde und anschließend der Größe entsprechend in Agarose-Gelen fraktioniert worden war. Er war in der Lage, ein DNA-Abbild der gelfraktionierten DNA auf NC herzustellen, welche anschließend auf ausgewählte Sequenzen sondiert werden konnte. Der "Southern-Transfer" oder "Southern-Blot" ist wahrscheinlich die wichtigste Technik, die wir heute außer dem DNA- Sequenzieren zur vergleichenden Genstrukturanalyse besitzen.
    • B. RNA-Immobilisierung in NaCl
  • Das Folgende ist ein kurzer Überblick über die Geschichte der Versuche, RNA auf festen Trägern zu immobilisieren.
  • In frühen Arbeiten zur DNA-Immobilisierung berichteten Gillespie und Spiegelman (J. Mol. Biol. 12 : 829-842, 1965) kategorisch, daß RNA nicht an NC bände. Einige Jahre später berichtigten DeLarco und Guroff (Biochem. Biophys. Res. Comm. 50 : 486-492, 1973) diesen irrtümlichen Schluß durch Immobilisieren von RNA an NC, indem sie sehr konzentrierte NaCl-Lösungen verwendeten, um dies auszuführen. Sie nahmen an, daß nur gewisse RNA-Moleküle an NC haften, insbesondere RNA-Moleküle, die ein Endstück aus Adenosin-Resten, den sogenannten "Poly(A)- Schwanz", trugen. Alle RNA-Moleküle mit genügend langen Poly(A)-Schwänzen (hierin auch als "Poly(A)-plus-RNA" bezeichnet) können in konzentriertem NaCl an NC binden. So weit wir wissen, waren alle diese polyadenylierten RNA-Moleküle Boten-RNA, die zum Kodieren auf Proteine befähigt ist. RNA-Moleküle, denen Poly(A) fehlt (hierin auch als "Poly(A)-minus-RNA" bezeichnet), schienen mit NC in konzentriertem NaCl nicht in Wechselwirkung zu treten. Das meiste dieser Poly(A)-minus-RNA ist Ribosomen- RNA und Transfer-RNA, die nicht-kodogene RNA-Arten sind, obschon einige Prozent der Poly(A)-minus-RNA "schwanzlose" Boten- RNA ist. Deshalb war das Verfahren mit konzentriertem NaCl zum Binden gereinigter RNA an NC für Boten-RNA selektiv, schloß aber nicht alle Boten-RNA-Arten ein.
  • In den mittleren und späten 1970ern wurden mehrere Träger zum Immobilisieren von mRNA beschrieben (siehe Seed, B., Genetic Engineering 4 : 91-102, 1982, zu einer Übersicht). Dies waren Abhandlungen verschiedener Art, die reaktionsfähige Gruppen zeigten, an welche reine RNA kovalent gebunden werden konnte. Diese Papiere waren für mRNA oder selbst für RNA nicht selektiv, da DNA und Proteine ebenfalls an die reaktiven Gruppen gebunden werden können. Diese besaßen jedoch den Vorteil, daß alle RNA-Moleküle, nicht nur eine ausgewählte Population, an ihnen immobilisiert werden konnte.
  • 1979 berichtete Pat Thomas von einer wichtigen Beobachtung. Sie bemerkte, daß denaturierte RNA jeder Art in konzentrierten NaCl-Lösungen auf NC immobilisiert werden konnte (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 : 5201-5205, 1980). Sie nützte diese Beobachtung aus, indem sie das RNA-Analogon des Southern-Transfers entwickelte, ein Verfahren, das ganz natürlich "Northern Transfer" genannt wurde. Pat Thomas Arbeit führte eine neue Erklärung für die Ergebnisse von DeLarco/Guroff ein; und zwar, daß die RNA, die in konzentriertem NaCl an NC gebunden war, dies nicht über ihren langen Poly(A)-Schwanz tat, sondern natürlich weil sie denaturierter als RNA mit kurzem oder ohne terminalem Poly(A) war.
  • Unglücklicherweise hat sich die Northern-Transfer-Methodik nicht zur Immobilisierung von mRNA aus ganzen Zellen oder anderen natürlich erzeugten biologischen Quellen geeignet. White und Bancroft (J. Biol. Chem. 257 : 8659-8572, 1982) konnten ein Verfahren zum Immobilisieren ganzer RNA aus cytoplasmatischen Extrakten auf der Grundlage des Denaturierungsverfahrens von Pat Thomas entwickeln, es hat sich aber nicht verbreitet, wahrscheinlich wegen der enormen Probleme, die sich durch die Protein-Koimmobilisierung und die drängende Frage, wieviel denaturierte DNA koimmobilisiert, stellten. Ein kleiner Fortschritt wurde gemacht, als erfahren wurde, daß Natriumdodecylsulfat DNA-NC- und Protein-NC-Wechselwirkungen unterdrückt, aber mRNA-NC-Wechselwirkungen nicht stört (Bresser et al., DNA 2 : 243-254, 1983), aber die Techniken auf der Grundlage selektiv durchgängiger Detergenzien haben ebenfalls keine verläßliche mengenmäßige Bestimmung erreicht und sind alle auf die Verwendung kleiner Mengen Zellmaterial beschränkt.
  • Alle vorstehend beschriebenen Verfahren hängen von NaCl-geförderten Wechselwirkungen zwischen NC und DNA oder RNA ab. In allen diesen Fällen mußte die Nukleinsäure an der NC durch Zusammenkleben bei hoher Temperatur "fixiert" werden. Folglich war an NC adsorbierte RNA biologisch inaktiv - sie konnte nicht revers transkribiert oder translatiert werden.
  • Gillespie et al. beschreiben im am 20. November 1984 erteilten US-Patent Nr. 4 483 920 ein Verfahren zum direkten Immobilisieren einer mRNA aus Zellen auf Filterpapier, wobei Zell-mRNA mit einem chaotropen Salz löslich gemacht wird, und auf einem Filter, welches mRNA selektiv bindet, in einem wahlfreien Schritt des Zusammenklebens immobilisiert wird.
  • Die auf diese Weise immobilisierte Ziel-mRNA wird anschließend mit einer markierten DNA-Sonde hybridisiert.
  • Cox et al., FEBS LETTERS, Bd. 155, Nr. 1, 73-80 (Mai 1983) beschreiben ein Ein-Schritt-Verfahren zur Isolierung einer besonderen mRNA aus rohen Lysaten von Physarum polycephalum, die durch Löslichmachen mit unter anderem Guanidiniumisothiocyanat freigesetzt wurde, durch Hybridisierung mit komplementärer DNA, die durch Binden an Aminotriophenolpapier immobilisiert worden ist. Auf diese Weise wurden nicht nur die Poly(A)-Schwänze, sondern auch die Kodierungsregion der mRNA durch molekulare Hybridisierung in dem rohen Guanidiniumisothiocyanat-Lysat isoliert.
  • Strayer et al., PNAS, Bd. 80, S. 4770-4774 (August 1983) offenbaren eine molekulare Flüssig-Flüssig-Hybridisierung chaotrop löslichgemachter DNA, wo die Hybridisierung in der chaotropen Lösung bewirkt wird. Die Duplexregionen erniedrigten den Auftrieb des DNA-Komplexes in direktem Verhältnis zum Längenverhältnis der doppelsträngigen zu den einzelsträngigen Elementen und erlaubte dadurch die Analyse der DNA mittels eines NaI- Gradienten.
  • Kohne, Internationale Anmeldung Nr. WO 84/02721, veröffentlicht am 19. Juli 1984, offenbarte ein Verfahren zum mengenmäßigen Bestimmen und Nachweisen RNA-haltiger Organismen, welches das Löslichmachen der Nukleinsäure des Organismus und Sondieren der löslichgemachten Nukleinsäure mit einer markierten Sonde umfaßte, welche zu der Nukleinsäure komplementär war, wobei die Hybridisierung in Lösung ohne Reinigen der RNA-Probe bewirkt wurde. Auf Seite 34 schlägt Kohne das Verwenden eines chaotropen Mittels als löslichmachendes Mittel vor. Kohne benützt eine Hybridisierung "in Lösung", d. h., sowohl die Sonde als auch die RNA-Probe befanden sich in Lösung.
  • Cox et al., Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 127 327 A1, veröffentlicht am 5. Dezember 1984, offenbaren einen Test für Nukleinsäuren, der eine chaotrop löslichgemachte Zell-Nukleinsäure umfaßt und wobei eine molekulare Hybridisierung in der chaotropen Lösung ausgeführt wird, wobei eine zu der Zielnukleinsäure komplementäre markierte Sonde verwendet wird. Während alle von Cox et al. offenbarten Beispiele auf die heterogene Hybridisierung mittels einer immobilisierten, markierten Sonde gerichtet sind, schlagen Cox et al. auf Seite 7, Zeile 18 vor, daß die Hybridisierung "homogen" sein könnte. Es werden keine homogenen Hybridisierungsparameter offenbart.
  • Vor dem wirksamen Datum dieser Erfindung hat jedoch ein anhaltendes Bedürfnis nach dem Vorliegen eines Mittels zum Untersuchen der Nukleinsäure einer biologischen Probe bestanden, das die molekulare Hybridisierung zwischen einer markierten Nukleinsäuresonde, die zu der Nukleinsäureprobe komplementär ist, und der Nukleinsäureprobe gestattete, welches keine vorherige Reinigung und/oder Immobilisierung der löslichgemachten Nukleinsäureprobe erforderte.
  • Noch wichtiger war, daß ein Bedürfnis nach einem Verfahren zum Untersuchen zellulärer Nukleinsäuren weiterbestanden hatte, welches an eine klinische Verwendung angepaßt ist. Ein derartiges Verfahren muß die Genauigkeit und Empfindlichkeit der vorstehend zitierten technischen Verfahren behalten, wenn es im Forschungslaboratorium verwendet wird. Die klinische Anpassung verlangt jedoch zusätzliche Geschwindigkeit, Einfachheit/Verläßlichkeit, Wirtschaftlichkeit, Vielseitigkeit und Automatisierbarkeit.
    • Geschwindigkeit
  • Ein idealer klinischer Test sollte in 30 Min., d. h. während des Besuches eines Patienten von außen in der Praxis des Arztes, durchgeführt werden. Mindestens sollte ein Gen-Diagnosetest schneller sein als konkurrierende Kultur, immunologische oder biochemische Tests. Praktischerweise ist ein Ziel von 2-3 Stunden für den Abschluß eines Gen-Diagnosetests von den meisten Handelshäusern aufgestellt worden.
    • Einfachheit/Verläßlichkeit
  • Ein klinischer Test sollte von einem Laboratoriumstechniker ohne Abschluß einer weiterführenden Schule ausgeführt werden können. Das Verfahren sollte nicht durch gewöhnliche Schwankungen der Temperatur, Zeit, Volumina, Probenzusammensetzung usw., die in einem klinischen Laboratorium erwartet werden, gestört werden. Das Verfahren sollte einfach genug sein, um automatisiert zu werden.
    • Wirtschaftlichkeit
  • Ein an die Klinik angepaßter Diagnosetest muß so wirtschaftlich sein, wie der Test, den er auf dem klinischen Markt ersetzt, typischerweise unter zehn Dollar je Test.
    • Vielseitigkeit
  • Ein Gen-Diagnoseverfahren sollte auf einen breiten Bereich "schmutziger" klinischer Proben, einschließlich Blut, Urin, feste Gewebe, Stuhl, Abstriche usw., die Viren, Zellen, Mikroorganismen usw. enthalten, anwendbar sein.
    • Automatisierbarkeit
  • Alle oder ein Teil der Gen-Diagnoseverfahren wird in klinischen Laboratorien maschinell ausgeführt. Ein derartiges Verfahren besitzt ein Mindestmaß an Schritten und wird bei ungefähr Raumtemperatur ohne ätzende oder toxische Lösungsmittel oder Lösungen ausgeführt. Ein derartiges Verfahren vermeidet mühsame Verfahren, wie etwa Zentrifugieren und Gelelektrophorese.
  • Die klinische Anwendbarkeit fordert, daß alle vorstehenden Eigenschaften zu einer Laboratoriumsgenauigkeit und -empfindlichkeit hinzukommen. Nach unserer Kenntnis nimmt der Stand der Technik nicht vorweg, wie dies gemacht werden kann.
    • C. Messung der HIV-Belastung in Patienten
  • Bei AIDS-Patienten wurde gefunden, daß sie Antikörper besitzen, die mit HTLV-I kreuzreagieren (Essex et al., Science 220 : 859 (1983)). Später wurde ein neues Virus, HIV oder HTLV III/LAV (AIDS-Virus) entdeckt (Barre-Sinoussi et al., Science 220 : 868 (1983); Povovic et al., ibid. 224 : 497 (1984)) und es wurde gezeigt, daß AIDS-Patienten Antikörper gegen verschiedene Proteine des AIDS-Virus besitzen (Sarngadharan et al., Science 224: 506 (1984); Kalyanaraman et al., Science 225 : 321 (1984)). AIDS-Patienten tragen AIDS-Virus-DNA-Sequenzen in den Zellen (Hahn et al., Nature 312 : 166 (1984); Shaw et al., Science 227: 177 (1985) und in Gehirnzellen (Shaw et al., Science 227 : 177 (1985). Sehr wenige Lymphocyten können das AIDS-Virus enthalten (Hahn et al., Nature 312 : 166 (1984); Shaw et al., Science 226: 1165 (1984); Shaw et al., Science 227 : 177 (1985)). Das Virus ist für T-Helferzellen zytopathisch, kann aber durch andere Blutzellen ohne Zellysis mitgeführt werden (D. Morgan und J. Levy, persönliche Mitteilung).
  • Kürzliche Schätzungen legen nahe, daß 1 Lymphocyt in 10&sup4; oder weniger infiziert sein kann. AIDS-Virus-Isolate aus unterschiedlichen Personen können eine genomische Verschiedenartigkeit zeigen (Wong-Staal et al., Science 229 : 759 (1985)). Das AIDS-Virus ist genetisch mit dem Lentivirus verwandt (Chiu et al., Nature 317 : 366 (1985)), und wie Lentiviren ist es zumindest in T4-Zellen zytopathisch. Da Lentiviren einer Immunüberwachung entrinnen können, betonen Chiu et al. "die Herausforderung, welche diese sich rasch entwickelnden Retroviren bei der Verhütung und Kontrolle der mit ihnen verbundenen Krankheit darstellen".
  • Viele Laboratorien und Handelsfirmen versuchen HIV-Nukleinsäuren in AIDS-Patienten zu messen. Cherman, Gallo, Volsky und andere haben Klone von HIV-Genen zur Verwendung als Sonden hergestellt. Messungen von HIV-Nukleinsäuren sind auf die Reinigung von RNA oder DNA aus Zellen folgend gemacht worden, die in vitro mit Virus infiziert wurden und aus Blutzellen, aber diese Techniken sind weder rasch noch einfach genug, um routinemäßig bei klinischen Proben verwendet zu werden. Der Nachweis von HIV-RNA ist durch In-situ-Hybridisierung, gefolgt von der Abscheidung von Blutzellen auf Mikroskop-Objektträgern durchgeführt worden (Shaw et al., Science 227 : 177 (1985). Dieser Weg wird von ENZO Biochemicals, ONCOR und DuPont in der Form im Handel erhältlicher Kits oder Sonden gezeigt; es ist jedoch offensichtlich, daß dieser Weg nicht die Einfachheit oder Verläßlichkeit bietet, die von einem klinisch wertvollen HIV-Test gefordert wird. Es gibt weder einen überzeugenden Beweis, daß die In-situ-Hybridisierung HIV mengenmäßig messen kann, noch daß ein Bestätigungstest für Fälle anscheinend positiven Nachweises besteht. "Punkt-Blots" sind zum Messen von Virus-RNA oder -DNA in infizierten Zellen ohne Nukleinsäurereinigung verwendet worden. RNA kann aus lysierten Zellen in NaI, GuSCN, Formaldehyd/SDS oder SDS selektiv immobilisiert werden, die Wirksamkeit der RNA-Immobilisierung schwankt jedoch. Die Hybridisierung mit immobilisierter Nukleinsäure-RNA ist verhältnismäßig langsam. Ein weiterer Mangel der Immobilisierung von Nukleinsäuren aus rohen Lysaten ist, daß die Mitimmobilisierung von Proteinen die Hybridisierung stört. Alles in allem hat diesen Immobilisierungswegen, sei es mittels Lysaten oder gereinigten Nukleinsäuren, die Empfindlichkeit, welche von einem klinisch wertvollen HIV-Test gefordert wird, gefehlt. Cetus hat die Strategie der Zielverstärkung eingesetzt, aber derzeit kann diese nur mit gereinigten Nukleinsäuren ausgeführt werden und verlangt gegenwärtig ein DNA-Ziel.
  • Die jetzigen Tests zum Nachweis des HIV-Virus sind ein Kokulturverfahren. Mononukleäre Blutzellen aus AIDS-Patienten werden zusammen mit empfindlichen Indikatorzellen, üblicherweise PHA- stimulierten Lymphocyten aus normalen Freiwilligen, kultiviert. Nach 1-3 Wochen Kokultur wird in das Medium freigesetzter Virus durch Messen der reversen Transkriptase oder des Virusantigens bestimmt. Die Empfindlichkeit der gegenwärtigen Kokulturtests ist nicht bekannt. Schwankung in der Isolierungshäufigkeit aufeinanderfolgender Kulturen oder gewisser Patienten ist beobachtet worden. Diese Schwankung könnte mit der Empfindlichkeit unterschiedlicher Donorzubereitungen von Humanlymphocyten auf die Infizierung mit HIV verwandt sein (T. Folks et al., J. Immunol. 136 : 4049 (1985)). Es ist noch nicht möglich, die Virusbelastung mit dem Kokulturtest mengenmäßig zu bestimmen.
  • Die Arbeiten befinden sich bei Abbott und DuPont und anderen im Fortschritt, um einen direkten Test auf HIV-Antigene im Serum von ARC/AIDS-Patienten zu entwickeln. Bei Abbott an ARC/AIDS- Proben ausgeführte Tests zeigten nur 50% Positivität bei dem direkten Test. Es kann außerdem erwartet werden, daß direkte Antigentests durch die gleichzeitige Anwesenheit geringer Mengen Antikörper in ARC/AIDS-Patienten, die Komplexe mit dem Antigen bilden und aus dem Blut gespalten werden, kompliziert werden (J. Goudsmit et al., The Lancet, Samstag der 26 Juli, S. 177-180 (1986))
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen und/oder mengenmäßigen Bestimmen einer Zielnukleinsäure in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren
  • A. das Löslichmachen der Nukleinsäure der biologischen Probe durch Zusammenbringen der biologischen Probe mit einem chaotropen Salz, wodurch eine Lösung einer in Lösung gebrachten Nukleinsäure hergestellt wird,
  • B. das Inkubieren dieser Lösung einer in Lösung gebrachten Nukleinsäure mit wenigsten einer Nukleinsäuresonde, die zu wenigstens einem Teil der in Lösung gebrachten Nukleinsäure komplementär ist, unter Bedingungen, welche die molekulare Hybridisierung zwischen der Sonde und der in Lösung gebrachten Nukleinsäure fördern; und
  • C. das Nachweisen der molekularen Hybridisierung umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit eine bedeutsame Verbesserung in der Krankheitsdiagnose bereit. Die Erfindung beruht auf einem Verfahren zum Immobilisieren von mRNA aus einer biologischen Quelle, welches einfach, rasch und genau ist. Grob gesagt bezieht sich dieses Verfahren auf ein Verfahren zum Immobilisieren von RNA, wobei das Verfahren die Schritte des
  • A. Lösens einer biologischen, RNA enthaltenden Quelle durch Zusammenbringen der biologischen Quelle mit einer Lösung eines chaotropen Salzes; und
  • B. das Filtrieren der auf diese Weise gelösten biologischen Quelle durch ein Filtermaterial, welches die mRNA selektiv immobilisiert,
  • umfaßt.
  • Die Erfindung ist hinsichtlich der bestehenden Methodik sehr vorteilhaft, welche wie zuvor erwähnt einen Reinigungsschritt erfordert und anschließend getrennt davon einen Immobilisierungsschritt erfordert. Durch die vorliegende Erfindung wird eine RNA enthaltende biologische Quelle, wie etwa Zellen, zuerst in einer Lösung eines chaotropen Salzes aufgelöst, was eine Lösung der mRNA und des Rests des Zellmaterials bildet. Indem anschließend die Lösung des Zellmaterials durch ein Filter filtriert wird, wird die mRNA selektiv immobilisiert und auf den Rest des Zellmaterials wird dementsprechend durch Hindurchgehen durch das Filter verzichtet. Somit ist ein großer Vorteil der Erfindung, daß der Immobilisierungsschritt an sich auch der Reinigungsschritt ist. Es ist keine Trennung des Reinigungsschritts vom Immobilisierungsschritt erforderlich.
  • Die Tatsache, daß der Immobilisierungsschritt auch der Reinigungsschritt ist, stellt einen wichtigen Fortschritt dar, was das Vereinfachen und Verbessern bestehender Verfahren betrifft. Gewöhnliche biologische Proben müssen ausführlich gereinigt werden, um mitimmobilisierende Verunreinigungen zu entfernen, so daß die Immobilisierung eines gewünschten Bestandteils überhaupt stattfinden kann. In der vorliegenden Erfindung führt jedoch die Verwendung einer Lösung eines chaotropen Salzes zum Auflösen biologischer Proben zu dem interessierenden Bestandteil, wobei RNA (oder DNA, wie nachfolgend erklärt wird) selektiv an einem immobilisierenden Filtermaterial immobilisiert wird.
  • Unter "selektivem Immobilisieren" von RNA aus einer gelösten RNA-Quelle wie etwa Zellen oder Bakterien wird verstanden, daß der Hauptteil des Fremdmaterials (d. h. nicht-RNA) durch den Immobilisierungsfilter hindurchgeht, obschon das Mitimmobilisieren eines geringen Anteils des nicht-RNA-Materials wahrscheinlich unvermeidbar ist. Das einfache Hindurchführen der gelösten (d. h. in einer chaotropen Lösung) RNA-Quelle liefert so viele wenn nicht mehr Reinigung als bestehende Verfahren, welche getrennte Reinigungsschritte einsetzen. Die bevorzugten Schritte in der vorliegenden Erfindung sind das vorstehende (A) und (B), obschon die Erfindung vorteilhafterweise durch den Einschluß hilfsweiser (d. h. nicht wesentlicher) Verfahrensschritte, wie nachstehend beschrieben, noch wirksamer gemacht werden kann.
  • Ein "chaotropes" Salz ist eines, das eine biologische RNA- Quelle (wie etwa Zellen und Bakterien) auflöst und die RNA darin in eine zur selektiven Immobilisierung geeignete Form überführt, hauptsächlich durch Unterbrechen der schwachen intramolekularen Kräfte, die allgemein als van-der-Waalsche- Anziehung bekannt sind. van-der-Waalsche-Anziehungen sind zum Beispiel hauptsächlich für das Zusammenhalten von Fettzellmembranen (z. B. vom Zweischicht-Lipidtyp) verantwortlich. Chaotrope Salze solvatisieren auch andere Typen biologischer Moleküle wie etwa Proteine. Chaotrope Salze führen mehrere Funktionen gleichzeitig aus, was sie zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet macht:
  • 1. sie lösen Zellen und Zellbestandteile oder andere mRNA- Quellen auf;
  • 2. sie neigen dazu, Nukleinsäuren zu denaturieren;
  • 3. sie erlauben das selektive Binden einer Nukleinsäure an eine geeignete immobilisierende Oberfläche.
  • Chaotrope Salze bilden eine angemessen ausgewählte Gruppe innerhalb aller bekannten Salze. Gewiß sind nicht alle Salze chaotrop und deshalb nicht zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Die chaotrope Wirksamkeit ist physikalisch durch eine biologische Quelle gekennzeichnet, die sich im wesentlichen in der Lösung des chaotropen Salzes vollständig auflöst. Die Auflösung kann für die Zwecke der Erfindung als Menge des sichtbaren Lichts gemessen werden, das durch Teilchen (d. h. ungelöstes Material) gestreut wird. Ein chaotropes Salz löst im allgemeinen eine biologische Probe unter Erzeugen einer im wesentlichen klaren Lösung auf (obschon die Lösung gefärbt sein kann). Die "Auflösung" kann als Verringerung der optischen Dichte des sichtbaren Lichts um einen Faktor von wenigstens etwa 2 (z. B. bei 600 Millimikron gemessen), welche für eine chaotrop gelöste biologische Probe, bezogen auf die optische Dichte, gemessen wird, welche für eine identische, in 5% Glycerin in Wasser suspendierte Probe gemessen wird, definiert werden. Die "Auflösung" für irgendein spezielles Salz kann im Einsatz durch Mischen (mechanisch, wie in der Technik bekannt) eines Milligramms Zellen auf jeden Milliliter Lösung bei einer vorbestimmten Salzkonzentration bestimmt werden. Für Einsatzzwecke des Bestimmens, ob ein Salz chaotrop ist, ist die vorbestimmte Konzentration 5 molar, obschon zur Verwendung bei tatsächlichen Proben die Konzentration verändert werden kann, um an die Natur der-biologischen Quelle, aus der die Probe stammt, angepaßt zu werden. Wenn das Salz chaotrop ist, führt das Mischen zur "Auflösung", wie durch eine wenigstens etwa 2fache Verringerung, bezogen auf eine Suspension in 5% Glycerin in Wasser, des gestreuten, in einem Standardtrübungsmesser gemessenen Lichts angezeigt wird. Eine zahlenmäßige Veranschaulichung davon findet sich in Beispiel 7.
  • Geeignete chaotrope Salze schließen Alkalimetallperchlorate, -iodide, -trifluoracetate, -trichloracetate und -thiocyanate ein. Spezielle chaotrope Salze, die getestet und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet befunden worden sind, schließen Natriumtrifluoracetat, Natriumtrichloracetat, Natriumperchlorat, Guanidinthiocyanat und Kaliumthiocyanat ein. Bei chaotropen Salzen mit einem Alkalimetallkation (z. B. Natriumtrichloracetat) kann das Ersetzen durch ein unterschiedliches Alkalimetallkation (z. B. Kaliumtrichloracetat), wenn überhaupt, wenig Unterschied im chaotropen Verhalten hervorrufen.
  • Die Konzentration eines speziellen chaotropen Salzes, die zum Bewirken einer im wesentlichen vollständigen Lösung einer biologischen Quelle ausreicht, schwankt in Abhängigkeit von dem speziellen Salz und der Natur und Konzentration der eingesetzten biologischen Quelle. Typische Konzentrationen des chaotropen Salzes liegen in der Größenordnung von 5 molar (siehe Beispiel 3), obschon andere Salzkonzentrationen sich etwas unterscheiden können. Zum Beispiel ist eine bevorzugte NaI-Lösung, wie hier nachstehend beschrieben wird, gesättigt (bei 25ºC). Die Einstellung von Konzentrationen stellt eine Routineoptimierung dar, die innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt. Das chaotrope Salz muß in einer zum Bewirken einer im wesentlichen vollständigen Lösung der biologischen Quelle oder Probe ausreichenden Konzentration vorliegen.
  • Der Ausdruck "biologische Quelle" bezieht sich auf Material aus irgendeinem lebenden Organismus, schließt aber gereinigte Chemikalien (oder Biochemikalien) aus. Eine "biologische Quelle" zieht insbesondere biologische Proben, die aus Menschen entnommen sind, in Betracht. Der Erfinder hat die Erfindung mittels getrennter Zellen, Gewebestücken, Stuhl, Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Lymphe, Urin, Speichel usw.), Bakterien, Viren, Hefe und Unterfraktionen (wie etwa getrennte Kerne oder Cytoplasma) der vorherigen Quellen mit guten Ergebnissen getestet. Somit wird unter dem Ausdruck "biologische Probe" alles vorstehende verstanden.
  • Die Erfindung schließt weiter ein neues Verfahren zum selektiven Trennen irgendeiner speziellen RNA oder DNA aus einer biologischen Quelle ein, wobei dieses Verfahren hierin als "homogene Hybridisierung", "Ein-Phasen-Hybridisierung" oder "Flüssig-Flüssig-Hybridisierung" bezeichnet wird. Unter dem Ausdruck "homogene Hybridisierung", "Ein-Phasen-Hybridisierung" oder "Flüssig-Flüssig-Hybridisierung", wobei die Ausdrücke als synonym aufgefaßt werden, wird verstanden, daß sowohl die markierte Sonde als auch die Zielnukleinsäure (Probe) sich während der molekularen Hybridisierungsreaktion zwischen den beiden in Lösung befinden, wobei die molekulare Hybridisierung in der chaotropen Lösung bewirkt wird.
  • Gleichgültig, ob RNA oder DNA in einer nukleinsäurehaltigen biologischen Probe zur Identifizierung und/oder mengenmäßigen Bestimmung getrennt werden sollen, wird die Probe zuerst in einer Lösung eines chaotropen Salzes gelöst. Falls RNA nachgewiesen und/oder mengenmäßig bestimmt werden soll, kann eine geeignete, markierte Nukleinsäuresonde (DNA oder RNA) direkt der chaotropen RNA-Lösung unter Bedingungen zugesetzt werden, die für die Hybridisierung zwischen der markierten Sonde und der RNA-Probe günstig sind.
  • Falls DNA gemessen werden soll, wird die biologische Probe in chaotroper Lösung gelöst und die Lösung wird vor der Hybridisierung erhitzt. Das Erhitzen der DNA denaturiert das Molekül, wodurch eine einzelsträngige DNA vorliegt, die zur Hybridisierung mit einer geeignet markierten Sonde geeignet ist. In dieser Situation werden Detergenzien, wie etwa die in der vorstehend beschriebenen "Umkehrsondierung" benützten, nicht benötigt.
  • Typische Verfahren zum analytischen Bestimmen des Ausmaßes einer Hybridisierung (und damit der Menge der interessierenden RNA- oder DNA-Sequenz in der Probe) werden wie vorstehend in Beispiel 5 und 10 erläutert.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung weiter ein Verfahren zum selektiven Abt rennen einer speziellen RNA-Sequenz aus einer biologischen Quelle, welche die spezielle RNA-Sequenz enthält, oder zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit der speziellen RNA-Sequenz in der biologischen Quelle bereit, umfassend die Schritte des
  • A. Lösens der biologischen Quelle in einer chaotropen Lösung; und
  • B. Zusammenbringens der gelösten Quelle in der chaotropen Lösung, in der die gelöste Quelle gelöst ist, mit einer Nukleinsäuresonde, die zu wenigstens einem Teil der RNA-Sequenz komplementär ist, wobei sich die Nukleinsäuresonde in löslicher Form befindet, und Inkubieren der auf diese Weise zusammengebrachten Probe bei einer Temperatur, welche die molekulare Hybridisierung fördert und welche die DNA in einem undenaturierten Zustand erhält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum selektiven Nachweisen und/oder mengenmäßigen Bestimmen einer speziellen DNA-Sequenz aus einer biologischen Probe bereit, umfassend die Schritte des:
  • A. Lösens einer biologischen Probe, welche die spezielle DNA- Sequenz enthält, durch Zusammenbringen einer derartigen Probe mit einer Lösung eines chaotropen Salzes;
  • B. Erhitzens der sich daraus ergebenden chaotropen Lösung mit einer DNA-Probe, die darin löslich gemacht wurde, auf wenigstens 45ºC zum Denaturieren der DNA; und
  • C. Zusammenbringens der Lösung, welche die denaturierte Probe enthält, mit einer markierten Nukleinsäuresonde, die zu wenigstens einem Teil der speziellen DNA-Sequenz komplementär ist, und Inkubieren der auf diese Weise zusammengebrachten Probe bei einer Temperatur, welche die molekulare Hybridisierung fördert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen Kit bereit, der zum Bewirken einer Probenvorbereitung und homogenen Hybridisierung zum Untersuchen von Nukleinsäuren, die aus der aus RNA und DNA bestehenden Gruppe ausgewählt sind, geeignet ist, wobei der Kit getrennt umfaßt
  • A. ein chaotropes Salz;
  • B. Zubehör zum Ausführen einer molekularen Hybridisierung; und
  • C. einen Test zum Nachweisen und/oder mengenmäßigen Hybridisieren von Duplexen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen Kit bereit, der zum Messen der Menge der speziellen RNA- oder DNA-Sequenz geeignet ist, wobei der Kit umfaßt:
  • A. ein chaotropes Salz;
  • B. Zubehör zum Ausführen einer molekularen Hybridisierung;
  • C. einen Test zum Nachweisen und/oder mengenmäßigen Hybridisieren von Duplexen;
  • D. eine Sonde, die eine Nukleinsäure umfaßt, welche zu der speziellen RNA- oder DNA-Sequenz komplementär ist; und
  • E. positive und negative biologische Kontrollproben, die in einem Chaotrop gelöst sind.
  • Wie vorstehend erörtert, bietet diese homogene Hybridisierung den besonderen Vorteil, daß die analytische Bestimmung des Typs und/oder Kontakts der Nukleinsäure in einer vorgegebenen Probe besonders an die klinische Anwendung angepaßt ist. Die vorliegende Erfindung, welche die Probenvorbereitung und die homogene Hybridisierung in der im wesentlichen gleichen chaotropen Lösung vereinigt, ist in ihrer Fähigkeit, die Genauigkeit und Empfindlichkeit der meisten fortschrittlichen Laboratoriumsverfahren zu erhalten, während sie die Geschwindigkeit, Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, Vielseitigkeit und Automatisierbarkeit, die für eine klinische Anpassung notwendig sind, zu erhalten, einmalig. Um das Verstehen der Erfindung und ihrer Neuheit zu erleichtern, werden die vorstehenden Parameter in bezug auf die Erfindung zusammengefaßt und auf entsprechende Beispiele der Versuchsdurchführung kreuzverwiesen.
    • Genauigkeit
  • Die Hybridisierung in Chaotropen verläuft bei gereinigten Nukleinsäuren mit 100% Wirksamkeit (Beispiel 5, Fig. 4B, obere Kurve) und verläuft bei Nukleinsäuren in biologischen Quellen mit gleicher Wirksamkeit (Beispiel 5, Fig. 4C). Die Hybridisierung in einer Flüssigkeit kann mathematisch beschrieben werden (Britten und Kohne, Science 161 : 529, 1968). Die vorliegende Erfindung führt Hybridisierungen aus, welche dem mathematischen Modell entsprechen (Beispiel 7, Fig. 6). Bei einem Sondenüberschuß besteht eine lineare Beziehung zwischen der Menge der vorhandenen Zielnukleinsäure und der Menge der hybridisierten Sonde und die Proportionalitätskonstante beträgt 1 (Beispiel 5, Fig. 4B, obere Kurve). Bei geringeren Sondenmengen besteht immer noch eine lineare Beziehung zwischen der Menge der vorhandenen Zielnukleinsäure und der Menge hybridisierter Sonde (Beispiel 10, Fig. 7). Alle diese Tatsachen zeigen, daß die vorliegende Erfindung eine genaue Untersuchung von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe liefern kann. Beispiel 11 veranschaulicht dies auf praktische Weise (Fig. 8)
    • Empfindlichkeit
  • 30 Femtogramm komplementäre Zielsequenz wurden nachgewiesen (Beispiel 5). Dieser Empfindlichkeitswert ist zur Zeit Stand der Technik.
    • Geschwindigkeit
  • Ungeachtet der Menge der Zielsequenz liefert die Erfindung ein Mittel zum Vervollständigen einer Probenvorbereitung/Hybridisierung in 15 Minuten für Ziel-DNA in Bakterien (Beispiel 5, Fig. 4D) und in 11 Minuten für Ziel-DNA in menschlichen Lymphocyten (Beispiel 5). Daraus folgt, daß Ziel- RNA in 6 Minuten untersucht werden kann, da das Verfahren identisch ist, außer daß eine Inkubation von 5 Minuten weggelassen wird, aber dies wird in der Anmeldung nicht veranschaulicht. Es ist wichtig anzumerken, daß eine vollständige Genauigkeit und Empfindlichkeit bei diesen Hochgeschwindigkeitsexperimenten erhalten bleibt. Ein Grund dafür, daß die vorgenannte Geschwindigkeit möglich ist, ist die unerwartete Beschleunigung der Hybridisierung, welche allgemein durch Chaotrope geliefert wird (Beispiel 6, Fig. 5A und 5B) und durch GuSCN im besonderen (Beispiel 6 und 7, Fig. 5 und 6).
    • Einfachheit
  • Die vorliegende Erfindung zum Untersuchen von Ziel-RNA in einer biologischen Probe erfordert nur: 1) Zusammenbringen einer Flüssigkeit oder eines feinverteilten Gewebes mit einem starken Chaotrop über etwa 1 Minute, anschließend 2) Zufügen einer Probe auf etwa 1 ug/ml und Inkubieren des Gemischs während etwa 5 Minuten. Dies wird in Beispiel 10 und 11 veranschaulicht, außer daß der Hybridisierungsschritt wegen der geringen Mengen Sonde, die verwendet wurden, verlängert wurde. Es ist für den Fachmann aus Beispiel 5 offensichtlich, daß, wenn in Beispiel 10 und 11 größere Mengen Sonde verwendet worden wären, die Hybridisierung hätte abgekürzt werden können. Weiter kann die Sonde mit dem Chaotrop vorgemischt werden und die beiden können gleichzeitig zugefügt werden.
  • Das Verfahren ist zum Ausführen durch ungelernte Personen einfach genug und tatsächlich ist es im Laboratorium des Erfinders durch einen Oberschüler, einen Schüler einer weiterführenden Schule und einen Studenten ausgeführt worden.
  • Das Verfahren ist nicht empfindlich gegenüber Störungen der Bedingungen, wie sie in einem klinischen Laboratorium erwartet werden. Das Verfahren ist gleichermaßen von 3-6,5 M GuSCN wirkungsvoll, wenn es bei Raumtemperatur ausgeführt wird (Beispiel 7, Fig. 4C) und das Verwenden von 3-4 M GuSCN ist von 23-30ºC gleich wirkungsvoll (Beispiel 7, Fig. 6A, B). Hybridisierungen können 5 Minuten oder mehrere Tage durchgeführt werden (siehe Beispiel 6, Fig. 5A, B und vergleiche mit Beispiel 5, Fig. 4D).
  • Daß ein derart außergewöhnlich einfaches Verfahren zur Probenvorbereitung und molekularen Hybridisierung ausreicht, war aus dem Stand der Technik nicht vorherzusehen. Während der Probenvorbereitung werden üblicherweise Kombinationen aus Enzymen, Detergenzien, organischen Lösungsmitteln, Reduktionsmitteln usw. verwendet. Die Bedingungen werden gewöhnlich verändert und sind zum Ausführen einer molekularen Hybridisierung ziemlich spezifisch. Da Zielnukleinsäuren in biologischen Proben mit anderen Makromolekülen über viele Arten von Kräften komplexiert sind, welche ionische Bindungen, Wasserstoffbindungen und nichtpolare Bindungen einschließen, konnte nicht vorhergesehen werden, daß ein Aussetzen einer biologischen Probe einem Chaotrop die Zielnukleinsäuren in dem Ausmaß freisetzen würde, daß sie genau, wirksam und empfindlich sondiert werden könnten. Sicherlich konnte nicht vorhergesehen werden, daß ein derartiges Sondieren in im wesentlichen genau derselben Lösung, die zur Probenverarbeitung verwendet wird, ablaufen könnte. Und schließlich konnte nicht vorhergesehen werden, daß die Geschwindigkeit des Sondierungsverfahrens durch das Chaotrop beschleunigt würde, was ein schnelleres Verfahren liefert.
  • Es sollte angemerkt werden, daß die Einfachheit des Chaotrop- Verfahrens ohne ein Opfer an Genauigkeit, Empfindlichkeit oder Geschwindigkeit erhalten wurde.
    • Wirtschaftlichkeit
  • Die Kosten des Chaotrop-Verfahrens sind niedriger als alle anderen, dem Erfinder bekannten Verfahren. Wenn solche Kosten, wie Sonden-Kosten, Hybridnachweis-Kosten, Probensammelvorrichtungs-Kosten, zwischen allen Systemen gleich gehalten werden, sind die Kosten des chaotropen Systems, die Kosten des Chaotrop selbst, Kosten, die sich auf Pennies oder Bruchteile davon je Test belaufen. Von einem manuellen Gendiagnosetest mittels des Chaotrop-Systems ist geschätzt worden, daß er zum Ausführen unter $ 1,50 kostet. Die Kosten eines automatisierten Tests sind nicht leicht zu berechnen, aber sollten im Hinblick auf die Einfachheit der vorliegenden Erfindung verhältnismäßig niedrig sein.
    • Vielseitigkeit
  • Klinische Proben werden wegen der hohen Anteile von Verunreinigungen in solchen Proben wie Stuhl, Blut, Urin usw. gemeinhin als "schmutzig" bezeichnet, wenn sie mit Forschungslaboratoriumsproben verglichen werden. Die vorliegende Erfindung ist über das Spektrum klinischer Proben getestet worden und es wurde gefunden, daß sie in allen Fällen wirkungsvoll abläuft. Dem Erfinder ist weder ein Stand der Technik bekannt, der diese Vielseitigkeit erreicht, noch ein Stand der Technik, der diese Vielseitigkeit erwarten läßt. Sie war für den Erfinder ziemlich unerwartet.
  • Es sollte betont werden, daß, soweit es die Erfahrung des Erfinders betrifft, diese Vielseitigkeit ohne Opfer bei der Genauigkeit, Empfindlichkeit, Geschwindigkeit, Einfachheit oder Wirtschaftlichkeit erhalten wurde. Folglich verkörpert die vorliegende Erfindung unerwarteterweise die besten all jener Eigenschaften, die ein klinisch anwendbares Gendiagnoseverfahren auszeichnen.
    • Automatisierbarkeit
  • Bis eine derartige Automatisierung tatsächlich vorliegt, ist es schwierig zu begründen, welches von mehreren Verfahren am leichtesten zu automatisieren ist. Es ist für den Fachmann jedoch offensichtlich, daß die Einfachheit der vorliegenden Erfindung sich für eine Automatisierung eignet.
  • Die Erfindung stellt weiter ein Mittel zum Nachweisen und mengenmäßigen Bestimmen von HIV-Nukleinsäuren in Patienten zur Verfügung.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 ist eine diagrammartige Darstellung, welche die konkurrierende Umkehrsondierung zeigt;
  • Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der Verwendung der konkurrierenden Umkehrsondierung beim Messen von DNA-Sequenzen in Zellen;
  • Fig. 3 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Bestimmen der Struktur einer immobilisierten RNA;
  • Fig. 4 stellt Darstellungen der Empfindlichkeit der Erfindung unter verschiedenen Bedingungen dar:
  • A = reine Ziel-DNA, Radioautographie
  • B = reine Ziel-DNA, grafische Darstellung eines Szintillationszählungsziels
  • C = Ziel-DNA, die mit Zellen gemischt ist, Radioautographie
  • D = Ziel-DNA in Bakterien, Radioautographie
  • Fig. 5 stellt die Wirksamkeit der Erfindung dar:
  • A = Vergleich der Hybridisierung in 3 M GuSCN oder NaI oder in 50% Formamid, Radioautographie
  • B, C = Hybridisierung verschiedener Konzentrationen GuSCN oder NaI bei verschiedenen Temperaturen, grafische Darstellung einer Szintillationszählung
  • Fig. 6 ist eine grafische Darstellung der Kinetik der Hybridisierung in GuSCN:
  • A = Kinetik in 3 M GuSCN bei 23, 37 und 45ºC
  • B = Kinetik in 4 M GuSCN bei 23, 30, 37 und 45ºC
  • C = Kinetik in 3, 4, 4,9, 5,9, 6,5 M GuSCN bei 23ºC;
  • Fig. 7 ist eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Zahl virusinfizierter Zellen, die in GuSCN gelöst sind, und den Hybridisierungswerten.
  • Fig. 8 ist eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der verwendeten Sondenmenge und den Hybridisierungswerten, was zeigt, wie die Sättigungswerte zum Ermitteln der Zahl der in einer biologischen Probe vorhandenen RNA-Moleküle zu verwenden sind.
  • Fig. 9. An vier ARC-Patienten erhaltene Kokultur- und HIV- Werte ohne nachweisbares Serumantigen vor der Behandlung.
  • Fig. 10. Mit drei ARC-Patienten, die nachweisbares Serumantigen vor der Behandlung besaßen, erhaltene Kokultur-, Hybridisierungs- und Antigenergebnisse.
  • Fig. 11. Mit drei AIDS-Patienten erhaltene Kokultur-, Hybridisierungs- und Antigenergebnisse.
    • GENAUE ERÖRTERUNGEN
  • Alle hier angegebenen Temperaturen sind Grad Celsius, solange nicht anders angegeben. "NC" bezieht sich auf Nitrocellulose enthaltende Membranen.
    • 1. mRNA-Immobilisierungsverfahren zur molekularen Hybridisierung mit Hilfsschritten
  • Boten-RNA kann aus ganzen Zellen, gemäß dem folgenden Verfahren, selektiv immobilisiert werden:
  • (a) Vorbereiten einer biologischen Quelle
  • (b) enzymatisches Entproteinisieren
  • (c) Hinzufügen von Detergenzien
  • (d) Hinzufügen eines chaotropen Salzes
  • (e) Filtrieren durch eine immobilisierende Membran
  • (f) Waschen des Filters (z. B. Tränken des Filters in H&sub2;O, EtOH/H&sub2;O, Acetanhydrid)
  • (g) Ausführen der molekularen Hybridisierung.
  • Wie zuvor bemerkt, sind von den vorstehenden Schritten (d) und (e) wesentlich. Die Schritte (a)-(c) und (f) stellen hilfsweise, nicht wesentliche Verfahren dar, die in Abhängigkeit von der Natur der mRNA-Quelle zum Verstärken der Wirksamkeit der mRNA-Immobilisierung, wie nachstehend erläutert, verwendet werden können. Schritt (g) ist der Hybridisierungsschritt, der die mengenmäßige Bestimmung erlaubt.
    • a. Vorbereitung der biologischen Quelle
  • Hier verwendet bezieht sich "Vorbereitung" auf Handhabungen, die dazu benötigt werden, die mRNA-Quelle in einem Zustand zu versetzen, der zur mRNA-Immobilisierung geeignet ist, während die grundlegende strukturelle Unversehrtheit der Nukleinsäuren soweit wie möglich erhalten wird. Typische Handhabungen zur Zellvorbereitung können die Entfernung von Flüssigkeiten aus Zell- oder Gewebeproben, Entfernung von Zellen oder Teilchen aus Körperflüssigkeiten, die Herstellung von Unterfraktionen aus Zellen, Flüssigkeiten usw., einschließen. Einige Beispiele werden nachstehend veranschaulicht. Zellen können durch jedes herkömmliche Mittel vorbereitet werden, vorausgesetzt, daß man Vorsicht walten läßt, um die mRNA durch Verhindern ihres strukturellen Abbaus zu stabilisieren. Üblicherweise wird dies durch Arbeiten mit der Probe auf Eis, Tragen von Handschuhen während des Verfahrens und Einbeziehen von Cyclohexamid plus Ribonukleasehemmern bei Lösungen, die mit Zellen in Kontakt kommen, bewerkstelligt. Cyclohexamid schützt aus Zellen stammende mRNA durch Erhalten der mRNA in einer natürlichen Struktur auf Ribosomen. Ribonukleasehemmer verringern den Abbau von mRNA durch Ribonukleasen. Der Ribonukleasehemmer Vanadylribonukleosid, der durch das Verfahren von Berger und Birkenmeyer hergestellt wird, ist ausreichend, bleibt aber mit NC verbunden. Vanadylribonukleoside stören die molekulare Hybridisierung nicht, sie hemmen aber die reverse Transkription und Translation immobilisierter mRNA. Die Kombination von 0,5 mM Aurintricarbonsäure (Sigma Chemicals) plus 1 mM Hydroxystilbamidinisothamin (Merrell) oder 1 E/ml RNA in (Promega Biotech) besitzt diese Hemmwirkung nicht, es müssen aber keine so wirksamen Ribonukleasehemmer wie Vanadylribonukleoside sein.
  • Falls die Probe mononukleäre Blut- oder Knochenmarkszellen enthält, können diese durch diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugierung in Ficoll Hypaque vorbereitet werden. In Gewebekulturen gezüchtete Ein-Schicht-Zellen können auf dem üblichen Weg mit Trypsin freigesetzt werden, aber diese enzymatische Behandlung ersetzt den späteren Proteaseschritt nicht. Feste Gewebe können direkt in einer Lösung eines chaotropen Salzes gelöst werden oder vor dem Immobilisieren zu einzelnen Zellen aufgespalten werden. Dies kann enzymatisch mit DNAase und Kollagenase (Slocum et al., Cancer Res. 41 : 1428-1434) durchgeführt werden, aber ein Mischen bei niedriger Geschwindigkeit oder Gefrieren und Pulverisieren kann ebenfalls wirksam sein. Nach Kenntnis des Erfinders ist eine nahezu unendliche Vielfalt von Quellenvorbereitungsschritten vorstellbar, die alle mit der vorliegenden Erfindung verträglich sind.
    • b. Entproteinisierung
  • Obschon die Hauptmenge proteinartigen Materials durch NC hindurchgeht, nachdem eine biologische Probe in einer Lösung eines chaotropen Salzes gelöst worden ist, kann in Abhängigkeit von der Natur und Menge der biologischen Probe genügend Protein mit RNA zusammen immobilisieren, so daß es manchmal ratsam ist, soviel wie möglich Protein so früh wie möglich in dem Verfahren vor der Filtration abzubauen. Dies wird bequemerweise durch Hinzufügen proteolytischer Enzyme (Proteasen genannt) zu vorbereiteten Zellen, die wie vorstehend beschrieben suspendiert sind, und 30 Minuten Inkubieren der Zellsuspension bei 37ºC durchgeführt. Proteinase K (Sigma) kann zum Beispiel zu etwa 200 ug/ml verwendet werden. Pronase B (RNAase-frei, Calbiochem) ist ein weiteres Beispiel einer kommerziell nützlichen Protease und sollte zu 1 mg/ml verwendet werden, nachdem eine Vorratslösung mit 10 mg/ml hergestellt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurde (Gillespie und Spiegelman, J. Mol. Biol. 12 : 829-842, 1965). Falls eine subzelluläre Fraktionierung (siehe nachstehend) gewünscht wird, sollte der Proteaseschritt aufgeschoben werden.
    • Zusatz von Detergenzien (c) und chaotropem Salz (d)
  • Die Reihenfolge der Zugabe von Detergenzien und chaotropem Salz zu einer Lösung ist nicht kritisch. Jedes kann zuerst zugesetzt werden, gefolgt von der anderen, oder sie können zusammen zugesetzt werden.
  • Detergenzien brechen Zellen auf und helfen, Protein und die DNA-Immobilisierung aus der Lösung des chaotropen Salzes zu unterdrücken.
  • Falls die Natur der mRNA-Quelle derart ist, daß hohe Mengen Protein und/oder DNA zur Verfügung stehen, dann ist der Zusatz eines Detergenzes ratsam. Geeignete Detergenzien sind in der Technik wohlbekannt und im Handel erhältlich. Bevorzugt sind nicht ionische Detergenzien, wie etwa im Handel erhältliche Polyoxyethylene wie die Brij®-Reihe (Sigma) oder die Tween®- Reihe (Sigma). Schwach ionische Detergenzien wie Natriumlaurylsarcosinat und Natriumdesoxycholat wirken ebenfalls gut. Weniger bevorzugt, aber nötigenfalls verwendbar, sind stark anionische Detergenzien wie etwa Natriumdodecylsulfat und stark kationische Detergenzien wie etwa Cetyltrimethylammoniumbromid. Detergenziengemische können ebenfalls eingesetzt werden.
  • Um zum Beispiel Zellen aufzubrechen, wird 1/20 Vol. (Anmerkung "Vol." bezieht sich, wenn immer es hier verwendet wird, auf das
  • Probenvolumen an diesem Punkt des Verfahrens) 10% Brij® 35 (Sigma) zugesetzt und die Probe wird vermischt. Anschließend wird 1/20 Vol. 10% Natriumdesoxycholat (Sigma) zugesetzt und die Probe wird erneut gemischt. Die Menge Detergenz, die zugesetzt werden sollte, ist typischerweise die vorstehend angegebene, kann aber von der Natur der Probe abhängen (z. B. Blut gegenüber Organgewebe) und kann mittels einfacher Experimente oder "Probeläufe" eingestellt werden und liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung.
  • Auf die Detergenzzugabe folgend, wird nötigenfalls 1 Vol. übersättigte Lösung eines chaotropen Salzes zugesetzt, um den Zellextrakt im Hinblick auf das chaotrope Salz ungefähr gesättigt zu machen. Die starken Salzlösungen werden leicht hergestellt. Unter Verwenden von NaI als Beispiel wird übersättigtes NaI bequemerweise durch Lösen von NaI in heißem Wasser (wenigstens 75ºC) in einem Verhältnis wie (Gew./Vol.) von 2,5 g NaI (Baker) auf jeden ml heißes H&sub2;O hergestellt. Die Lösung kann bei Raumtemperatur fest gelagert werden, anschließend durch Erhitzen auf mindestens 75ºC vor der Verwendung geschmolzen werden. Eine gesättigte NaI-Lösung wird durch Hinzusetzen von etwa 1 Vol. übersättigter NaI zu einer NaI-freien Lösung, Suspension, biologischen Quelle usw. hergestellt. Eine klare, bernsteinfarbene Lösung sollte sich aus der Zugabe von 1 Vol. übersättigtem NaI zum Suspendieren von Zellen, Gewebeprobe oder Körperflüssigkeit ergeben. Verdünnungen können auf dieser Stufe in gesättigtem NaI durchgeführt werden. Ähnliche Verfahren können bei den anderen chaotropen Salzen angewandt werden, die selbstverständlich an unterschiedliche Molekulargewichte und Löslichkeiten, und damit unterschiedliche Gew./Vol. angepaßt werden. Das Herstellen einer an dem chaotropen Salz "gesättigten" Lösung ist ein wegen seiner Leichtigkeit, seiner Reproduzierbarkeit und der Wirksamkeit der gesättigten Lösungen erwünschtes Verfahren. Falls gewünscht können jedoch auch geringere Konzentrationen verwendet werden.
    • e. Filtration durch eine Nukleinsäure-immobilisierte Membran
  • Es ist anzumerken, daß die Ausdrücke "Filter" und "Membran" hier austauschbar verwendet werden. Die meisten Membranen, einschließlich Nitrocellulose (NC) und Nylon können für das Immobilisieren von Nukleinsäuren durch ihr Anfeuchten in RNAasefreiem H&sub2;O, anschließend ihr Einweichen während 5 Minuten oder länger in RNAase-freiem 6xSSC vorbereitet werden. Es kann notwendig sein, einige hydrophobe Membranen vorher in einem Alkohol wie Ethanol anzufeuchten. Membranen können für wenigstens einige Tage in 6xSSC gelagert werden. Auf eine gewisse Weise kann das Aussetzen von Membranen einer starken NaCl-Lösung die Membrane für die Wechselwirkung in Nukleinsäuren aktivieren, die in einer Lösung eines chaotropen Salzes gelöst sind. Die Filtration kann durch trockene Membranen ausgeführt werden, aber es tritt eine beträchtliche seitliche Diffusion der rRNA auf und die Immobilisierung kann nicht quantitativ sein.
  • Einige Nukleinsäure-Immobilisierungsverfahren (d. h. für mRNA oder DNA) umfassen das Filtrieren mehrerer Verdünnungen und/oder mehrfacher Zellproben. Aus diesem Grund sind 72-96 Näpfchen enthaltende Verteilungsvorrichtungen, die zur Filtration einer großen Probenzahl ausgelegt sind, für die vorliegende Erfindung optimal. Das Minifold ITM, hergestellt von Schleicher und Schuell, ist besonders geeignet, weil jedes Näpfchen eine ziemlich große Oberfläche besitzt. Die Membran wird typischerweise auf die Vakuumkammer der Vorrichtung über ein Stück in 6xSSC vorgeweichtes Löschpapier gelegt. Die Verteilerplatte wird über die Membran geklemmt und die Proben werden unter Vakuum durch die Membran filtriert.
    • f. Waschen RNA-haltiger-Membranen
  • Der Zweck der Waschschritte ist das Entfernen von NaI und Molekülen, die keine Nukleinsäure sind, von der Membran. Es wird erneut betont, daß dieser Schritt hilfsweise erfolgt, wobei das Ausmaß, in dem er gewünscht wird, durch die Natur der zu testenden biologischen Probe bestimmt wird. Zum Entfernen sowohl restlichen chaotropen Salzes als auch von Verunreinigungen in der mRNA-Quelle kann das mRNA-Filter nacheinander in H&sub2;O, 70% Ethanol/30% H&sub2;O und Acetanhydrid eingeweicht werden. Das mRNA- Filter kann von der Verteilereinheit entfernt werden und direkt in einen Trog gelegt werden, der 1-2 ml H&sub2;O je cm² Membran enthält. Man sollte angemessene Vorsicht walten lassen, um einen Kontakt zwischen Ribonukleasen und dem mRNA-Filter aus zuschließen, trotz Beobachtungen, daß auf NC in einer Lösung eines chaotropen Salzes immobilisierte mRNA gegenüber Ribonuklease A bemerkenswert widerstandsfähig ist. Es sollten Handschuhe getragen werden, das mRNA-Filter sollte mit einer sauberen Pinzette gehandhabt werden und RNAase-freies H&sub2;O sollte verwendet werden. Das mRNA-Filter wird wenigsten 5 Minuten bei Raumtemperatur getränkt, anschließend wird die Waschlösung ausgewechselt. Mehrfache Filter können in einem einzigen Trog getränkt werden. Die Filter können bei der ersten Wasserwäsche, vorzugsweise bei der ersten Ethanolwäsche, gesammelt werden. Insgesamt sollten die Filter in drei Auswechselungen Wasser, drei Auswechselungen 70% Ethanol/30% H&sub2;O und einmal in Acetanhydrid eingeweicht werden.
  • Die Waschung mit Acetanhydrid kann für Versuche zur molekularen Hybridisierung wichtig sein. Acetanhydrid acetyliert basische Proteine, wodurch die Bildung nichtspezifischer Sonde-Protein- Komplexe auf ein Minimum zurückgeführt wird, und durch ein noch unbekanntes Mittel das Signal der molekularen Hybridisierung verstärkt werden kann. Acetanhydrid ist in H&sub2;O instabil, so daß Vorratslösungen nicht hergestellt und gelagert werden können. Die Acetanhydridlösung wird bequem durch Zufügen von 0,25 ml reinem Acetanhydrid (Fisher Chemicals) zu 100 ml 0,1 M Triethanolamin (Fisher Chemicals) hergestellt. Die Lösung wird heftig gemischt, in einen sauberen Trog verbracht und das mRNA- Filter wird sofort zugefügt. Das Einweichen mit Acetanhydrid sollte auf 10 Minuten bei Raumtemperatur ausgedehnt werden.
  • mRNA-Filter können aus dem Acetanhydrid entnommen und sofort verwendet werden, oder sie können luftgetrocknet und in mit Reißverschlüssen verschlossenen Beuteln gefroren gelagert werden. Wenn Wiederholungsproben hergestellt werden, ist es bequem, die Wiederholungen vor der Lagerung zu numerieren und zu trennen. Gelagerte Filter sollten gut trocken sein, um ein Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Ob sie sofort verwendet oder gelagert werden, so sind die mRNA-Filter nun zur molekularen Hybridisierung bereit.
  • Es ist anzumerken, daß die Konzentrationen von Proteasen, Ribonukleasehemmern und Detergenzien, welche in den hilfsweisen Schritten (a), (b) und (c) zugesetzt werden, in Abhängigkeit von der Natur der biologischen Quelle schwanken können und daß die hier angeführten Werte als beispielhaft aufzufassen sind.
  • Eine derartige Schwankung stellt eine Routineoptimierung dar, die innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns liegt.
    • g. Molekulare Hybridisierung immobilisierter mRNA
  • Eine der Hauptverwendungen für immobilisierte DNA oder RNA liegt beim Bestimmen der Menge einer oder einer weniger spezieller Sequenzen, die unter der gesamten Nukleinsäurepopulation vorliegen. Auf diese Weise kann das Gensondieren unter Millionen immobilisierter Gene aus einer typischen Säugerzelle die Anwesenheit eines einzigen Gens nachweisen und seine Menge bestimmen. Und unter hunderten bis hunderttausenden immobilisierter mRNA-Arten aus verschiedenen Arten Säugerzellen kann das Gensondieren die Anwesenheit einer einzigen mRNA nachweisen und die Menge bestimmen. Dies ist deshalb so, weil größtenteils jede Gen- und jede mRNA-Art eine einmalige Nukleotidsequenz besitzt, die einzig-artig und quantitativ durch eine markierte Gensonde über einen interaktiven, molekulare Hybridisierung genannten Vorgang erkannt werden kann. Die molekulare Hybridisierung ist ein Vorgang, der seit 20 Jahren auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt ist (siehe Gillespie, D., und Spiegelman, S., J. Mol. Biol. 12 : 829-842, 1965; Gillespie, D., Methods Enzymol. 12B: 641-668, 1968; Seed, B., Genetic Engineering 4 : 91-102, 1982; Lehninger, A. L., Biochemistry Text (Worth Publishers), S. 882-883, 1975; Stryer, L., Biochemistry Text (Freeman und Co.), S. 600-601, 1975). Sie umfaßt die Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen zwei Nukleinsäuren mit komplementären Nukleotidsequenzen, wie sie in den gegenüberliegenden Strängen jeder DNA-Region angetroffen werden (Watson, J. D., und Crick, F. H. C., Nature 71 : 737-738, 1953). Auf diese Weise kann eine markierte Sonde, die aus einem DNA-Strang oder ihrem chemischen Äquivalent besteht (z. B. RNA oder modifizierte DNA oder RNA derselben Nukleotidsequenz) zum Nachweisen und mengenmäßigen Bestimmen immobilisierter DNA oder RNA mit einer komplementären oder nahezu komplementären Nukleotidsequenz verwendet werden.
  • Die molekulare Hybridisierung ist selbstverständlich nicht Teil des Verfahrens zum Immobilisieren von mRNA. Vielmehr ist sie ein Verfahrensschritt, der es einer speziellen immobilisierten mRNA-Sequenz (unter vielen anderen, die ebenfalls immobilisiert werden) erlaubt, bestimmt zu werden. Die Hybridisierung wird durch Paaren markierter DNA oder mRNA (d. h. die Sonde), welche zu der interessierenden mRNA-Sequenz komplementär (d. h. spezifisch) ist, mit der mRNA ausgeführt. Die mengenmäßige Bestimmung der Markierung steht in direktem Bezug zur Menge der interessierenden mRNA-Sequenz. Viele Markierungen sind möglich, wie etwa diejenigen, welche in die breiten Kategorien der Radioaktivität, Fluoreszenz und Enzyme fallen. Zur leichteren Veranschaulichung wird die Hybridisierung unter Einsetzen radioaktiver Markierungen erörtert, aber dies soll nicht als einschränkend aufgefaßt werden.
  • Viele Systeme sind zur molekularen Hybridisierung mittels radioaktiver DNA-Sonden beschrieben worden. Gemeinhin wird das Verfahren in drei Schritten durchgeführt: (a) Einweichen des mRNA-Filters in einer Lösung, welcher die Sonde fehlt, was Wechselwirkungen zwischen radioaktiver DNA (der Sonde) und der Membran ("Vorhybridisierung") auf ein Minimum zurückführt; (b) Inkubieren des mRNA-Filters in einer Sonde enthaltenden Lösung, was die Hybridisierung zwischen radioaktiver DNA und mRNA begünstigt ("Hybridisierung"); und (c) Abwaschen unhybridisierter Sonde ("Nachhybridisierung"). Gemeinhin verwendete Vorhybridisierungslösungen, welche Wechselwirkungen zwischen radioaktiver DNA und NC auf ein Minimum zurückführen, enthalten im allgemeinen die folgenden Bestandteile: 0,2% Rinderserumalbumin (Fraktion IV, Sigma), 0,2% Ficoll (Typ 400, Pharmacia), 0,2% Polyvinylpyrrolidon (Sigma), 50 ug/ml DNA niedrigen Molekulargewichts (z. B. beschalltes Lachssperma-DNA, Sigma) und 50 ug/ml Poly(A) (Collaborative Research). Vermutlich besetzen alle diese Moleküle verschiedene Stellen auf der NC, welche die radioaktive Sonde anziehen können, so daß die einzig möglichen verbliebenen Reaktionen während der Hybridisierung zwischen der Sonde und der immobilisierten mRNA auftreten. Die Vorhybridisierung wird bequemerweise durch Versiegeln eines oder mehrerer Filter in einem Seal-a-meal-Beutel (z. B. Sears) mit etwa 1 ml/cm² NC einer Vorhybridisierungslösung, welche die vorstehend angeführten Bestandteile enthält, bewerkstelligt. Der verschlossene Beutel kann anschließend mehrere Stunden bei derselben Temperatur, wie sie für die Hybridisierung verwendet wird, inkubiert werden.
  • Für die Hybridisierung wird der filterhaltige Beutel einfach geöffnet, gespült, mit einem geringen Volumen (0,1-0,2 ml/cm² NC) Hybridisierungslösung ersetzt und erneut unter leichtem Schütteln inkubiert. Eine bevorzugte Lösung zur Hybridisierung immobilisierter Nukleinsäure enthält (Endkonzentrationen): 50% Formamid, pH 7 (Fluka-Granite), 0,45 M NaCl, 0,045 M Natriumcitrat, 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,0, 1% SDS (Sigma) und 10&sup6;- 10&sup7; cpm/ml DNA-Sonde. Die Hybridisierung wird normalerweise über Nacht bei 42º in dieser Lösung ausgeführt, obschon so niedrige Temperaturen wie 20-25º erfolgreich verwendet worden sind. Höhere Temperaturen liefern eine spezifischere Hybridisierung.
  • Die Natur und Menge des Formamids sind wichtig. Direkt aus der Flasche entnommenes Formamid, das einen hohen pH auf pH-Papier zeigt, streift immobilisierte mRNA von ihrem festen Träger ab. Auf ähnliche Weise entfernen sehr hohe Formamidkonzentrationen, selbst sehr reines Formamid mit neutralem pH, mRNA von Filtern. Es ist nicht bewiesen, daß es notwendig ist, Formamid erneut zu destillieren oder zu entionisieren, wenn eine Hybridisierung ausgeführt wird, aber es ist wichtig, den Inhalt jeder Flasche zeitweise auf den pH zu testen, und es ist klug, aus einer Formamid-Vorratsflasche auszugießen, anstatt daraus zu pipettieren. Reines Formamid kann in dunklen Flaschen bei Raumtemperatur für eine geringe Wochenzahl gelagert werden; eine verlängerte Lagerung sollte bei einer niedrigeren Temperatur im Dunkeln stattfinden.
  • Die Natur der DNA-Sonde ist ebenfalls wichtig. Viele Verfahren stehen nun zur Synthese und Reinigung von DNA-Sonden zur Verfügung und neue Verfahren tauchen ständig auf. Die primären Kriterien für eine befriedigende Sonde sind diejenigen, das sie von genügender Kettenlänge ist, um die molekulare Hybridisierung zu unterstützen (> 20 Nukleotide) und daß sie verhältnismäßig frei von markiertem Material ist, das mit dem Filter in Wechselwirkung tritt. Als Sondensynthese kann die Nick-Translation bequemerweise durch Verwendung eines handelsüblichen Kits bewerkstelligt werden (Amersham), während das Oligonukleotidgestartete Kopieren gelgereinigter, denaturierter DNA immer noch einzelne Bestandteile erfordert (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132 : 6-13, 1983). Zwei nützliche Schritte zum Reinigen Nick-translatierter DNA sind das Molekularsieben durch Sephadex® G-100 (Pharmacia), gefolgt von der Filtration durch NC (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 466-467, 1982). Eine gereinigte Sonde wird 10 Minuten bei 100º denaturiert, gekühlt und schließlich der Hybridisierungslösung zugesetzt.
  • Zur Nachhybridisierung können Filter eine Anzahl von Malen in 10xSSC plus 0,1% SDS eingeweicht werden. Die Zeit und Temperaturerfordernisse für diese Einweichungen schwanken mit der Natur der Sonde und den Zellproben. Üblicherweise sind drei Einweichungen von jeweils 30 Minuten bei 42º ausreichend, um unhybridisierte Sonde zu entfernen. Zur mengenmäßigen Bestimmung seltener mRNA kann es notwendig sein, wiederholte Einweichungen bei erhöhten Temperaturen über eine längere Zeit auszuführen. In jedem Fall sollten diese Einweichungen von einer Einweichung von 60 Minuten bei 60º in 0,015 M NaCl, 0,0015 M Natriumcitrat und 1% SDS gefolgt werden, um die letzten Spuren unhybridisierter Sonde zu entfernen und Sonde zu entfernen, die nichtspezifische Wasserstoffbindungen mit immobilisierter mRNA gebildet hat. Wie vorstehend angeführt, sind viele Systeme zum Ausführen einer molekularen Hybridisierung entwickelt worden, einschließlich Formamid, Harnstoff, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Guanidinhydrochlorid enthaltender Systeme oder hoher Temperaturen. Alle diese Systeme sind mit mRNA oder DNA, die mit der vorliegenden Erfindung immobilisiert wurden, erfolgreich eingesetzt worden.
  • Wie für den Durchschnittsfachmann offensichtlich ist, sind Verfahren, die den vorstehend beschriebenen ähnlich sind, die im Hinblick auf die besondere biologische Probe und besondere untersuchte RNA entsprechend modifiziert worden sind (d. h. rRNA aus einer Bakterienquelle, genomische RNA, mRNA, tRNA und hnRNA), im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen.
    • ll) Molekulare Hybridisierung löslichgemachter Nukleinsäureprobe
  • Eine biologische Probe kann durch ein Verfahren untersucht werden, bei dem die biologische Probe, die 1 oder mehrere Nukleinsäuresequenzen von Interesse enthält, durch Lösen der Probe in einer Lösung eines chaotropen Salzes hergestellt wird. Die interessierende Nukleinsäuresequenz (die Zielnukleinsäuresequenz) wird in dem chaotropen Medium, das die vorbereitete Probe darstellt, unter Verwenden einer markierten Nukleinsäuresonde, die zu der Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist, sondiert.
  • Unter dem Ausdruck "untersucht" wird der Nachweis und/oder die mengenmäßige Bestimmung der Zielnukleinsäure verstanden. Dementsprechend können Proben, von denen vermutet wird, daß sie eine Nukleinsäuresequenz enthalten, auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Sequenz untersucht werden. Auf ähnliche Weise kann die Probe auch durch mengenmäßiges Bestimmen der in der Probe enthaltenen Menge Zielnukleinsäure untersucht werden.
  • Wo die Probe auf den Nachweis einer vermuteten Zielnukleinsäuresequenz untersucht werden soll, kann die vorbereitete biologische Probe mit einer markierten Nukleinsäuresonde inkubiert werden, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche zu der nachzuweisenden Sequenz unter Bedingungen, welche eine Hybridisierung zwischen der Zielnukleinsäuresequenz, falls vorhanden, und der markierten Nukleinsäuresonde fördern. Auf den Inkubationszeitraum folgend kann die Probe auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einer hybridisierten Sonde getestet werden.
  • Wo die Probe im Sinne einer mengenmäßigen Bestimmung der Zielnukleinsäure untersucht werden soll, benützt die mengenmäßige Bestimmung der hybridisierten Sonde in der Technik bekannte Techniken.
  • Eine Sammlung verschiedener Verfahren zum Nachweisen hybridisierter Duplexe kann in dem Buch "Nucleic Acid Hybridization" (Hames und Higgins, Hrsgb.; IRL Press, Washington, D. C., 1985) und in Abschnitt 1f der "Genauen Erörterungen" vorstehend gefunden werden.
  • Unter dem Ausdruck "biologische Probe" wird dasselbe Material wie vorstehend beschrieben verstanden, d. h., getrennte Zellen, Gewebestücke, Stuhl, Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Lmyphe, Urin, Speichel usw.), Bakterien, Viren, Hefe und Unterfraktionen (wie etwa getrennte Kerne oder Cytoplasma); siehe Abschnitt 1a "Genaue Erörterungen" dieser Anmeldung.
  • Unter dem Ausdruck "Löslichmachen" wird verstanden, daß die Zielnukleinsäure von anderen Zellbestandteilen genügend getrennt ist, um die wirksame Hybridisierung der Zielnukleinsäure mit markierter Nukleinsäure, die dazu komplementär ist, zu ermöglichen, während die grundlegende strukturelle Unversehrtheit der Nukleinsäuren soweit wie möglich noch erhalten bleibt. Siehe Abschnitte 1a, 1d, "Genaue Erörterungen" dieser Anmeldung.
  • Unter dem Ausdruck "Zusammenbringen" wird verstanden, daß die biologische Probe und die chaotrope Lösung in einer solchen Weise übereinander gebracht werden, daß die Lösung der Probe in der chaotropen Lösung erlaubt wird. Typischerweise wird die biologische Probe in einen Behälter der chaotropen Salzlösung eingeführt.
  • Unter dem Ausdruck "chaotropes Salz" wird ein Salz verstanden, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumiodid, Natriumperchlorat, Kaliumiodid, Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Guanidinthiocyanat, Natriumtrichloracetat und Natriumtrifluoracetat besteht, in Konzentrationen, die zum Erreichen der "Lösung" einer in der ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG beschriebenen Probe ausreichend ist. Andere Alkalimetallsalze der vorstehenden Anionen können ebenfalls verwendet werden. Guanidinthiocyanat ist das bevorzugte chaotrope Salz.
  • Unter dem Ausdruck "Nukleinsäuresonde" wird jede Nukleinsäuresequenz, DNA oder RNA oder deren Modifikation in markierter Form verstanden, welche wenigstens einen Teil der Zielnukleinsäuresequenz hybridisiert. Der sich daraus ergebende "hybridisierte Duplex" kann ein DNA-RNA-Duplex, ein DNA-DNA-Duplex oder ein RNA-RNA-Duplex sein.
  • Unter dem Ausdruck "komplementär" wird verstanden, daß die Zielsequenz und Sondensequenz genügend Basenpaar-Übereinstimmung zeigen, um eine Duplexbildung unter Hybridisierungsbedingungen zu ermöglichen. Es ist jedoch nicht erforderlich, daß die Basenpaar-Übereinstimmung genau ist; siehe Abschnitt 1f, "Genaue Erörterungen", dieser Anmeldung. Allgemein gesagt verzögern jede 10% Nichtübereinstimmung zwischen Sonde und Ziel, die Hybridisierungsgeschwindigkeiten um einen Faktor von 2 und erniedrigen die Tm des hybridisierten Duplex um 10ºC. (Siehe "Nukleinsäurehybridisierung", ibid., S. 7, 8.)
  • Unter dem Ausdruck "Bedingungen, welche die molekulare Hybridisierung fördern", werden die in der Technik bekannten Bedingungen oder in dieser Anmeldung offenbarten, zum Fördern der Hybridisierung zwischen zwei DNA-Sequenzen, zwei RNA-Sequenzen oder einer RNA- und einer DNA-Sequenz verstanden.
  • Wenn man beabsichtigt, auf eine Ziel-RNA-Sequenz in Anwesenheit einer doppelsträngigen DNA-Sequenz zu sondieren, müssen, wie in der Technik bekannt ist, die Hybridisierungsbedingungen gewöhnlich derart sein, daß die doppelsträngigen DNA-Sequenzen doppelsträngig bleibt. Wenn man beabsichtigt, auf eine DNA-Sequenz in Anwesenheit einer RNA-Sequenz zu sondieren, muß in ähnlicher Weise die doppelsträngige DNA denaturiert und anschließend unter Bedingungen sondiert werden, bei denen eine Hybridisierung zwischen Sonde und etwa vorliegender RNA vermieden oder nicht nachgewiesen wird.
  • Unter dem Ausdruck "Nachweisen" wird sowohl der tatsächliche Nachweis als auch die mengenmäßige Bestimmung der molekularen Hybridisierung verstanden. Typische, in der Technik bekannte Verfahren schließen die Hydroxyapatit-Chromatographie, den enzymatischen Verdau einer ungepaarten Sonde, die Membranfiltration, Elektrophorese usw. ein (siehe "Nucleic Acid Hybridization", ibid., Kapitel 1-4),
  • Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die Zielnukleinsäure durch Verwenden einer vorstehend beschriebenen Lösung eines chaotropen Salzes löslich gemacht und anschließend mit einer markierten Nukleinsäuresonde inkubiert. Die markierte Nukleinsäure kann in immobilisierter oder löslicher Form vorliegen. Die Ausführungsform, bei der die markierte Nukleinsäuresonde sich in unlöslicher Form befindet, wird "Umkehrsondieren" für die Zwecke dieser Erfindung genannt. Das Umkehrsondieren wird nachstehend in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Ausführungsform, bei der die molekulare Hybridisierung unter Bedingungen einer Lösungshomogenität erreicht wird, wo sowohl die Zielnukleinsäuresequenz als auch die Nukleinsäuresonde in Lösung sind, wird ebenfalls in Beispiel 4 eingeführt und auf andere Beispiele ausgedehnt. Die Erfindung ist typischerweise wie folgt. Eine biologische Probe wird zuerst für den Gebrauch fertiggemacht. Körperflüssigkeiten werden verwendet wie-sie sind oder nach Fraktionierung in Bestandteile wie etwa Plasma, zellfreies Filtrat usw., was durch Verfahren gemacht wird, die in der Technik Standard sind. Zellen werden durch ihr Pelletieren aus einer Körperflüssigkeit oder einer Laboratoriumslösung oder durch Suspendieren derartiger Pellets in einer Laboratoriumslösung, ebenfalls unter Verwenden von Standardtechniken, fertiggemacht. Proben festen Gewebes werden enzymatisch in eine Einzelzellsuspension überführt oder werden durch Mahlen, Pulverisieren, Mischen oder Homogenisieren in eine Suspension oder eine pastenartige Konsistenz überführt. Diese Verfahren sind ebenfalls Standard in der Technik.
  • Die biologische Probe wird anschließend mit einem chaotropen Ion zusammengebracht. Guanidinthiocyanat ist das bevorzugte chaotrope Ion. Typischerweise wird die biologische Quelle etwa 5 M an Guanidinthiocyanat bei Raumtemperatur gemacht. Bei Lösungen oder Suspensionen wird dies durch Zusetzen von 0,4 Volumina der Lösung oder Suspension zu etwa 1 Volumen 7 M Guanidinthiocyanat und Mischen zu im wesentlichen gelösten Feststoffen bewerkstelligt. Bei Zellpellets oder Gewebeproben, die in eine pastenartige Konsistenz überführt wurden, wird eine Lösung von 5 M Guanidinthiocyanat zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wird gemischt, bis die Feststoffe im wesentlichen gelöst sind. Andere Chaotrope als gesättigtes Natriumiodid oder Guanidinthiocyanat sind zum Vorbereiten biologischer Proben verwendet worden, wie etwa 6 M Natriumtrifluoracetat, 5 M Natriumtrichloracetat und 5 M Natriumperchlorat.
  • Wie in der Technik bekannt ist, können andere Additive zugesetzt werden, um bei der Probenauflösung und/oder dem Erhalt molekularer Bestandteile nach Wunsch behilflich zu sein. Oberflächenaktive Mittel schließen ionische Detergenzien ein, die durch Natriumdodecylsulfat verkörpert werden, oder nichtionische Detergenzien, die durch Brij® 35 verkörpert werden, sind erfolgreich verwendet worden. Die Verwendung von Detergenzien und Nukleasehemmern in natriumiodidhaltigen Lösungen ist in der Technik bekannt. Die Verwendung von Wasserstoffbindungsbrechern und Detergenzien beim Helfen, Zellproben zu lösen, ist ebenfalls in der Technik wohlbekannt.
  • Ein neuer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der, daß der Lösungsvorgang einer biologischen Probe in einer starken Chaotroplösung Nukleinsäuren in der biologischen Quelle zum Sondieren mittels des Verfahrens der molekularen Hybridisierung zugänglich macht. Nachdem die biologische Quelle im wesentlichen gelöst ist, wird die molekulare Hybridisierung einfach durch Zusetzen einer Gensonde und Inkubieren der Lösung oder Suspension bei Umgebungs- oder leicht erhöhter Temperatur, typischerweise 20-37ºC, während eines von einigen Minuten bis mehrere Stunden reichenden Zeitraums erreicht. Spezielle Beispiele einer Flüssig-Flüssig-Hybridisierung werden nachstehend angegeben. Wahlweise kann die Sonde als Teil der chaotropen Lösung zugesetzt werden.
  • Der Flüssig-Flüssig-Hybridisierungstest der vorliegenden Erfindung ist zur DNA- oder RNA-Untersuchung einer biologischen Probe geeignet. Hybride wurden zwischen ³²P-markierten RNA-Sonden und Nukleinsäuren in Zellysaten gebildet. Tierische Zellen oder lysozymbehandelte Bakterien wurden durch Zentrifugieren geerntet und in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA mit oder ohne 1 M NaCl in einem Verhältnis von 1 ml Lösungsmittel auf 10&sup7; Zellen gelöst. Die Zellen lösten sich bei Raumtemperatur leicht nach 2-3 Minuten Rühren und ergaben eine klare, mäßig viskose, bernsteinfarbene Lösung. Die gelösten Zellen wurden bei -70º aufbewahrt, außer als sie zum Entfernen aliquoter Mengen für Tests aufgetaut wurden. Die Lösungsviskosität erniedrigte sich nach 1-2 Gefrier- Tau-Vorgängen.
    • ZIEL-DNA
  • Die Hybridisierung von RNA-Sonden mit Ziel-DNA wurde durch leichtes Erhitzen der gelösten Zellen auf 60º oder darüber während 5 Minuten zum Denaturieren von DNA, dem Zusetzen einer Sonde, Inkubieren bei Raumtemperatur oder darüber und Abfangen von Sonden-RNA: Ziel-DNA-Hybriden auf einer Nitrozellulosemembran, wie in Beispiel 10 ausgeführt, bewerkstelligt. Typischerweise wurde das Äquivalent von 10&sup5; peripheren Blutlymphocyten in 10 ul 5 M GuSCN/0,1 M EDTA gelöst. Zweieinhalb Mikroliter, die 5 ng RNA-Sonde enthielten, welche in 2xSSC/0,1 M EDTA gelöst war, wurden zugesetzt und die Hybridisierung wurde während 5 Minuten bei 25º bewerkstelligt. Hybride wurden durch Szintillationszählen oder Radioautographie sichtbar gemacht.
    • RNA
  • Die Hybridisierung von RNA-Sonden mit Ziel-RNA wurde durch Zufügen der Sonde zu gelösten Zellen, Inkubieren bei Raumtemperatur oder darüber, Abbauen unhybridisierter Sonde mit RNAase, Fällen hybridisierter Sonde mit TCA und Sammeln der Fällung auf einer Nitrocellulosemembran, wie in Beispiel 15 beschrieben, bewerkstelligt. Typischerweise wird das Äquivalent von 10&sup5; peripheren Blutlymphocyten in 10 ul 5 M GuSCN/0,1 M EDTA gelöst. Zweieinhalb Mikroliter 2xSSC/0,1 M EDTA, die 5 mg Sonde enthalten, werden zugesetzt und die Hybridisierung wird während 5 Minuten bei 25º bewerkstelligt. Hybride werden durch Szintillationszählen oder Radioautographie sichtbar gemacht.
  • Was die Handhabung von Daten aus der Flüssig-Flüssig-Version der vorliegenden Erfindung betrifft, werden im wesentlichen dieselben Regeln angewandt, wie sie in Abschnitt 4 der vorstehenden "Genauen Erörterungen" dieser Anmeldung beschrieben sind.
  • Mehrere chaotrope Salze sind erfolgreich zur Probenvorbereitung (siehe Beispiel 3) verwendet worden und zwei, NaI und GuSCN, sind auf das Unterstützen der molekularen Hybridisierung getestet worden (siehe Beispiel 6, Fig. 5). Beide chaotropen Salze funktionierten gut, wobei sie bessere molekulare Hybridisierungsergebnisse als die Standardsysteme (Formamid und Phosphat) ergaben, aber GuSCN wurde bevorzugt, weil es unerwarteterweise die Geschwindigkeit der Molekularhybridisierung mehr als 100fach verglichen mit dem NaI-System beschleunigte.
    • Kits zur molekularen Hybridisierung einer löslichgemachten Nukleinsäureprobe
  • Ein beispielhafter Kit für die molekulare Hybridisierung einer löslichgemachten Nukleinsäureprobe gemäß der vorliegenden Erfindung kann wenigstens ein dunkles Plastikröhrchen mit festem GuSCN und festem Tetranatrium-EDTA enthalten, dem H&sub2;O oder eine Körperflüssigkeit zugesetzt werden kann, um eine Lösung von 5 M GuSCN/0,1 M EDTA zu liefern. Sollte H&sub2;O zugesetzt werden, kann die sich daraus ergebende Lösung einer biologischen Probe in einem Verhältnis von 1 ml je 10&sup7; Zellen oder dem Äquivalent zugesetzt werden, um eine löslichgemachte biologische Probe zu liefern. Wahlweise kann eine vorgefertigte Lösung eines Chaotrop bereitgestellt werden. Der Kit kann ferner eine Sonde zum Untersuchen einer vorgegebenen Sequenz in der biologischen Probe enthalten, wobei die Sonde in einer Menge zum Ausführen von etwa 20 Tests (z. B. 100 ng Sonde) bereitgestellt wird. Die Sonde kann fertig zum Gebrauch (z. B. bereits markiert) oder in einer zum Markieren durch den Anwender geeigneten Vorläuferform bereitgestellt werden. Die Sonde kann auch Teil der chaotropen Lösung sein.
  • Der Kit kann auch eine "positive Kontrolle" und "negative Kontrolle" für die biologischen Proben enthalten, die in dem Chaotrop gelöst sind, wobei die biologischen Proben bekannte Mengen spezieller Nukleinsäuren besitzen, und die Ergebnisse der molekularen Hybridisierungen, die an den Proben ausgeführt wurden, Zahlenwerte liefern, um Ergebnisse an unbekannten biologischen Testproben mengenmäßig zu bestimmen.
  • Der Kit kann auch Materialien und Vorrichtungen zum Hybridnachweis enthalten, zum Beispiel Filtrationslösungen, Blockiermittel, Membranen, Nukleaselösungen, Trichloressigsäure, Hydroxyapatit usw.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiter zum Nachweisen oder mengenmäßigen Bestimmen von HIV-Nukleinsäuren in Patienten geeignet. Ein Dilemma des Untersuchens einer HIV-Belastung bei der ARC-Risiko-, ARC- oder AIDS-Diagnose ist, daß direkte Tests von Virusantigenen oder der Virusinfizierbarkeit in einem Prozentsatz von Fällen schwierig oder unmöglich sein kann, weil die Virämie vorübergehend ist und durch natürliche Immunmechanismen während der Erkrankungen unterschiedliche Ausmaßen gegenübersteht. Diese Schwierigkeit verschlimmert sich, falls Patienten mit antiviralen Antikörpern behandelt werden oder induziert werden, sie zu entwickeln. Weiterhin können nichtproduktiv infizierte Zellen (z. B. Ernten eines latenten oder defekten Virus) zu Erkrankungen beitragen, ohne Virusantigene oder wiederaufnehmbare infektiöse Zentren aufzuweisen. Die Empfindlichkeit, Geschwindigkeit, Vielseitigkeit und Automatisierbarkeit der vorliegenden Erfindung macht jedoch einen derartigen Nachweis und eine mengenmäßige Bestimmung möglich.
  • Indem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird dieselbe durch Bezug auf die folgenden Beispiele, die hier nur zum Zweck der Veranschauung angeführt werden, und solange nicht anders angegeben nicht als einschränkend anzusehen sind, besser verständlich.
    • Beispiel 1 Umkehrsondieren in einer Lösung eines chaotropen Salzes mittels einer immobilisierten Sonde
  • Von dem Ausdruck "Umkehrsondieren" wird hier angenommen, daß er ein Verfahren bedeutet, bei dem Zellen direkt in einer starken Lösung eines chaotropen Salzes gelöst werden, zum Denaturieren von DNA und Zerstören von DNA erhitzt werden oder wahlweise nicht erhitzt werden, anschließend mit einer sondenhaltigen Membran unter Bedingungen der molekularen Hybridisierung und unter Bedingungen, wo eine direkte Wechselwirkung zwischen gelösten Nukleinsäuren und der Membran auf ein Mindestmaß zurückgeführt worden sind, inkubiert werden. Dieses Verfahren begünstigt die Hybridisierung zwischen der immobilisierten Sonde und Zellnukleinsäuren, die zu der immobilisierten Sonde komplementär sind. Wenn Zellen erhitzt werden, hybridisiert Zell- DNA mit der immobilisierten Sonde; wenn Zellen nicht erhitzt werden, hybridisiert Zell-RNA mit der immobilisierten Sonde. Das Umkehrsondieren verwendet die chemischen Prinzipien chaotroper Salze, die für den Immobilisierungsprozeß dieser Erfindung zentral sind.
  • In den vorangehenden speziellen Ausführungsformen und Beispielen wurden Nukleinsäuren aus Zellen, Viren, Bakterien usw.
  • auf einem festen Träger in NaI immobilisiert, anschließend mit einer reinen, radioaktiven, fluoreszierenden oder auf andere Weise gekennzeichneten Sonde hybridisiert, die in einer geeigneten Lösung zum Fördern der molekularen Hybridisierung gelöst war. Das Umkehrsondieren stellt eine unterschiedliche Konfiguration dar. Beim Umkehrsondieren kann die Sonde auch auf NC, Nylon oder einem anderen Membrantyp immobilisiert sein, wobei die vorliegende Erfindung oder eine andere Technik verwendet wird, anschließend kann die Hybridisierung durch Lösen von Zellen, Bakterien, Hefen, Viren usw. oder subzellulären Fraktionen davon in einem chaotropen Salz wie etwa NaI in Anwesenheit von Additiven wie etwa Detergenzien, Proteinen, Oligonukleotiden usw., welche die direkte Wechselwirkung zwischen DNA oder mRNA und der Membran verringern, und Inkubieren des sich daraus ergebenden Gemischs mit dem sondenhaltigen Filter, immobilisiert werden. Die Hybridbildung kann durch irgendeines von mehreren Mitteln nachgewiesen werden.
  • Zum Beispiel kann durch Einschließen einer gekennzeichneten Sonde, die zu der immobilisierten Sonde komplementär ist, in der Lösung die Hybridbildung zwischen gelöster Zell-DNA, RNA und der gekennzeichneten oder immobilisierten Sonde (DNA oder RNA) durch Reduktion (Konkurrenz) bei der Hybridisierung zwischen der gekennzeichneten Sonde und ihrem immobilisierten Gegenstück (Fig. 1) gemessen werden. Wir nennen dies "konkurrierende Umkehrsondierung". Fig. 2 stellt einen Versuch zum Veranschaulichen dieses Prinzips dar, welche die Messung menschlicher wiederholter DNA in 10&sup6;, 2·10&sup6; oder 4·10&sup6; Blutzellen zeigt. NC-Membranen, die 3 Mikrogramm menschliche wiederholte DNA enthielten, wurden durch die vorliegende Erfindung hergestellt. Eine radioaktive Sonde menschlicher wiederholter DNA wurde durch Nick-Translation hergestellt. Mononukleäre Blutzellen wurden in NaI gelöst, das 1% Brij® 58 enthielt, und anschließend wurden zweifache aliquote Mengen von 1 ml NaI/Brij® 58, die 0, 10&sup6;, ·10&sup6; oder 4·10&sup6; Zellen enthielten, hergestellt. Jeder aliquoten Menge wurden 106 cpm radioaktive menschliche DNA (etwa 10&supmin;² Mikrogramm) zugesetzt. Ein Satz Lösungen wurde anschließend zum Denaturieren von DNA 20 Min. gekocht. Eine DNA-haltige Membran wurde jeder Lösung zugesetzt. Die Hybridisierung wurde durch 17 Std. Inkubation bei 37º ausgeführt, anschließend wurden umgesetzte Nukleinsäuren von den Filtern abgewaschen. Die Filter wurden der Radioautographie unterzogen, anschließend wurde die Radioaktivität durch Szintillationszählen mengenmäßig bestimmt. Beide Ergebnisse werden in Fig. 2 dargestellt. Es ist zu ersehen, daß in den gekochten Proben eine merkliche Konkurrenz in dem Ausmaß auftrat, daß berechnet werden kann, daß 10&sup6; menschliche Zellen 2-3 Mikrogramm DNA enthalten. Da 10&sup6; menschliche Zellen 6 Mikrogramm DNA enthalten, von der etwa 40% wiederholte DNA ist, ist dieses Ergebnis in ausgezeichneter Übereinstimmung mit dem erwarteten.
  • Viele Änderungen sind möglich. Spezielle DNA-Sequenzen können durch Verändern der Sonden gemessen werden. Sonden, die aus geklonter Hepatitisvirus-DNA bestehen, erlauben den Nachweis und die mengenmäßige Bestimmung von Hepatitisvirusgenomen oder mRNA in Zellen. Die Immobilisierung von 1 Picogramm Sonde gestattet den Nachweis von 10&sup6; Virusgenomen. Das Verwenden anderer Virussonden gestattet den Nachweis anderer Virusgenome. Das Auslassen des Kochschritts und/oder der Herstellung subzellulärer Fraktionen gestattet den Nachweis von RNA anstatt von DNA. In diesem Fall sollte die markierte Sonde einzelsträngig und von derselben Sequenz wie die RNA sein und die sondenhaltige Membran sollte mit einer Vorhybridisierungslösung vorbehandelt sein. Virus-RNA kann mit diesem Verfahren mittels Virussonden nachgewiesen und mengenmäßig bestimmt werden. Zell-RNA kann mittels klonierter Gensonden wie etwa der myc-Gensonde nachgewiesen und mengenmäßig bestimmt werden, aber selbstverständlich nicht auf diese Gensonde beschränkt. DNA- oder RNA- Sonden können verwendet werden. Andere Membranen als NC können verwendet werden, solange wie 1) die Sonde-Membrankomplexe hergestellt werden können und 2) die Hybridisierung mit der immobilisierten Sonde in Abwesenheit direkt gelöster Nukleinsäuremembran Wechselwirkungen während der molekularen Hybridisierung auftreten können.
  • Die direkte Sichtbarmachung anstatt der konkurrierenden Hybridisierung ist ebenfalls möglich. Das vorstehend beschriebene Experiment wurde wiederholt, wobei die radioaktive Sonde weggelassen wurde. Anstatt das Ergebnis der molekularen Hybridisierung durch eine Radioautographie zu bestimmen, wurden die Membranen in eine Lösung eingetaucht, die 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthielt. Die Filter wurden anschließend unter UV-Licht zum Nachweisen doppelsträngiger Nukleinsäuren auf der Membran sichtbar gemacht. Keine derartigen Strukturen wurden nachgewiesen, wenn die Zellen weggelassen wurden. Eine Fluoreszenz wurde, in allen Fällen erhalten, wo die Zellen gekocht wurden, was direkt zeigt, daß die Hybridisierung zwischen der gelösten denaturierten Zell-DNA und der immobilisierten Sonde aufgetreten war. Wir nennen dies "lackmusartiges Umkehrsondieren".
  • Alle vorstehend für die konkurrierende Umkehrsondierung beschriebenen Änderungen sind auch für die lackmusartige Umkehrsondierung möglich. Außerdem sind viele andere Verfahren zum Nachweisen von Hybridstrukturen möglich, einschließlich der Verwendung spezieller Antikörper, Avidin-Biotin-Komplexe, radioaktiver Nachweissysteme, Interkalatoren usw., ohne darauf beschränkt zu sein.
  • Das konkurrierende Umkehrsondieren und lackmusartige Umkehrsondieren haben wegen des Immobilisierungsprinzips, das für diese Patentanmeldung zentral ist, Erfolg. Chaotrope Salze können zum Lösen von Zellen, Denaturieren von Nukleinsäuren, Verhindern einer Nukleaseaktivität und Fördern einer speziellen Nukleinsäurehybridisierung verwendet werden. NaI ist in der chaotropen Reihe enthalten und wird als Prototyp eines chaotropen Salzes für das Immobilisierungsverfahren verwendet. Guanidinthiocyanat ist ebenfalls mit gleichem Erfolg verwendet worden und vermutlich sind andere chaotrope Salze, wie etwa Natriumperchlorat, Natriumtrichloracetat, Natriumtrifluoracetat usw., auch brauchbar. Detergenzien führen DNA-Membran-Wechselwirkungen, ein kritischer Aspekt von Umkehrsondierungstechniken wie es bei Standard-Immobilisierungsmethoden der Fall ist, auf ein Mindestmaß zurück. Wir erwarten, daß andere Merkmale der vorliegenden Erfindung, wie etwa Selektivität auf mRNA, auch zum Erfolg der Umkehrsondierungsvariation beitragen, zum Beispiel wenn synthetische RNA-Sonden verwendet werden.
    • VERGLEICHSBEISPIEL 2 Anwendung der vorliegenden Immobilisierungstechnologie
  • Beispiel 1 handelte hauptsächlich vom Wert der Immobilisierung, die mit der molekularen Hybridisierung gekoppelt ist, beim Erhalten genauer Messungen der Menge einer speziellen mRNA, die aus einer vorgegebenen Zahl Zellen immobilisiert ist. Die vorliegende Erfindung richtet sich selbst auch auf Verfahren für Bestimmungen einer mRNA-Struktur sowohl zum Klonieren von Kopien von mRNA-Populationen in Zellen, als auch auf das Reinigen, Analysieren und Klonieren einzelner mRNA-Spezies. Der Stand der Technik bei diesen Verfahren wird nachstehend umrissen.
    • mRNA-Struktur #1: Modifizierter S1-Nukleasetest
  • Die Struktur einer immobilisierten mRNA kann durch Messen der Größe der Sonde bestimmt werden, die mit einer immobilisierten RNA hybridisiert, mit S1-Nuklease verdaut und vom Filter freigesetzt wurde (Fig. 3). Der Versuch ist durch Hybridisieren langer Einzelstränge markierter menschlicher DNA an immobilisierte nukleäre RNA aus leukämischen Leukocyten, Verdauen unhybridisierter Sonde zu Nukleotiden mit S1-Nuklease, Freisetzen einer S1-resistenten Sonde aus dem Filter und ihr Analysieren durch Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel erfolgreich bewerkstelligt worden.
  • Die mRNA-Immobilisierung und Hybridisierung wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Der das DNA-mRNA-Hybrid enthaltende Fleck wurde ausgeschnitten und in eine Lösung verbracht, die 1000 E/ml S1-Nuklease enthielt, und wurde 5-10 Min. bei 45º inkubiert. In diesem Experiment verblieb unverdaute Sonde auf dem Filter. Unverdaute Sonde kann aus dem Filter freigesetzt werden, falls die S1-Nuklease Ribonuklease enthält oder wenn Hybride mit immobilisierter DNA gebildet werden.
  • Nach der Verdauung durch S1 wurde der Filterfleck aus der Lösung entfernt, mit kaltem, 0,01xSSPE gewaschen, anschließend 15 Sek. in kochendes 0,01xSSPE eingetaucht. Die freigesetzte Sonde wurde durch Elektrophorese in Polyacrylamid fraktioniert und die Ergebnisse wurden durch Radioautographie angezeigt.
  • Es gibt bei diesem Verfahren keine offensichtlichen Nachteile, die dem ursprünglichen Berk-Sharp-S1-Nukleasetest nicht innewohnen (Berk und Sharp, Cell 12 : 721-726).
    • mRNA-Struktur #2: Modifizierter Northern-Transfer
  • Im Prinzip kann mRNA aus einer Membran mit reinem Formamid freigesetzt, durch Elektrophorese in Polyacrylamid fraktioniert, anschließend zur Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde auf eine andere Membran überführt werden. In der Praxis ist mRNA, die aus NC freigesetzt worden ist, revers transkribiert und translatiert worden (Bresser et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1983) und ist erneut zur molekularen Hybridisierung auf NC aufgebracht worden (J. Bresser, unveröffentlichte Beobachtungen), ist aber noch nicht durch. Elektrophorese in Agarose erfolgreich fraktioniert worden. mRNA ist wie vorstehend beschrieben immobilisiert und freigesetzt worden. Die freigesetzte mRNA ist durch Elektrophorese in Polyacrylamid wie beschrieben fraktioniert worden (Bresser et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1983), anschließend wurde das Gel der Radioautographie unterzogen. In allen bis jetzt untersuchten Fällen zeigte die mRNA nach der Freisetzung von NC eine niedrigere elektrophoretische Beweglichkeit als vor der Immobilisierung. Der Grund dafür befindet sich in Untersuchung.
  • Nach der Elektrophorese kann mRNA auf NC entweder durch-das Thomassche Verfahren (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 : 5201-5205) mittels NaCl oder durch Verwenden von NaI (Bresser et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1983) überführt werden. Eine geringere Überführung erfolgt beim Verwenden von NaCl, das auf NC ein schärferes Abbild erzeugt. In NaI überführte mRNA ist biologisch aktiv und kann revers transkribiert oder translatiert werden.
    • Klonieren von Kopien von mRNA-Populationen in Zellen
  • Der Aufbau von "mRNA"-Banken aus definierten Zellpopulationen ist ein wichtiges Forschungswerkzeug geworden. Da aus einer geringen Zellzahl immobilisierte mRNA zu cDNA voller Länge revers transkribiert werden kann (Bresser et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1983), ist ein rasches Klonierverfahren möglich. Ein Problem bestand in der niedrigen Wirksamkeit der Transkription immobilisierter mRNA, aber die Wirksamkeit der reversen Transkription ist durch (I) Weglassen der EtOH- und Acetanhydrid- Einweichungen, die Teil der "mRNA-Immobilisierung" sein können; (II) Weglassen des Salzes während der mRNA-Filter-Vorwäschen; und (III) des Verwendens von NH&sub4;Ac während der Fällung bedeutend erhöht worden. Die Synthese eines zweiten Strangs aufimmobilisierter mRNA ist nicht bewiesen worden, wird aber aus der Tatsache angezeigt, daß cDNA aus dem Filter freigesetzt wird, wenn Actinomycin D nicht in dem Synthesegemisch enthalten ist (J. Bresser, unveröffentlichte Beobachtung).
    • Klonieren gereinigter mRNA durch eine Immobilisierungstechnologie
  • Das Klonieren spezieller mRNA aus unterschiedlichen Zellen liefert ein Reagenz zum genauen Erklären der Unterschiede bei der Regulierung der wichtigsten mRNA. Der Ablauf für dieses Verfahren ist:
  • Elektrophoretisches Fraktionieren von mRNA in Polyacrylamid.
  • Überführen der mRNA in NaI auf NC.
  • Lokalisieren der entsprechenden mRNA-Arten durch molekulare Hybridisierung.
  • Abschmelzen der hybridisierten Sonde.
  • Reverses Transkribieren der entsprechenden mRNA.
  • Klonieren der cDNA und Durchmustern von Rekombinanten.
  • Dieses Verfahren verträgt sich mit jedem Verfahren zur mRNA- Reinigung. Es ist eindeutig, daß, je einfacher das Verfahren der mRNA-Reinigung ist, desto wirkungsvoller das Gesamtverfahren ist. Idealerweise liefert die vorstehend unter "mRNA- Struktur #2: Modifizierter Northern-Transfer" umrissene mRNA- Reinigung für diesen Versuch geeignete mRNA-Populationen.
  • Der mRNA-Transfer von Polyacrylamid auf NC muß in NaI durchgeführt werden (Bresser et al., Proc. Nat. Acad. Sci., im Druck, 1983), um die biologische Aktivität zu erhalten. Das Verfahren dafür ist wie folgt: Polyacrylamidgele wurden in gesättigtem NaI 30-60 Min. eingeweicht. Das Gel wurde mit einem Bogen NC überschichtet, der in Wasser, anschließend in 1 M NaCl, anschließend in gesättigtem NaI eingeweicht worden war. Das NC wurde mit Saugpapiertüchern überschichtet. Einer Überführung wurde gestattet abzulaufen, bis eine Menge NaI-Lösung, welche dem zehnfachen Volumen des Gels äquivalent war, durch das Gel hindurchgegangen war. Die NC wurde aus dem Polyacrylamid abgezogen und in H&sub2;O eingeweicht.
  • Sobald die gesamte Zell-mRNA auf NC überführt worden war, können die entsprechenden mRNA-Spezies durch molekulare Hybridisierung nachgewiesen werden. Die mRNA-haltige Bande kann anschließend genau aus der Membran ausgeschnitten werden und die Sonde kann nötigenfalls durch Eintauchen der Membran in siedendes 0,01xSSPE entfernt werden. Die reverse Transkription und das Klonieren können den in dem vorigen Abschnitt umrissenen Verfahren folgen. Insgesamt liefert dieser Weg ein äußerst rasches und wirkungsvolles Mittel zum Klonieren von DNA-Kopien spezieller mRNA in Fällen, wo eine mRNA-Anreicherung nützlich ist.
    • Beispiel 3 Immobilisierungen mittels verschiedener chaotroper Salze
  • K562-Zellen wurden mit Hankschen Salzen gewaschen, die 50 ug/ml Cyclohexamid und 10 mM Vanadylnukleoside enthielten, und in demselben Puffer erneut zu 10&sup7; Zellen/ml suspendiert. Aliquote Mengen von 1 ml wurden in einzelnen Eppendorf-Zentrifugenröhrchen verteilt und 10 Min. bei 3000 Upm zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Jedes einzelne Pellet wurde in einer 5-M-Salzlösung suspendiert. Die verwendeten Salze waren Natriumchlorid (NaCl), Kaliumchlorid (KCl), Kaliumbromid (KBr) (B), Kaliumacetat (KAc), Kaliumiodid (KI), (GSCN), Guanidinhydrochlorid (GH), Natriumperchlorat (NaClO&sub4;), Natriumtrifluoracetat (NaCF&sub3;COO) und Natriumtrichloracetat (NaCCl&sub3;COO). Lösungen von NaCl, KCl, KAc und KBr erzeugten trübe, nichtviskose Zellsuspensionen. Eine derartige Trübung wird durch Lichtstreuung von ungelösten Teilchen (wie etwa ganze Zellen) in den Lösungen hervorgerufen. Deshalb lösen diese Salze Zellen nicht. Lösungen von KI, NaI, GSCN, NaClO&sub4;, NaCF&sub3;COO und NaCCl&sub3;COO erzeugten klare (nichttrübe), leicht viskose Lösungen, die gelöste Zellen mit freier doppelsträngiger DNA darstellten. Das Erhitzen dieser Lösungen auf 90º beseitigte die Viskosität durch Denaturieren der DNA. Das Erhitzen der Suspensionen auf 90º bewirkte ein Verklumpen des Zellmaterials. Somit sind NaCl, KCl, CAc, GH und KBr nicht-chaotrope Salze. Die anderen Salze sind chaotrop.
  • Ein Zehntel Milliliter jeder Lösung wurde durch Nitrocellulose- und Nylonmembranen zum Immobilisieren von DNA filtriert. Nicht erhitzte Lösungen wurden bei Raumtemperatur, 20-22º Celsius, filtriert. Erhitzte Lösungen wurden filtriert, während sie heiß waren, über 50º. Die Filtration verlief in den Fällen nichtchaotroper Salze langsam oder überhaupt nicht, und rasch in den Fällen der chaotropen Salz. Die Membranen wurden dreimal in 20xSSC (3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat) gewaschen, wurden anschließend in Vorhybridisierungslösung eingeweicht und anschließend mittels einer abl-Oncogensonde, die radioaktiv war, hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen gewaschen, der Radioautographie unterzogen, anschließend wurden einzelne Flecken wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeschnitten und gezählt. Immobilisierungen von DNA aus Zellen, die in Lösungen chaotroper Salze erhitzt wurden, und von mRNA aus Zellen in nicht erhitzten Lösungen chaotroper Salze erzeugten ein intensives Signal der molekularen Hybridisierung, während die versuchte mRNA- oder DNA-Immobilisierung aus Zellen in Lösungen nicht-chaotroper Salze ein viel geringer intensives Hybridisierungssignal ergab. Der Grund für dieses niedrige Signal bei nicht-chaotropen Salzen war ein mehrfacher: nur ein Teil der Probe wurde durch die Membran filtriert, bevor sie sich zusammenballte, noch an der DNA oder mRNA haftende Proteine behinderten die Immobilisierung (Bresser, J., Doering, G. und Gillespie, D., DNA 2 : 243-254 (1983), Koimmobilisieren von Proteinen und Schritte der Nachhybridisierung (Gillespie, D. und Spiegelman, S., J. Mol. Biol. 12 : 829-842, 1965, verglichen mit Bresser, J., Doering, G. und Gillespie, D., DNA 2 : 243-254, 1983) usw. Dieser Versuch zeigt, daß die Salze der chaotropen Reihe bei der DNA-Immobilisierung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, während es nicht-chaotrope Salze nicht sind.
  • Der Versuch wurde mit einem 3 : 2-Gemisch der vorstehend angeführten Salzlösungen und DMSO wiederholt. Dieselben vorstehend bemerkten nicht-chaotrop-chaotropen Unterschiede ohne DMSO wurden auch mit DMSO erkannt. Keine Unterschiede wurden erkannt, wenn die mit DMSO erhaltenen Ergebnisse mit den ohne DMSO erhaltenen verglichen wurden, außer daß DMSO-Lösungen weniger viskos waren.
  • Der Versuch wurde wiederholt, wobei 1% Brij® 58 in allen Lösungen enthalten war, und jegliches Erhitzen über Raumtemperatur vermieden wurde. Diese Bedingungen begünstigen eine mRNA- Immobilisierung statt einer DNA-Immobilisierung. Zellen, die in nicht-chaotropen Salzen plus Brij® 58 suspendiert waren, blieben trüb und nichtviskos, was wahrscheinlich unversehrte, ungelöste Kerne widerspiegelte. Chaotrope Salze plus Brij® 58 erzeugten erneut klare, leicht viskose Lösungen, die gelöste Zellen mit freier, doppelsträngiger DNA darstellten. In nichtchaotropen Salzen plus Brij® 58 suspendierte Zellen wurden langsam oder überhaupt nicht filtriert, während in chaotropen Salzen gelöste Zellen rasch filtriert wurden. Nach der Hybridisierung mit der radioaktiven abl-Sonde ergab mRNA, die aus in chaotropen Salzen gelösten Zellen immobilisiert war, wahrscheinlich aus den vorstehend für die DNA-Immobilisierung angeführten Gründen, ein intensives Signal der molekularen Hybridisierung. Dieser Versuch zeigt, daß alle Salze der chaotropen Reihen bei der mRNA-Immobilisierung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, während es die nicht-chaotropen Salze nicht sind.
  • Dieser Versuch wurde mit einem 3 : 2-Gemisch der vorgenannten Salzlösungen und DMSO wiederholt. Dieselben vorstehend ohne DMSO bemerkten nicht-chaotropen-chaotropen Unterschiede wurden mit DMSO ebenfalls bemerkt. Beim Vergleichen von Ergebnissen, die ohne DMSO erhalten wurden, mit denjenigen, die mit DMSO erhalten wurden, wurden keine Unterschiede bemerkt, außer daß DMSO-Lösungen weniger viskos waren.
    • Beispiel 4
  • Das chaotrope Verhalten-verschiedener Salze wurde mittels der in "ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG" angegebenen Definition gezeigt. 2·10&sup6; menschliche K562-Leukämiezellen wurden in einer zu 2 mg/ml äquivalenten Konzentration aus Kulturmedium pelletiert und in 5% Glycerin in Wasser als Kontrolle und in verschiedenen Salzlösungen suspendiert. Die Konzentration jedes Salzes war 5 molar. Chaotropes Verhalten wurde gezeigt, wenn die in den verschiedenen Salzlösungen suspendierten (oder gelösten) Zellen eine Abnahme der optischen Dichte (bei 600 Millimicron abgelesen) um einen Faktor von etwa 2, bezogen auf diejenige, welche von der Glycerin-Wasser-Kontrolle gezeigt wird, zeigten. Ein nicht-chaotropes Verhalten wird, wenn überhaupt, durch wenig Änderung (oder eine Änderung in der falschen Richtung, d. h. zu einer noch höheren optischen Dichte) der optischen Dichte gezeigt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1 Chaotropie verschiedener Salze 2 mg Zellen/ml Zahl Salz Optische Dichte&sup6;&sup0; 5% Glycerin in Wasser (Kontrolle) Kulturmedium NaCl Natriumacetat Kaliumacetat Kaliumbromid Guanidinhydrochlorid NaI NaClO&sub4; KI NaSCN KSCN Guanidin-SCN Natriumtrichloracetat Natriumtrifluoracetat
  • Auf der Grundlage des Vorstehenden ist leicht einzusehen, daß Kulturmedium und die Salze 3-7 nicht chaotrop sind. Die Salze 8-15 sind chaotrop.
    • Beispiel 5 Ein Versuch wurde ausgeführt, um die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit der Erfindung beim Nachweisen von Ziel-DNA-Sequenzen zu bestimmen. Ziel-DNa
  • Mit Eco R1 linearisierte SP64-Plasmid-DNA wurde in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA pH 7,0 verdünnt. Aliquote Mengen von 10 ul der DNA-Verdünnungen wurden in 500-ul-Eppendorf-Röhrchen doppelt hergestellt. Die Röhrchen wurden zugedeckelt, 5 Min. auf 60º erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und mit 5 ul einer in 2xSSC gelösten RNA-Sonde gemischt.
    • RNA-Sondenherstellung
  • Die RNA-Sonde wurde an einer supergedrehten SP64-DNA mittels SP6-RNA-Polymerase wie vom Hersteller, Promega Biotech., angegeben synthetisiert. Ein Mikrogramm DNA und 30 Einheiten RNA- Polymerase wurden 1 Std. bei 37ºC in 50 ul einer von Promega Biotech angegebenen Lösung plus Nukleosidtriphosphaten wie folgt inkubiert: 500 uM ATP, CTP und UTP plus 5 [LM GTP und 200 MC ³²P GTP (3000 C/m Mol). Nach Inkubation bei 37º wurde DNAase 1 (3 Einheiten von Promega Biotech) zugesetzt und die Inkubation wurde 15 Min. bei 37ºC fortgesetzt. Diethyloxydiformat (5 ul; Eastman Chemical; auch als Diethylpyrocarbonat bekannt) wurde zugesetzt und die Emulsion wurde 5 Sek. heftig gerührt. Das Volumen wurde mit TE-Puffer auf 200 ul eingestellt und unumgesetzte Nukleotide wurden durch Spinnchromatographie durch Sephadex G50, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, verlegt von Cold Spring Harbor (1982) ausgeführt, entfernt. Das Durchgeflossene wurde 0,4 M an NaCl gemacht, 20 Min. auf 100º erhitzt und durch 2 Lagen Nitrocellulose (BA85, Schleicher und Schuell) filtriert. Das Filtrat wurde mit 2xSSC auf 10&sup6; cpm/ul verdünnt und bei -20º aufbewahrt. Zur Langzeitlagerung wurde die Sonde aus 2 Volumen Ethanol gefällt, durch 15 Min. Zentrifugieren bei 12000 x g gesammelt, in 100% Formamid gelöst und bei -20º gehalten. Die Sonde wurde vor Gebrauch in 2xSSC fünffach verdünnt (Konzentration = 2·10&sup5; dpm/ul; ca. 2 ng/ul oder 5 ng/Hybridisierungsreaktion). Die Sonde stellte 600 nt der 3000 nt SP64-DNA dar.
    • Molekulare Hybridisierung
  • Sofort nachdem die Sonde zugesetzt war, wurde die Lösung in ein Bad von 37º überführt und dort 2 Std. gehalten, um die molekulare Hybridisierung zwischen der RNA-Sonde und der SP64-Ziel- DNA zu erlauben.
    • Hybridnachweis
  • Nach der Hybridisierung wurden 200 ul 2xSSC/0,1 M EDTA pH 7/50 ug je ml Polyadenylsäure dazugemischt und die sich daraus ergebende Lösung wurde durch Nitrocellulose (BA85, Schleicher und Schuell) in einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml/Min. filtriert. Die Nitrocellulose war in H&sub2;O gewässert und kurz in 2xSSC vor der Filtration eingeweicht worden. Der Großteil der unumgesetzten RNA-Sonde floß durch die Membran, während DNA und damit verbundene RNA-Sonde an der Membran gebunden wurden.
  • Nach der Filtration wurde die Membran 30 Min. bei 55º in 50 ml 2xSSC/20 ug je ml Ribonuklease A/20 Einheiten je ml Ribonuklease T1 eingeweicht. Dieser Schritt entfernt zufällig gebundene Sonde und hinterläßt nur hybridisierte, mit der Membran verbundene Sonde. Die Radioaktivität auf der Membran wurde durch Radioautographie mit Röntgenfilm (Fig. 4, Reihe A) abgeschätzt und durch Szintillationszählen (Fig. 4, Reihe B) mengenmäßig bestimmt.
  • Wie Fig. 4, Reihe A und B, zeigt, war die Menge RNA-Sonde, die mit der Membran verbunden war, eine direkte Funktion der Menge Ziel-DNA. Die geringste Menge DNA, welche ein erhöhtes Radioaktivitätssignal ("positive Hybridisierung") in diesem Versuch ergab, betrug 0,3 Picogramm DNA. Dies entspricht dem Nachweis von etwa 300000 DNA-Molekülen in Gengröße (ca. 1000 Nukleotide lang) in einem 3-Std.-Test. Diese Geschwindigkeits- und Empfindlichskeitsparameter liegen innerhalb der Erfordernisse der meisten Gelegenheiten, wo eine Gendiagnose zuerst verwendet wird. Da die Sonde nur 1/5 der Komplexität (Länge) des Ziels umfaßte, und da nur einer der zwei Zielstränge nachgewiesen wird, wurden 0,03 pg (30 Femtogramm) komplementäre Ziel-Sequenz in diesem Versuch gemessen.
  • Reihe B ist eine mengenmäßige Darstellung der Ergebnisse, wie die in Reihe A dargestellten. Es ist anzumerken, daß mit 5 ng Sonde die Menge hybridisierte Sonde genau der Menge vorhandener komplementärer Ziel-bNA entspricht, das heißt, die Hybridisierung ist im Hinblick auf die Sättigung von Zielstellen 100% wirksam.
  • Der Versuch wurde in einer einer Gendiagnose vergleichbareren Umgebung wiederholt. Die Zellen wurden zuerst in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA pH 7,0 in einem Verhältnis von 10&sup7; Zellen/ml gelöst. Dieses wurde wie folgt ausgeführt: Fünf Milliliter Blut wurden auf Heparin enthaltende Röhrchen aufgezogen. Mononukleäre Zellen wurden durch Zentrifugieren in Ficoll-Hypaque mittels Verfahren, die in der Technik Standard sind, hergestellt. Die mononukleären Zellen wurden mit PBS verdünnt, in einem Hämocytometer gezählt, durch Zentrifugieren pelletiert und 1 ml 5 M GuSCN/0,1 M EDTA pH 7,0 wurde für jeweils 10&sup7; pelletierte Zellen zugesetzt. Die Zellen lösten sich im wesentlichen nach 1-2 Min. leichtem Rühren auf.
  • Mit Eco R1 linearisierte SP64-Plasmid-DNA wurde in die Lösung gelöster Zellen verdünnt. Aliquote Mengen von 10 ul der DNA- Verdünnungen wurden doppelt in 500 ul Eppendorf-Röhrchen hergestellt. Die Röhrchen wurden zugedeckelt, 5 Min. auf 60º erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und sofort mit 5 ul der vorstehend beschriebenen RNA-Sonde gemischt. Die Inkubation bei 37º, Verdünnung in 2xSSC/0,1 M EDTA pH 7,0/50 ug je ml Polyadenylsäure, Filtration, Nukleasebehandlung, Filmen und Szintillationszählen wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Wie aus Reihe C von Fig. 4 zu ersehen ist, wurde im wesentlichen dieselbe Empfindlichkeit der mengenmäßigen Ziel-DNA- Bestimmung in Anwesenheit gelöster Zellen, wie in ihrer Abwesenheit erreicht. Dieses Ergebnis bestätigt, daß die vorliegende Erfindung erfolgreich zur Gendiagnose an einer klinischen Probe verwendet werden kann.
  • Der Versuch wurde wiederholt, um zu erfahren, ob die Erfindung bei einer Körperflüssigkeit anstelle einer Einzelzell-Suspension verwendet werden könnte. Zuerst wurde eine Lösung von 7 M GuSCN/0,14 M EDTA durch Mischen von 16,6 g festem GuSCN (Fluka Chemicals) mit 5,6 ml 0,5 M EDTA hergestellt. Das Volumen wurde auf 25 ml eingestellt und Feststoffe wurden durch leichtes Erhitzen aufgelöst. Aliquote Mengen von einem halben Milliliter wurden verteilt, während die Lösung warm war. Die Lösung verfestigte sich beim Kühlen auf Raumtemperatur.
  • Zwei Zehntel Milliliter ganzen, heparinisierten Bluts wurden einem Aliquot von 0,5 7 MGuSCN/0,14 M EDTA zugesetzt und das System wurde bei Raumtemperatur leicht geschüttelt, bis die Feststoffe im wesentlichen gelöst waren, typischerweise 1-2 Min.
  • Mit Eco R1 linearisierte SP64-Plasmid-DNA wurde in die Lösung des gelösten Bluts verdünnt und wie vorstehend beschrieben sondiert, außer daß 1) die Sonde in 5 M GuSCN hergestellt wurde, so daß das System bei 5 M GuSCN während der Hybridisierung gehalten wurde, 2) die Hybridisierung bei 23º ausgeführt wurde und 3) Hybride in 200 ul 2xSSC/0,1 M EDTA, pH 7/50 ug/ml Polyadenylsäure verdünnt wurden und durch BA85-NC wie vorstehend filtriert wurden. Es wurde im wesentlichen dieselbe Empfindlichkeit der mengenmäßigen Ziel-DNA-Bestimmung in Anwesenheit gelösten Bluts mit gelösten Zellen oder reiner GuSCN/EDTA- Lösung erreicht.
  • Der Versuch wurde wiederholt, um zu erfahren, ob die Erfindung an einem festen Gewebe verwendet werden könnte. Eine Biopsie eines Lungenkrebses wurde als ein übriggelassenes Stück aus einer pathologischen Studie erhalten. Die Gewebeprobe wurde gewogen und wurde anschließend auf einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Edelstahlbehälter gelegt. Nachdem das Gewebe gefroren war, wurde es mit einem in flüssigem Stickstoff gekühlten Pistill pulverisiert. Das Pulver wurde in ein Röhrchen überführt und 5 M GuSCN/0,1 M EDTA pH 7 wurde in einem Verhältnis von 1 ml je 10 mg Pulver zugesetzt. Nach 1-2 Min. leichtem Rühren war das Pulver im wesentlichen gelöst.
  • Mit Eco R1 linearisierte SP64-DNA wurde in die Lösung gelösten Gewebes verdünnt und wie für 5 M GuSCN ermangelndes Gewebe beschrieben sondiert. Es wurde im wesentlichen dieselbe Empfindlichkeit der mengenmäßigen Ziel-DNA-Bestimmung in Anwesenheit gelösten Gewebes wie mit gelöstem Blut oder gelösten Zellen oder mit reiner GuSCN/EDTA-Lösung erreicht (Daten nicht gezeigt).
  • Der Versuch wurde wiederholt, um zu erfahren, ob die Erfindung bei unversehrten Bakterien verwendet werden könnte. Die das SP64-Plasmid tragende E. coli wurde mit 2 mg/ml Lysozym 5 Minuten bei 25º inkubiert, wurde anschließend wie für ganzes Blut beschrieben 5 M GuSCN/0,1 M EDTA gemacht und 5 Minuten auf 60º erhitzt. Hybride wurden in 15 ul 3 M GuSCN/0,06 M EDTA mit 10 mg RNA-Sonde gebildet. Die Hybridisierung geschah 5 Minuten bei 25º. Die Ergebnisse wurden durch Radioautographie (Fig. 4D) und durch Szintillationszählen bestimmt. Die Nachweisempfindlichkeit des intrazellulären Plasmids wurde mit derjenigen einer äquivalenten Menge gereinigter, linearisierter DNA verglichen. Der Nachweis des intrazellulären Plasmids (2569 cpm hybridisiert) war etwa halb so wirksam, wie der Nachweis gereinigter DNA (5177 cpm hybridisiert). Die Unwirksamkeit folgte wahrscheinlich aus einem unvollständigen Hybrideinfang auf Nitrocellulose, da andere Nachweisverfahren mittels Oligodeoxynukleotidsonden gezeigt haben, daß Messungen des intrazellulären Plasmids 90-115% so wirkungsvoll sind, wie der Nachweis mit markierter DNA (M. Collins, persönliche Mitteilung). SDS war in einigen Proben enthalten, um bei der bakteriellen Lysis behilflich zu sein, wurde aber als unnötig befunden und behinderte tatsächlich die Hybridimmobilisierung. Eine Inkubation bei 105º kann anstelle der Lysozymvorbehandlung verwendet werden.
  • Der vorstehende Versuch veranschaulicht die Geschwindigkeit, mit der die Erfindung eingesetzt werden kann. Diese Geschwindigkeit wird auch durch den nachstehend beschriebenen Versuch veranschaulicht.
  • Der Versuch wurde wiederholt, um zu erfahren, ob die Erfindung an unversehrten Zellen zum Messen von HIV-Virus-RNA verwendet werden könnte. Einhunderttausend infizierte oder uninfizierte Lymphocyten wurden in 10 ul 5 M GuSCN/0,1 M EDTA/l M NaCl gelöst und 5 Minuten auf 60ºC erhitzt. Die Hybridisierung der gelösten Zellen mit 10 ng einer RNA-Sonde, die dem Pst1-EcoRigagpol-Fragment des HIV-Virus entsprach, wurde in 12,5 ul 4 M GuSCN/0,08 M EDTA/0,8 M NaCl 5 Minuten bei 25ºC ausgeführt. Die Hybridisierung wurde durch Szintillationszählen mengenmäßig bestimmt. Die Ergebnisse waren wie folgt: Kultur C (infiziert) = 5555 cpm hybridisiert, Kultur D (infiziert) = 3585 cpm hybridisiert, Kultur E (nichtinfiziert) = 1031 cpm hybridisiert und Kultur F (nichtinfiziert) = 1044 cpm hybridisiert. Da andere Versuche zeigten, daß die Reaktion kinetisch vollständig ist, da die Sonde eine spezifische Aktivität von 10³ cpm/pg besaß und da die Komplexität des Ziels 1500 Nukleotide betrug, zeigt das Ergebnis einen Durchschnitt von 13 Kopien je Zelle Virusgene in Kultur C und 7,5 Kopien je Zelle Virusgene in Kultur D. Auf diese Weise veranschaulicht dieser Versuch die Geschwindigkeit, Einfachheit und quantitative Natur der Erfindung.
  • Insgesamt veranschaulicht dieses Beispiel mehrere vorteilhafte Merkmale der Erfindung. Außer der Geschwindigkeit, Einfachheit und mengenmäßigen Bestimmung, wie vorstehend angeführt, zeigen die Versuche dieses Beispiels die Vielseitigkeit der Erfindung, wenn sie auf eine breite Vielfalt klinischer Proben angewendet wird.
  • Es ist weiter für den Fachmann offensichtlich, daß die verhältnismäßig kleine Zahl Manipulationen und die milden eingesetzten Temperaturen bedeuten, daß die Erfindung zur Automatisierung gut geeignet ist.
  • Alle diese Eigenschaften vereinigen sich synergistisch, um eine klinische Anwendbarkeit zu bieten, die im Stand der Technik nicht vorweggenommen ist.
  • Es ist anzumerken, daß die Praxis der Erfindung von der Natur der Sonde und dem Mittel des Hybridnachweises unabhängig ist. Zum Beispiel können Sonden, die zu einem unterschiedlichen Fragment des Virusgenoms komplementär sind, verwendet werden. Weiter sind doppelsträngige Sonden oder Oligonukleotidsonden anstelle einzelsträngiger Sonden mit ähnlicher oder gleicher Wirksamkeit verwendet worden. Mit Biotin markierte Sonden sind verwendet worden und andere mit Enzymen, Metallen oder Antigenen markierte hätten anstelle einer radioaktiven Sonde verwendet werden können. Die Photonenemission, welche aus einem Energietransfer-Vorgang folgt, oder irgendein anderes Verfahren hätte anstelle einer Filtration zum Messen des Ausmaßes der Hybridisierung verwendet werden können. Das Wesentliche der Erfindung mit Bezug auf dieses Beispiel 5 ist die wirksame Löslichmachung von DNA aus einer biologischen Probe und ihre Denaturierung, die im wesentlichen unmittelbar ihre Hybridisierung mit einer DNA- oder RNA-Sonde gestattet.
    • Beispiel 6 Ein Versuch wurde ausgeführt, um die Wirksamkeit der Flüssig-Flüssig-Hybridisierung in GuSCN, NaI und Formamid zu zeigen
  • Eine RNA-Sonde wurde wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt. Fünfundzwanzig pg RNA-Sonde wurden mit linearisierter, denaturierter SP64-DNA (siehe Beispiel 5) in 15 ul Hybridisierungslösung hybridisiert. Hybridisierungslösungen bestanden aus verschiedenen Konzentrationen von GuSCN oder NaI in H&sub2;O (2 M, 3 M, 4 M oder 5 M) oder 50% Formamid, 0,9 M NaCl/0,9 M Na- Citrat/0,014 M Na-Phosphat, pH 6,8. Die Hybridisierung wurde 2 Stunden bei 25, 37, 45 oder 55º ausgeführt.
  • Um die Hybridisierung mit überschüssiger Ziel-DNA zu messen, wurden in 15 ul mit 200 ng DNA-Ziel gebildete RNA-DNA-Hybride wie in Beispiel 10 beschrieben durch Nitrocellulose filtriert und der Radioautographie unterzogen. In 5 M GuSCN, welcher EDTA fehlte, in 2-3 M NaI oder in 50% Formamid/0,9 M NaCl verlief die Hybridisierung einer Spur einer RNA-Sonde (25 pg/15 ul) mit einem Überschuß DNA-Ziel (200 ng/15 ul) wirkungsvoll, wobei unter optimalen Bedingungen 90% der RNA-Ketten in RNA-DNA- Hybridstrukturen überführt wurden. Routinemäßig konnten 40-50% der eingesetzten Radioaktivität auf Hybride überführt werden, welche einer RNAase-Behandlung in 0,3 M NaCl bei 23º widerstanden.
  • Bei Versuchen mit nur einem mäßigen Überschuß Ziel-DNA (10 ng in 15 ul) verlief das Ausmaß der Hybridisierung von 25 pg RNA- Sonde in 2 Stunden bei nicht optimalen Bedingungen weniger wirkungsvoll, aber bei der Topt in 3-5 M GuSCN wurden über 90% Sonden-RNA-Ketten in Hybridkomplexen mit DNA eingefangen (Fig. 5A). Die Hybridisierungswirksamkeit in GuSCN betrug 50-100 Mal, soviel wie bei 50% Formamid/0,9 M NaCl bei 42ºC in parallelen Versuchen beobachtet wurde (Fig. 5B). Hybridisierungen in konzentriertem NaI verliefen unwirksam (Fig. 5C)
  • Die optimalen Bedingungen-schwankten mit schwankender GuSCN- Konzentration (Fig. 5). Niedrigere optimale Temperaturen korrelierten wie erwartet mit höheren GuSCN-Konzentrationen. Das Temperaturoptimum in 3 M GuSCN betrug über 55º, während in 5 M GuSCN die Topt bei etwa 37º lag. Nichtsdestotrotz erreichte die Hybridisierungsreaktion selbst mit niedrigen Sondenmengen in 2 Stunden über einen breiten Bereich von Bedingungen einen Abschluß (Fig. 5B).
    • Beispiel 7 Versuche wurden ausgeführt um die Geschwindigkeit der molekularen Hybridisierung in GuSCN zu bestimmen
  • Eine RNA-Sonde wurde wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt. Die RNA-Sonde wurde mit linearisierter, denaturierter SP64-DNA in 15 ul Hybridisierungslösung hybridisiert (siehe Beispiel 5). Die Hybridisierungslösung bestand aus verschiedenen Konzentrationen GuSCN in 0,1 M EDTA, pH 7,0. Die Hybridisierungen wurden bei verschiedenen Temperaturen über verschiedene Zeiträume ausgeführt.
  • Auf der Grundlage direkter Vergleiche mit Hybriden, die bei 37º in 50% Formamid in Sondenüberschuß (z. B. Beispiel 6) gebildet wurden, wurde die Hybridisierung in GuSCN um etwa das 100fache beschleunigt. Eine ähnlich rasche Kinetik wurde bei niedrigeren Sondenkonzentrationen (Fig. 6A und 6B) erhalten. Mittels 1,3 ng/ml Sonde und 0,25 ng/ml komplementärer Ziel-DNA waren die Hybridisierungen in 3 oder 4 M GuSCN in 5-10 Stunden im wesentlichen vorbei. Der Zeitpunkt der Vervollständigung zur Hälfte betrug etwa 3 Stunden, was einer C&sub0;tl/2 von 0,03·10&supmin;³ anstelle der 2·10&supmin;³ entsprach, welche für Nukleinsäuren der Komplexität 1 kb erwartet wurde. Dies beläuft sich auf eine berechnete 70fache Beschleunigung gegenüber den Standardbedingungen von Britten und Kohne (Science 161 : 529, 1968). Mit 1 M NaCl wurde keine weitere Beschleunigung erhalten. Die Hybridisierungsgeschwindigkeit war im wesentlichen über einen breiten Bereich der GuSCN-Konzentration bei 23º konstant (Fig. 6).
  • Hohe Chaotropkonzentrationen während der Hybridisierung erniedrigen die Topt der Hybridisierung und beschleunigen die Hybridisierungsreaktion. Die Topt-Werte schwanken wahrscheinlich mit jedem Chaotrop, wie von Hamaguchi und Geiduschek angegeben (J. Am. Chem. Soc. 84 : 1329, 1962). In der Praxis wurde GuSCN gegenüber NaI bevorzugt, weil die Hybridisierungswirksamkeit mit GuSCN immer besser war und weil die Beschleunigungen der Hybridisierungsgeschwindigkeit größer waren.
  • RNA-DNA-Hybridisierungen können bei Raumtemperatur in 3-6 M GuSCN ausgeführt werden. Die t½ bei Hybridisierungen mittels Nanogramm RNA und komplementäre Ziel-DNA je Milliliter beträgt 4 Stunden. Mit 100 ng Sonde je Milliliter gefahrene Hybridisierungen sind zu 75% oder mehr in 5 Minuten bei Raumtemperatur beendet.
    • Beispiel 8 Verwendung der Erfindung zur Virus-DNA-Diagnose an Ganzblutproben
  • Blut wurde in Heparin enthaltenden evakuierten Röhrchen sowohl zwei Personen mit aktiver Hepatitis und Hepatitis-B-Virus-DNA- Sequenzen in mononukleären Zellen als auch zwei normalen, virusfreien Freiwilligen entnommen. Fünf Mikroliter ungeronnenes Ganzblut wurden in einem 0,5-ml-Plastikröhrchen mit konischem Boden mit 5 Mikrolitern flüssigem, übersättigtem NaI gemischt. Fünf Mikroliter einer Lösung, die 10 ng Tricin, pH 7,0/0,1 mM Dithiotreit und 100 ng einer einzelsträngigen ³²P-markierten RNA-Sonde enthielt, die aus dem ganzen Hepatitis-B-Virusgenom bestand, wurden zugesetzt und die Lösung wurde gründlich gemischt. Die Sonde wurde wie in Beispiel 5 angegeben hergestellt, aber unter Verwenden einer rekombinanten SP64-DNA- Matrize, in die das gesamte Hepatitis-B-Virusgenom kloniert worden war. Die Lösung wurde zum Denaturieren der DNA-Probe 5 Minuten bei 90º inkubiert. Einige Röhrchen wurden auf ein Wasserbad von 37º überführt und dort 4 Std. inkubiert, um die molekulare Hybridisierung zu gestatten. Nach der Hybridisierung wurde die Lösung in ein Röhrchen entleert, das 350 Mikroliter 2xSSC/0,1 M EDTA/50 ug/ml Poly(A) enthielt. Die hybridisierten Sondenmoleküle wurden auf einer Nitrocellulosemembran durch Filtration unter schwachem Vakuum (siehe Beispiel 5) eingefangen. Einige Membranen wurden 30 Min. bei 37º in 0,4 M NaCl/0,05 M Tris, pH 7,2/20 g je ml RNAase A zum Zerstören restlicher, unhybridisierter RNA-Sonde inkubiert. Alle Membranen wurden 15 Min. in 0,4 M NaCl/0,05 M Tris, pH 7, bei Raumtemperatur eingeweicht. Das Ausmaß der Hybridisierung wurde durch Radioautographie mittels Röntgenfilm bestimmt und durch Analysieren der Radioaktivität auf der Membran in einem Szintillationszähler mittels herkömmlicher Techniken mengenmäßig bestimmt. Wie in Tabelle 5 ersehen werden kann, wurde ein größeres Hybridisierungssignal mit Blut aus Personen mit Hepatitis erhalten, verglichen mit den nicht befallenen Kontrollen, solange die 4-Std.-Inkubation zum Fördern der molekularen Hybridisierung eingeschlossen war. Tabelle 2 Blutquelle -RNAase +RNAase Normal Hepatitis
  • Nachweis viraler DNA-Sequenzen im Blut von Hepatitis-Patienten mittels der Erfindung.
  • Jede Zahl bedeutet den Durchschnitt aus drei Bestimmungen, gemessen durch Szintillationszählen.
  • Wahlweise wurde die RNA-Sonde durch eine einzelsträngige DNA- Sonde ersetzt, die aus dem gesamten Hepatitis-Virusgenom bestand, und das Hybridisierungsverfahren wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Nach der molekularen Hybridisierung wurde die Probe in 1 ml einer Lösung verdünnt, die 0,05 M Tris- HCl, pH 7,0/0,4 M NaCl/0,1 M ZnCl&sub2;/10 E S1-Nuklease enthielt, und 30 Min. zum Zerstören unhybridisierter Sonde bei 45 inkubiert, wie vom Hersteller, Worthington Biochemicals, beschrieben. Die hybridisierte Sonde wurde durch Denaturierung und Filtration durch Nitrocellulose gesammelt (Nygaard und Hall, 1964).
  • Bei allen diesen Versuchszuständen wurde die Hybridbildung mittels Blut aus den Patienten mit akuter aktiver Hepatitis und Hepatitis-Virus-DNA-Sequenzen in mononukleären Blutzellen mit der Hybridbildung mittels Blut, das aus den virusnegativen, normalen Kontrollen erhalten wurde, verglichen. Bei jedem Versuchszustand wurde mehr membrangebundene Radioaktivität (d. h. molekulare Hybridisierung) mit Blut aus den Personen mit Hepatitis erhalten.
    • Beispiel 9 Verwendung der Erfindung zur Bakterien-DNA-Diagnose bei Stuhlproben
  • Eine Stuhlprobe wurde von einem Kind mit Diarrhö erhalten. Einer aliquoten Menge wurde das Bakterium Campylobacter in einem Verhältnis von 10&sup4; Organismen je Milliliter Stuhl zugesetzt. Die Stuhlprobe wurde 0,5 g GuSCN zum Ergeben von 1 ml Lösung mit 5 M GuSCN zugesetzt. Die Probe wurde 5 Minuten bei 105º inkubiert.
  • Zehn Mikroliter Stuhlprobe wurden gründlich mit 2,5 ul einer Lösung gemischt, die 10 ng einer einzelsträngigen, ³²P-markierten RNA-Sonde enthielt, die aus dem Transkript von 10 Kb des Campylobactergenoms bestand. Die Proben wurden 30 Min. bei 23º inkubiert, um die molekulare Hybridisierung zu erlauben, und Hybride wurden wie in Beispiel 5 beschrieben nachgewiesen. Die aliquote Menge Stuhl, der Campylobacter zugesetzt worden war, lieferte merklich mehr molekulare Hybridisierung als die aliquote Menge Stuhl, der Campylobacter fehlte.
    • Beispiel 10 Verwendung der Erfindung zum Nachweisen von HIV- Virus-RNA in einer geringen Zellzahl
  • Nichtinfizierte und HIV-infizierte Zellen wurden in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA in einem Verhältnis von 10&sup7; Zellen/ml gelöst. HIV-infizierte Zellen wurden seriell in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA oder in die nichtinfizierten Zellen, die in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA gelöst waren, verdünnt. Aliquote Mengen von 10 ul wurden 2,5 ul, die 100 pg der im Beispiel 5 beschriebenen gag-pol-RNA- Sonde enthielten, zugesetzt. Die Hybridisierung wurde 48 Stunden bei 25º ausgeführt.
  • Nach der Hybridisierung wurden 200 ul 2xSSC/0,1 M EDTA/10 ug Poly(A)/4 ug RNAase A/4 E RNAase T1 zugesetzt und die unhybridisierte Sonde wurde während einer Inkubation von 30 Minuten bei 25º verdaut. Die Lösung wurde gekühlt, 10%ig an TCA gemacht und die hybridisierte Sonde wurde auf einer Nitrocellulosemembran mittels Verfahren gesammelt, die in der Technik Standard sind. Die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählen gemessen.
  • Aus Fig. 7 kann ersehen werden, daß die Menge der hybridisierten Sonde eine lineare Funktion der Zahl der infizierten Zellen von 100 bis 10000 Zellen ist, ob sie in 5 M GuSCN oder in infizierte Zellen verdünnt wurden, die in 5 M GuSCN gelöst waren. Schon 10 Zellen ergaben positive Hybridisierungswerte.
    • Beispiel 11 Verwendung der Erfindung zum mengenmäßigen Bestimmen von HIV-Virus-RNA in Zellen
  • HIV-infizierte Zellen wurden in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA in einem Verhältnis von 10&sup7; Zellen/ml gelöst. Zehn Mikrolitern Zellen wurden 5 ul einer Lösung zugesetzt, die verschiedene Mengen der in Beispiel 5 beschriebenen gag-pol-RNA-Sonde enthielten. Die Hybridisierung wurde 17 Stunden bei 25º ausgeführt. Die Hybride wurden wie in Beispiel 10 beschrieben weiter umgesetzt.
  • Aus Fig. 8 kann ersehen werden, daß die Hybridisierung mittels infizierter Zellen mit zunehmender Sonde rasch zunahm, anschließend ein "Plateau" erreichte und danach im wesentlichen im selben Verhältnis zunahm, wie wenn uninfizierte Zellen verwendet wurden. Der Höchstwert der Hybridisierung, abzüglich des Plateaus, ist der "Sättigungs"-Wert, d. h. der Wert der Menge hybridisierter Sonde, wenn alle Ziel-RNA-Stellen besetzt sind. Da bei Sondenüberschuß die Wirksamkeit des Sättigens von Zielstellen in 3 M GuSCN 100% beträgt (Fig. 4B von Beispiel 5), entsprechen die ug hybridisierter Sonde den ug der in der Probe vorhandenen Ziel-RNA. Deshalb zeigen die Ergebnisse von Fig. 7 200 beziehungsweise 150 pg Ziel-RNA je 10&sup5; Zellen Kultur C und D. Da die Sonde eine Komplexität von 1,5 Nukleotiden hat, gibt es 3250 beziehungsweise 3000 Moleküle Virus-RNA je Zelle in Kultur C und D.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Stärke der Erfindung zum mengenmäßigen Bestimmen der Zahl Ziel-RNA-Moleküle in einer klinischen Probe.
    • Beispiel 12 Messung von HIV-Nukleinsäuren in Patienten
  • Die vorliegende Erfindung-wurde an einer Reihe von 10 Patienten mit ARC und AIDS ausgeführt, die mit Ampligen behandelt wurden. Dieses nichtübereinstimmende dsRNA-Molekül ist sowohl ein antivirales Mittel als auch ein Immunverstärker und insbesondere ein wirksamer Hemmer der HIV-Infektion in vitro. Vor der Therapie zeigten alle 10 Patienten in dieser Studie im Kreislauf befindliche Antikörper gegen HIV, die mit den Hauptvirusproteinen einschließlich p24 reagierten. Außerdem waren die 10 Patienten HIV-positiv nach dem Kokulturtest bei zwei oder drei Gelegenheiten vor der Ampligen-Behandlung.
  • Die Zahl der RNA-Moleküle auf 250000 Zellen wurde durch molekulare Hybridisierung mit einer ³²P-RNA-Sonde, die zum 5'-Ende des gag-Gens und dem Großteil des pol-Gens von HIV (siehe Beispiel 5) komplementär ist, gemessen. Aus heparinisiertem Blut, durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation gereinigte, mononukleäre Zellen wurden anschließend durch Zentrifugieren geerntet und in 5 M GuSCN/0,1 M EDTA/10 mM DTT bei einer Konzentration von 10&sup7; Zellen/ml (siehe Beispiel 5) gelöst. Unter diesen Bedingungen lösen sich Lymphocyten im wesentlichen auf und Ziel-RNA wird in einer Form freigesetzt, die zur wirksamen molekularen Hybridisierung direkt geeignet ist. Die RNA-Sonde wurde direkt den GuSCN-gelösten Zellen zugesetzt und die molekulare Hybridisierung wurde 44 Stunden in 4 M GuSCN bei 26ºC ausgeführt. RNA- RNA-Hybride wurden durch das in Beispiel 10 beschriebene RNAase/TCA-Verfahren gereinigt.
  • Fig. 9 bis 11 sind grafische Abbildungen unter Verwenden der vorliegenden Erfindung, welche Änderungen zeigen, die durch eine Chemotherapie in AIDS-Virus-RNA bewirkt wird, die in Blutzellen von zehn Patienten mit AIDS oder ARC (AIDS-verwandter Komplex) vorhanden ist. Die Ergebnisse wurden Kokultur- und direkten Serumantigen-Messungen gegenübergestellt.
  • Die Hybridisierungen wurden mit 25 pg Sonde und 250000 Zellen in 4 M GuSCN bei 26ºC ausgeführt. Die Hybridisierungswerte wurden in die Zahl Ziel-RNA-Moleküle nach Subtrahieren der negativen Kontrollen überführt. Die negativen Kontrollen entsprachen 0,1-0,2% der eingesetzten Sonde. Ein cpm = 1500 - 3600 HIV-RNA-Moleküle, in Abhängigkeit von der spezifischen Aktivität der Sonde.
  • Vor der Ampligen-Therapie konnte HIV-RNA in Blutzellen von neun der zehn Patienten durch direkte molekulare Hybridisierung nachgewiesen werden (ausgefüllte Symbole auf der Ordinate, Figuren 14-16). Der zehnte Patient (Fari, Fig. 9) schien hybridisierungsnegativ nach der Subtraktion eines ungewöhnlich hohen negativen Kontrollwerts zu sein und kann aus diesem Grund falsch negativ gewesen sein. HIV-RNA-Werte lagen im allgemeinen bei 100000 Molekülen je 250000 mononukleären Blutzellen, was etwa einer infizierten Zelle auf 10&sup4; mononukleäre Blutzellen entspricht. Da die Hybridisierungen mit geringen Mengen Sonde durchgeführt wurden, sind dies Mindest-HIV-RNA-Werte. Serum- HIV-Antigen wurde in nur 5 der 10 Patienten vor der Behandlung nachgewiesen (Gibm, Bror, Edwd, Tawi, Fowi) (halbgefüllte Symbole der Fig. 9 bis 11).
  • HIV-RNA in im Kreislauf befindlichen Blutzellen, die durch molekulare Hybridisierung gemessen wurde, wurde bei allen Patienten beim ersten Zeitpunkt, der nach Beginn der Ampligen- Therapie gewählt wurde, nicht nachweisbar. Zwei offenbar positive Hybridisierungsergebnisse nach acht Wochen wurden mit ungewöhnlich niedrigen negativen Kontrollen in Verbindung gebracht und erwiesen sich beim erneuten Testen als negativ. Das vorliegende Beispiel zeigt, daß HIV-RNA in im Kreislauf befindlichen Blutzellen direkt in Anwesenheit einer chaotropen Lösung durch Verwenden einer direkten molekularen Hybridisierung mengenmäßig bestimmt werden kann.
    • Beispiel 13 Messung von rRNA in Bakterien
  • Die vorliegende Erfindung kann zum Messen bakterieller rRNA in einer Probe, ohne rRNA zu reinigen, verwendet werden. Dieses Beispiel veranschaulicht die Messung einer nicht-mRNA-Art.
  • E. coli wird in L-Brühe kultiviert, durch Zentrifugieren gesammelt und mit 5 M GuSCN/0,1 M EDTA/10 mM Dithiothreit (GED) in einem Verhältnis von 10&sup6; Zellen/ml gemischt. Zehn Mikroliter aliquoter Mengen dieser Zellen oder Verdünnungen in GED werden mit 2,5 -1 einer Lösung gemischt, die 2·10&sup5; cpm (2 ng) einer ³²P-markierten RNA-Sonde enthält, die zu E.-coli-rRNA komplementär ist. Diese Mischungen werden 5 Stunden bei 26ºC inkubiert, anschließend wie in Beispiel 15 beschrieben durch den RNAase/TCA-Test verarbeitet. Mit diesem Verfahren erhöht sich ein Hybridisierungssignal mit zunehmenden Zahlen an E. coli und liegt im Bereich von 10 cpm je Bakterium, was zu einem Hybridisierungssignal von 100000 cpm mit der unverdünnten Probe führt.
  • Im Gegensatz dazu, tritt mit Sonden, die zu E.-coli-RNA nicht komplementär sind, im wesentlichen keine Hybridisierung auf (200-500 cpm).
  • Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß, vorausgesetzt eine geeignete Sonde verfügbar ist, die vorliegende Erfindung zum Nachweisen und mengenmäßigen Bestimmen jeder Art RNA nicht nur der in diesen Beispielen dargestellten genomischen RNA, mRNA und rRNA verwendet werden kann.

Claims (18)

1. Verfahren zum Nachweisen und/oder mengenmäßigen Bestimmen einer Zielnukleinsäure in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren
A. das Löslichmachen der Nukleinsäure der biologischen Probe durch Zusammenbringen der biologischen Probe mit einem chaotropen Salz, wodurch eine Lösung einer in Lösung gebrachten Nukleinsäure hergestellt wird,
B. das Inkubieren dieser Lösung einer in Lösung gebrachten Nukleinsäure mit wenigstens einer Nukleinsäuresonde, die zu wenigstens einem Teil-der in Lösung gebrachten Nukleinsäure komplementär ist, unter Bedingungen, welche die molekulare Hybridisierung zwischen der Sonde und der in Lösung gebrachten Nukleinsäure fördern, und
C. das Nachweisen der molekularen Hybridisierung umfaßt.
2. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die in Lösung gebrachte Nukleinsäure immobilisiert ist.
3. Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei sich die Nukleinsäuresonde in Lösung befindet.
4. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei die Nukleinsäure RNA oder DNA ist und/oder die molekulare Hybridisierung eine DNA-DNA-Hybridisierung, DNA-RNA- Hybridisierung oder RNA-RNA-Hybridisierung ist.
5. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei das chaotrope Salz ein Alkalimetallperchlorat, -iodid, -trifluoracetat, -trichloracetat oder -thiocyanat ist.
6. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei das chaotrope Salz Natriumiodid, Natriumperchlorat, Kaliumiodid, Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Guanidinthiocyanat, Natriumtrichloracetat oder Natriumtrifluoracetat ist.
7. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei die in Lösung gebrachte DNA erhitzt wird, um die in Lösung gebrachte DNA vor dem Inkubationsschritt zu denaturieren.
8. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, wobei der Abschnitt der in Lösung gebrachten Nukleinsäure die Kodierungsregion der in Lösung gebrachten Nukleinsäure ist.
9. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht, wobei die Hybridisierung bei einer Temperatur im Bereich von 20º bis 40ºC ausgeführt wird.
10. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei die Nukleinsäuresonde zur Kodierungsregion der in Lösung gebrachten Nukleinsäure komplementär ist.
11. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 10 beansprucht, wobei die Sonde an einer Membrane immobilisiert ist, die Nitrocellulose oder Nylon enthält,
12. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 11 beansprucht, wobei die Sonde durch
A. In-Berührung-bringen der Sonde mit einem immobilisierenden Material und
B. Blockieren der verbleibenden aktiven Stellen auf dem immobilisierenden Material immobilisiert wird.
13. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, wobei das chaotrope Salz wenigstens eine Nukleinsäuresonde enthält.
14. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 beansprucht, wobei wenigstens eine Nukleinsäuresonde zu wenigstens einem HIV-Virus-RNA-Fragment hybridisiert.
15. Kit, der zum Ausführen eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 geeignet ist, welcher einen abgeteilten Träger zum Aufnehmen wenigstens zweier Behältermittel darin umfaßt, wobei eines der Behältermittel ein chaotropes Salz umfaßt und ein zweites Behältermittel wenigstens eine Nukleinsäuresonde umfaßt.
16. Kit wie in Anspruch 15 beansprucht, in dem wenigstens eine Nukleinsäuresonde markiert ist und/oder sich das chaotrope Salz in Lösung befindet.
17. Kit wie in Anspruch 15 oder 16 beansprucht, in dem sich wenigstens ein zusätzliches Behältermittel befindet, das eine positive biologische Kontrollprobe, eine negative biologische Kontrollprobe, eine biologische Standardprobe, ein Blockierungsmittel, eine Nuklease oder ein Detergens umfaßt.
18. Kit wie in Anspruch 16 oder 17 beansprucht, in dem das chaotrope Salz und wenigstens eine Nukleinsäuresonde in demselben Behältermittel enthalten sind.
DE3750774T 1986-05-02 1987-05-04 Chaotropisches verfahren zur schätzung von nukleinen säuren in einer biologischen probe. Expired - Fee Related DE3750774T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85900386A 1986-05-02 1986-05-02
PCT/US1987/001023 WO1987006621A1 (en) 1986-05-02 1987-05-04 Chaotropic method for evaluating nucleic acids in a biological sample

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3750774D1 DE3750774D1 (de) 1995-01-05
DE3750774T2 true DE3750774T2 (de) 1995-04-27

Family

ID=25329732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3750774T Expired - Fee Related DE3750774T2 (de) 1986-05-02 1987-05-04 Chaotropisches verfahren zur schätzung von nukleinen säuren in einer biologischen probe.

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0305399B1 (de)
JP (1) JP2552691B2 (de)
AT (1) ATE114334T1 (de)
AU (1) AU613870B2 (de)
CA (1) CA1301606C (de)
DE (1) DE3750774T2 (de)
WO (1) WO1987006621A1 (de)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988008038A1 (en) * 1987-04-15 1988-10-20 Yissum Research Development Company Of The Hebrew Method for detecting the expression of bioregulatory genes in microcultures of eukaryotic cells and kit therefor
CA2049042A1 (en) * 1989-03-10 1990-09-11 Mark L. Collins Preventing interference with affinity capture schemes
US5589335A (en) * 1989-04-05 1996-12-31 Amoco Corporation Hybridization promotion reagents
CA2031536A1 (en) * 1989-04-05 1990-10-06 Kevin R. Kearney Hybridization promotion reagents
WO1991000926A1 (en) * 1989-07-11 1991-01-24 Microprobe Corporation Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US5506350A (en) * 1990-09-20 1996-04-09 Bittner; Michael L. Production of chromosome region specific DNA sequences and transamination
US5459253A (en) * 1991-07-19 1995-10-17 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. M-RNA purification
EP0554437B1 (de) * 1991-07-31 2000-04-05 VYSIS, Inc. Nukleinsäure sonden welche bei nachweis von shigellabakterien verwendbar sind
WO1993020234A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company A rapid, high capacity nucleic acid based assay
US6001559A (en) * 1992-07-13 1999-12-14 The Pillsbury Company Method for detecting Listeria monocytogenes via esculin hydrolysis and nucleic acid hybridization
WO1995002068A1 (fr) * 1993-07-09 1995-01-19 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode de discrimination des acides nucleiques et necessaire d'essai a cette fin
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
ATE496288T1 (de) 1995-10-11 2011-02-15 Luminex Corp Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
AT1082U2 (de) * 1996-07-09 1996-10-25 Labordiagnostika Ges Mbh Verfahren zur stabilisierung von nukleinsäuren vor deren isolierung aus blutproben
EP0952228A3 (de) * 1996-09-24 1999-12-15 Rapigene, Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung der Hybridisierungsspezifität
US6361940B1 (en) 1996-09-24 2002-03-26 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity
CA2266847A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Rapigene, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization specificity
US6210881B1 (en) 1996-12-30 2001-04-03 Becton, Dickinson And Company Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization
US5763185A (en) * 1996-12-30 1998-06-09 Becton Dickinson And Company Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization
DE19746874A1 (de) 1997-10-23 1999-04-29 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
DE19956820A1 (de) 1999-11-25 2001-05-31 Roche Diagnostics Gmbh Spezies-spezifischer Nachweis von Nukleinsäuren mittels eines Analyseelementes
US6503716B1 (en) 2000-11-28 2003-01-07 Pe Corporation (Ny) Compositions and methods for extracting a nucleic acid
US8148171B2 (en) 2001-10-09 2012-04-03 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
JP4106026B2 (ja) 2001-11-28 2008-06-25 アプレラ コーポレイション 選択的な核酸の単離方法および組成物
GB0207975D0 (en) 2002-04-05 2002-05-15 Genovision As Isolating nucleic acid
DE10261529A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-08 Indivumed Gmbh Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von biologischem Probenmaterial und Probensammlung
JP4831725B2 (ja) * 2004-02-13 2011-12-07 栄研化学株式会社 簡易的核酸抽出法
US20050208501A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-22 Ambion, Inc. Process and reagents for extraction of RNA from fractionated blood leukocytes
JPWO2010134245A1 (ja) * 2009-05-20 2012-11-08 オリンパス株式会社 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット
BR112015005718A2 (pt) * 2012-09-19 2017-07-04 Beckman Coulter Inc uso de íons divalentes, proteases, detergentes, e ph baixo na extração de ácidos nucleicos

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4483920A (en) * 1982-05-17 1984-11-20 Hahnemann University Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material
US4427580A (en) * 1982-09-01 1984-01-24 Cornell Research Foundation, Inc. Method for separation and recovery of proteins and nucleic acids from nucleoproteins using water destructuring salts

Also Published As

Publication number Publication date
EP0305399B1 (de) 1994-11-23
AU613870B2 (en) 1991-08-15
JP2552691B2 (ja) 1996-11-13
EP0305399A4 (de) 1989-12-28
EP0305399A1 (de) 1989-03-08
WO1987006621A1 (en) 1987-11-05
DE3750774D1 (de) 1995-01-05
JPH01502317A (ja) 1989-08-17
AU7432987A (en) 1987-11-24
CA1301606C (en) 1992-05-26
ATE114334T1 (de) 1994-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3750774T2 (de) Chaotropisches verfahren zur schätzung von nukleinen säuren in einer biologischen probe.
US5482834A (en) Evaluation of nucleic acids in a biological sample hybridization in a solution of chaotrophic salt solubilized cells
DE68928082T2 (de) Manuelles in situ hybridisierungsverfahren
DE69029563T2 (de) Verfahren zur Nukleinsäureextraktion und PCR-Amplifizierung ohne Gebrauch von proteolytischem Enzym
DE2915082C2 (de)
DE69003104T2 (de) Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen.
DE69031957T2 (de) Verfahren zur Extraktion, Amplifikation und zum Nachweis von Nukleinsäuren aus Vollblut
DE3854056T2 (de) Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz in einer Probe.
DE69116993T2 (de) Verfahren zum nukleotidsequenzennachweis mittels technik der sandwich-hybridisierung
DE69730974T2 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren unter anwendung von alkaliner phosphatase
DE69736667T2 (de) Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm)
DE68926504T2 (de) Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
DE69533771T2 (de) Verfahren zum Einfangen und selektivem Freisetzen von Nukleinsäuren unter Verwendung eines schwach basischen Polymers und Amplifikation dieser Nukleinsäuren
DE69833160T2 (de) Amplifizierung und Detektion von HIV-1 und/oder HIV-2
DE3785590T2 (de) Campylobacter-sonde.
DE69003477T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren.
DE69004632T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren.
DE3855709T2 (de) Hybridisierungsverfahren und Reagenzsatz dafür
DE69029740T2 (de) Neues verfahren zum nachweis einer spezifischen nukleinsäuresequenz in einer zellprobe
DE3888653T2 (de) Verfahren und Testsatz zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz.
DE68928080T2 (de) Einstufiges in situ-hybridierungstestverfahren
WO1999023249A2 (de) Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren
WO2000029611A2 (de) Neue primer und sonden zum nachweis von hiv
EP0566050B1 (de) Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
DE68907305T2 (de) Methode zur Analyse einer spezifischen Sequenz von DNS oder RNS, Reagenzien und Kits dafür.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee