DE69003104T2 - Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen. - Google Patents

Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von geringen Mengen an Nucleinsäuren, die durch Amplification erhalten wurden, sowie dessen Anwendungen.
  • Eines der ersten beschriebenen Amplificationsverfahren ist die Kettenpolymerisationsreaktion (PCR), die von SAIKI R. et al. (Science 1985, 230, 1350) entwickelt wurde. Diese Technik erlaubt insbesondere die Amplification von doppelsträngigen DNA-Sequenzen und basiert auf der cyclischen Funktion einer DNA-Polymerase. Dieses Enzym kann einen als Matrize verwendeten DNA-Strang in einen komplementären Strang durch Verlängerung von dem freien 3' OH-Ende eines Oligonucleotidstarters kopieren.
  • Bei der PCR-Technik führt man n aufeinanderfolgende Amplificationcyclen durch, im Verlauf derer zwei Starter die Amplification der doppelsträngigen DNA-Sequenz, die sie umfassen, dirigieren.
  • Ein Amplificationcyclus besteht aus drei Stufen, die die schrittweise Durchführung der Denaturierung der DNA (95ºC), der Hybridisierung der Starter (37 bis 55ºC) und der Verlängerung der DNA-Stränge durch eine DNA- Polymerase erlauben.
  • Die technologischen Grundlagen der PCR beruhen auf zwei fundamentalen Punkten:
  • - der Verwendung von zwei Oligonucleotidstartern, wobei einer komplementär dem DNA+-Strang ist und der andere dem DNA-Strang ist und dessen 3'-Enden einander gegenüberstehen;
  • - der wiederholten Verwendung der Aktivität einer geeigneten DNA-Polymerase.
  • Die PCR gestattet somit die Verwendung von allen im Cyclus n neu synthetisierten Sequenzen als Matrizen für die DNA-Polymerase im Cyclus (n+1) unter geeigneten Bedingungen. Daraus folgt eine exponentielle Amplification der Anzahl der Nucleinsäure-Zielsequenzen als Funktion der Anzahl der Cyclen entsprechend der Amplificationskurve, die eine exponentielle Phase umfaßt, in der die Menge Q der erhaltenen Zielsequenzen auf die Menge Qo der anfänglichen Zielsequenzen durch den Amplificationsfaktor x und die Anzahl der Cyclen n durch die folgende Formel: Q = Qo (1 + x)n zurückgeführt werden kann.
  • Die PCR erlaubt somit die exponentielle Amplification von sogenannten Nucleinsäure-Zielsequenzen um das Tausendfache.
  • Diese Amplificationstechnik ist ausführlicher in der europäischen Patentanmeldung CETUS 201 184 beschrieben, die insbesondere ausführt, daß die zwei bei der PCR verwendeten Oligonucleotidstarter bevorzugt einzelsträngig sind und ausreichend lang sein müssen, um die Synthese des Extensionsprodukts in Gegenwart der DNA-Polymerase zu starten.
  • Eine bestimmte Anzahl von Verbesserungen oder Perfektionierungen dieser Technik wurden vorgeschlagen, und insbesondere wird, um die Zugabe von Enzymen zu jedem Cyclus zu vermeiden, eine DNA-Polymerase, die bis 100ºC beständig sein kann, die Taq-Polymerase, die in der europäischen Patentanmeldung CETUS 258 017 beschrieben ist, am Beginn des Verfahrens zugesetzt und erlaubt die Durchführung einer großen Anzahl von aufeinanderfolgenden Amplificationscyclen. Die Taq-Polymerase erlaubte einerseits die Automatisierung des Amplificationsverfahrens und andererseits die Erhöhung der Spezifität der Amplification.
  • Die PCR erlaubt somit den Erhalt einer beträchtlichen Amplification einer Nucleinsäuresequenz, der sogenannten Zielsequenz, ohne Clonieren, also eine enorme Erhöhung der Sensibilität. Die amplifizierte Zielsequenz ist anschließend direkt verschiedenen Analysenverfahren, wie dem Dot-Blot-Verfahren, der Elektrophorese oder der Sequenzierung, zugänglich. Zwei Patentanmeldungen (europäische Patentanmeldungen CETUS Nr. 200 362 und Nr. 229 701) beschreiben ausführlicher die Verknüpfung Amplification- Hybridisierung zum Nachweis einer der gewünschten Nucleinsäuresequenzen in einer Probe.
  • Anschließend wurden Varianten und/oder Perfektionierungen vorgeschlagen, um die Stufe des Nachweises der amplifizierten Sequenzen zu erleichtern, und sie betreffen insbesondere die Starter und/oder die verwendeten Sonden.
  • Eine dieser Perfektionierungen ist die Verwendung von zwei verschiedenen Sonden, von denen eine markierte Sonde als Detektionssonde bezeichnet wird und die andere ein Fragment mit einer Affinität für einen anderen Bestandteil umfaßt und als Einfangssonde bezeichnet wird [britisches Patent 2 169 403, französisches Patent 85 19394, KOHNE D. (American Clin. Review, November 1986), U.S. Patent 4,486,539, europäische Patentanmeldungen 70685 und 70687].
  • Als Variante werden die Starter selbst so modifiziert, daß sie den Einfang des gebildeten Hybrids erlauben (französische Patentanmeldung 8803107, europäische Patentanmeldung MOLECULAR DIAGNOSIS Inc., Nr. 297 379).
  • Eine andere dieser Perfektionierungen wird durch das in der europäischen Patentanmeldung Syntex Nr. 300 796 beschriebene Verfahren erläutert, das eine Variante der PCR vorschlägt, die die Empfindlichkeit des letzteren insbesondere in Gegenwart von sehr geringen Nucleinsäuremengen erhöht, ohne insgesamt die Spezifität zu erhöhen.
  • In der Tat scheint die routinemäßige Verwendung der PCR einen bedeutenden Nachteil aufgeworfen zu haben, der mit deren extremer Empfindlichkeit verbunden ist, nämlich dem Auftreten von Falsch-Positiven, von denen nach einer sorgfältigen Analyse der Ergebnisse festgestellt wurde, daß sie im wesentlichen mit einer Verunreinigung der zu analysierenden Probe durch homologe Sequenzen verbunden sind.
  • Eine bestimmte Anzahl von Artikeln, die seit etwa zwei Jahren erschienen sind, beschreiben derartige Fälle von Kontaminationen und schlagen Mittel zu deren Beseitigung vor:
  • - Y.M.D. LO et al. führen in einem Artikel, der in Lancet (1988, ii, 679) erschienen ist, diesen Nachteil der Kettenpolymerisationsreaktion auf dessen Empfindlichkeit zurück und schlagen, um diesem wichtigen Nachteil abzuhelfen, vor, besondere Sorgfalt auf die Herstellung der DNA-Matrize vor der Amplification zu verwenden.
  • - R.A. GIBBS et al. erteilen in einem Artikel, der in Genes & Development, 1989, 3, 1095-1098 erschienen ist, die folgenden Ratschläge: Isolierung aller verwendeten Reagentien zur Durchführung der PCR, der verwendeten Einrichtungen zur Analyse der erhaltenen Produkte; Verwendung von Schraubdeckeln und selbst beim Einfrieren des Inhalts vor der Durchführung der abschließenden Reaktion, um die Aerosolbildung zu vermeiden; Begrenzung der Anzahl der Amplificationscyclen auf ein Minimum, um gleichzeitig das Risiko, kleine Mengen an Verunreinigungen, die bereits vorhanden sind, zu amplifizieren, zu verringern und um die Gesamtmenge der Reaktionsprodukte zu verringern; und Verwendung eines anderen Pipettensatzes für jeden Fleck.
  • - G. SARKAR et al. schlagen in einem Artikel, der in Nature, 1990, 343, 27 erschienen ist, vor, die Probe mit UV-Strahlen zu behandeln, bevor die zu amplifizierende DNA-Matrix hinzugefügt wird, um die Kontamination zu vermeiden.
  • - S. KWOK et al. schlagen in einem Artikel, der in Nature, 1989, 339, 237-238 erschienen ist, eine bestimmte Anzahl von "guten Laborpraktiken" vor, um die Kontamination zu kontrollieren und zu vermeiden: physikalische Isolierung der Präparate und der Produkte für die PCR (getrennte Stücke, UV-Strahlen ...); Autoklavieren der verwendeten Puffer; Teilen der Reagentien in kleine Proben, um ein wiederholtes Pipettieren zu vermeiden; Verwendung von Schutzhandschuhen; Vermeidung von Verspritzen; Verwendung von Pipetten, die kein Aerosol entstehen lassen; etc. .
  • In der Tat berücksichtigen die von den verschiedenen genannten Autoren zur Vermeidung der Kontamination vorgeschlagenen Vorschläge in keinem Fall das Problem der Falsch-Positiven in Folge der Amplification von heterologen Sequenzen und/oder des Vorhandenseins von Zelltrümmern.
  • Derartige heterologe Sequenzen, die sich von den nachzuweisenden Zielsequenzen unterscheiden, aber doch eine ausreichende strukturelle Ahnlichkeit besitzen, um eine unvollständige Hybridisierung zwischen den für die nachzuweisenden Zielsequenzen spezifischen Startern und diesen heterologen Sequenzen zu gestatten, werden exponentiell wie die Zielsequenzen während der PCR amplifiziert.
  • In der Tat erlaubt kein Amplificationsverfahren und/oder Detektionsverfahren für spezifische Nucleinsäuresequenzen aus dem Stand der Technik, die die einzigen sind, die leicht automatisierbar sind:
  • 1. die Beseitigung von während der PCR exponentiell amplifizierten heterologen Sequenzen als Folge der direkten physikalischen Integration der Starter in die neuen synthetisierten Stränge, wobei die Amplification dieser heterologen Sequenzen zum Auftreten von Falsch-Positiven führt, und/oder
  • 2. die Realisierung eines Nachweises der Nucleinsäure in homogener Phase, d.h., wobei weder die Abtrennung auf einem Elektrophoresegel, noch die Fixierung auf einem festen Träger zum Einfang, noch die Verwendung von modifizierten Nucleotidstartern, noch eine Stufe der Hybridisierung mit einer Nachweissonde notwendig ist.
  • Deshalb hat sich die Anmelderin folglich zur Aufgabe gestellt, ein Verfahren zum sowohl qualitativen, semi-quantitativen als auch quantitativen Nachweis und zur Identifizierung geringer Mengen von Nucleinsäuren durch Amplification, insbesondere in homogener Phase, bereitzustellen, das besser den Notwendigkeiten der Praxis als die Verfahren aus dem Stand der Technik entspricht, das insbesondere leicht automatisierbar ist, spezifisch, empfindlich, rasch und ökonomisch ist und bei dem das Vorhandensein von heterologen Sequenzen und/oder Zelltrümmern praktisch keinen Einfluß auf den Nachweis besitzt.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Sequenzen aus einer bzw. mehreren Nucleinsäure(n) (Einzelsequenz und/oder Gemisch aus Nucleinsäuresequenzen), die in einer biologischen Probe vorhanden ist bzw. sind, umfassend mindestens eine enzymatische Amplification, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man, nachdem man die biologische Probe zur Extraktion der Nucleinsäure(n) in eine geeignete Lösung gebracht hat, eine Nucleinsäuresequenz oder ein Gemisch aus Sequenzen mit Hilfe der folgenden Stufen nachweist:
  • (1) eine Stufe der Anreicherung der Zielsequenz bzw. der Zielsequenzen durch:
  • (a) in Kontakt bringen der in Lösung gebrachten biologischen Probe mit mindestens einem Paar geeigneter Startsequenzen, um mindestens ein Fragment der Nucleinsäure-Zielsequenz bzw. -Sequenzen zu amplifizieren, wobei die Startsequenzen mit der bzw. den Zielsequenz(en) hybridisieren und den Erhalt einer Amplificationslösung zur Anreicherung gestatten, und
  • (b) mindestens eine Verdünnung zwischen 1/50 und 1/100.000 der in (a) erhaltenen Amplificationslösung zur Anreicherung;
  • (2) eine Stufe des Nachweises der erhaltenen amplifizierten Zielsequenzen durch:
  • (c) in Kontakt bringen einer Fraktion der in (b) erhaltenen Anreicherungslösung mit mindestens einem Paar Startsequenzen, von denen mindestens eine der Sequenzen in der amplifizierten Zielsequenz gemäß (a) enthalten ist um mindestens ein Fragment der Nucleinsäure-Zielsequenz bzw. -Sequenzen zu amplifizieren, und
  • (d) Nachweis der doppelsträngigen in (c) erhaltenen Kopien der Zielnucleinsäure durch irgendein geeignetes Mittel.
  • Nachstehend wird diese zuletzt genannte Amplification mit dem Namen "zweite Amplificationsreihe" bezeichnet.
  • Erfindungsgemäß werden die Stufen (a) und (b) mindestens einmal wiederholt.
  • Gemäß einer vorteilhaften Durchführung dieser Ausführungsform liegt die Verdünnung der Stufe (b) zwischen 1/50 und 1/50.000.
  • Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform liegt die Verdünnung der Stufe (b) zwischen 1/50 und 1/10.000, bevorzugt zwischen 1/200 und 1/5.000.
  • Diese Verdünnung erlaubt den Start der Amplification des Nachweises, ausgehend von einem gereinigten biologischen Material und den folgenden Eigenschaften:
  • - es ist einerseits angereichert an Zielsequenzen
  • - es ist andererseits verarmt an unerwünschten "parasitären" Sequenzen, nämlich an in der Stufe (a) nicht verwendeten Startern, an heterologen Sequenzen, an Gesamtnucleinsäure, bezogen auf die anfängliche biologische Probe, und an Zelltrümmern.
  • Die Tatsache, daß diese nicht verwendeten Starter aus Stufe (a) verdünnt werden, hat den Vorteil, daß eine Kompetition zwischen den Startern der Stufe (a) und den Startern der Stufe (c) im Augenblick der zweiten Amplificationsreihe vermieden wird. Außerdem erlaubt dies die Verwendung von weniger Startern während der zweiten Amplificationsreihe und den Erhalt einer besseren Ausbeute beim Einbau dieser letzteren. Dies besitzt einen wichtigen Vorteil, weil die Starter der Amplification des Nachweises allgemein teuer und schwieriger zu synthetisieren sind.
  • Diese Anreicherung an Zielsequenzen durch Verdünnung der Amplificationslösung der Stufe (a) erlaubt, daß die heterologen Sequenzen, die ein falsches Starten der Vorlage durch fälschliche Hybridisierung hervorrufen, und die Zelltrümmer unter für ihre Amplification während der zweiten Amplificationsreihe und während des Nachweises wenig geeignete Bedingungen gegeben werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt insbesondere den Vorteil, daß es die Spezifität der Bestimmung erhöht, indem es die Menge an restlicher Nucleinsäure und verschiedenen heterologen Sequenzen aus der biologischen Probe erniedrigt.
  • Erfindungsgemäß sind die Starter der Stufe (a) einzelsträngige Nucleotidsequenzen (einfacher Starter (As)), die mit einer Zielsequenz hybridisieren.
  • Derartige Starter können gegebenenfalls modifiziert werden. Dies erlaubt gegebenenfalls entweder den Erhalt eines Einfangsstarters oder eines Nachweisstarters.
  • Ebenso sind erfindungsgemäß die Starter der Stufe (c) Paare, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Paare: Starter modifiziert durch ein Einfangssystem - Starter modifiziert durch ein Nachweissystem (Ac-Ad), die Paare einfacher Starter - einfacher Starter (As1-As2), die Paare einfacher Starter - Starter modifiziert durch ein Einfangssystem (As1-Ac), die Paare einfacher Starter - Starter modifiziert durch ein Nachweissystem (As1-Ad).
  • Unter Einfangsstarter (Ac) wird eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz verstanden, die insbesondere durch mindestens eine Einheit eines Affinitätspaares modifiziert ist und die mit einer Zielsequenz hybridisiert. Beispielsweise können an einem Ende der Oligonucleotidkette ein oder mehrere Biotinreste fixiert sein. Der Einfangsstarter kann auch ein verzweigtes Oligonucleotid sein.
  • Unter Nachweisstarter (Ad) wird eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz verstanden, die durch ein Nachweissystem modifiziert ist und die mit einer Zielsequenz hybridisiert. Beispielsweise kann das Oligonucleotid an seinem 5'-Ende durch Phosphor-32 markiert sein.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Menge der im Verlauf der Stufe (c) (zweite Amplificationsreihe) verwendeten Starter deutlich unter der Menge der im Verlauf der Stufe (a) verwendeten Menge an Startern.
  • Gemäß einer vorteilhaften Durchführung dieser Ausführungsform ist die Menge der Starter, die während der Stufe (c) verwendet wird, mindestens fünffach geringer als die Menge der Starter, die während der Stufe (a) verwendet wird.
  • Die Anzahl der Zyklen der zweiten Amplificationsreihe wird insbesondere als Funktion der Verdünnung und der Natur der Probe so gewählt, daß dieser zweiten Amplificationsreihe ein exponentieller Charakter verliehen wird.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Durchführungsform der Erfindung umfaßt die Stufe des Nachweises (2), wenn das Paar der Starter aus Stufe (c) einen Einfangsstarter enthält:
  • (d) in Kontakt bringen der Amplificationslösung zum Nachweis mit einem geeigneten Träger, der die Nucleinsäurefragmente, die den eingebauten Einfangsstarter (Ac) tragen, und
  • (e) Nachweis von Kopien von doppelsträngigen Zielnucleinsäuren, die auf dem Träger zurückgehalten wurden, durch jedes geeignete Mittel.
  • Dieser Nachweis kann mit Hilfe einer Nachweissonde (Nachweisstarter oder weitere Hybridisierung mit einer geeigneterweise markierten Sonde) durchgeführt werden.
  • Bei einer derartigen Ausführungsform ist das Einfangssystem vorteilhafterweise eine Einheit des Affinitätspaares. Ein derartiges System erlaubt die Fixierung des Oligonucleotids auf dem Träger, der die andere Einheit des Affinitäspaares trägt.
  • Als Affinitätspaare kann man insbesondere die Paare Biotin-Avidin oder Streptavidin, Schwermetallderivat-Thiogruppe, diverse Homopolynucleotide, wie poly dG-poly dC, poly dA-poly dT und poly dA-poly dU sowie verschiedene Oligonucleotide mit spezifischen Sequenzen, wie gegebenenfalls beispielsweise von verzweigten Startern und den Paaren Antigen-Antikörper nennen. Andere Paare aus Verbindungen können ebenfalls verwendet werden, wenn sie eine ausreichend starke Affinität besitzen, um die spezifische Bindung der Einfangsstarter (Ac), die in die Kopien der Zielnucleinsäuren auf dem festen Träger eingebaut sind, zu erlauben. Liganden und Konjugate können Teile eines Affinitätspaares sein.
  • Das Nachweissystem wird vorteilhafterweise aus der Gruppe, umfassend Isotope (¹²&sup5;I, ³&sup5;S, ³²P), Fluorophore, ein fluoreszierendes System vom Lanthaniden-Typ, ein enzymatisches colorimetrisches System (alkalische Phosphatase, Peroxidase), ein fluorimetrisches, lumineszierendes, biolumineszierendes oder elektorchemisches enzymatisches System und Verbindungen, die mit einer doppelsträngigen Nucleinsäure, insbesondere einem farbgebenden Mittel oder einem intercalierenden Mittel, Wechselwirkung zeigen, ausgewählt.
  • Gemäß einer Durchführungsform dieser Ausführungsform wird, wenn ein Nachweisstarter (Ad) in den Zielstrang der Nucleinsäure im Verlauf der Stufe (c) integriert wird, die Detektion der Stufe (e) mit Hilfe des Nachweisstarters (Ad) durchgeführt.
  • Gemäß einer anderen Durchführungsform dieser Ausführungsform wird, wenn ein einfacher Starter (As) in einen Strang im Verlauf der Stufe (c) integriert wird, der Nachweis der Stufe (e) entweder durch Hybridisieren von Kopien der doppelsträngigen Zielnucleinsäure, die auf dem Träger mit einer geeigneten Nachweissonde zurückgehalten werden, oder durch Kontaktieren mit einer Verbindung, die mit der doppelsträngigen Zielnucleinsäure wechselwirkt, insbesondere einem farbgebenden Mittel oder einem intercalierenden Mittel, die Spektralmodifikationen hervorrufen können, und anschließende Detektion dieser Spektralmodifikationen der Verbindung, die mit der doppelsträngigen Nucleinsäure wechselwirkt, durch jedes geeignete Mittel durchgeführt.
  • Gemäß einer anderen Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Stufe der Detektion (2), wenn das Starterpaar der Stufe (c) keinen Einfangsstarter enthält:
  • (d) den direkten Nachweis in homogener flüssiger Phase der amplifizierten Zielsequenzen durch in Kontakt bringen der doppelsträngigen Nucleinsäuren der Stufen (a), (b) und (c), die vorstehend definiert wurden, erhalten wurden, entweder mit einer geeigneten Detektionssonde oder mit einer Verbindung, die mit einer doppelsträngigen Nucleinsäure wechselwirkt, insbesondere einem farbgebenden Mittel oder einem intercalierenden Mittel, die geeignet sind, Spektralmodifikationen hervorzurufen, und anschließende Detektion dieser Spektralmodifikationen der Verbindung, die mit der doppelsträngigen Nucleinsäure wechselwirkt, durch jedes geeignete Mittel.
  • Gemäß einer vorteilhaften Durchführungsform dieser Ausführungsform wird diese Verbindung aus Substanzen, die nach Bindung an doppelsträngige DNA eine physikalisch-chemische Modifikation besitzen, ausgewählt.
  • Als nicht-beschränkende Beispiele für derartige Verbindungen sind 4',6-Di-2-amidino-2-phenylindol (DAPI), Bisbenzimidin, Ethidium, 9-Aminoagridin, Proflavin, Chinacrin, Chloroquin, Lucanthon, Hycanthon, Tiloron, mAMSA, Daunomycin, Adriamycin, Actinomycin D, 9-OH-N-Methylellipticin, Mithoxanthron, Bleomycin, Echinomycin, Ditercalin und Derivate dieser Verbindungen, HOECHST 33 sowie auf geeignete Weise modifizierte Nucleotide zu nennen.
  • Gemäß einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsform ist die Verbindung mit der Eignung Spektralmodifikationen hervorzurufen ein fluoreszierendes intercalierendes Mittel, wie insbesondere Ethidiumbromid oder Bisbenzimidin, wie HOECHST 33-258.
  • Eine derartige Ausführungsform besitzt den Vorteil, daß nur eine direkte Messung der doppelsträngigen markierten in der Lösung insgesamt vorhandenen Nucleinsäure notwendig ist, um die gesuchte Sequenz zu charakterisieren.
  • Eine derartige Ausführungsform besitzt unter anderem den Vorteil, daß kompetitive Reaktionen, die sich in den Verfahren aus dem Stand der Technik abspielen, und die eine Fixierung des erhaltenen doppelsträngigen Extensionsprodukts auf dem Träger zum Nachweis der Nucleinsäure notwendig machen, beseitigt werden.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Durchführungsform dieser Ausführungsform werden die aufeinanderfolgenden Verdünnungen einer zu prüfenden DNA und insbesondere einer zu prüfenden viralen DNA einer ersten Amplificationsreihe in einem geeigneten Volumen, das mindestens zwei geeignete Zielsequenzen, die als Matrizen dienen, die vier Desoxyribonucleosidtriphosphate, eine geeignete Menge der Taq-DNA-Polymerase in einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,3, die eine geringe Menge (in der Größenordnung von 0,01% Gew./Vol.) Gelatine enthält, unterworfen, wobei die Produkte der ersten Amplificationsreihe anschließend einer zweiten Verdünnungsstufe und dann einer zweiten Amplificationsreihe in einem Amplificationsmedium, das vorteilhafterweise dem, das in der ersten Amplificationsreihe verwendet wurde, ähnlich ist und das mindestens zwei Zielsequenzen mit der Eignung, als Matrizen zu dienen, enthält, unterworfen werden, wonach die Verbindung mit der Eignung, Spektralmodifikationen hervorzurufen, der als Folge der zweiten Amplificationsreihe erhaltenen Amplificationslösung zugesetzt wird, um die doppelsträngige, gegebenenfalls in den Lösungen vorhandene virale DNA nachzuweisen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine bestimmte Anzahl von Vorteilen gegenüber den Verfahren aus dem Stand der Technik:
  • - eine erhöhte Spezifität
  • - eine Verringerung des Untergrundrauschens
  • - eine erhöhte Sensibilität in dem Umfang, in dem die Probe nach der Amplificationsanreicherung starkt verdünnt wird; in der Tat erlaubt diese Verdünnung:
  • . den häufigen Aufenthalt ausschließlich der Zielsequenzen in der exponentiellen Amplificationsphase, d.h., wenn die Menge Q der erhaltenen Zielsequenzen mit dem Amplificationsfaktor x und der Anzahl der Zyklen n durch die Formel: Q = Qo (1 + x)n in Beziehung gesetzt werden kann;
  • . den Erhalt eines Verhältnisses Zielsequenzen/nicht-spezifische Sequenzen deutlich über 1 vom Beginn der Amplification zur Detektion;
  • . die Verringerung der kompetitiven Reaktionen im Zusammenhang mit den Extensionsprodukten der heterologen Nucleinsäuren und der Verbindungen, die in dem biologischen Medium vorhanden sind (Zelltrümmer, Proteine, natürliches Biotin, gesamte anfängliche Nucleinsäure ...).
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt ebenso im Verlauf der Amplification zur Detektion und gleichzeitig und in dem gleichen Reagenzglas von der Amplification zur Detektion von mehreren Zielsequenzen und der Verwendung von verzweigten Oligonucleotiden als Einfangsstarter vorzugehen. Die Duplices, die verzweigte Oligonucleotide tragen, besitzen einen freien einsträngigen DNA-Strang. Dieser freie einzelsträngige DNA-Strang erlaubt die Durchführung einer selektiven Fixierung mit Hilfe eines komplementären, an einen Träger gebundenen Oligonucleotids.
  • Es ist unter anderem zu unterstreichen, daß die Verdünnung, die nach der ersten Amplification durchgeführt wurde, die Arbeit mit einer Konzentration an Startern, die ausreichend gering ist, um das Auftreten des Dimerisierungs- und Amplificationsphänomens der Starter zu beseitigen, was zu einem "parasitären" Signal führen würde, erlaubt. Außerdem erlaubt die Verdünnung die Verwendung weniger Starter und somit den Erhalt einer besseren Spezifität in der Phase des Nachweises der Amplification zur Detektion.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auf die Detektion von genetischen Krankheiten, infektiösen Krankheiten (Virus, Parasiten, Pilze, Bakterien ...) und Tumorerkrankungen sowohl des Menschen als auch der Tiere als auch der Pflanzen zur Kontrolle biologischer Proben sowie zur Zelltypisierung anwendbar.
  • Gegenstand der Erfindung ist des weiteren eine gebrauchsfertige Reagenszusammenstellung, Kit oder aufeinander abgestimmte Garnitur zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß sie bzw. es außer nützlichen Mengen an Puffern und Reagentien zur Durchführung des Nachweises mindestens:
  • - geeignete Mengen mindestens eines ersten Paares geeigneter Startsequenzen zur Durchführung der Stufe (a) des Verfahrens;
  • - geeignete Mengen mindestens eines zweiten Paares geeigneter Startsequenzen zur Durchführung der Stufe (c) des Verfahrens, und gegebenenfalls
  • - geeignete Mengen einer geeigneten Sonde zur Durchführung der Stufe
  • (e) des Verfahrens und/oder geeignete Mengen mindestens einer Verbindung, die sich nicht covalent an eine doppelsträngige Nucleinsäure bindet, wie insbesondere eines farbgebenden Mittels oder eines intercalierenden Mittels mit der Eignung zur Erzeugung von Spektralmodifikationen bei Bindung an eine Nucleinsäure oder bei fehlender Bindung an eine Nucleinsäure
  • umfaßt.
  • Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen, die sich auf Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens beziehen.
  • Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.
  • In den nachstehenden Beispielen beschreiben die Beispiele 1 bis 8 Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Hybridassays und die Beispiele 9 bis 11 Ausführungsformen in homogener Phase (Detektion in Gegenwart eines intercalierenden Mittels).
    • I - Beispiele der Ausführungsform in Lösung A) Detektion durch eine radioaktive Verbindung: Beispiel 1: Detektion des menschlichen Papilloma-Virus vom Typ 16 (HPV 16) mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von zwei einfachen Startern (As1 und As2) zur Amplificationsanreicherung und eines Starterpaares Ad-Ac zur Amplification zum Nachweis.
  • Während des erfindungsgemäßen Hybridassays hängen die Anzahl der Zyklen im Verlauf der Amplification zur Anreicherung, die Verdünnung und die Anzahl der Zyklen im Verlauf der Amplification zum Nachweis von der zu amplifizierenden und nachzuweisenden Zielsequenz, der Verdünnung und der Natur der Probe ab.
  • Die Amplification zur Anreicherung kann als nicht-beschränkende Beispiele zwischen 20 und 40 Zyklen, die Verdünnung zwischen 1/200 und 1/100.000 betragen, und die Amplification zum Nachweis kann 3 bis 15 Zyklen umfassen. In diesem Fall sind die Konzentrationen des Starters während der Amplification zum Nachweis zehnmal schwächer als diejenigen bei der Amplification zur Anreicherung, wobei in jedem Fall in dem Endprodukt ein sehr erhöhter Einbaugrad des Starters (etwa 75%) erhalten wird.
  • Ein anderes Beispiel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt zwei Amplificationsreihen zur Anreicherung, die als nicht-beschränkendes Beispiel wie folgt konzipiert werden können:
  • - 1. Amplification zur Anreicherung (10 bis 40 Zyklen), Verdünnung 1/200;
  • - 2. Amplification zur Anreicherung, ausgehend von der erhaltenen Lösung (10 bis 40 Zyklen), Verdünnung 1/1000;
  • - Amplification zum Nachweis (3 bis 15 Zyklen).
    • - Herstellung des Trägers
  • Die hier verwendeten Träger sind Polystyrolröhren mit zuerst mit Rinderserumalbumin (BSA) in Bindung an Biotin und dann durch Avidin beschichteten Rippen.
  • 5 g BSA-Biotin in 500 µl Phosphatpuffer (0,05 M pH 7,3) werden zwei Stunden lang bei Umgebungstemperatur in den Röhren mit Rippen inkubiert. Die Flüssigkeit wird entleert und durch 500 µl einer Lösung mit 5 mg/ml Avidin im gleichen Puffer ersetzt, den man zwei Stunden lang bei Umgebungstemperatur inkubieren läßt. Die freien Stellen des Trägers werden anschließend durch eine Lösung mit 20 µg/ml DNA von denaturiertem Heringssperma blockiert und beschallt. Die Röhren können in diesem Medium mehrere Wochen bei +4ºC aufbewahrt werden.
    • - Amplification zur Anreicherung
  • Die zu prüfende DNA-Lösung wird der ersten Amplification in einem Medium von einem Gesamtvolumen von 50 µl mit 50 pmol jedes der zwei Starter As1 und As2, 300 M jedes der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) (Boehringer Mannheim), 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,9, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine und 2,5 Einheiten Taq-DNA- Polymerase (Amersham) unterworfen. Dreißig Amplificationszyklen werden mit einem automatischen Gerät durchgeführt (ein Zyklus entspricht 90 s Denaturierung bei 92ºC, 90 s Hybridisierung bei 50ºC und 120 s Polymerisation bei 72ºC).
    • - Amplification zum Nachweis
  • 2 µl jeder zuvor in einem Volumen von 50 µl amplifizierten Probe werden in 400 µl Wasser verdünnt. 2 µl dieser Lösung (entspricht 1/5000stel der Amplification zur Anreicherung) werden anschließend einer Amplification zur Detektion mit 12 Zyklen in einem Gesamtvolumen von 25 µl in dem vorstehend beschriebenen Amplificationsmedium in Gegenwart von modifizierten Startern unterworfen: entspricht 5 pmol an 5' biotinyliertem Oligonucleotid Ac3 und 5 pmol 5' durch ³²P markiertem Oligonucleotid Ad4, wobei die spezifische Aktivität der Sonde freiwillig auf 50.000 cpm/pmol begrenzt wurde; die Gesamtaktivität pro Probe beträgt etwa 250.000 cpm.
  • Die Figur 1 zeigt das Prinzip des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens. Das Starterpaar der Amplification zur Anreicherung ist durch die einfachen Starter As1 und As2 wiedergegeben. Das Starterpaar zur Amplification zum Nachweis ist durch die Starter Ad4, markiert in 5' mit ³²P und den biotinylierten Starter Ac3 wiedergegeben.
    • - Fixierung auf dem Rohr und Nachweis der gebildeten DNA:
  • Das Gesamtvolumen von 25 µl aus der Amplification zum Nachweis wird in ein mit Avidin beschichtetes Rohr, das 475 µl Fixierungspuffer ST (0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 9,5) enthält, überführt. Die Fixierung läuft im Verlauf einer Stunde bei 50ºC ab. Die Rohre werden anschließend entleert und mit 1 ml ST-Tween 20 in einer Konzentration von 1% einmal 5 Minuten bei Umgebungstemperatur, einmal 5 Minuten bei 50 ºC und einmal 5 Minuten bei 50ºC mit 1 ml 1%igem ST 0,1x-Tween 20 gespült.
  • Die auf den Rohren fixierte Radioaktivität wird anschließend direkt durch den Cerenkov-Effekt gemessen. Die Ergebnisse werden durch das Verhältnis "R" der in dem Rohr fixierten Aktivität zur gesamten Ausgangsaktivität (entspricht etwa 250.000 cpm) ausgedrückt.
    • Beispiel 2: Nachweis des menschlichen Papillomavirus vom Typ 16 (HPV 16) mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von zwei einfachen Startern As1 und As2 zur Amplification zur Anreicherung, eines Paares Ac3-As4 zur Amplification zum Nachweis und einer Sonde Ad5 zum Nachweis.
  • Es wird wie in Beispiel 1 vorgegangen. Der Unterschied ist auf das Starterpaar zur Amplification zum Nachweis und zum Nachweis zurückzuführen.
  • Das Oligonucleotid As4 ist nicht markiert. Der Nachweis wird nach Denaturierung der Probe bei 100ºC durch eine Hybridisierung mit 0,1 pmol der Sonde Ad5 (35-meres), die 5' mit ³²P markiert ist, gewährleistet. Die spezifische Aktivität der Sonde ist stark (2,5 x 10&sup6; cpm/pmol) und die Gesamtaktivität pro Probe beträgt etwa 250.000 cpm.
  • Die markierte Sonde Ad5 zum Nachweis wird nach Transfer der Amplificationslösung zur Detektion in ein mit Avidin beschichtetes Rohr, das 175 µl Fixierungspuffer ST enthält, wie in Beispiel 1 näher ausgeführt, überführt.
    • Beispiel 3: Nachweis der HPV 16-DNA in verdächtigen Biopsien des Gebärmutterhalses.
  • Die DNA der Biopsien wird auf klassischem Weg mit Phenol-Chloroform nach einer Lyse der Zellen und Abbau der Proteine (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) durchgeführt. Von den 12 Proben waren 4 stark positiv (R > 25%), 3 positiv (R > 10%); die negativen hatten ein sehr niedriges Untergrundrauschen (R < 1%) (R ist das Verhältnis der in dem Rohr fixierten Aktivität der gesamten Ausgangsaktivität). Die aus dieser erfindungsgemäßen Technik hervorgehenden Werte entsprechen den Ergebnissen, die durch klassische Hybridisierung auf einem Filter erhalten wurden, aber besitzen überraschenderweise eine deutlich höhere Empfindlichkeit.
    • Beispiel 4: Nachweis von HPV 16 in Vaginalabstrichen.
  • Die Vaginalabstriche werden einfach in sterilem PBS in Suspension gegeben und anschließend zentrifugiert. Der Bodensatz wird in 200 µl Wasser aufgenommen und 15 Minuten lang auf 100ºC gebracht. Der Überstand wird gewonnen und auf -20ºC eingefroren. Von den 8 Proben, die nach dem vorstehend beschriebenen Protokoll behandelt wurden (Beispiel 1), erwies sich eine als schwach positiv (R = 2,5%), die anderen hatten eine Aktivität, die derjenigen der negativen Kontrollen vergleichbar war (R < 1%). Diese Ergebnisse entsprachen immer denjenigen, die mit der Hybridisierungstechnik auf einem Filter erhalten wurden.
    • Beispiel 5: Verwendung eines mit Iod¹²&sup5; markierten Starters.
  • DNA von mit dem Virus HPV 16 infizierten Zellen und DNA von nichtinfizierten Zellen, die als negative Kontrolle verwendet wurden, wurden einer Amplification zur Anreicherung nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll unterworfen.
  • Nach 500facher Verdünnung wird die Amplification zum Nachweis in Gegenwart des biotinylierten Einfangsstarters Ac und eines Oligonucleotids zum Nachweis Ad, das mit Iod¹²&sup5; 5'-markiert ist, nach der in dem französischen Patent 88 08240 beschriebenen Technik durchgeführt. Die Markierung wird freiwillig auf eine schwache spezifische Aktivität (375.000 cpm/mol) beschränkt. Der Nachweis des Doppelstranges wird nach dem für den mit ³² P markierten Starter verwendeten Protokoll, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Der Doppelstrang wird durch Biotin auf dem Avidin beschichteten Rohr fixiert. Nach Spülen wird das Iod¹²&sup5; mit einem Gamma- Counter gemessen. Ergebnisse Ausbeute der Zählung R (cpm fixiert/cpm gesamt) (DNA der Biopsie HPV16 positiv) (celluläre DNA HPV16 negativ) Untergrundrauschen in Abwesenheit von DNA
    • B) nicht-radioaktive Detektion: Beispiel 6: colorimetrischer Nachweis auf Microtiterplatten. Verwendung eines Starters mit einer Dinitrophenylgruppe.
  • DNA von Zellen, die mit dem HPV16-Virus infiziert sind, und gesunde genomische DNA wurden einer Amplification zur Anreicherung unterworfen und dann nach dem beschriebenen Protokoll (siehe Beispiel 1) verdünnt. Die Amplification zur Detektion wird in Gegenwart des biotinylierten Einfangsstarters Ac und eines Starters Ad, der die nach der in dem französischen Patent 88 08240 beschriebenen Technik eingeführte Dinitrophenylgruppe in 5' trägt, durchgeführt. Der Nachweis des Doppelstranges umfaßt mehrere Stufen:
  • 1. Inkubation mit einem Kaninchen-Anti-Dinitrophenol-Antikörper (Sigma Chemical Co.) in einem PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), 1% Tween 20, 1% BSA (Rinderserumalbumin), 1 Stunde bei 37ºC.
  • 2. Waschungen mit 3 x 400 µl PBS-Puffer, 1% Tween 20, 1% BSA bei Umgebungstemperatur.
  • 3. Inkubation mit dem auf 1/300 verdünnten Anti-Kaninchen-Antikörper, der an alkalische Phosphatase (Sigma Chemical Co.) gekoppelt ist, in dem gleichen Puffer, 1 Stunde bei 37ºC.
  • 4. Drei Waschungen mit PBS, 1% Tween 20, 1% BSA bei Umgebungstemperatur.
  • 5. Hydrolytischer Nachweis von Dinitrophenylphosphat (Sigma Kit). Ablesung bei 405 nm. Ergebnisse DO Signal/Rauschen (DNA der Biopsie HPV16 positiv) (DNA der Biopsie HPV16 negativ) In Abwesenheit der DNA
    • Beispiel 7: Andere Beispiele zum Nachweis durch das Verfahren in Lösung. a) Amplificationen:
  • Rohe Zellextrakte wurden ausgehend von Hela-Zellen (HPV18 +) und Eibroplasten (HPV -) hergestellt: nach Zentrifugation wurde der celluläre Bodensatz in 250 µl Wasser aufgenommen und 10 Minuten auf 100ºC erhitzt. Die Zelltrümmer wurden durch eine kurze Zentrifugation entfernt, und der Überstand, der die löslichen Nucleinsäuren enthält, wurde gewonnen.
  • Eine Amplification zur Anreicherung an HPV18 wurde in einem klassischen PCR-Medium, in Gegenwart von 50 pmol jedes der Starter durchgeführt. Sie umfaßt 30 Zyklen: Denaturierung 94ºC, 1 Minute 30, Hybridisierung 50ºC, 1 Minute und Verlängerung 72ºC, 1 Minute 30.
  • Eine Amplification zur Detektion wird ausgehend von einer 1/800fachen Verdünnung der Lösung zur Anreicherung durchgeführt. Diese Amplification wird mit zwei modifizierten Startern durchgeführt: der erste enthält 5' einen Dinitrophenylrest, dies ist der Einfangsstarter, der zweite ist ein Biotinrest, dies ist der Nachweisstarter. Das Amplificationsmedium enthält 5 pmol jedes Starters in einem Gesamtvolumen von 25 µl. Die Anzahl der Zyklen beträgt 18: Denaturierung 94ºC, 1 Minute, Hybridisierung 55ºC, 1 Minute und Elongation 72ºC, 1 Minute.
    • b) Sättigung der Röhren:
  • Nunc-Startröhren, kleines Modell, werden mit DNP-Antikörpern in einem 0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,5, 1 mM MgCl&sub2; eine Nacht bei 37ºC beschichtet. Die freien Stellen werden anschließend durch eine 2%ige BSA-Lösung in dem gleichen Puffer 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gesättigt. Die Röhren werden anschließend 5 Minuten lang in PBS gewaschen und in diesem gleichen Puffer bei 4ºC konserviert.
    • c) Fixierung der Amplificationsprodukte:
  • 15 µl der Amplificationsprodukte zum Nachweis in 500 µl PBS werden zwei Stunden lang bei 37ºC fixiert. Anschließend wird 5 Minuten lang in 500 µl PBS/0,1% BSA/4% Tween 20 gewaschen und dann zweimal 5 Minuten lang in PBS.
  • Anschließend wird mit BSA (3%ige Lösung in PBS) kurz gesättigt: eine Stunde bei 37ºC. Es wird 5 Minuten lang mit PBS gewaschen. Die Lösung aus Avidin-alkalischer Phosphatase (Verdünnung 1/12500 in PBS) wird umgesetzt. Die Fixierung dieses Komplexes vollzieht sich in 30 Minuten bei Umgebungstemperatur. Es folgen drei 5-minütige Waschungen in PBS.
    • d) Nachweis durch Fluoreszens:
  • Das verwendete Substrat der alkalischen Phosphatase ist 4-Methylumbelliferylphosphat. Nach der Spaltung von Phosphat durch das Enzym wird das Substrat fluoreszierend. Die Anregungswellenlänge beträgt 374 mm und die Emissionswellenlänge der Fluoreszens beträgt 450 nm.
  • Es wird eine Stammlösung von 0,05 M Substrat in 0,1 M Tris-Puffer, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl&sub2; hergestellt. Die Arbeitslösung wird durch Verdünnen auf das 1/300 der Stammlösung erhalten. Davon werden 500 µl pro Röhrchen verwendet. Das Enzym wird 15 Minuten lang reagieren gelassen, dann wird die sehr intensive blaue Fluoreszens gemessen.
  • Einstellung des Fluorimeters: 0% an Puffer
  • 100% an positiver DNA
  • Messung der negativen DNA: 2%
  • Messung des Leerwerts: 2%
    • e) Detektion durch Lumineszens:
  • Das Substrat der Lumineszens ist ein Dioxethanderivat: 1,2-Adamantyldioxethanphosphat. Die Lumineszens ist direkt abhängig von der Wirkung des Enzyms: die Spaltung des Phosphats ruft die Bildung eines instabilen Anions hervor, das sich zersetzt. Diese Spaltung erzeugt ein neues aktives Anion, das für das emittierte Licht verantwortlich ist.
  • Es wird ein Stammlösung zu 10 mg/ml hergestellt. Diese Lösung wird 100fach in einem 0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,5, 1 mM MgCl&sub2; verdünnt. Davon werden 500 µl pro Röhrchen verwendet. Es wird 10 Minuten lang reagieren gelassen. Dann wird das Licht in einem Luminometer gemessen.
  • Signal der positiven DNA: 245
  • Signal der negativen DNA: 4
  • Signal des Leerwerts: 1,8
  • Dieses Nachweisverfahren erreicht fast die Empfindlichkeitswerte der radioaktiven Verfahren. Es ist ein Verfahren der Wahl für eine nicht-radioaktive Detektion.
    • f) Detektion durch Colorimetrie:
  • Das für die alkalische Phosphatase verwendete Substrat ist p-Nitrophenylphosphat. Die Abspaltung des Phosphats durch die Enzymwirkung führt zu einer gelben Verbindung, dessen optische Dichte man bei 405 nm mißt.
  • Es werden zwei Phosphatase-Substratpastillen (Sigma 104) in 10 ml 0,8M Diethanolaminpuffer, 5 mM MgCl&sub2;, pH 9,8, aufgelöst. 500 µl pro Röhrchen werden verwendet. Es wird 10 Minuten lang im Dunkeln reagieren gelassen, und dann wird die Reaktion durch Zugabe von 250 µl 2N Natronlauge gestoppt.
  • Messung der DNA positiv: 0,32 O.D.
  • Messung der DNA negativ: 0,02 O.D.
  • Messung des Leerwerts: 0,01 O.D.
  • II - Ausführungsbeispiele in homogener Phase
    • Beispiel 8: Nachweis der DNA des menschlichen Papillomavirus Typ-16 (HPV 16) mit Hilfe der erfindungsgemäßen Ausfuhrungsform in homogener Phase.
  • Die unterschiedlichen zu testenden DNA-Lösungen wurden einer ersten Amplification in einem Medium, das ein Gesamtvolumen von 50 µl enthielt, unterworfen: 50 pmol jedes der zwei Starter A1 und A2, 200 µM jedes der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) (Boehringer Mannheim), 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine und 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Amersham). Dreißig Amplificationszyklen wurden mit einem automatischen Gerät durchgeführt (ein Zyklus entspricht 90 s Denaturierung bei 94ºC, 90 s Hybridisierung bei 50ºC und 120 s Polymerisation bei 72ºC).
  • 1 µl jeder zuvor amplifizierten Probe wird in 100 µl Wasser verdünnt. 1 µl jeder Lösung (1/2.500) wird anschließend einer zweiten Amplificationsreihe mit 15 Zyklen in einem Gesamtvolumen von 25 µl in dem zuvor beschriebenen Amplificationsmedium, das 5 pmol der zwei Starter B1 und B2 enthält, unterworfen.
  • 20 µl der Amplificationslösung werden mit 1 µl 5 µg/ml Ethidiumbromid (entspricht 5 ng) versetzt; es wird gerührt, anschließend werden die Röhrchen unter UV bei 254 nm beobachtet. Nur die Lösungen, die virale DNA von HPV16 enthalten, emittieren eine beobachtbare Fluoreszens. Das erlaubt eine rasche Unterscheidung zwischen den positiven und negativen Proben. Die erhaltenen Ergebnisse entsprechen denen, die mit dem Kontrollgel erhalten wurden.
    • Beispiel 9: Nachweis der viralen DNA von HPV18, die in einem Plasmid enthalten ist.
  • Es werden schrittweise Verdünnungen der Plasmid-DNA von pBR 322, die virale DNA von HPV18 enthält oder nicht, hergestellt. So werden Konzentrationen von 20, 10, 1 und 0,1 ng DNA pro 1 µl erhalten.
  • Die so erhaltenen acht DNA-Lösungen werden einer Amplification in einem Volumen von 25 µl, das 3 pmol jedes der zwei Starter A&sub1; und A&sub2;, die 4 Desoxyribonucleosidtriphosphate (200 µM), 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine und 0,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase enthält, unterworfen. Fünfzehn Amplificationszyklen werden mit Hilfe eines automatischen Geräts durchgeführt: Denaturierung bei 94ºC während 1 Minute 30, Hybridisierung bei 55ºC während 1 Minute 30, anschließend Elongation bei 72ºC während 1 Minute.
  • Am Ende dieser 15 Zyklen werden zu jedem der Röhrchen 1 µl Ethidiumbromidlösung in einer Konzentration von 5 µg/ml (entspricht 5 ng) zugesetzt, dann wird rasch gerührt und anschließend werden die Röhrchen auf einem Leuchttisch bei UV 254 nm beobachtet.
  • Die Röhrchen, die die Amplificationslösungen des Plasmids mit viraler DNA (20, 10 und 1 ng) enthalten, fluoreszieren deutlich, diejenige, die 0,1 ng Plasmid mit viraler DNA enthält, fluoresziert leicht und diejenigen, die nur das Plasmid enthalten, geben kein Signal.
  • Die Detektion von Ethidiumbromid des Amplificationsprodukts einer sehr gereinigten und sehr verdünnten DNA wird unmittelbar nach der Amplification durchgeführt und ergibt ein sehr signifikantes Ergebnis.
    • Beispiel 10: Andere Beispiele zur direkten Detektion in flüssigem Medium:
  • 1) Verwendung eines Bisbenzimids (mit der Bezeichnung HOECHST 33- 258):
  • a) Detektion der DNA des HIV-Virus (erworbenes Immundefekt-Syndrom).
  • 1 µl DNA aus Lymphocyten oder Monocyten von gesunden Personen oder Virusträgern, aus der Milz eines Virusträgers, wobei das Plasmid eine Insertion aus dem Stamm HIV1/lav enthält, werden einer ersten Amplification in einem Volumen von 50 µl, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen.
  • 1 µl jeder zuvor amplifizierten Probe wird in 200 µl H&sub2;O verdünnt. 2 µl dieser Lösung werden einer zweiten Amplification von 25 Zyklen in einem Endvolumen von 25 µl mit den Startern B1 und B2 unterworfen.
  • 20 µl dieser Lösung werden anschließend in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 2M NaCl, welcher 1 µl Endvolumen HOECHST 33-258 enthält, verdünnt.
  • Nach Rühren wird die Fluoreszens in einem Spektrofluorimeter Perkin Elmer LS5 (Anregung 360 nm, Emission 450 nm) gemessen. Das Gerät wurde zuvor mit verschiedenen Verdünnungen doppelsträngiger DNA gemessen. Eichlösung:
  • Es werden zwei Sätze von verschiedenen Primern in dem Tat-Gen und in dem Pol-Gen von HIV1 verwendet. Ergebnisse von Pol: KONTROLL-H&sub2;O LYMPHO+ LYMPHOMILZ+ PLASMID+ LÖSUNG FILTER Ergebnisse von Tat: KONTROLL-H&sub2;O LYMPHO+ LYMPHOMONO+ PLASMID+ LÖSUNG FILTER
  • b) Detektion der DNA des menschlichen Papilloma-Virus vom Typ 16 und 18.
  • 5 µl einer Lösung des Überstands der HPV 18+-Zellen (HELA) und der HPV 16+-Zellen (CASKI), (10&sup6; Zellen in 250 ;µl H&sub2;O) und auf HPV negative Fibroplasten werden einer Amplification, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Nach einer 200fachen Verdünnung werden 2 µl einer zweiten Amplification unterworfen und durch Fluoreszens gemessen. Eichlösung: HPV 16: KONTROLLE FIBROPLASTEN CASKI SOUTHERN LÖSUNG HPV 18: KONTROLLE FIBROPLASTEN HELA SOUTHERN LÖSUNG
  • 2) Verwendung von DAPI:
  • a) Detektion von HPV 18:
  • Es wird das gleiche Protokoll wie in dem vorstehenden Beispiel verwendet; es werden zwei verschiedene Verdünnungen getestet: 1/50 und 1/200.
  • Die Fluoreszens wird in einem 5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, 8 mM NaCl mit 0,02 µg/ml DAPI gemessen (Anregung 372 nm, Emission 454 nm). Eichlösung: HPV 18: KONTROLLE FIBROBLASTEN LÖSUNG SOUTHERN
  • b) Detektion von HIV1:
  • Gleiches Protokoll wie die vorstehenden Beispiele. Eichlösung: HIV1: KONTROLLE LYMPHO+ MONO+ LYMPHOPLASMID+ SOUTHERN LÖSUNG
  • III-Rolle der Stufe (b) der Verdünnung.
  • Die einleitenden Versuche zeigten, daß eine 1/10 Verdünnung ein großes Untergrundrauschen mit einem tiefen Signal nach der Bindung der Hybride an die Affinitätsmatrix herbeiführen und dies unabhängig von der Anzahl der Zykien der zweiten Amplificationsserie. Dies kann durch die Tatsache erklärt werden, daß die PCR üblicherweise in Gegenwart eines großen Überschusses an Startern durchgeführt wird, und daß nach einer 1/10 Verdünnung die in der Lösung noch vorhandene Menge an Amplificationsstartern erhöht wird. Im Verlauf der zweiten Amplificationsreihe findet nun eine Kompetition zwischen den Amplificationsstartern und den Detektionsstartern statt, was zu einer Verringerung der Wirksamkeit der PCR führt. Erhöhte Konzentrationen an Startern können ebenso zur Bildung von Starterdimeren führen.
  • Das Vorhandensein von Zelltrümmern kann ebenso zu einer Teilhemmung der Reaktion führen, da die PCR an frischen DNA-Proben durchgeführt wird und eine Verdünnung von 1/10 nicht immer ausreichend ist, um sie zu entfernen. Die Werte des Untergrundrauschens werden durch Messen der Amplification der nicht-spezifischen Sequenzen erhalten. Das spezifische Signal ist also als die Anzahl der Ausschläge einer spezifischen Amplification nach Abziehen des Wertes für das Untergrundrauschen definiert. Man schätzt die Empfindlichkeit des Verfahrens durch die Messung des Prozentsatzes der Fixierung des spezifischen Signals ab. Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt. Die Nachweisempfindlichkeit ist als Funktion der Zyklen dargestellt.
  • Die Figur 3, bei der auf der Abszisse die Anzahl der Zyklen und auf der Ordonate der Prozentsatz der Fixierungen aufgetragen ist, zeigt PCR- Reaktionen, die an HPV 18+-Zellen (Hela &Delta;, , ) und HPV 18-Zellen (BJAB, , , ) durchgeführt wurden. Die erste Amplification wurde an Zellen (2 x 10&sup4; ) in einem Volumen von 100 µl durchgeführt. Nach einer 1/10 Verdünnung ( , ), einer 1/200 Verdünnung ( &Delta;, ) und einer 1/2000 Verdünnung ( , ) wurden die Proben einer zweiten Amplification in Gegenwart eines mit Iod¹²&sup5; markierten Starters und eines biotinylierten Starters unterworfen. Die Hybride wurden gewonnen, und die Radioaktivität wurde gemessen. Die Gesamtaktivität beträgt 71.000 cpm/Röhrchen, wobei der angegebene Wert der Prozentsatz der fixierten Radioaktivität ist.
  • Wenn die Verdünnung auf 1/200 ( &Delta;, ) bzw. 1/2000 ( ( , ) gebracht wird, ist die Anzahl der Kopien der Zielsequenz, die bei der zweiten Amplification vorhanden sind, anfänglich niedriger und führt zu einer besseren Effizienz der PCR. Die exponentielle Phase ist so ausgeprägter, und das Plateau wird nach 20 bzw. 25 Zyklen erreicht. Im Vergleich dazu beginnt das Untergrundrauschen exponentiell nach 16 und 20 Zyklen anzusteigen.

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweis von spezifischen Sequenzen aus einer bzw. inehreren Nucleinsäure(n) (Einzelseguenz und/ oder Gemisch aus Nucleinsäuresequenzen), die in einer biologischen Probe vorhanden ist bzw. sind, umfassend mindestens eine enzymatische Amplification, dadurch gekennzeichnet, daß man, nachdem man die biologische Probe zu Extraktion der Nucleinsäure(n) in eine geeignete Lösung gebracht hat, eine Nucleinsäuresequenz oder ein Gemisch aus Sequenzen mit Hilfe der folgenden Stufen nachweist:
(1) eine Stufe der Anreicherung der Zielsequenz bzw. Zielsequenzen durch:
(a) Inkontaktbringen der in Lösung gebrachten biologischen Probe mit mindestens einem Paar geeigneter Startsequenzen, um mindestens ein Fragment der Nucleinsäurezielsequenz bzw.
-sequenzen zu amplifizieren, wobei die Startsequenzen mit der bzw. den Zielsequenz(en) hybridisieren und den Erhalt einer Amplificationslösung zur Anreicherung gestatten, und
(b) mindestens eine Verdünnung zwischen 1/50 und 1/100.000 der in (a) erhaltenen Amplificationslösung zur Anreicherung;
(2) eine Stufe des Nachweises der erhaltenen amplifizierten Zielsequenzen durch:
(c) Inkontaktbringen einer Fraktion der in (b) erhaltenen Anreicherungslösung mit mindestens einem Paar Startsequenzen, von denen mindestens eine der Sequenzen in der amplifizierten Zielsequenz gemäß (a) enthalten ist, um mindestens ein Fragment der Nucleinsäurezielsequenz bzw. -sequenzen zu amplifizieren, und
(d) Nachweis der doppelsträngigen, in (c) erhaltenen Kopien der Nucleinsäuren durch irgendein geeignetes Mittel.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (a) und (b) mindestens einmal wiederholt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdünnung der Stufe (b) zwischen 1/50 und 1/50.000 liegt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdünnung der Stufe (b) zwischen 1/50 und 1/10.000, bevorzugt zwischen 1/200 und 1/5.000, liegt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Startsequenzen aus Stufe (a) einzelsträngige Nucleotidsequenzen (einfache Startsequenzen (As)) sind, die mit der geeigneten Zielsequenz hybridisieren.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Startsequenzen aus Stufe (c) Paare, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Paare: durch ein Einfangsystem modifizierte Startsequenz -durch ein Detektionssystem modifizierte Startsequenz (Ac- Ad), die Paare: einzelsträngige Startsequenz - einzelsträngige Startsequenz (As1-As2), die Paare: einzelsträngige Startsequenz - durch ein Einfangsystem modifizierte Startsequenz (Asl-Ac), die Paare: einzelsträngige Startsequenz - durch ein Detektionssystem modifizierte Startsequenz (As1-Ad), sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der im Verlauf der Stufe (c) verwendeten Startsequenzen (zweiter Amplificationscyclus) deutlich unter der Menge der im Verlauf der Stufe (a) verwendeten Startsequenzen liegt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der im Verlauf von Stufe (c) verwendeten Startsequenzen mindestens fünfmal geringer als die Menge der in Stufe (a) verwendeten Startsequenzen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn das Paar der Startsequenzen aus Stufe (c) eine Einfangstartsequenz enthält, die Stufe des Nachweises (2) umfaßt:
(d) Kontaktieren der Amplificationslösung zur Detektion mit einem geeigneten Träger, der die Nucleinsäurefragmente, die die integrierte Startsequenz zum Einfang (Ac) tragen, einfängt, und
(e) Nachweis von Kopien von doppelsträngigen Zielnucleinsäuren, die auf dem Träger zurückgehalten wurden, durch jedes beliebige geeignete Mittel.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn ein Startstück zum Nachweis (Ad) in einen Nucleinsäurezielstrang im Verlauf der Stufe (c) integriert wird, der Nachweis der Stufe (e) mit Hilfe des Startstücks zum Nachweis (Ad) durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn eine einzelsträngige Startsequenz (As) in einen Strang im Verlauf der Stufe (c) integriert wird, der Nachweis der Stufe (e) entweder durch Hybridisieren der doppelsträngigen Kopien der Zielnucleinsäuren, die auf dem Träger zurückgehalten wurden, mit einer geeigneten Nachweissonde durchgeführt wird, oder durch Inkontaktbringen mit einer Verbindung, die mit der doppelsträngigen Zielnucleinsäure in Wechselwirkung tritt, insbesondere einem Farbstoff oder einem intercalierenden Mittel mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Spektralmodificationen, anschließenden Nachweis der Spektralmodificationen der Verbindung, die mit der doppelsträngigen Nucleinsäure wechselwirkt, durch jedes geeignete Mittel, durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn das Paar der Startsequenzen der Stufe (c) keine Startsequenz zum Einfang enthält, die Stufe der Detektion (2) umfaßt:
(d) Direkter Nachweis in homogener flüssiger Phase der amplifizierten Zielsequenzen durch Inkontaktbringen der doppelsträngigen Nucleinsäuren, die nach den vorstehenden Stufen (a), (b) und (c) erhalten wurden, entweder mit einer geeigneten Nachweissonde oder mit einer Verbindung, die mit einer doppelsträngigen Nucleinsäure in Wechselwirkung tritt, insbesondere einem Farbstoff oder einem intercalierenden Mittel mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Spektralmodificationen, anschließender Nachweis der Spektralmodificationen der Verbindung, die mit der doppelsträngigen Nucleinsäure in Wechselwirkung trat, durch jedes beliebige geeignete Mittel.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung aus Substanzen, die nach der Bindung an doppelsträngige DNA eine physikalischchemische Modification zeigen, ausgewählt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der Eignung zur Erzeugung von Spektralmodificationen ein fluoreszierendes, intercalierendes Mittel, wie insbesondere Ethidiumbromid oder Bis-Benzimidin, ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die schrittweisen Verdünnungen einer zu testenden DNA, und insbesondere einer zu testenden viralen DNA, einem ersten Amplificationscyclus in einem geeigneten Volumen, das mindestens zwei Zielsequenzen mit der Eignung, als Matrizen zu dienen, die vier Desoxyribonucleosidtriphosphate, eine geeignete Menge an Tag DNA-Polymerase in einer geeigneten Pufferlösung mit pH 8,3, die eine geringe Menge (in der Größenordnung von 0,01% Gew./Vol.) Gelatine enthält, enthält, unterworfen werden, wobei die Produkte des ersten Amplificationscyclus anschließend einem zweiten Verdünnungsschritt, dann einem zweiten Amplificationscyclus in einem Amplificationsmedium, das bevorzugt dem in dem ersten Amplificationscyclus verwendeten ähnlich ist, und das mindestens zwei Zielsequenzen mit der Eignung, als Matrizen zu dienen, enthält, unterworfen werden, wonach die Verbindung mit der Eignung zur Erzeugung von Spektralmodificationen der nach dem zweiten Amplificationscyclus erhaltenen Amplificationslösung zugesetzt wird, um virale doppelsträngige DNA, die in den Lösungen gegebenenfalls vorhanden ist, nachzu weisen.
16 Gebrauchsfertige Reagenszusammenstellung, Kit oder aufeinander abgestimmte Garnitur zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie bzw. es außer nützlichen Mengen an Puffern und Reagenzien zur Durchführung eines Nachweises mindestens:
- geeignete Mengen mindestens eines ersten Paares geeigneter Startsequenzen zur Durchführung der Stufe (a) des Verfahrens;
- geeignete Mengen mindestens eines zweiten Paares geeigneter Startsequenzen zum Nachweis der Stufe (c) des Verfahrens, und gegebenenfalls
- geeignete Mengen einer geeigneten Sonde zur Durchführung der Stufe (e) des Verfahrens und/oder
- geeignete Mengen mindestens einer Verbindung, die sich nicht covalent an eine doppelsträngige Nucleinsäure bindet, wie insbesondere eines Farbstoffs oder eines intercalierenden Mittels, mit der Eignung zur Erzeugung von Spektralmodificationen bei Fixierung an eine Nucleinsäure oder bei fehlender Fixierung an eine Nucleinsäure,
umfaßt.
17. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zum Nachweis genetischer Erkrankungen sowohl von Menschen und Tieren als auch von Pflanzen.
18. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zum Nachweis von Infektionskrankheiten sowohl des Menschen und der Tiere als auch von Pflanzen.
19. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zum Nachweis von Tumorerkrankungen sowohl von Menschen und Tieren als auch von Pflanzen.
20. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Kontrolle biologischer Proben.
21. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Zelltypisierung.
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