DE3688383T2

DE3688383T2 - Rekombinantes vektorsystem fuer metalloproteinase-inhibitorsequenz und dessen verwendung und herstellung nach dem rekombinant-dns-verfahren.

Info

Publication number: DE3688383T2
Application number: DE8686902087T
Authority: DE
Inventors: David C Anderson; David Carmichael; George Stricklin; Howard Welgus
Original assignee: Synergen Biologicals Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1985-02-05
Filing date: 1986-02-05
Publication date: 1993-08-26
Anticipated expiration: 2006-02-06
Also published as: DK422786A; WO1986004608A1; ATE89005T1; EP0211077B1; DK422786D0; DK175964B1; US6090585A; DE3688383D1; US6800732B2; KR940010862B1; JPS62502101A; JPH088870B2; US20030003556A1; KR870700096A; EP0211077A1; EP0211077A4; US6342374B1; AU5549386A; AU636370B2; AU5971090A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Anmeldung ist eine Continuation in Part-Anmeldung der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 784,319, eingereicht am 4. Oktober 1985, die wiederum eine Continuation in Part- Anmeldung der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 699,181, eingereicht am 5. Februar 1985, ist. Endogene proteolytische Enzyme dienen zum Abbau von eindringenden Organismen, Antigen-Antikörperkomplexen und bestimmten Gewebeproteinen, die für den Organismus nicht länger notwendig oder nützlich sind. In einem normal funktionierenden Organismus werden proteolytische Enzyme in begrenzter Menge erzeugt und zum Teil durch spezifische Inhibitoren reguliert.
Metalloproteinasen sind im Körper vorhandene Enzyme, die oft am Abbau von Bindegeweben beteiligt sind. Während ein geringer Abbau von Bindegewebe für das normale Funktionieren eines Organismus notwendig ist, tritt ein Übermaß des Abbaus von Bindegewebe bei verschiedenen Krankheitszuständen auf und wird, zumindest zum Teil, auf überschüssige Metalloproteinase zurückgeführt. Es wird angenommen, daß Metalloproteinasen zumindest an periodontalen Erkrankungen, Ulcera der Cornea und der Haut, rheumatoider Arthritis und der Verbreitung von karzinomatösen festen Tumoren beteiligt sind.
Diese Erkrankungen treten im allgemeinen in Körperbereichen auf, die einen hohen Anteil von Kollagen, einer besonderen Form von Bindegewebe, enthalten. Eine Untersuchung von Patienten mit diesen Bindegewebserkrankungen hat einen exzessiven Abbau der verschiedenen Bestandteile des Bindegewebes gezeigt, einschließlich von Kollagen, Proteoglycanen und Elastin. Es ist daher abgeleitet worden, daß eine überschüssige Konzentration einer bestimmten Metalloproteinase, z. B. Kollagenase, Proteoglyconase, Gelatinase und von bestimmten Elastasen, die mit den zuvor erwähnten Erkrankungen verbundene Bindegewebszerstörung verursachen oder verstärken kann.
Im normalen Zustand besitzt der Körper Metalloproteinase- Inhibitoren, die an die Metalloproteinasen binden, um diese Enzyme effektiv davon abzuhalten, auf ihre Bindegewebssubstrate einzuwirken. Im gesunden Organismus sind die Metalloproteinase-Inhibitoren in Konzentrationen vorhanden, die ausreichend sind, mit den Metalloproteinasen in einem Ausmaß in Wechselwirkung zu treten, die einer ausreichenden Menge von Metalloproteinase erlaubt, aktiv zu bleiben, während überschüssige Metalloproteinase gebunden wird, so daß die bei den verschiedenen Erkrankungen beobachteten Bindegewebsschäden nicht auftreten.
Es wird angenommen, daß eine unmittelbare Ursache der Bindegewebszerstörung, die bei den vorstehend genannten Krankheitszuständen vorhanden ist, ein Ungleichgewicht der relativen Metalloproteinase/Metalloproteinase-Inhibitorkonzentrationen ist. Es wird vermutet, daß in diesen Situationen entweder infolge einer überschüssigen Menge von aktiver Metalloproteinase oder einer Defizienz bei der Menge von aktivem Metalloproteinase-Inhibitor überschüssige Metalloproteinase den Bindegewebsabbau verursacht, der für die Entstehung oder die Verschlimmerung der Krankheit verantwortlich ist. Es wird postuliert, daß durch Behandlung von Personen mit Bindegewebserkrankungen mit Metalloproteinase-Inhibitoren die abbauende Wirkung der überschüssigen Metalloproteinase eingeschränkt oder zum Stillstand gebracht werden kann. Metalloproteinase-Inhibitoren von besonderem Interesse für die vorliegenden Erfinder sind daher Kollagenase-Inhibitoren, weil angenommen wird, daß diese Inhibitoren für die Behandlung oder Prophylaxe von Bindegewebserkrankungen pharmazeutisch nützlich sein könnten.
Die Existenz von Metalloproteinase und Metalloproteinase- Inhibitoren ist in der Literatur bereits erörtert worden. Beispielsweise diskutieren Sellers et al., Biochemical And Biophysical Research Communications 87:581-587 (1979), die Isolierung von Kaninchenknochen-Kollagenase-Inhibitor. Aus menschlichen Hautfibroblasten isolierter Kollagenase-Inhibitor wird von Stricklin und Welgus, J.B.C. 258:12252-12258 (1983) und Welgus und Stricklin, J.B.C. 258:12259-12264 (1983), erörtert. Die Gegenwart von Kollagenase-Inhibitoren in natürlich auftretenden Körperflüssigkeiten wird weiter in Murphy et al., Biochem. J. 195:167-170 (1981) und Cawston et al., Arthritis and Rheumatism, 27:285 (1984), diskutiert. Weiterhin werden Metalloproteinase-Inhibitoren von Reynolds et al., in Cellular Interactions, Dingle and Gordon, eds. (1981), diskutiert. Obwohl diese Artikel besondere isolierte Metalloproteinase-Inhibitoren charakterisieren und in einem gewissen Ausmaß die Rolle oder die mögliche Rolle von Metalloproteinasen bei der Erkrankung von Bindegewebserkrankungen erörtern und über die Fähigkeit von Metalloproteinase-Inhibitoren spekulieren, dieser Zerstörung entgegenzuwirken, war keiner dieser Forscher zuvor in der Lage, eine tragbare DNA-Sequenz zu isolieren, die die intrazelluläre Produktion von Metalloproteinase-Inhibitoren steuern kann, oder ein rekombinantes DNA-Verfahren für die Erzeugung solcher Inhibitoren zu schaffen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise eine tragbare DNA-Sequenz entdeckt, die die rekombinante DNA-Synthese von Metalloproteinase-Inhibitoren steuern kann. Diese Metalloproteinase-Inhibitoren sind den aus menschlichen Hautfibroblastenkulturen isolierten Metalloproteinase-Inhibitoren biologisch äquivalent. Die erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitoren, die mit den hier beschriebenen rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden, werden eine verstärkte Forschung auf dem Gebiet der Vorbeugung und Behandlung von Metalloproteinase-induzierten Bindegewebserkrankungen ermöglichen. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitoren für die Neutralisierung von Metalloproteinasen, einschließlich der mit den Krankheitszuständen verbundenen überschüssigen Metalloproteinasen, nützlich. Es wird daher angenommen, daß ein Heilmittel für diese Erkrankungen entwickelt werden wird, das als einen aktiven Bestandteil die erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitoren umfassen wird. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitoren mit ihren Metalloproteinasezielen auf eine Weise in Wechselwirkung treten, die die Entwicklung von diagnostischen Tests für degradativen Bindegewebserkrankungen unter Verwendung der neu entdeckten Inhibitoren erlaubt.
Die rekombinanten Metalloproteinase-Inhibitoren, die hier erörtert werden, treten mit ihren Metalloproteinasezielen stoechiometrisch (d. h., in einem 1:1-Verhältnis) in Wechselwirkung. Diese Metalloproteinase-Inhibitoren sind außerdem wärmebeständig, säurestabil, glycosyliert und weisen einen hohen isoelektrischen Punkt auf.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Metalloproteinase-Inhibitoren und ein rekombinantes DNA-Verfahren zu deren Erzeugung und auftragbare DNA-Sequenzen, die zur Steuerung der intrazellulären Erzeugung von Metalloproteinase- Inhibitoren fähig sind. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kollagenase-Inhibitor, ein rekombinantes DNA-Verfahren zu dessen Erzeugung und auf tragbare DNA-Sequenzen für die Verwendung in dem rekombinanten Verfahren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Reihe von Vektoren, die diese tragbaren DNA-Sequenzen enthalten.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Metalloproteinase-Inhibitor zur Verfügung zu stellen, der in ausreichender Menge und ausreichender Reinheit erzeugt werden kann, um ökonomische pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die Metalloproteinase-Inhibitor-Aktivität besitzen.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein rekombinantes DNA-Verfahren für die Erzeugung dieser Metalloproteinase-Inhibitoren bereitzustellen. Die rekombinanten Metalloproteinase-Inhibitoren, die mit diesem Verfahren erzeugt werden, sind dem aus Kulturen menschlicher Hautfibroblasten isolierbaren biologisch äquivalent.
Um die rekombinante DNA-Synthese dieser Metalloproteinase- Inhibitoren zu erleichtern, ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, tragbare DNA-Sequenzen bereitzustellen, die die intrazelluläre Erzeugung von Metalloproteinasen Inhibitoren steuern können. Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Klonierungsvektoren bereitzustellen, die diese tragbaren DNA-Sequenzen enthalten. Diese Vektoren können in rekombinanten Systemen verwendet werden, um pharmazeutisch nützliche Mengen der Metalloproteinasen Inhibitoren zu erzeugen.
Weitere Aufgabe und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung ausgeführt werden und sind zum Teil aus der Beschreibung offensichtlich oder können bei der Durchführung der Erfindung erlernt werden. Die Aufgaben und Vorteile können mittels der Werkzeuge und Kombinationen, die in den anhängenden Ansprüchen besonders aufgeführt sind, erkannt und erreicht werden.
Um diese Aufgaben zu lösen und im Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung werden Metalloproteinase-Inhibitoren erläutert, die mit Metalloproteinasen eine stoechiometrische Reaktion eingehen können. Diese Metalloproteinase- Inhibitoren sind bemerkenswert wärmebeständig, säurestabil, glycosyliert und weisen einen hohen isoelektrischen Punkt auf. Weiter sind diese Metalloproteinase-Inhibitoren jenen Inhibitoren biologisch äquivalent, die aus Kulturen menschlicher Hautfibroblasten isoliert worden sind.
Um die Aufgaben weiter zu lösen und in Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung, wie sie hier umfaßt und breit beschrieben wird, werden für Metalloproteinase-Inhibitoren kodierende tragbare DNA-Sequenzen bereitgestellt. Diese Sequenzen umfassen Nukleotidsequenzen, die die intrazelluläre Produktion von Metalloproteinase-Inhibitoren steuern können. Diese tragbaren Sequenzen können entweder synthetische Sequenzen oder Restriktionsfragmente ("natürliche" DNA-Sequenzen) sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine tragbare DNA-Sequenz aus einer cDNA-Bank menschlicher Fibroblasten isoliert und kann die intrazelluläre Produktion eines Kollagenase-Inhibitors steuern, der biologisch dem Inhibitor äquivalent ist, der aus einer Kultur humaner Hautfibroblasten isoliert werden kann.
Der kodierende Strang einer ersten bevorzugten DNA-Sequenz, die entdeckt worden ist, hat die folgende Nukleotidsequenz:
Die durch die vorstehenden Abkürzungen dargestellten Nukleotide sind in der eingehenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen erläutert.
Eine zweite bevorzugte DNA-Sequenz ist entdeckt worden, die eine zusätzliche Nukleotidsequenz 5' von der Initiatorsequenz aufweist. Diese Sequenz, die als die Nukleotide 82 bis 432 die Nukleotide 1 bis 351 der ersten bevorzugten DNA-Sequenz, die oben erläutert ist, enthält, hat die folgende Nukleotidsequenz:
Eine dritte bevorzugte DNA-Sequenz, die den 5'-Bereich der zweiten bevorzugten Sequenz und die 3'-Sequenz der ersten bevorzugten Sequenz enthält, hat die folgende Nukleotidsequenz:
Derzeit bevorzugen die Erfinder für die Expression des Metalloproteinase-Inhibitoren in Tierzellen ein Verfahren, das eine vierte bevorzugte DNA-Sequenz verwendet. Der kodierende Strang dieser Sequenz lautet wie folgt:
Um die Identifizierung und Isolierung natürlicher DNA-Sequenzen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, haben die Erfinder eine cDNA-Bank von menschlichen Hautfibroblasten entwickelt. Diese Bank enthält die genetische Information, die zur Steuerung der Zelle zur Synthese der erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitoren fähig ist. Andere natürliche DNA-Sequenzen, die in den hier erläuterten rekombinanten DNA-Verfahren verwendet werden können, können aus Humangenombanken isoliert werden.
Zusätzlich können für die erfindungsgemäßen Verfahren nützliche tragbare DNA-Sequenzen synthetisch erzeugt werden. Die synthetischen DNA-Sequenzen können durch Polynukleotidsynthese und Sequenzierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Weiterhin wird, um die Aufgabe zu lösen und im Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes DNA-Verfahren offenbart, das zur mikrobiellen Herstellung der erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitoren unter Verwendung der oben erwähnten tragbaren DNA-Sequenz führt. Dieses rekombinante DNA-Verfahren umfaßt:
a) das Herstellen einer tragbaren DNA-Sequenz, die fähig ist, einen Wirtsmikroorganismus zu steuern, so daß er eine Proteinsequenz mit Metalloproteinase-Inhibitoraktivität, bevorzugt Kollagenase-Inhibitoraktivität, erzeugt;
b) das Klonieren der tragbaren DNA-Sequenz in einem Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen werden und darin replizieren kann, wobei der Vektor Steuerungselemente für die tragbare DNA-Sequenz enthält;
c) das Übertragen des die tragbare DNA-Sequenz und die Steuerungselemente enthaltenden Vektors in einen Wirtsmikroorganismus, der zum Exprimieren des Metalloproteinase-Inhibitorproteins fähig ist;
d) das Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die für die Amplifikation des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind; und
e) in beliebiger Reihenfolge:
(i) das Ernten des Inhibitors; und
(ii) das den Inhibitor Veranlassen, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wodurch er Metalloproteinase-Inhibitoraktivität besitzt.
Um weiter die Aufgaben der Erfindung zu lösen und im Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung wird eine Reihe von Klonierungsvektoren bereitgestellt, die mindestens eine der oben erörterten tragbaren DNA-Sequenzen umfassen. Insbesondere wird das Plasmid pUC9-F5/237P10 offenbart.
Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung sind nur als beispielhaft und erläuternd zu verstehen und beschränken nicht die Erfindung, so wie sie beansprucht wird.
Die begleitende Zeichnung, die in die Beschreibung eingefügt ist und ein Teil dieser darstellt, veranschaulicht eine Ausführungsform der Erfindung und dient zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung der Prinzipien der Erfindung.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1* ist eine partielle Restriktionskarte des Plasmides pUC9-F5/237P10.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Im Folgenden wird nun detailliert auf die derzeit bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen Bezug genommen werden, was zusammen mit der Zeichnung und den folgenden Beispielen zur Erklärung der Prinzipien der Erfindung dient.
Wie oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung zum Teil auf tragbare DNA-Sequenzen, die zur Steuerung der intrazellulären Produktion von Metalloproteinase-Inhibitoren in einer Vielzahl von Wirtsorganismen fähig sind. In diesem Zusammenhang soll "tragbare DNA-Sequenz" entweder eine syn-* Anm. des Übersetzers: Fig. 1 ist nicht Bestandteil der erteilten Fassung des Patentes
thetisch erzeugte Nukleotidsequenz oder ein Restriktionsfragment einer natürlich auftretenden DNA-Sequenz bezeichnen. Für die Zwecke dieser Beschreibung soll "Metalloproteinase-Inhibitor" die Primärstruktur des Proteins bezeichnen, wie sie durch die in der Desoxyribonukleinsäuresequenz, die die intrazelluläre Produktion der Aminosäuresequenz steuert, vorhandenen Kodons definiert ist, und die posttranslationale Modifikationen einschließen kann oder auch nicht. Es wird in Betracht gezogen, daß solche posttranslationale Modifikationen beispielsweise Glycosylierung umfassen. Es ist weiter beabsichtigt, daß der Ausdruck "Metalloproteinase-Inhibitor" entweder die Form des Proteins bezeichnet, wie es von einem Mikroorganismus ausgeschieden werden würde, oder den Methionyl-Metalloproteinase-Inhibitor, wie er in Mikroorganismen vorhanden sein kann, aus denen er nicht ausgeschieden worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die tragbaren DNA-Sequenzen zur Steuerung der intrazellulären Produktion von Kollagenase-Inhibitoren fähig. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können die tragbaren DNA-Sequenzen die intrazelluläre Produktion eines Kollagenase-Inhibitors steuern, der dem zuvor aus Kulturen menschlicher Hautfibroblasten isolierten biologisch äquivalent ist. Mit "biologisch äquivalent", so wie es hier in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, ist gemeint, daß ein Inhibitor, der unter Verwendung einer erfindungsgemäßen tragbaren DNA-Sequenz erzeugt wird, Kollagenase-induzierte Gewebeschädigungen des gleichen Typs, aber nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß wie nativer Human-Kollagenase-Inhibitor verhindern kann, insbesondere jener nativer Human-Kollagenase- Inhibitor, der aus Kulturen menschlicher Hautfibroblastenzellen isolierbar ist.
Eine erste bevorzugte erfindungsgemäße tragbare DNA-Sequenz hat eine folgende Nukleotidsequenz:
worin die folgenden Nukleotide durch die unten gezeigten Abkürzungen dargestellt werden.
Nukleotide Abkürzung
Desoxyadenylsäure A
Desoxyguanylsäure G
Desoxycytidylsäure C
Thymidylsäure T
Eine zweite bevorzugte erfindungsgemäße tragbare DNA-Sequenz hat die folgende Nukleotidsequenz:
Bei dieser zweiten bevorzugten DNA-Sequenz existiert ein offenes Leseraster von Nukleotid 1 bis Nukleotid 432. Das erste Methionin dieses Leserasters wird durch die Nukleotide 49 bis 51 kodiert und ist die Stelle der Translationinitiation. Es sollte bemerkt werden, daß die Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotide 49 bis 114 beschrieben wird, nicht in reifen Metalloproteinasen gefunden wird. Es wird angenommen, daß diese Sequenz die Leitsequenz des menschlichen Proteines ist.
Eine dritte bevorzugte DNA-Sequenz hat die Nukleotidsequenz:
Diese dritte Sequenz enthält den 5' nicht-translatierten Bereich der zweiten bevorzugten Sequenz und den 3'-Bereich der ersten bevorzugten Sequenz. Es wird angenommen, daß diese dritte bevorzugte Sequenz die intrazelluläre Produktion einer einem reifen Human-Kollagenase-Inhibitor analogen Metalloproteinase in einem mikrobiellen oder einem Säugetier-Expressionssystem steuern kann.
Für die Expression der erfindungsgemäßen Metalloproteinase- Inhibitoren in Tierzellen bevorzugen die Erfinder derzeit ein Verfahren, das eine vierte bevorzugte DNA-Sequenz verwendet. Der kodierende Strang der Sequenz lautet wie folgt:
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung muß berücksichtigt werden, daß die Veränderung einiger Aminosäuren in einer Proteinsequenz die grundlegenden Eigenschaften des Proteins nicht beeinflussen muß. Es ist daher ebenso beabsichtigt, daß andere tragbare DNA-Sequenzen, und zwar sowohl solche, die zur Steuerung der intrazellulären Produktion von identischen Aminosäuresequenzen fähig sind, als auch solche, die zur Steuerung der intrazellulären Produktion von analogen Aminosäuresequenzen fähig sind, die ebenfalls Metalloproteinase-Inhibitor-Aktivität besitzen, in den Bereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Es wird angenommen, daß einige dieser analogen Aminosäuresequenzen im wesentlichen zu nativen Metalloproteinase-Inhibitoren homolog sind, während andere Aminosäuresequenzen, die als Metalloproteinase-Inhibitor wirken können, keine wesentliche Homologie mit nativen Inhibitoren aufweisen werden. Mit "wesentlicher Homologie", so wie es hier verwendet wird, ist ein Grad der Homologie mit einem nativen Metalloproteinase-Inhibitor von mehr als 50%, bevorzugt mehr als 60% und bevorzugt mehr als 80% gemeint. Der Prozentsatz Homologie, so wie er hier diskutiert wird, wird als der Prozentsatz der Aminosäurereste berechnet, die in der kleineren der beiden Sequenzen gefunden wird, die mit identischen Aminosäureresten in der Sequenz übereinstimmen, wobei der Vergleich durchgeführt wird, wenn vier Lücken bei einer Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um diese Zuordnung zu unterstützen, wie von Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequenz and Structure, Band 5, Seite 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., erläutert wird; diese Literaturstelle wird durch Bezugnahme hier einbezogen.
Wie oben erwähnt, können die erfindungsgemäßen tragbaren DNA-Sequenzen synthetisch erzeugt werden. Es wird angenommen, daß die Mittel für die synthetische Erzeugung dieser Polynukleotidsequenzen dem Fachmann allgemein bekannt sind, insbesondere im Licht der hier enthaltenen Lehren. Als ein Beispiel für den derzeitigen Stand der Technik bezüglich der Polynukleotidsynthese wird auf Matteucci, M.D. und Beaucage, S.L. und Caruthers, M.H. in Tetrahedron Lett. 22: 1859 (1981), hier durch Verweis mit einbezogen, verwiesen.
Die tragbare DNA-Sequenz kann weiterhin ein Fragment einer natürlichen Sequenz sein, d. h., ein Fragment eines Polynukleotides, das in der Natur auftritt und das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung das erste Mal isoliert und gereinigt worden ist. In einer Ausführungsform ist die tragbare DNA-Sequenz ein Restriktionsfragment, das aus einer cDNA-Bank isoliert worden ist. In dieser bevorzugten Ausführungsform wird die cDNA-Bank aus menschlichen Hautfibroblasten erzeugt.
In einer alternativen Ausführungsform wird die tragbare DNA-Sequenz aus einer Genombank des Menschen isoliert. Ein Beispiel für eine solche für diese Ausführungsform nützliche Bank wird von Lawn et al., Cell 15: 1157-1174 (1978), erläutert; die Literaturstelle wird hier durch Verweis einbezogen.
Wie oben bereits erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Reihe von Vektoren, deren jeder mindestens eine der hier beschriebenen tragbaren DNA-Sequenzen enthält. Es wird angenommen, daß weitere Kopien der tragbaren DNA-Sequenz in einen einzelnen Vektor einbezogen werden können, um die Fähigkeit eines Wirtsorganismus zu erhöhen, große Mengen des gewünschten Metalloproteinase-Inhibitors zu erzeugen.
Die Klonierungsvektoren im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung können außerdem weitere Nukleotidsequenzen enthalten, die der tragbaren DNA-Sequenz vorangehen oder ihr folgen. Diese ergänzenden Sequenzen sind solche, die nicht mit der Transkription der tragbaren DNA-Sequenz interferieren und in einigen Fällen, die weiter unten ausführlicher beschrieben sind, die Transkription, Translation oder die Fähigkeit der primären Aminosäurestruktur des resultierenden Metalloproteinase-Inhibitors, eine aktive Tertiärform einzunehmen, steigern.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Vektor ist in Fig. 1* gezeigt. Dieser Vektor, pUC9-F5/237P10, enthält die oben erläuterte bevorzugte Nukleotidsequenz. Der Vektor pUC9-F5/ 237P10 ist in den C600/pUC9-F5/237P10-Zellen bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, unter der Hinterlegungs-Nr. 53003 hinterlegt.
Eine bevorzugte Nukleotidsequenz, die für den Metalloproteinase-Inhibitor kodiert, ist in Fig. 1* als Bereich A identifiziert. Das Plasinid pUC9-F5/237P10 enthält ergänzende Nukleotidsequenzen, die der bevorzugten tragbaren DNA-Sequenz im Bereich A vorangehen oder ihr nachfolgen. Diese ergänzenden Sequenzen sind als Bereich B bzw. C identifiziert.
In alternativen bevorzugten Ausführungsformen kann entweder eine oder beide der vorangehenden oder nachfolgenden ergänzenden Sequenzen aus dem Vektor von Fig. 1* durch Behandlung des Vektors mit Restriktionsendonukleasen, die für die Ent- fernung der ergänzenden Sequenzen geeignet sind, entfernt werden. Die ergänzende Sequenz nach der tragbaren DNA-Se- quenz, die in Fig. 1* als Bereich C identifiziert ist, kann durch Behandlung des Vektors mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease, bevorzugt HgiAI, entfernt werden, gefolgt von Rekonstruktion des 3'-Endes des Bereiches A unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide und Ligation des Vektors mit T4-DNA-Ligase. Die Deletion der ergänzenden
* siehe Anm. auf s. 13
Sequenz, die der tragbaren DNA-Sequenz vorangeht, die in Fig. 1* als Bereich B identifiziert ist, wird spezifisch durch das im Beispiel 2 gezeigte Verfahren erreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen enthalten Klonierungsvektoren, die die erfindungsgemäße tragbare DNA-Sequenz enthalten und exprimieren können, verschiedene funktionelle Elemente. Diese "funktionellen Elemente", so wie sie hier diskutiert werden, umfassen mindestens einen Promotor, mindestens eine Shine-Dalgarno-Sequenz und mindestens ein Terminatorkodon. Diese "funktionellen Elemente" umfassen bevorzugt mindestens einen Operator, mindestens eine Leitsequenz und bei Proteinen, die aus dem Intrazellularraum exportiert werden, mindestens einen Regulator und jede andere DNA-Sequenz, die für eine entsprechende Transkription und anschließende Translation der Vektor-DNA notwendig oder bevorzugt sind.
Weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann man sich vorstellen als andere bekannte oder derzeit noch nicht entdeckte Vektoren verwendend, die eine oder mehrere der hier beschriebenen tragbaren DNA-Sequenzen enthalten würden. Insbesondere ist es bevorzugt, daß diese Vektoren einige oder alle der folgenden Merkmale haben:
1) eine minimale Anzahl von Wirtsorganismussequenzen zu besitzen; 2) in dem gewünschten Wirt stabil zu sein; 3) fähig zu sein, in einer hohen Kopienzahl in dem gewünschten Wirt vorhanden zu sein; 4) einen regulierbaren Promotor zu besitzen; 5) mindestens eine DNA-Sequenz zu haben, die für ein nachweisbares Merkmal kodiert, das auf einem von dem Teil des Plasmides, in den die tragbare DNA-Sequenz insertiert werden wird, getrennten Teil des Plasmides vorhanden ist; und 6) in den Vektor integriert zu werden.
Die folgende nicht-abschließende Liste von Klonierungsvektoren wird angesehen als eine Liste, die Vektoren aufführt,
* siehe Anm. auf S. 13
die leicht verändert werden können, um die oben genannten Kriterien zu erfüllen, und die daher für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Solche Veränderungen kann der Fachmann im Licht der verfügbaren Literatur und der hier gegebenen Lehren leicht durchführen. Tabelle I Wirt Vektoren Kommentare E. coli Viele selektierbare Replikons sind charakterisiert worden. Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. BACILLUS B. subtilis B. amyloliquefaciens B. stearothermophilus Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan und Hoch, eds., 1984, Academic Press. PSEUDOMONAS P. aeruginosa P. putida Einige Vektoren sind in einem breiten Wirtsbereich von Gram-negativen Bakterien einschließlich Xanthomonas und Agrobakterium nützlich. CLOSTRIDIUM C. perfringens Schaukelplasmide für E. coli und C. perfringens, Konstruktion siehe Squires, C. et al. (1984) Journal Bacteriol. 159: 465-471. SACCHAROMYCES S. cerevisiae Botstein und Davis in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones, und Broach, eds., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.
Es ist zu verstehen, daß zusätzliche Klonierungsvektoren jetzt bestehen können oder entdeckt werden, die die oben genannten Eigenschaften haben und daher für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Diese Vektoren werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs der offenbarten Reihe von Klonierungsvektoren, in die die tragbaren DNA-Sequenzen zusammen mit jedem notwendigen funktionellen Element eingeführt werden können, liegend angesehen, wobei der veränderte Vektor im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegt und in dem unten genauer beschriebenen rekombinanten DNA-Verfahren verwendet werden könnte.
Zusätzlich zu der oben angegebenen Liste ist ein E. coli- Vektorsystem, wie gezeigt im Beispiel 2, in einer Ausführungsform als ein Klonierungsvektor bevorzugt. Darüberhinaus sind einige Vektorplasmide, die in einem weiten Bereich von Gram-negativen Bakterien autonom replizieren, für die Verwendung als Klonierungsvehikel in Wirten der Gattung Pseudomonas bevorzugt. Diese sind von Tait, R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M., Rodriguez, R.L. und Kado, C.I.
in Biotechnology, May 1983, Seiten 269-275; Panopoulos, N.J. in Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, Seiten 163-185, (1981); und Sakaguchi, K. in Current Topic in Microbiology and Immunology 96:31-45, (1982), beschrieben worden; jede dieser Veröffentlichungen wird hier durch Verweis einbezogen.
Eine besonders bevorzugte Konstruktion verwendet das Plasmid RSF1010 und dessen Derivate, wie von Bagdasarian, M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S., und Timmis, K.N. in Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. und Pühler, A., Hrsg., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), hier durch Verweis einbezogen, beschrieben. Die Vorteile von RSF1010 sind, daß es ein relativ kleines Plasmid mit einer hohen Kopienzahl ist, das leicht in E. coli- und Pseudomonas-Arten transformiert wird und stabil beibehalten wird. In diesem System ist es bevorzugt, das Tac-Expressionssystem zu verwenden, wie beschrieben für Escherichia, da es scheint, daß der E. coli-trp-Promotor von der Pseudomonas-RNA-Polymerase leicht erkannt wird, wie von Sakaguchi, K. in Current Topics in Microbiology and Immunology 96:31-45 (1982) und Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H., und Heyneker, H.L. in Biotechnology Feb. 1984, Seiten 161-165, ausgeführt, die hier beide durch Verweis mit einbezogen werden. Die Transkriptionsaktivität kann weiter maximiert werden, indem der Promotor durch beispielsweise einen E. coli- oder P. aeruginosa-trp-Promotor ausgetauscht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird P. aeruginosa mit Vektoren transformiert, die die Synthese der Metalloproteinase-Inhibitoren entweder als intrazelluläres Produkt oder als Produkt, das an eine Leitsequenz gekoppelt ist, die seine Prozessierung und den Export aus der Zelle bewirkt, steuern. In dieser Ausführungsform werden die Leitsequenzen bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus β-Lactamase, OmpA-Protein, dem natürlich auftretenden menschlichen Signalpeptid und dem der Carboxypeptidase G2 aus Pseudomonas besteht. Die Translation kann an die Translationsinitiation für jedes der in Beispiel 2 beschriebenen E. coli-Proteine gekoppelt werden, sowie an Initiationsstellen jedes der hoch exprimierten Proteine des Wirtes, um eine intrazelluläre Expression des Metalloproteinase-Inhibitors hervorzurufen.
In solchen Fällen, wo Restriktions-Minus-Stämme einer Wirts-Pseudomonas-Art nicht verfügbar sind, ist die Transformationseffizienz mit Plasmidkonstrukten, die aus E. coli isoliert worden sind, gering. Daher ist eine Passage des Pseudomonas-Klonierungsvektors durch einen r- m+ -Stamm einer anderen Art vor der Transformation des gewünschten Wirtes erwünscht, wie von Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, Seiten 411-422, (1979) ausgeführt; die Literaturstelle wird durch Verweis hier einbezogen.
Ein bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus involviert die Verwendung des Plasmides pUB110 als Klonierungsvehikel. Wie in anderen Wirts-Vektor-Systemen, ist es in Bacillus möglich, die erfindungsgemäßen Metalloproteinase-Inhibitor als intrazelluläres oder ausgeschiedenes Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsformen umfassen beide Systeme. Schaukelvektoren, die sowohl in Bacillus als auch in E. coli replizieren, sind für die Konstruktion und das Testen verschiedener Gene verfügbar, wie von Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., und Shivakumar, A.G. in Genetic Engineering, Band 2, Setlow und Hollander eds., Plenum Press, New York, New York, Seiten 115-131, (1980), beschrieben; die Literaturstelle wird durch Verweis hier einbezogen. Für die Expression und Sekretion von Metalloproteinase-Inhibitoren aus B. subtilis wird bevorzugt die Signalsequenz von α-Amylase an den kodierenden Bereich des Metalloproteinase-Inhibitors gekoppelt. Für die Synthese des intrazellulären Metalloproteinase-Inhibitors wird die tragbare DNA-Sequenz translational an die Ribosomenbindungsstelle der α-Amylase-Leitsequenz gekoppelt.
Die Transkription jedes dieser Konstrukte wird bevorzugt von einem α-Amylase-Promotor oder einem seiner Derivate gesteuert. Dieses Derivat enthält die RNA-Polymerase-Erkennungssequenz des nativen α-Amylase-Promotors, enthält aber den Lac-Operatorbereich ebenfalls eingebaut. Von ähnlichen Hybridpromotoren, die aus dem Penicillinasegen-Promotor und dem Lac-Operator konstruiert worden sind, ist gezeigt worden, daß sie in Bacillus-Wirten auf regulierbare Weise funktionieren, wie von Yansura, D.G. und Henner in Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan, A.T. und Hoch, J.A., eds., Academic Press, Seiten 249-263, (1984) ausgeführt; die Literaturstelle wird durch Verweis einbezogen. Das lacI-Gen von lacIq würde zum Bewirken der Regulation ebenfalls einbezogen werden.
Eine bevorzugte Konstruktion für die Expression in Clostridium ist die Konstruktion im Plasmid pJU12, beschrieben von Squires, C.H. et al., in J. Bacteriol. 159:465-471 (1984), durch Verweis hier einbezogen, transformiert in C. perfringens nach dem Verfahren von Heefner, D.L. et al., wie beschrieben in J. Bacteriol. 159:460-464 (1984); die Literaturstelle wird durch Verweis einbezogen. Die Transkription wird durch den Promotor des Tetracyclinresistenzgenes gesteuert. Die Translation ist an die Shine-Dalgarno-Sequenz des gleichen tetr-Genes auf eine Weise gekoppelt, die den oben ausgeführten Verfahren für die zur Verwendung in anderen Wirten geeigneten Vektoren strikt analog ist.
Das Beibehalten von fremder DNA, die in Hefe eingeführt worden ist, kann auf verschiedene Arten bewirkt werden (Botstein, D., und tavis, R.W., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones und Broach, eds., Seiten 607-636 (1982)). Ein bevorzugtes Expressionssystem für die Verwendung mit Wirtsorganismen der Gattung Saccharomyces beherbergt das Antikollagenasegen auf dem 2-Mikron-Plasmid. Die Vorteile des 2-Mikron-Kreises umfassen eine relativ hohe Kopienzahl und die Stabilität, wenn er in cirº-Stämme eingeführt wird. Die Vektoren enthalten bevorzugt den Replikationsursprung und mindestens einen Antibiotika-Resistenzmarker aus pBR322 eingebaut, um Replikation und Selektion in E. coli zu erlauben. Zusätzlich hat das Plasmid bevorzugt 2-Mikron-Sequenzen und das Hefe-LEU2-Gen, um den gleichen Zweck in LEU2-Mutanten von Hefe zu erfüllen.
Der regulierbare Promotor aus dem Hefe-GAL1-Gen wird bevorzugt angepaßt, um die Transkription des tragbaren DNA-Sequenz-Genes zu steuern. Die Translation der tragbaren DNA- Sequenz in Hefe wird an die Leitsequenz gekoppelt, die die Sekretion des Hefe α-Faktors steuert. Dies wird die Bildung eines Fusionsproteines verursachen, das in Hefe prozessiert wird, und zur Sekretion eines Metalloproteinase-Inhibitors führen. Alternativ wird ein Methionyl-Metalloproteinase-Inhibitor innerhalb der Zelle translatiert und dort behalten.
Es wird erwartet, daß die Translation von mRNA, die für den Metalloproteinase-Inhibitor kodiert, in Hefe bei Berücksichtigung der bevorzugten Kodonverwendung von Hefe effizienter sein wird, als mit der in pUC8-Fic vorhandenen Sequenz, gezeigt in Beispiel 2, die auf prokaryontische Anforderungen zugeschnitten ist. Aus diesem Grund wird der Teil des 5'-Endes der tragbaren DNA-Sequenz, der an der Tth111I-Stelle beginnt, bevorzugt erneut synthetisiert. Die neue Sequenz begünstigt die am häufigsten in Hefe verwendeten Kodons. Diese neue Sequenz hat bevorzugt die folgende Nukleotidsequenz:
Wie aus einer Untersuchung der individuellen Klonierungsvektoren und Systeme, die in der oben genannten Liste und in der Beschreibung enthalten sind, gesehen wird, können verschiedene funktionelle Elemente in jedem der erfindungsgemäß bevorzugten Vektoren vorhanden sein. Es wird davon ausgegangen, daß jedes zusätzliche funktionelle Element, das erforderlich sein mag, diesen Vektoren zugefügt werden kann, wobei Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, insbesondere im Licht der hier gegebenen Lehre.
In der Praxis ist es möglich, jeden dieser Vektoren auf eine Weise zu konstruieren, die es erlaubt, ihn leicht zu isolieren, zusammenzusetzen und zu verändern. Dies erleichtert das Zusammensetzen unzähliger funktioneller Gene aus Kombinationen dieser Elemente und der kodierenden Region des Metalloproteinase-Inhibitors. Weiter können viele dieser Elemente in mehr als einem Wirt anwendbar sein.
Mindestens ein von dem ins Auge gefaßten Wirtsorganismus erkannter Replikationsursprung mit mindestens einem selektierbaren Marker und mindestens einer Promotorsequenz, die zur Initiation der Transkription der tragbaren DNA-Sequenz fähig ist, werden als in diesen Vektoren enthalten vorgesehen. Es ist außerdem beabsichtigt, daß die Vektoren in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen DNA-Sequenzen enthalten werden, die als Regulatoren ("operators") funktionieren, und andere DNA-Sequenzen, die für die Regulatorproteine kodieren können. In bevorzugten Vektoren dieser Reihe enthalten die Vektoren zusätzlich Ribosomenbindungsstellen, Transkriptionsterminatoren und Leitsequenzen.
Diese Regulatoren werden in einer Ausführungsform dazu dienen, die Expression der tragbaren DNA-Sequenz in Gegenwart von bestimmten Bedingungen in der Umgebung zu verhindern und in Gegenwart von anderen Bedingungen in der Umgebung Transkription und anschließend Expression des von der tragbaren DNA-Sequenz kodierten Proteins zu erlauben. Es ist insbesondere bevorzugt, daß regulatorische Elemente in den Vektor insertiert werden, so daß die Expression der tragbaren DNA-Sequenz nicht z. B. in Abwesenheit von Isopropylthio-β- D-Galactosid geschieht. In dieser Situation kann der die tragbare DNA enthaltende transformierte Mikroorganismus bis zu einer gewünschten Dichte wachsengelassen werden, bevor die Expression des Metalloproteinase-Inhibitors initiiert wird. In dieser Ausführungsform wird die Expression des gewünschten Proteaseinhibitors durch Zufügen einer Substanz zu der mikrobiellen Umgebung induziert, die die Expression der DNA-Sequenz nach Erreichen der gewünschten Dichte veranlassen kann.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß eine geeignete Sekretionsleitsequenz entweder in dem Vektor oder am 5'-Ende der tragbaren DNA-Sequenz vorhanden ist, wobei die Leitsequenz in einer Position ist, die ihr erlaubt, unmittelbar dem Anfangsteil der Nukleotidsequenz benachbart zu sein, die zur Steuerung der Expression des Protease-Inhibitors fähig ist, ohne irgendwelche dazwischenliegenden Transkriptions- oder Translationsterminations-Signale. Die Gegenwart der Leitsequenz ist zum Teil aus einem oder mehreren der folgenden Gründe erwünscht: 1) die Gegenwart der Leitsequenz kann die Weiterverarbeitung des Anfangsproduktes zum reifen rekombinanten Metalloproteinase-Inhibitor durch den Wirt erleichtern; 2) die Gegenwart der Leitsequenz kann die Reinigung des rekombinanten Metalloproteinase-Inhibitors erleichtern, indem der Metalloproteinase-Inhibitor aus dem Zellzytoplasma geleitet wird; 3) die Gegenwart der Leitsequenz kann die Fähigkeit des rekombinanten Metalloproteinase-Inhibitors beeinflussen, sich zu seiner aktiven Struktur zu falten, indem der Metalloproteinase-Inhibitor aus dem Zellzytoplasma geleitet wird.
Die Leitsequenz kann insbesondere die Spaltung des anfänglichen Translationsproduktes durch eine Leitpeptidase steuern, so daß die Leitsequenz entfernt wird und ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die das Potential einer Metalloproteinase-Inhibitor-Aktivität hat, zurückbleibt. In einigen Arten von Wirtsmikroorganismen wird die Gegenwart einer geeigneten Leitsequenz den Transport des vervollständigten Proteines in den periplasmatischen Raum erlauben, so wie es für E. coli der Fall ist. Im Fall von bestimmten Hefen und Stämmen von Bacillus und Pseudomonas wird eine geeignete Leitsequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran und in das extrazelluläre Medium erlauben. In dieser Situation kann das Protein aus dem extrazellulären Protein gereinigt werden.
Drittens kann im Fall einiger der erfindungsgemäß hergestellten Metalloproteinase-Inhibitoren die Gegenwart der Leitsequenz erforderlich sein, um das vollständige Protein in eine Umgebung zu bringen, in der es sich falten kann, um seine aktive Struktur anzunehmen, wobei diese Struktur die entsprechende Metalloproteinase-Aktivität besitzt.
Weitere funktionelle Elemente umfassen Ribosomenbindungsstellen und andere DNA-Sequenzen, die für die mikrobielle Expression von fremden Proteinen notwendig sind; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die hier diskutierten funktionellen Elemente können vom Fachmann im Licht von Vorveröffentlichungen und der hier enthaltenen Lehren routinemäßig ausgewählt werden. Allgemeine Beispiele solcher funktionellen Elemente sind in B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983) erläutert; diese Publikation wird hier ausdrücklich durch Verweis einbezogen. Verschiedene Beispiele geeigneter funktioneller Elemente können in den oben diskutierten Vektoren gefunden werden und können durch eine Übersicht über Publikationen, die die grundlegenden Eigenschaften der zuvor genannten Vektoren erörtern, erklärt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine zusätzliche DNA-Sequenz unmittelbar vor der tragbaren DNA-Sequenz, die für den Metalloproteinase-Inhibitor kodiert, angeordnet. Die zusätzliche DNA-Sequenz kann als Translationskoppler wirken, d. h., es ist eine DNA-Sequenz, die für eine RNA kodiert, die dazu dient, Ribosomen unmittelbar benachbart zur Ribosombindungsstelle der Metalloproteinase-Inhibitor-RNA, mit der sie fortlaufend ist, anzuordnen.
Nach Synthese und/oder Isolierung aller notwendigen und gewünschten Bestandteile der oben diskutierten Klonierungsvektoren werden die Vektoren durch dem Fachmann bekannte Verfahren zusammengesetzt. Das Zusammensetzen solcher Vektoren wird als im Bereich der Aufgaben und Pflichten des Durchschnittsfachmanns liegend angesehen und kann als solches ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand durchgeführt werden. Es sind z. B. ähnliche DNA-Sequenzen in geeignete Klonierungsvektoren ligiert worden, wie von Schoner et al., Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 81: 5403-5407 (1984) erläutert; diese Publikation wird hier ausdrücklich durch Verweis einbezogen.
Bei der Konstruktion der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren sollte zusätzlich bemerkt werden, daß in jeden Vektor multiple Kopien der tragbaren DNA-Sequenz und ihre dazugehörigen funktionellen Elemente eingebaut werden können. In einer solchen Ausführungsform würde der Wirtsorganismus größere Mengen des gewünschten Metalloproteinase-Inhibitors pro Vektor erzeugen. Die Anzahl multipler Kopien der DNA-Sequenz, die in den Vektor insertiert werden kann, wird nur durch die Fähigkeit des resultierenden Vektors eingeschränkt, aufgrund seiner Größe in einen geeigneten Wirtsorganismus tranferiert zu werden, repliziert und transkribiert zu werden.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß die Klonierungsvektoren eines selektierbaren Marker enthalten, beispielsweise einen Wirkstoffresistenzmarker oder einen anderen Marker, der die Expression eines selektierbaren Merkmals durch den Wirtsorganismus verursacht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Gen für Ampicillinresistenz in den Vektor pUC9-F5/237P10 einbezogen.
Ein solcher Wirkstoffresistenz- oder anderer selektierbarer Marker soll zum Teil die Selektion der Transformanten erleichtern. Weiterhin kann die Gegenwart eines solchen selektierbaren Markers auf dem Klonierungsvektor von Nutzen sein, um kontaminierende Mikroorganismen von der Vermehrung in dem Kulturmedium abzuhalten. In dieser Ausführungsform würde eine reine Kultur des transformierten Wirtsorganismus durch Kultivieren der Mikroorganismen und Bedingungen, die den induzierten Phänotyp zum Überleben brauchen, erhalten werden.
Es wird festgestellt, daß in einer bevorzugten Ausführungsform es außerdem wünschenswert ist, das 3'-Ende des kodierenden Bereiches zu rekonstruieren, um ein Zusammensetzen mit 3'-nicht-translatierten Sequenzen zu erlauben. Eingeschlossen in diese nicht translatierten Sequenzen sind solche, die die mRNA stabilisieren oder ihre Transkription steigern, und solche, die starke Transkriptionsterminationssignale bereitstellen, die den Vektor stabilisieren, wie sie z. B. von Gentz, R., Langner, A., Chang, A.C.Y., Cohen, S.H., und Bujard, H. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:4936-4940 (1981) identifiziert worden sind; diese Publikation wird ausdrücklich durch Verweis einbezogen.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein rekombinantes DNA-Verfahren für die Erzeugung von Metalloproteinase-Inhibitoren. Das Verfahren umfaßt allgemein:
a) das Herstellen einer tragbaren DNA-Sequenz, die fähig ist, einen Wirtsmikroorganismus zu steuern, so daß er eine Proteinsequenz mit Metalloproteinase-Inhibitoraktivität erzeugt;
b) das Klonieren der tragbaren DNA-Sequenz in einem Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen werden und darin replizieren kann, wobei der Vektor Steuerungselemente für die tragbare DNA-Sequenz enthält;
c) das Übertragen des die tragbare DNA-Sequenz und die Steuerungselemente enthaltenden Vektors in einen Wirtsmikroorganismus, der zum Exprimieren des Metalloproteinase-Inhibitorproteins fähig ist;
d) das Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die für die Amplifikation des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind; und
e) in beliebiger Reihenfolge:
(i) das Ernten des Inhibitors; und
(ii) das den Inhibitor Veranlassen, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wodurch er Metalloproteinase-Inhibitoraktivität besitzt.
Bei diesem Verfahren sind die tragbaren DNA-Sequenzen solche synthetischen oder natürlich auftretenden Polynukleotide, wie sie oben beschrieben sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens hat die tragbare DNA-Sequenz die folgende Nukleotidsequenz:
Die für das erfindungsgemäße Verfahren als nützlich angesehenen Vektoren sind die oben beschriebenen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Klonierungsvektor pUC9-F5/ 237P10 im offenbarten Verfahren verwendet.
Der so erhaltene Vektor wird dann in einen geeigneten Wirtsorganismus tranferiert. Es wird angenommen, daß jeder Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, exogene DNA aufzunehmen und diese Gene und die dazugehörigen funktionellen Elemente zu exprimieren, ausgewählt werden kann. Es ist bevorzugt, daß der Wirtsmikroorganismus ein anaerober, fakultativer anaerober oder aerober ist. Besondere Wirte, die für die Verwendung in diesem Verfahren bevorzugt sein mögen, umfassen Hefen und Bakterien. Besondere Hefen umfassen solche der Gattung Saccharomyces und insbesondere Saccharomyces cerevisiae.
Besondere Bakterien umfassen solche der Gattungen Bacillus und Escherichia und Pseudomonas. Verschiedene andere bevorzugte Wirte sind in Tabelle I, oben, erläutert. In anderen, alternativ bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa als Wirtsmikroorganismen ausgewählt.
Nach der Auswahl eines Wirtsorganismus wird der Vektor in den Wirtsorganismus unter Verwendung dem Fachmann allgemein bekannter Verfahren transferiert. Beispiele solcher Verfahren können in Advanced Bacterial Genetics von R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980) gefunden werden; diese Publikation wird hier ausdrücklich durch Verweis einbezogen. In einer Ausführungsform ist es bevorzugt, daß die Transformation bei niedrigen Temperaturen stattfindet, da die Temperaturregulation als ein Mittel zur Regulation der Genexpression durch die Verwendung von funktionellen Elementen, wie sie oben diskutiert sind, angesehen wird. In einer anderen Ausführungsform, wenn osmolare Regulatoren in den Vektor insertiert worden sind, wäre eine Regulation der Salzkonzentrationen während der Transformation erforderlich, um eine geeignete Kontrolle der synthetischen Gene sicherzustellen.
Wenn es ins Auge gefaßt wird, die rekombinanten Metalloproteinase-Inhibitoren letztendlich in Hefe zu exprimieren, ist es bevorzugt, daß der Klonierungsvektor zunächst in Escherichia coli transferiert wird, wo der Vektor replizieren könnte und woraus der Vektor nach Amplifikation erhalten und gereinigt werden könnte. Der Vektor würde dann schließlich für die Expression des Metalloproteinase-Inhibitors in Hefe transferiert werden.
Die Wirtsmikroorganismen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression des Metalloproteinase-Inhibitors geeignet sind. Diese Bedingungen sind im allgemeinen für den Wirtsorganismus spezifisch und werden vom Fachmann anhand der publizierten Literatur im Betreff auf die Wachstumsbedingungen für einen solchen Organismus leicht bestimmt, z. B. anhand von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, das durch Verweis hier ausdrücklich mit einbezogen wird.
Während der Transformations- und Kultivierungsstadien wären alle Bedingungen, die für die Regulation der Expression der DNA-Sequenz erforderlich sind, abhängig von jedweden funktionellen Elementen, die in den Vektor eingefügt oder dort vorhanden sind, wirksam. In einer Ausführungsform werden die Zellen in Gegenwart geeigneter regulatorischer Bedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz inhibieren, zu hoher Dichte wachsen gelassen. Wenn eine optimale Zelldichte erreicht ist, werden die Bedingungen der Umgebung in jene überführt, die für die Expression der tragbaren DNA-Sequenz geeignet sind. Es ist daher vorgesehen, daß die Erzeugung des Metalloproteinase-Inhibitors in einer Zeitspanne geschieht, die im Anschluß an das Wachstum der Wirtszellen bis nahe zur optimalen Dichte liegt, und daß der resultierende Metalloproteinase-Inhibitor einige Zeit nach der Induktion der regulatorischen Bedingungen, die für seine Expression notwendig sind, geerntet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekombinante Metalloproteinase-Inhibitor im Anschluß an das Ernten und bevor er seine aktive Struktur annimmt gereinigt. Diese Ausführungsform ist bevorzugt, da die Erfinder glauben, daß die Gewinnung einer hohen Ausbeute wieder gefalteten Proteins erleichtert ist, wenn das Protein zunächst gereinigt wird. In einer bevorzugten, alternativen Ausführungsform kann dem Metalloproteinase-Inhibitor jedoch gestattet werden, sich vor der Reinigung wieder zu seiner aktiven Struktur zu falten. In einer weiteren bevorzugten, alternativen Ausführungsform wird der Metalloproteinase-Inhibitor veranlaßt, seinen gefalteten, aktiven Zustand nach der Gewinnung aus dem Kulturmedium anzunehmen.
Unter bestimmten Umständen wird der Metalloproteinase-Inhibitor seine korrekte aktive Struktur nach Expression in dem Wirtsorganismus und Transport des Proteines durch den Zellwall oder die Zellmembran oder in den periplasmatischen Raum annehmen. Dies wird im allgemeinen auftreten, wenn eine DNA, die für eine geeignete Leitsequenz kodiert, mit der für das rekombinante Protein kodierenden DNA verbunden worden ist. Die erfindungsgemäß bevorzugten Metalloproteinase-Inhibitoren werden ihre reife aktive Form nach Translokation aus der inneren Zellmembran heraus annehmen. Die Strukturen unzähliger Signalpeptide sind publiziert worden, beispielsweise von Marion E.E. Watson in Nuc. Acid. Res., 12:515-5164, 1984; diese Literaturstelle wird ausdrücklich durch Verweis hier mit einbezogen. Es ist beabsichtigt, daß diese Leitsequenzen zusammen mit tragbarer DNA die intrazelluläre Produktion eines Fusionsproteinssteuern werden, das durch die Zellmembran transportiert werden wird und dessen Leitsequenzanteil nach Freisetzung aus der Zelle abgespalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Signalpeptid des E. coli OmpA-Proteins als Leitsequenz verwendet und in einer Position angeordnet, die der tragbaren DNA-Sequenz, die für die Metalloproteinase-Inhibitor-Struktur kodiert, benachbart ist.
Weitere bevorzugte Leitsequenzen umfassen jene der β-Lactamase, Carboxapeptidase G2 und des Human-Signalproteines. Diese und andere Leitsequenzen sind beschrieben.
Wenn der Metalloproteinase-Inhibitor seine korrekte, aktive Struktur nicht annimmt, werden jedwede gebildeten Disulfidbindungen und/oder jedwede nicht kovalenten Wechselwirkungen, die aufgetreten sind, zunächst durch denaturierende und reduzierende Mittel aufgebrochen, beispielsweise Guadiniumchlorid und β-Mercaptoethanol, bevor der Metalloproteinase- Inhibitor seine aktive Struktur nach Verdünnen und Oxidation dieser Mittel unter kontrollierten Bedingungen annehmen kann.
Die hier in Betracht gezogenen Transkriptionsterminatoren dienen zur Stabilisierung des Vektors. Insbesondere werden die von Gentz et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 4936-4940 (1981) beschriebenen Sequenzen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen; diese Literaturstelle wird durch Verweis mit einbezogen.
Es soll verstanden werden, daß die Anwendung der erfindungsgemäßen Lehren auf ein spezielles Problem oder eine spezielle Umgebung im Licht der hier enthaltenen Lehren im Bereich der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns liegen. Beispiele der erfindungsgemäßen Produkte und repräsentative Verfahren für ihre Isolierung und Herstellung sind in den folgenden Beispielen beschrieben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Herstellen von Poly(A&spplus;)-RNA aus HEF-SA-Fibroblasten

HEF-SA-Zellen wurden bis nahe zur Konfluenz in 75 cm² T-Flaschen wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann zweimal in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und durch Zufügen von 2 ml 10 mM Tris, pH 7,5, enthaltend 1% w/v SDS (erhalten von BDH Chemicals, Ltd., Poole, England), 5 mM EDTA und 20 ug/ml Protease K (erhalten von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) geerntet. Jede Flasche wurde anschließend mit einem zusätzlichen Milliliter der gleichen Lösung gewaschen.
Die gesammelten Aliquots der Zellernte wurden auf 70 ug/ml Proteinase K ergänzt und 45 min bei 40ºC inkubiert. Die proteolysierte Lösung wurde auf eine NaCl-Konzentration von 150 mM durch Zufügen einer 5 M Stammlösung gebracht und anschließend mit dem gleichen Volumen Phenol:Chloroform 1:1 extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit dem gleichen Volumen Chloroform erneut extrahiert. Der wäßrigen Phase wurden 2 Volumina Ethanol zugefügt und über Nacht bei -20ºC inkubiert. Die präzipitierten Nukleinsäuren wurden durch 10 min Zentrifugation bei 17500 xg in einer Beckman J2-21 Zentrifuge, Beckman Instruments, Palo Alto, California, gewonnen und wurden in 25 ml 0,1% w/v SDS erneut gelöst. Diese Lösung wurde wieder mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wurde 2 Volumina kaltes Ethanol zugefügt und 2 Std. bei -20ºC gehalten. Das Präzipitat wurde durch 15 min Zentrifugation bei 10000 xg gesammelt und in 10 ml 1 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,5 gelöst. Die RNA wurde aus dieser Lösung durch Zufügen von 10 ml 4 M LiCl, 20 mM NaoAc, pH 5,0 präzipitiert und 18 Std. bei -20ºC inkubiert. Das Präzipitat wurde wieder durch Zentrifugation gewonnen und zweimal mit 2 M LiCl gewaschen, bevor es in 1 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,5, gelöst wurde. Diese Lösung wurde bei -70ºC aufbewahrt.

Chromatographie auf Oligo dT-Zellulose

Die wie oben hergestellte gesamte zelluläre RNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 0,5 M NaCl gelöst. 5 ml der RNA mit 0,45 mg/ml wurden auf eine 1 ml-Säule Oligo-dT-Zellulose (gewaschener Typ VII) aufgetragen (erhalten von PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin). Die Säule wurde dann mit 10 ml 0,5 M NaCl gewaschen und mit 2,0 ml sterilem Wasser eluiert. Die eluierte Poly(A&spplus;)-Fraktion der RNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0 gelöst, um-eine Lösung von 1 mg/ml zu ergeben. Diese wurde bei -70ºC gelagert.

cDNA-Synthese

Die Poly(A&spplus;)-RNA wurde mit Oligo-dT (erhalten von PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin), das als Matrize für die cDNA-Synthese durch AMV-Reverse-Transkriptase (erhalten von Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida) diente, gestartet (engl.: primed). Nach der Synthesereaktion wurde die RNA durch Zufügen von 0,1 Volumen 3 N NaOH hydrolysiert und 10 min bei 67ºC inkubiert. Die Lösung wurde dann neutralisiert und die cDNA durch Gelfiltrationschromatographie auf Biogel A 1,5 (erhalten von BioRad Laboratories, Richmond, California) in einer 0,7·25 cm-Säule in einer Lösung von 10 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,5, gereinigt. Die die cDNA enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und durch Ethanolpräzipitation konzentriert. Die cDNA wurde mit dG verlängert und mittels Gelfiltration unter Verwendung des oben angegebenen Verfahrens gereinigt. Die Synthese des zweiten Stranges wurde mit Oligo-dC gestartet und die Polymerisation in einer anfänglichen Reaktion mit dem großen (Klenow-)Fragment der DNA-Polymerase (erhalten von Boehringer Mannheim) durchgeführt. Nach der Synthese des zweiten Stranges wurde E. coli-DNA-Polymerase I (erhalten von Boehringer Mannheim) zugefügt und die Inkubation fortgesetzt, um stumpfe Enden zu bilden. Die doppelsträngige cDNA wurde erneut durch Chromatographie gereinigt. EcoRI-Restriktionsstellen innerhalb der cDNA wurden durch Wirkung von EcoRI- Methylase, erhalten von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, modifiziert. Die cDNA wurde erneut gereinigt und mit synthetischen EcoRI-Linkern verknüpft. Die Enden wurden schließlich mit der Endonuklease zurechtgeschnitten und die cDNA durch Gelfiltration gereinigt. Diese DNA wurde in eine einzelne EcoRI-Stelle in λgt10-DNA ligiert, in vitro verpackt und zur Infektion von E. coli-Stamm hflA nach dem Verfahren von Huynh, T.V., Young, R.A., und Davis, R.W., DNA Cloning Techniques, A Practical Approach (Hrsg. Glover, D.M.) (IRL Press Oxford), im Druck, verwendet; diese Literaturstelle wird durch Verweis ausdrücklich einbezogen. Ungefähr 25000 Rekombinanten wurden auf diese Weise amplifiziert.

Durchmusterung

Rekombinante Phagen enthaltende Sequenzen von Interesse wurden durch ihre präferentielle Hybridisierung mit synthetischen Oligonukleotiden, die Teile der Primärstruktur des gewünschten Metalloproteinase-Inhibitors enthielten, die im Folgenden als FIBAC bezeichnet wird, ausgewählt. Diese Teile der Proteinsequenz entsprechen zum Teil den in der Literatur von Stricklin, G.P. und Welgus, H.G., J. Biol. Chem., 258: 12252-12258 (1983) publizierten, die hier ausdrücklich durch Verweis einbezogen wird. Die rekombinanten Phagen wurden zur Infektion von E. coli-Stamm hflA verwendet und in einer Dichte von ungefähr 2·10³ pfu (Plaque bildenden Einheiten)/150 mm Petrischale plattiert. Die Phagen wurden auf Nitrozellulosefilter (BA85,Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire) geblottet (übertragen), und die DNA wurde im wesentlichen wie von Benton und Davis in Science, 196: 180-182 (1979) beschrieben, denaturiert und fixiert; diese Literaturstelle wird durch Verweis hier ausdrücklich einbezogen.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden die Filter nacheinander jeweils 10 bis 15 min in 0,5 M NaCl, dann 1,0 M Tris, 1,5 M NaCl pH 8,0 behandelt und schließlich in 2· SSPE getaucht (2· SSPE ist 0,36 M NaCl, 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 2 mM EDTA pH 7,4). Die Filter wurden trocken getupft und 3 bis 4 Std. bei 75 bis 80ºC gebacken. Von jeder Platte wurden Duplikatfilter hergestellt. Die Filter wurden 1 bis 3 Std. bei 37ºC in 5·SSPE, enthaltend 0,1·SET, 0,15% NaPPi und 1· Denhardt's Lösung, vorhybridisiert. Die Filter wurden dann 72 Std. bei 37ºC in der gleichen Lösung, enthaltend 5·10 cpm/ml 5'-endmarkiertes 51-mer Oligonukleotid mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 10&sup6;cpm/pmol hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter sechsmal in 5· SSPE, enthaltend 0,1·SET und 0,05% Natriumpyrophosphat bei 37ºC gewaschen, dann dreimal in 2·SSPE bei 21ºC. Sie wurden dann getrocknet und mit Kodak XAR-5 Filmen bei -70ºC mit einer Kodak-Verstärkerfolie (lightening-plus intensifying screen) autoradiographiert. Die auf den Duplikatfiltern gut sichtbaren Signale wurden verwendet, um Phagen für die Plaquereinigung zu picken. Die Filterherstellung und Hybridisierungsverfahren für die Plaquereinigungsschritte waren die gleichen wie oben. Das Waschverfahren wurde auf sechs Wechsel von 2·SSPE bei 37ºC vereinfacht. Sechs durch wiederholtes Plattieren gereinigte Isolate wurden dann auf einen einzelnen Rasen von E. coli-Stamm C600 angeordnet, um mit nachfolgenden Proben zu testen.
Eine präferentielle Hybridisierung des 17-mer an jedes der Isolate (im Gegensatz zu Kontrollplaques) wurde unter Bedingungen beobachtet, die den für die Plaquereinigung verwendeten identisch waren. Die Sonde C wurde in einem ähnlichen Test verwendet, mit der Ausnahme, daß die SSPE-Konzentration während der Hybridisierung auf 4· reduziert war. Wieder zeigte jedes der Isolate eine stärkere Hybridisierung zu der Sonde, als die Kontrollplaques.

Phasenreinigung und cDNA-Charakterisierung

Von jedem der sechs isolierten Phagen wurden Mengen mittels des Stammplattenverfahrens hergestellt und durch aufeinanderfolgende Cscl-Blockgradientenzentrifugationen gereinigt. Aus diesen wurde die DNA durch Dialyse gegen 50% Formamid gereinigt, wie von Davis, R.W., Botstein, D., Roth, J.R., in A manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, 1980, Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben; diese Literaturstelle wird ausdrücklich durch Verweis einbezogen. Die DNA aus diesen Isolaten wurde mit EcoRI verdaut und die Produkte durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Vom Insert eines der größeren Klone, λ FIBAC 5, wurde festgestellt, daß ihm die internen Stellen für SalI, HindIII, BamHI und EcoRI fehlen. Das cDNA Insert wurde aus der λ FIBAC 5-DNA freigesetzt und die λ-Arme durch gleichzeitigen Verdau mit diesen vier Enzymen abgebaut. Die Fragmente wurden dann mit Ethanol präzipitiert und ohne weitere Reinigung in die EcoRI-Stelle von Plasmid pLJC9 ligiert. Diese Plasmide wurden dann zur Transformation von E. coli-Stamm JM83 verwendet. Die Transformanten wurden auf Ampicillin-haltigen Platten selektioniert. Plasmide aus mehreren Transformanten wurden gereinigt und auf der Basis der EcoRI-Abbauprodukte charakterisiert. Es wurde eines ausgewählt, das ein Insert hatte, das mit dem Insert von λ FIBAC 5 bei einer Agarosegelelektrophorese comigrierte. Dieses Plasmid ist pUC9-F5/ 237P10 genannt worden.

Kartieren und Subklonieren

Das Insert in pUC9-F5/237P10 wurde hinsichtlich der internen PstI-Stellen kartiert. Doppelverdaus mit EcoRI und Pst zeigten drei interne PstI-Erkennungsstellen. Das gesamte Insert- und die Bestandteile wurden in M13 Bakteriophagen mp19 bzw. mp18 subkloniert. Die Sequenzierung der Stücke wurde nach dem Didesoxyverfahren, beschrieben von Sanger et al., in Sanger, F., Nicklen, S., und Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977), durchgeführt; diese Literaturstelle wird hier durch Verweis ausdrücklich einbezogen.
Die Sequenz des DNA-Inserts aus pUC9-F5/237P10 zeigte ein offenes Leseraster, das für die Primärstruktur des reifen Fibroblasten-Kollagenase-Inhibitors kodiert, der dem aus menschlichen Hautfibroblasten isolierbaren biologisch äquivalent ist. Die hervorstechenden Merkmale der Sequenz sind:
1) das Insert wird von EcoRI-Restriktionsstellen und G/C- und A/T-Homopolymertrakten flankiert, was mit dem Klonierungsverfahren konsistent ist;
2) der kodierende Strang wird in 5' nach 3'-Weise gezeigt, mit Poly-C am 5'-Ende und Poly-A am 3'- Ende, wiederum im Einklang mit den verwendeten Verfahren;
3) wenn das erste G in der Sequenz GTTGTTG, das dem 3'-Ende des Poly-C-Traktes unmittelbar benachbart ist, als Nukleotid 1 angesehen wird, dann stellt sich ein offenes Leseraster dar, das für die Primärstruktur des reifen Humanfibroblasten-Kollagenase-Inhibitors kodiert, das bei Nukleotid 34 beginnt und sich bis Nukleotid 585 fortsetzt;
4) das Terminationskodon TGA bei Nukleotid 586 bis Nukleotid 588 definiert den Carboxyterminus des Translationsproduktes, der der gleiche ist, wie der des reifen Proteines;
5) die Nukleotide 1 bis 33 definieren eine Aminosäuresequenz, die in der Primärstruktur des prozessierten Proteines nicht gefunden wird, die aber wahrscheinlich einen Teil eines Leitpeptides, wie es für ausgeschiedene Proteine charakteristisch ist, darstellt;
6) die drei internen PstI-Stellen haben als ihre ersten Basen die Nukleotide 298, 327 und 448;
7) es gibt eine einzelne Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Tth111I, beginnend bei Nukleotid 78; und
8) es gibt eine einzelne Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease NcoI, beginnend bei Nukleotid 227.
Die Sequenz der Nukleotide 1 bis 703 und Restriktionsstellenanalyse werden gezeigt. Anzahl Stellen Fragmente Enden der Fragmente Anzahl Stellen Fragmente Enden der Fragmente Anzahl Stellen Fragmente Enden der Fragmente Anzahl Stellen Fragmente Enden der Fragmente Anzahl Stellen Fragmente Enden der Fragmente Die folgenden treten nicht auf:

BEISPIEL 2

Expression von Kollagenase-Inhibitor in E. coli

In diesem Beispiel wird ein bevorzugtes Verfahren zum Koppeln einer bevorzugten tragbaren DNA-Sequenz an das 5'-Ende klonierter cDNA ausgeführt. Dieses involviert das Herstellen einer nukleolytischen Spaltung an einem angegebenen Punkt innerhalb der kodierenden Sequenz und das Rekonstruieren des gewünschten Teiles der kodierenden Sequenz mittels synthetischer Oligonukleotide auf eine Weise, die das Ausschneiden und die Rekombination erlauben (d. h., durch Einfügen nützlicher Restriktionsstellen).
Das Zurechtschneiden der 5'-Enden des kodierenden Bereiches wird durch Synthetisieren beider Stränge der sich von der Tth111I-Stelle in 5'-Richtung erstreckenden DNA, die in einem BamHI-Überhang endet, erreicht. Dieses synthetische Oligonukleotid, bezeichnet als FIBAC A, hat die folgenden Merkmale:
1) Es ist eine Kodonauswahl vorgenommen worden, um die in den Genen hochexprimierter bakterieller Proteine am häufigsten gefundenen Kodons zu bevorzugen;
2) ein Methioninkodon, von dem aus die Translation beginnt, ist unmittelbar stromaufwärts von dem Cystein, mit dem der kodierende Bereich des prozessierten Human-FIBAC's beginnt, vorgesehen worden;
3) der Abstand der BamHI-Stelle zum Methioninkodon ist so, daß nach Klonieren in pUC8 der kodierende Bereich von FIBAC im Raster mit dem 5'-Ende des β-Galactosidase-Genes sein wird;
4) es werden ein Stopkodon im Raster und eine Shine Dalgarno-Sequenz vorgesehen. Die Translation dieses Rasters für den aminoterminalen Teil der β-Galactosidase wird am TAA-Kodon beendet, und die Translation von FIBAC sollte am folgenden ATG beginnen;
5) die Kodons sind so ausgewählt worden, daß eine HgiAI-Stelle, die mit dem G in dem FIBAC-Initiationskodon beginnt, geschaffen wird; und
6) es gibt eine durch eine Base von 3'-Ende der BamHI-Sequenz getrennte PvuI-Stelle.
Die Struktur von FIBAC A ist
FIBAC A wird unter Verwendung des ABI DNA-Synthesegerätes (Foster City, California) als eine Reihe von vier Nukleotidbestandteilen synthetisiert.
Der Bestandteil Oligonukleotid FA1 ist:
Der Bestandteil Oligonukleotid FA2 ist:
Der Bestandteil Oligonukleotid FA3 ist:
Der Bestandteil Oligonukleotid FA4 ist:
Der Rest des kodierenden Teiles des FIBAC-Genes wird als das 3'-Tth111I- bis EcoRI-Fragment isoliert, das durch Doppelverdau von pUC9-F5/237P10 mit diesen Enzymen erzeugt wird.
Es wird ein synthetischer Linker hergestellt, um das 3'-Ende des Tth111I- bis EcoRI-Fragmentes an eine SalI-Stelle zu koppeln. Diese Oligonukleotide werden so entworfen, daß sie die SalI-Stelle zurückbilden und die EcoRI-Stelle zerstören. Der Linker besteht aus den Oligonukleotidlinkern A1 und A2.
Linker A1 ist: AATTGGCAG
Linker A2 ist: TCGACTGCC
Diese Oligonukleotide und die Oligonukleotide FA1-FA4 werden getrennt einer Kinasereaktion entworfen und im gleichen molaren Verhältnis mit dem Tth111I- bis EcoRI- 3'-Ende der cDNA und BamHI/SalI-geschnittenem mp19RF-DNA hybridisiert. Die ligierte DNA wird zur Transfektion von JM105 verwendet. Die Plaques werden anhand ihrer Farbe in Gegenwart von IPTG und X-gal und durch Hybridisierung mit Oligonukleotid FA2 gepickt. Mehrere positive Plaques werden sequenziert. Diejenigen, die die beabsichtigten Sequenzen enthalten, werden in BamHI/SalI verdauten pUC8 subkloniert. Die Translation des FIBAC-Genes in diesem Konstrukt ist an die für β-Galactosidase initiierte Translation gekoppelt. Dieser Expressionsvektor wird als pUC8-Fic bezeichnet.
Die Kopplung der Translation von FIBAC an die für andere hochexprimierte Proteine initiierte Translation wird ähnlich arrangiert. Beispielsweise wird ein Teil des OmpA-Genes, das die Shine Dalgarno- und Initiatormethioninsequenzen enthielt, synthetisiert. Diese Sequenz kodiert für das gesamte Signalpeptid des OmpA-Proteines und hat passende Restriktionsstellen, einschließlich solcher für EcoRI, EcoRV, PvuI und StuI.
Die Sequenz des Sinnstranges ist:
Diese Sequenz wird im folgenden als OmpA-Leitsequenz bezeichnet. Das Koppeln der Translation von FIBAC an OmpA wird durch Schneiden von pUC8-Fic mit PvuI und SalI und Isolieren des kodierenden Bereiches bewirkt. Dieses wird zusammen mit dem aus der OmpA-Leitsequenz isolierten EcoRI- bis PvuI-Fragment in EcoRI/SalI-geschnittenen pUC8 kloniert. Wie im vorhergehenden Beispiel wird die Transkription durch den lac-Promotor getrieben und durch das lacI-Genprodukt am lac-Operator reguliert. Dieser FIBAC-Expressionsvektor wird als pUC8-F/OmpAic bezeichnet.
Um die Translokation von FIBAC über die innere Zellmembran zu bewirken, wird eine entsprechende Leitsequenz an den Aminoterminus von FIBAC angefügt. Das so erzeugte Protein wird transloziert und prozessiert, um die reife Form zu ergeben.
Um eine solche Translokation zu bewirken, wird ein FIBAC-Gen, das für das Signalpeptid des E. coli OmpA-Proteines benachbart zum Strukturbereich von FIBAC kodiert, erzeugt. Dieses besondere FIBAC-Gen erfordert im Raster Stopkodons am 5'-Ende des veränderten, für FIBAC kodierenden Bereiches. Um das zu erreichen, wird der Teil des 5'-kodierenden Bereiches aus pUC8-Fic, der sich von der HgiAI-Stelle zur NcoI-Stelle erstreckt, isoliert. Die stromaufwärts gelegenen Sequenzen werden als Linker mit cohäsiven Enden für BamHI und HgiAI und mit einer internen StuI-Stelle erneut synthetisiert. Der Linker wird als zwei Oligonukleotide, Linker B1 und Linker B2, synthetisiert.
Linker B1 ist: GATCCCAGGCCTGCA
Linker B2 ist: GGCCTGG
Die Linker B1 und B2 werden getrennt einer Kinasereaktion unterworfen und in gleichen molaren Verhältnissen mit dem oben beschriebenen HgiAI- bis NcoI-Fragment und BamHI/NcoI-geschnittenem pUC8-Fic hybridisiert. Das resultierende Konstrukt hat die kodierenden Sequenzen von FIBAC im Raster mit der Translation des Aminoterminus von β-Galactosidase. Die Translation dieser Sequenz bildet ein Fusionsprotein mit FIBAC. Dieses Plasmid wird als pUC8-Ff bezeichnet.
Das Anhängen der OmpA-Leitsequenzen an den kodierenden Bereich von FIBAC wird durch Ligieren von EcoRI/StuI-geschnittenen pUC8-Ff mit einem Überschuß gereinigtem EcoRI- bis StuI-Fragmentes der OmpA-Leitsequenz erreicht. Nach der Transformation werden Plasmide verschiedener Kolonien durch Hybridisieren charakterisiert. Jene die das OmpA-Leitfragment eingebaut haben, werden weiter charakterisiert, um die Struktur zu verifizieren. Dieses Plasmid, pUC8-F OmpA1, wird die Synthese eines Fusionsproteines, das in dem Signalpeptid des E. coli OmpA-Proteines beginnt und in Human-FIBAC endet, steuern. Die im OmpA-Teil des Proteines vorhandenen Signale bewirken den Export des Proteines aus dem Zytoplasma und die entsprechende Spaltung der Primärstruktur von FIBAC.
Wenn die Effizienz der Expression durch die Sequenz des Leitpeptides oder seine Kombination mit FIBAC entweder auf Protein- oder Nukleinsäureebenen gefährdet wäre, könnte das Gen so verändert werden, daß für irgendeine der verschiedenen bekannten E. coli-Leitsequenzen kodiert.
Die Transkription all der diskutierten Gene wird durch den lac-Promotor bewirkt. Wie im Fall der Initiationsstellen für die Translation können der Promotor- und Operatorbereich des Genes ausgetauscht werden. FIBAC kann auch von Vektoren exprimiert werden, die den λPL-Promotor- und -Operator (OL) enthalten, und den Hybridpromotoroperator Tac, wie in Amann, E., Brosius, J., und Ptashne, M. Gene, 25:167-178 (1983), beschrieben; diese Literaturstelle wird hier durch Verweis ausdrücklich einbezogen. Das Ausschneiden solcher Teile des Genes einschließlich der Ribosomenbindungsstelle des Strukturbereiches und 3'-nicht-translatierter Sequenzen und Insertion in alternative Vektoren, die den PL- oder Tac-Promotor enthalten, macht Gebrauch von den einmaligen Restriktionsstellen, die diese Strukturen in pUC8-F/OmpAic und pUC8-F/OmpAl flankieren. Die Insertion des EcoRI- bis SalI-Fragmentes aus einem dieser Plasmide in ein ähnlich verdautes Plasmid pDP8 bewirkt die Transkription dieser Gene unter Kontrolle des λPL-Promotors. Die Transkriptionsregulation wäre aufgrund der cI857-Mutation, die von dem gleichen Plasmid beherbergt wird, temperaturempfindlich.
Das Einfügen ähnlicher Genfragmente in die Transkriptionseinheit des lac-Promotors wird erreicht, in dem zuerst das EcoRV- bis SalI-Fragment isoliert wird. Dieses wird zusammen mit der synthetischen Tac-Promotorsequenz, die von BamHI und PvuII-Stellen flankiert wird und die den lac-Operator enthält, in die BamHI- bis SalI-Stellen von pBR322 oder bevorzugt Derivaten davon insertiert. Die Derivate bedeuten in diesem Fall Konstruktionen, die entweder das lacI-Gen oder das Iq-Gen enthalten.
Die Expression von FIBAC in von Escherichia verschiedenen Wirtsorganismen wird in Betracht gezogen. Hefen und Bakterien der Gattungen Bacillus, Pseudomonas und Clostridium können jeweils besondere Vorteile bieten. Die oben ausgeführten Verfahren können leicht an andere angepaßt werden.
Im allgemeinen werden die Expressionsvektoren für jedweden Mikroorganismus Merkmale aufweisen, die jenen analog sind, die wir in die oben erwähnten Vektoren für E. coli eingebaut haben. In einigen Fällen wird es möglich sein, die speziellen Genkonstrukte, die oben erörtert worden sind, direkt in einen mit dem neuen Wirt kompatiblen Vektor zu versetzen. In anderen Fällen kann es notwendig oder wünschenswert sein, bestimmt funktionelle oder strukturelle Elemente des Genes zu verändern.

BEISPIEL 3

Der Human-Kollagenase-Inhibitor kann nach Expression in einer Vielzahl von Mikroben leicht gereinigt werden. Das Spektrum kontaminierender Proteine wird für jeden Fall verschieden sein. Die geeigneten Reinigungsschritte werden daher unter einer Vielzahl von Schritten ausgewählt werden, die bereits dafür bekannt sind, zu einer guten Trennung des Human-Kollagenase-Inhibitors von anderen Proteinen zu führen und unter anderen Verfahren, die funktionieren könnten.
Wenn der Inhibitor von den Mikroben nicht ausgeschieden wird, kann er Einschlußkörper innerhalb der rekombinanten Mikroben bilden. Diese Körper werden von anderen Proteinen durch differentielle Zentrifugation nach Zerreißen der Zellen mit einer French Press abgetrennt. Die unlöslichen Einschlußkörper werden in 6 M Guadiniumhydrochlorid oder 8 M Harnstoff gelöst, und das Inhibitorprotein wird durch Reaktion seiner Cysteine mit Natriumsulfit vollständig solubilisiert. Zu irgendeinem Zeitpunkt im Anschluß an diesen Schritt werden die Cysteine mit Dithiothreit in ihre reduzierten Form überführt. Sobald das Inhibitorprotein aus den Einschlußkörpern solubilisiert ist, wird eine Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die gegen den ungefalteten Inhibitor gerichtet sind, für die Reinigung vor dem erneuten Falten verwendet.
Der Inhibitor kann gemäß dem in Beispiel 6, unten, erwähnten Protokoll wieder gefaltet werden. Nach dem Falten des Inhibitors oder wenn der Inhibitor von den Mikroben ausgeschieden wird, wird die Reinigung von anderen Proteinen durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht. Die anfänglichen Schritte umfassen die Ultrafiltration durch eine 50 K Dalton-Ausschlußmembran oder Ammoniumsulfatfraktionierung. Andere nützliche Verfahren umfassen Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration, Heparin-Sepharose-Chromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder zink-Chelat-Chromatographie, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Alle diese Schritte sind in Reinigungsprotokollen erfolgreich verwendet worden. Zusätzliche Schritte mit hoher Auflösung umfassen hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder Immunaffinitätschromatographie. Nach der Reinigung ist der Metalloproteinase-Inhibitor bevorzugt mindestens 90 bis 95% rein.

BEISPIEL 4

Reinigung des Human-Kollagenase-Inhibitors aus Humanamnionflüssigkeit

Humane Amnionflüssigkeit, die aus verworfenen Amniozenteseproben erhalten wurde, wurde gesammelt und 6 Liter wurden einer Ultrafiltration durch ein 100 kD Molekulargewichts-Ausschlußfilter in einem Millipore Pellicon Kassettensystem, erhalten von der Millipore Corporation, unterworfen. Das Eluat wurde durch einen 10 kD Ausschlußfilter, erhalten von Millipore Corporation, konzentriert, dann durch eine Amicon PM-10 Membran. Aliquots (10 ml) konzentrierter Amnionflüssigkeit wurden durch eine 2,5·100 cm-Säule mit Ultrogel AcA54, erhalten von der LKB Corporation, die mit pH 7,6, 0,05 M HEPES, 1 M Natriumchlorid, 0,01 M Calciumchlorid und 0,02% Natriumazid (alle Chemikalien von Sigma Chemical Company) equilibriert worden war, eluiert. Die den Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und vereint, gegen pH 7,5, 0,025 M HEPES-Puffer, enthaltend 0,01 M Calciumchlorid und 0,02% Natriumazid, dialysiert und auf eine 1,5·28 cm Heparin-Sepharose CL-6B-Säule (erhalten von Pharmacia, Inc.), die mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war, geladen. Diese Säule wurde mit 1 l des oben erwähnten Puffers gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen aus dem größten Peak der Inhibitoraktivität, die bei ungefähr 0,1 bis 0,15 M Natriumchlorid eluieren, wurden vereinigt, auf 1 ml konzentriert und auf eine Synchropak RP-8 Umkehrphasen HPLC-Säule, die mit 0,05% Trifluoressigsäure (Aldrich Chemical Company) equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40% Acetonitril (J.T. Baker Chemical Company) mit 1/2% pro Minute eluiert. Alle Fraktionen wurden unmittelbar in einem Savant Speed-vac-Konzentrationsgerät getrocknet, um das Acetonitril zu entfernen, und in pH 7,5, 0,1 M HEPES vor dem Test gelöst. Der Inhibitor eluierte zwischen 32 bis 38% Acetonitril. Die den Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden vereint und 100 ul Aliquots wurden über eine Bio-rad Biosil-TSK 250 HPLC-Gelfiltrationssäule eluiert. Die vereinigten Peaks der Inhibitoraktivität enthielten 0,1 mg Inhibitor, der über 95% rein war, wie mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beurteilt wurde.

BEISPIEL 5

Reinigung des Humanfibroblasten-Kollagenase-Inhibitors aus einem serumfreien Medium menschlicher embryonaler Hautfibroblasten

Menschliche embryonale Hautfibroblasten wurden in einem serumfreien Gewebekulturmedium wachsen gelassen. 10 l dieses Mediums wurden gesammelt, gegen pH 7,5, 0,02 M HEPES-Puffer, enthaltend 0,02% Natriumazid und 0,01 M Calciumchlorid, dialysiert, und auf eine 2,8·48 cm-Säule mit Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Inc.), die mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 2 1 dieses Puffers gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M Natriumchlorid in diesem Puffer eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf die Gegenwart des Inhibitors anhand ihrer Fähigkeit, humane Fibroblastenkollagenase zu inhibieren, getestet. Die dem Aktivitätspeak entsprechenden Fraktionen waren die nahe 0,15 M Natriumchlorid erhaltenen. Diese Fraktionen wurden mittels Ultrafiltration durch einen Amicon YM10-Filter auf ungefähr 5 ml konzentriert und das Konzentrat wurde in vier getrennten Läufen auf eine 250·4,1 mm Synchropak RP-8-Umkehrphasen HPLC-Säule, equilibriert mit 1% Trifluoressigsäure, aufgetragen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Der Gradient wurde bei 1/2% Acetonitril pro Minute gefahren. Der Inhibitor eluierte in zwei scharfen Peaks zwischen 26 und 29% Acetonitril. Alle Fraktionen wurden unmittelbar in einem Savant Speed-vac-Konzentrationsgerät getrocknet, in pH 7,5, 0,1 M HEPES gelöst und getestet. Mindestens 1,2 mg Kollagenase-Inhibitor wurden gewonnen, die 90 bis 95% rein waren. Dieses Material ergibt eine einzelne Bande, wenn es auf einem 17,5%igen reduzierenden SDS-Gel laufengelassen wird. Nach Carboxymethylierung der Cysteine und Elution durch die gleiche RP-8-Säule unter identischen Bedingungen ist der Inhibitor ausreichend homogen für die Proteinsequenzierung.

BEISPIEL 6

Es wird angenommen, daß der Human-Kollagenase-Inhibitor aus seinem denaturierten Zustand nach Expression seines Genes in einer Mikrobe und Trennung des Kollagenase-Inhibitors von den meisten anderen von der Mikrobe produzierten Proteinen leicht wieder in seine native Struktur gefaltet werden kann. Durch Analogie mit den Bedingungen, die für das Falten anderer Disulfid enthaltender Proteine erforderlich sind, wie von Freedman, R.B. und Hillson, D.A., in "Formation of Disulfide Bonds", In: The Enzymology of Post-Translational Modification of Proteins, Band 1, R.B. Freedman und H.C. Hawkins, Hrsg., Seiten 158-207 (1980) ausgeführt wird, sollte das Falten des Human-Kollagenase-Inhibitors in Lösungen mit einem pH von 8,0 oder höher erfolgen; die genannte Literaturstelle wird hier durch Verweis ausdrücklich einbezogen. Bei diesem pH sind die Cysteine des Proteines zum Teil ionisiert und diese Bedingung ist für das Erreichen der nativen Disulfidbindungspaarungen notwendig. Die Inhibitorkonzentration sollte relativ niedrig sein, weniger als 0,1 mg/ml, um die Bildung von intermolekularen Disulfid-gebundenen Aggregaten zu minimieren, die den Faltungsprozeß stören würden.
Da die Stabilität der wieder gefalteten (nativen) Disulfidgebundenen Struktur im Verhältnis zur ungefalteten (reduzierten) Struktur sowohl vom Oxidations-Reduktionspotential in Lösung als auch den Konzentrationen anderer Redox-aktiver Moleküle abhängt, wird es ins Auge gefaßt, das Redoxpotential mit einem Redoxpuffer, der ein einem Verhältnis von reduzierten:oxidierten Glutathion von 10 äquivalentes Potential ergibt, zu puffern. Der bevorzugte Konzentrationsbereich des reduzierten Glutathions wäre 0,1 bis 1,0 mM. Bei höheren Konzentrationen würden sich mit dem Protein gemischte Disulfide bilden, die die Ausbeute an wieder gefalteter (nativer) Struktur verringern. Die relativen Stabilitäten des ungefalteten Proteins und der nativen Struktur, und daher die Geschwindigkeit und Ausbeute der erneuten Faltung hängen außerdem von anderen Lösungsvariablen ab, beispielsweise dem pH, der Temperatur, dem Typ des Wasserstoffionenpuffers, der Ionenstärke und der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten Anionen oder Kationen, wie in Privalov, P.L., "Stability of Proteins, Small Globular Proteins," in Advances in Protein Chemistry, Band 33, Seiten 167-236, (1979) diskutiert; diese Literaturstelle wird hier durch Verweis ausdrücklich einbezogen. Diese Bedingungen variieren für jedes Protein und können experimentell bestimmt werden. Es wird angenommen, daß das Zusetzen jedes Moleküles, das es stark bevorzugt, an die native (im Gegensatz zur ungefalteten) Struktur zu binden, und das hinterher von dem nativen (wieder gefalteten) Protein leicht abgetrennt werden kann, nicht nur die Ausbeute, sondern auch die Geschwindigkeit der Faltung steigert. Diese Moleküle umfassen monoklonale Antikörper, die gegen die native Struktur erzeugt werden, und andere Proteine, die fest an nativen Kollagenase-Inhibitor binden, so wie die Säugetierenzyme Kollagenase oder Gelatinase.

BEISPIEL 7

Die zweite bevorzugte Sequenz, die hier ausgeführt wird, d. h., hat die folgenden Restriktionsstellen: Anzahl Stellen Fragmente Enden der Fragmente
Die folgenden treten nicht auf:
Die hervorstechenden Merkmale dieser cDNA sind:
1. Der kodierende Strang wird in 5' nach 3'-Weise dargestellt, wobei der Poly-C-Trakt am 5'-Ende ist.
2. Wenn das erste G in der Sequenz GGC CAT CGC CGC als Nukleotid 1 betrachtet wird, existiert ein offenes Leseraster von Nukleotid 1 bis Nukleotid 432, welches das 3'-Ende dieser partiellen cDNA ist.
3. Das erste Methionin in diesem Leseraster wird durch die Nukleotide 49 bis 51 kodiert und stellt die Initiationsstelle für die Translation dar.
4. Die durch die Nukleotide 49 bis 114 beschriebene Aminosäuresequenz wird in der Primärstruktur des reifen Proteins nicht gefunden, sondern ist die Sequenz des Leitpeptides des Humanproteines.
5. Die Sequenz der Nukleotide 82 bis 432 ist mit der Sequenz der mit 1 bis 351 numerierten Nukleotide in dem Insert aus der ersten bevorzugten Sequenz von Beispiel 1 identisch.
6. Die Aminosäuresequenz des reifen Proteins weist zwei Konsensussequenzen für das Anheften von Zucker auf. Diese Sequenzen, -N-Q-T-, vorgeschrieben durch die Nukleotide 202 bis 210, und -N-R-S-, vorgeschrieben durch die Nukleotide 346 bis 354, sind die Aminosäurereste 30 bis 32 bzw. 78 bis 80 im reifen Protein. Beide Stellen sind im Human-Inhibitorprotein glykosyliert.

BEISPIEL 8

Eine Reihe von Expressionsvektoren, die die Transkription und Translation des FIBAC-Genes in E. coli steuern, sind konstruiert worden.

A. Expressionsvektor pFib51

Die erste diese Konstruktionen ist ein Derivat des Plasmides pUC8, das den kodierenden Bereich des Kollagenase-Inhibitors ("FIBAC")-Genes aus menschlichen Fibroblasten auf solche Weise angeordnet enthält, daß seine Transkription unter der Kontrolle und Regulation des lac-Promotors und -Operators ablaufen kann. Dieses Konstrukt, pFib51, wurde mit geringfügigen Modifikationen des in Beispiel 2 ausgeführten Verfahrens für das Zusammensetzen des Expressionsvektors pUC8-Fic hergestellt.
Das Zurechtschneiden des 5'-Endes des kodierenden Bereiches wurde durch Isolieren des Stückes DNA bewirkt, das sich von der HaeIII-Stelle bei Nukleotid 93 bis zur 3'-EcoRI-Stelle erstreckt, die bei Nukleotid 698 beginnt. Rekonstruktion des 5'-Endes wurde wie beschrieben erreicht, mit der Ausnahme, daß die Oligonukleotide FA3 und FA4 jeweils um 12 Basen verlängert wurden, um die Rekonstruktion bis zur HaeIII-Erkennungsstelle auszudehnen. Auf diese Weise wurde die Struktur von FIBAC A' geschaffen:
Die hervorstechenden Merkmale von FIBAC A' sind wie in Beispiel 2 beschrieben geblieben.
Um das 3'-Ende des HaeIII- bis EcoRI-Fragmentes an die SalI-Stelle zu koppeln, wurde ein synthetischer Linker hergestellt. Diese Oligonukleotide wurden so entworfen, daß sie die SalI-Stelle wieder bildeten und die EcoRI-Stelle zerstört wurde. Zusätzlich wurden die Linker im Vergleich mit der ursprünglichen Beschreibung modifiziert, um eine interne KpnI-Stelle einzuschließen. Der neue Linker besteht aus den Oligonukleotiden "modifizierter Linker A1" und "modifizierter Linker A2".
Der modifizierte Linker A1 ist: AATTGGTACCAG
Der modifizierte Linker A2 ist: TCGACTGGTACC
Die Ligation in M13 mp19, das Klonieren und die Selektion wurden im wesentlichen wie in den vorstehenden Beispielen durchgeführt. Der kodierende Bereich von FIBAC wurde aus einem Klon mit der entworfenen Sequenz durch Verdau mit BamHI und HindIII entfernt und in diese Restriktionsstellen in pUC8 subkloniert. Das resultierende Plasmid ist pFib51. In diesem Plasmid wird die Transkription des FIBAC-Genes durch den lac-Promotor gesteuert. Die Translation von Methionyl- FIBAC wird an die für β-Galactosidase initiierte Translation gekoppelt.

B. Expressionsvektor pFib55

Die Schaffung einer HgiAI-Restriktionsstelle am 5'-Ende der reifen für FIBAC kodierenden Sequenz würde erlauben, daß die gesamte für FIBAC kodierende Sequenz über einen HgiAI/SalI-, KpnI- oder HindIII-Doppelverdau in das Plasmid pFib51 tragbar wäre, mit Ausnahme einer weiteren HgiAI-Stelle bei Position 552 innerhalb der kodierenden Sequenz. Diese Restriktionsstelle wurde unter Verwendung von Oligonukleotid-gesteuerter stellenspezifischer Mutagenese in vitro entfernt, im wesentlichen wie von Zoller und Smith in Methods in Enzymology, 100:468, beschrieben; diese Literaturstelle wird durch Verweis ausdrücklich einbezogen.
Aus einem Derivat des Bakteriophagen mp18 isolierte einzelsträngige DNA, die das met-FIBAC-Gen translational an lacZ gekoppelt enthielt, wie oben beschrieben, wurde an das synthetische Oligonukleotid GGGCTTTGCACCTGGCAG hybridisiert. Dieses Oligonukleotid hybridisiert mit dem für FIBAC kodierenden Bereich über die HgiAI-Stelle mit einer einzelnen Fehlpaarung. Die resultierende DNA wird dann mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase, T4-DNA-Ligase und einer Mischung aller vier Desoxynukleotidtriphosphate inkubiert.
Die kovalent geschlossene, doppelsträngige Phagen-DNA, die so erhalten worden war, wurde zur Transfektion von E. coli- Stamm JM107 verwendet. Die Plaques wurden auf die Gegenwart der Mutantensequenz durch Hybridisieren mit dem oben gezeigten mutagenen Oligonukleotid bei 58ºC in 6·SSC getestet.
Der selektierte Klon hatte anstelle des leu-Kodons CTG das leu-Kodon CTT in Aminosäureposition 173. Der kodierende Bereich aus diesem Klon wurde als ein BamHI- bis HindIII- Fragment ausgeschnitten und in ein ähnlich verdautes pUC8 ligiert. Das resultierende Plasmid, pFib55, hat alle Merkmale von pFib51 sowie einen leichter mobilisierten für FIBAC kodierenden Bereich.

C. Expressionsvektor pFib56

Alternativverfahren für die Translationskopplung an β-Galactosidase oder jedwedes E. coli-Protein können ähnlich konstruiert werden. Für eine Ausführungsform ist ein Klon entworfen worden, der unter dem Gesichtspunkt der Regulation der Expression dem Plasmid pFib51 ähnlich ist (d. h., FIBAC translational an lacZ in pUC8 gekoppelt), der jedoch einen alternativen Translationskoppler verwendet. Um Plasmid pFib56 zu schaffen, wurden die folgenden DNA-Stücke synthetisiert: EcoRI-Ende HgiAI-Ende
Dieses doppelsträngige EcoRI/HgiAI-Fragment wurde dann mit der für FIBAC kodierenden Sequenz HgiAI/HindIII und dem Plasmid pUC8 kombiniert, das mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, und ligiert. Das resultierende Plasmid ist pFib56 genannt worden. Wenn dieses Plasinid in den E. coli- Stamm JM107 transformiert wird, kann der Stamm JM107/pFib56 induziert werden, sogar mehr Methionyl-FIBAC als JM107/ pFib51 oder JM107/pFib55 zu exprimieren. Daraus ist geschlossen worden, daß der Translationskoppler in pFib56 effizienter ist als in pFib51.

D. Expressionsvektoren pFib10 und pFib11

Um das exprimierte FIBAC in den periplasmatischen Raum von E. coli zu leiten, wird an den Aminoterminus von FIBAC ein Leitpeptid angefügt. Das Leitpeptid wird den Transport des Fusionsproteins aus der inneren Zellmembran bewirken. Die zelluläre Prozessierung (Weiterverarbeitung) entfernt das Signalpeptid und ergibt die reife Form von FIBAC.
Zu diesem Zweck sind zwei Signalsequenzen getrennt mit FIBAC verschmolzen worden. Dabei handelte es sich um die Leitpeptide der E. coli ompA- und phoS-Genprodukte. Sowohl ompAL- FIBAC als auch phoSL-FIBAC-Fusionsproteine enthalten Signale, durch die sie so gesteuert werden, daß sie in den periplasmatischen Raum von E. coli geleitet werden und daß eine proteolytische Prozessierung der Fusion in ompA- oder pho- Leitfragmente und natives FIBAC stattfinden kann.
Das Plasmid pFib10 ist ein Derivat von pUC8, in das die kodierende Sequenz für das ompAL-FIBAC-Fusionsprotein insertiert worden ist. Zusätzlich sind einige 5'-nicht-translatierte Sequenzen des ompA-Genes enthalten. Die Transkription dieses Plasmides wird durch den lac-Promotor/Operator von pUC8 gesteuert. Die Translation wird an dem Methioninkodon gestartet, mit dem die ompA-Leitsequenz beginnt, und verwendet die im ompA-Gen gefundene Shine Dalgarno-Sequenz.
Das Plasmid wurde durch Ligieren der für FIBAC kodierenden Sequenz, die in einem HgiAI/HindIII-Fragment von pFib55 zusammen mit synthetischen Oligonukleotiden, die für das ompA-Leitpeptid kodieren, enthalten ist, und EcoRI/HindIII- verdautem pUC8 konstruiert. Der kodierende Strang des synthetisierten Oligonukleotides ist: ompAL EcoRI-Ende PvuI HgiAI-Ende
Die Synthese wurde in Form von vier Oligonukleotiden durchgeführt, zwei für jeden Strang. Zusammen hat die doppelsträngige DNA die folgenden Merkmale:
a) Ein cohäsives EcoRI-Ende am 5'-Ende und ein cohäsives HgiAI-Ende am 3'-Ende des kodierenden Stranges;
b) ein für das Leitpeptid des ompA-Genproduktes kodierendes offenes Leseraster, das, wenn an der HgiAI-Stelle ligiert, im Raster mit dem FIBAC-Gen ist;
c) nicht-kodierende Sequenzen 5' zum translatierten Teil, die die Ribosomenbindungsstelle enthalten, die normalerweise im ompA-Gen gefunden wird; und
d) eine interne, einzelne PvuI-Stelle.
Das Plasmid pFib11 ist ein Derivat des Plasmides pKK223-3 und mit pFib10 identisch, mit der Ausnahme, daß sein pUC8- Teil durch das 4550 bp EcoRI/HindIII-Fragment des Plasmides pKK223-3 ersetzt ist. In diesem Konstrukt wird die Transkription gesteuert und reguliert vom Hybrid tac-Promotor/ Operator. Zusätzlich enthält dieses Plasmid einen Transkriptionsterminator, der das Plasmid in einem System mit hoher Expression stabilisieren kann.

E. Expressionsvektor pFib13

Im Plasmid pFib13 ist der 5' nicht-codierende Bereich der ompAL-Sequenz eliminiert und das ompAL-FIBAC-Fusionsgen ist hinsichtlich der Translation direkt an den N-terminalen Teil des lacZ-Genes gekoppelt, wie er im Plasmid pUC8 erscheint. Dies ist durch Ligieren des EcoRI/PvuI-Fragmentes (3200 bp) aus Plasmid pFib10 mit dem hier gezeigten synthetischen Oligonukleotid erreicht worden. EcoRI-Ende PvuI-Ende

F. Expressionsvektor pFib31

Das u-Gen von E. coli codiert für das Phosphat-bindende Protein und ist von Surin, B.D. et al., in J. Bacteriol. 157:772-778 (1984), beschrieben und sequenziert worden; die Literaturstelle wird durch Verweis hier ausdrücklich einbezogen. Das Protein ist ein periplasmatisches Protein mit einer Leitsequenz von 25 Aminosäuren, die es in dieses Kompartiment leiten. Die Leitsequenz wird während des Translationsprozesses proteolytisch entfernt, um nur reifes phoS-Protein in das Periplasma zu entlassen. Wir haben die phoS- Leitsequenz als zwei doppelsträngige DNA-Fragmente mit EcoRI- und HgiAI-Enden, wie gezeigt, synthetisiert: EcoRI/ClaI EcoRI-Ende ClaI-Ende ClaI-Ende EcoRI-Ende ClaI/HgiAI
Diese Fragmente wurden an einer internen ClaI-Stelle in der phoS-Leitsequenz miteinander ligiert. Diese Fragmente wurden gleichzeitig mit dem für FIBAC kodierenden HgiAI/HindIII- Fragment kombiniert, das oben beschrieben worden ist, und Plasmid pKK223-3, das mit EcoRI und HindIII verdaut worden war. Das resultierende Plasmid ist pFib31 genannt worden.

BEISPIEL 9

Expression des FIBAC-Genes in E.coli

Zur quantitativen Bestimmung der Menge und der Form von in E. coli, die die oben beschriebenen Plasmide beherbergen, erzeugten FIBAC sind drei Methoden verwendet worden. Dabei handelt es sich:
(1) Die spezifische Reaktion der FIBAC-Antikörper gegen E. coli-Proteine, die nach der Induktion des FIBAC-Genes erzeugt werden, aufgelöst durch Polyacrylamid-SDS-Elektrophorese und anschließend an Nitrozellulosepapier gebunden (Western blotting);
(2) Markieren von E. coli-Proteinen mit ³&sup5;S-Cystein, ³&sup5;S-Methionin oder ³&sup5;SO&sub4;²&supmin; nach Induktion des FIBAC-Genes und
(3) Inspektion von Polyacrylamid SDS-Gelen, die E. coli- Proteine und FIBAC ohne Antikörperkopplung oder radioaktive Markierung enthalten.
Diese Verfahren haben nicht nur den Vergleich der von jedem Stamm erzeugten FIBAC-Mengen erlaubt, sondern auch die Reinigung des FIBAC nach Expression ohne das Erfordernis für eine funktionelle Metalloproteinase-Inhibition. Alle die in Beispiel 8 diskutierten Plasmide sind im E. coli-Stamm JM107 als Hintergrund exprimiert worden. Die Expression von FIBAC in E. coli ist bis jetzt in solchen Systemen größer, die so entworfen worden sind, daß das Protein aus der inneren Zellmembran transportiert wird. Dies beruht möglicherweise auf dem Abbau von exprimiertem Protein im Zytoplasma.
Die Prozessierung von ompaL-FIBAC-Fusionsprotein zur Erzeugung der reifen Form von FIBAC hat sich als zum Teil abhängig von der Wachstumsphase der Zellen erwiesen. In der frühen Log-Phase des Wachstums mit IPTG induzierte Zellen akkumulieren eine Mischung prozessierten und nicht-prozessierten FIBAC's, während in der späten Log-Phase induzierte Zellkulturen nur prozessiertes FIBAC akkumulieren. Die Stämme, die das phosL- FIBAC-Fusionsprotein exprimieren, scheinen das Protein vollständig unabhängig von der Wachstumsphase zu prozessieren.
Alle die oben in Beispiel 8 beschriebenen Expressionsvektoren haben eine Ampicillinresistenz als selektierbaren Marker. Für den Zweck der Erzeugung mag es bevorzugt sein, einen Tetracyclinresistenz-Marker zu haben. Ein allgemein als Expressionsvektor nützliches Plasmid ist mit einem Tetracyclinresistenz- Marker konstruiert worden. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pKK223-3, in dem das verstümmelte Tetracyclinresistenz-Gen durch ein voll funktionelles tetr-Gen, das aus pBR322 adaptiert ist, ersetzt worden ist.

BEISPIEL 10

Reinigung von in E. coli exprimiertem FIBAC

Der rekombinante Human-Kollagenase-Inhibitor (FIBAC) ist aus einem mit dem Plasmid pFib11 transformiertem E. coli-Stamm JM107 gereinigt worden. In diesem Stamm, JM107/pFib11, kann FIBAC so hergestellt werden, daß es als ein unlösliches Aggregat akkumuliert. In diesem Beispiel werden die Bedingungen für das Zellwachstum, die Induktion der FIBAC-Gen-Expression, die Zellernte und die Reinigung von FIBAC aus der unlöslichen Fraktion eines Gesamtzell-Lysates beschrieben. Das gleiche Protokoll kann außerdem verwendet werden, um FIBAC aus der löslichen Fraktion von Gesamtzell-Lysaten anzureichern.

A. Unlösliche Fraktion

Ein Luria-Nährmedium, enthaltend Ampicillin in einer Konzentration von 100 ug/ml, wurde mit einer Übernacht-Kultur von JM107/pFib11 bis zu einer Anfangs-OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,15 bis 0,20 beimpft. Die Schüttelflaschen-Zellkultur wurde bei 37ºC bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,5 wachsengelassen; zu diesem Zeitpunkt wurde das Kulturmedium mit IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM supplementiert. Die Inkubation bei 37ºC wurde dann für 2,5 bis 3 Std. fortgesetzt. Die Zellkultur wurde in einem Eisbad rasch auf 4ºC abgekühlt und die Zellen mittels Zentrifugation geerntet. Eine 1-Liter-Kultur, die wie oben gezüchtet worden war, führte zu einem Durchschnitt von 3 g Zellen (Naßgewicht). Die Zellen wurden einmal mit kaltem Lysepuffer (50 mM MES, pH 6,0, 4 mM EDTA) gewaschen und dann im Lysepuffer zu einer Endkonzentration von 0,26 g Zellen (Naßgewicht)/ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde bei -70ºC bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren.
Ein Gesamtzell-Lysat wurde hergestellt, indem die Zellsuspension zweimal durch eine French Press-Zelle gegeben wurde (SLM-Aminco Modell # FA-079, ausgerüstet mit einem Kolben #FA-073 und bei 20000 psti betrieben; SLM Instruments, Inc., Urbana, Illinois). Das resultierende Zell-Lysat wurde mit 10 ug DNase I/g Zellen (Naßgewicht) 2 bis 3 Stunden auf Eis inkubiert. Das Zell-Lysat wurde dann in kleine Aliquots aufgeteilt und bis zur weiteren Verarbeitung bei -70ºC gelagert.
Ein Zell-Lysatüberstand und eine Zell-Lysatniederschlagsfraktionen wurden durch 30 min Zentrifugation einer 5 ml-Portion des Zell-Lysats bei 4ºC in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge erhalten. Das resultierende Pellet wurden zweimal mit 3 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 4 mM EDTA, 50 mM DTT gewaschen. Die Überstände dieser Waschungen wurden gesammelt und für die weitere Analyse aufgehoben. Das gewaschene Pellet wurde dann durch Resuspendieren in 3 ml 50 mM MES, pH 6,0, 4 mM EDTA, 50 mM DTT, 10 M Harnstoff solubilisiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Sollte infolge der Harnstoffsolubilisierung eine Proteincarbamylierung auftreten, könnte die Nebenreaktion durch Zufügen von einem hundertfachen Überschuß eines geeigneten Nukleophiles über die Gesamtproteinaminogruppen verhindert werden. Die resultierende Lösung wurde durch 15 min Zentrifugation bei 4ºC in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge geklärt. Der Überstand enthielt im wesentlichen alles Protein aus dem Solubilisierungsverfahren und wurde für die weitere Analyse aufgehoben. Das zurückbleibende kleine Pellet bestand zum größten Teil aus Zellwalldebris und wenigen Proteinen (von diesen war keines FIBAC). Es wurde verworfen.
Die Identifizierung von FIBAC in den verschiedenen, wie oben hergestellten Fraktionen, wurde durch SDS-PAGE und Umsetzen der Western Blots mit Anti-FIBAC-Antikörpern erreicht. Die SDS-Gel-Analyse von Gesamtzell-Lysatprotein, das aus IPTG-induziertem JM107/pFib11 erhalten war, zeigte die Gegenwart einer Proteinbande von ungefähr 20000 Dalton apparentem Molekulargewicht, die in dem Gelmuster eines Zell-Lysates von nicht induziertem JM107/pFib11 nicht vorhanden ist. Das 20000 Da-Protein und eine schneller wandernde Bande, vermutlich ein Abbauprodukt von FIBAC, reagiert mit Anti-FIBAC-Antikörpern in der Western Blot Analyse. Die von einer Induktion mit IPTG abhängige Anwesenheit des Proteins, das Molekulargewicht und die Reaktivität mit Anti-FIBAC-Antikörpern legen nahe, daß das Protein das exprimierte rekombinante FIBAC darstellt. Die Analyse der Überstandsfraktion des Zell-Lysates, erhalten aus IPTG-induziertem JM107/pFib11, und dem Zell-Lysat-Pellet zeigte wenig FIBAC. Die größte Menge von FIBAC wurde jedoch in dem Harnstoff-DTT-solubilisierten Zell-Lysat-Pelletfraktionen gefunden. Dies wurde so interpretiert, daß nach IPTG-Induktion FIBAC als unlösliche Fraktion akkumuliert und in im wesentlichen reiner Form aus dem gewaschenen Zell-Lysat-Pellet isoliert werden kann.
Das Harnstoff-DTT-solubilisierte Zell-Lysat-Pellet wurde als Ausgangsmaterial für die CM-Chromatographie verwendet. Ein 1,2 ml Aliquot solubilisierten Zell-Lysat-Pellets (16 mg Protein) wurde mit 25 ml kaltem CM-Puffer (50 mM MES, pH 6,0, 6 M Harnstoff, 14 mM 2-ME) verdünnt. Die Probe wurde dann auf eine Carboxymethylcellulosesäule (25·130 mm), die zuvor mit CM-Puffer bei 4ºC equilibriert worden war, aufgetragen. Nach Auftragen der Proben wurden die Säulen mit CM-Puffer gewaschen, bis der A&sub2;&sub8;&sub0;-Wert zur Grundlinie zurückkehrte. Adsorbiertes Protein wurde mit einem linearen Natriumchloridgradienten (0 bis 200 mM) CM-Puffer eluiert. Das Gesamtgradientenvolumen betrug 400 ml, die Flußrate betrug 26 ml/h und es wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt. Die Durchflußfraktionen (engl.: "flow-through") (CM-FT) und die Peak-Fraktionen 58 bis 61 wurden gesammelt und durch SDS-PAGE analysiert. Die elektrophoretische und immunologische Analyse dieser Fraktion zeigte, daß das rekombinante FIBAC, einschließlich von etwas abgebautem FIBAC, bei ungefähr 120 mM NaCl ohne irgendein anderes detektierbares Protein eluierte. Unter den angewendeten chromatographischen Bedingungen adsorbierte das meiste nicht-FIBAC-Protein nicht an die CM-Säule und wurde in der Durchflußfraktion gefunden.
Die Menge CM-gereinigten FIBACs, die mit diesem Verfahren erhalten wurde, wurde auf 1,3% des Zellproteins geschätzt. Für die Quantifizierung während der gesamten Isolierung und Reinigungsverfahren wurden Bradford Protein Tests verwendet.
2 ml (100 ug) gereinigtes FIBAC in 50 mM MES, 6 M Harnstoff, 14 mM 2-Mercaptoethanol wurden mittels Centricon-Zentrifugation auf 200 ul konzentriert und durch Zufügen von 2 M Tris- HCl, pH 8,5, auf eine Tris-Endkonzentration von 0,5 M auf pH 8,5 eingestellt. Die Cysteinreste von FIBAC wurden dann unter Verwendung von ³H-Jodessigsäure carboxymethyliert. Die Alkylierungsreaktionsmischung wurde durch Umkehrphasen-HPLC entsalzt. Das modifizierte FIBAC eluierte bei 30% Acetonitril und wurde für die weitere Analyse gesammelt. Ein Aliquot des modifizierten FIBAC's, das von der HPLC isoliert worden war, wurde einer SDS-PAGE-Analyse unterworfen. Der Vergleich des- CM-gereinigten FIBAC's, das für die Carboxymethylierung verwendet worden war (Ausgangsmaterial), und des FIBAC's nach Alkylierung und HPLC-Entsalzung zeigte, daß das modifizierte FIBAC etwas langsamer im SDS-Gel wanderte als das nicht-modifizierte FIBAC. Dies ist keine ungewöhnliche Beobachtung, insbesondere angesichts der erheblichen Anzahl modifizierter Cysteine, die in FIBAC vorhanden sind.
Das carboxymethylierte FIBAC wurde dann auf ein Gasphasen- Protein Sequenziergerät (Modell 470A) von Applied Biosystems (Foster City, CA) für den automatischen Edman-Abbau aufgetragen und die Aminosäuresequenz für die ersten 24 Reste wurde identifiziert. Die Sequenzierungsdaten für die ersten sechs Zyklen des Edman Abbaus sind in der Tabelle unten gezeigt. Die Daten zeigen eindeutig, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten FIBAC's (C-T-V-P-P...) mit der des zuvor bestimmten nativen FIBAC's identisch ist. Daraus wird geschlossen, daß pFib11 das rekombinante FIBAC sauber durch Spalten des ompA-FIBAC Fusionsproteins an seiner Ala-Cys-Bindung unter Erzeugung der reifen Form des FIBAC-Proteins prozessiert.

Sequenzanalyse der N-terminalen Aminosäure von gereinigtem rekombinanten FIBAC

(Cysteinreste wurden mit ³H-Jodessigsäure vor der Sequenzierung des Proteins markiert) Zyklus ³H-CPM PTH-AS Identifizierung

B. Lösliche Fraktion

Wegen der zusätzlichen Kontaminanten im Ausgangsmaterial führt das hier erörterte Verfahren nicht sofort zu einer homogenen FIBAC-Präparation. Das Verfahren stellt jedoch eine ausreichende Reinigung zur Verfügung, um ein Falten des FIBAC's zu seiner nativen Konformation zu erlauben. Anschließende Reinigungsschritte können dann zur Vervollständigung des Isolierungsverfahrens verwendet werden.
Das Zellwachstum, die Induktion, die Ernte und die Herstellung eines Gesamtzell-Lysates in diesem Beispiel waren die gleichen wie im vorhergehenden Beispiel. Um die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu zeigen, FIBAC aus jeder Fraktion des Zell-Lysates zu reinigen, wurde die ursprüngliche Fraktionierung des Homogenates durch Zentrifugation ausgelassen. Anstelle dessen wurde das gesamte Zell-Lysat auf 10 M Harnstoff, 4 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM MES, pH 6,0 eingestellt und 15 Minuten bei 22ºC inkubiert. Die Lösung wurde dann 15 Minuten bei 4ºC in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen und der Überstand mit CM-Puffer (50 mM MES, pH 6,0, 6 M Harnstoff, 14 mM 2-Mercaptoethanol) verdünnt und auf Carboxymethylzellulose wie im vorherigen Beispiel chromatograpisch fraktioniert. FIBAC eluierte bei ungefähr 120 mM Salz zusammen mit etwas abgebautem FIBAC und verschiedenen immunologisch nicht verwandten Kontaminanten. Eine Abschätzung der Reinheit von FIBAC durch SDS-PAGE Analyse zeigte, daß es mehr als 50% des Gesamtproteins in dieser Fraktion darstellte. Bei diesem Reinheitsgrad ist es möglich, unter Verwendung des Faltverfahrens, unten, FIBAC wieder in seine native Konformation zu falten. Das gefaltete FIBAC ist als Metalloprotease-Inhibitor voll funktionell und kann durch Anionenaustauscherchromatographie weiter gereinigt werden.
Die Anionenaustauscherchromatographie wurde auf einer 10·100 mm Whatman DE-52-Säule (Whatman Inc., Clifton, New Jersey) durchgeführt, die in 600 mM Harnstoff, 50 mM Tris, pH 9,6, equilibriert worden war. Die das unreine, wieder gefaltete FIBAC enthaltende Lösung wurde durch tropfenweises Zufügen von 5 N NaOH auf einen pH 9,6 titriert und auf DEAE-Cellulose aufgetragen. Die Analyse der Durchflußfraktion zeigte, daß FIBAC nicht zurückgehalten wurde. Die immunologisch nichtverwandten Kontaminanten banden an die Matrix und wurden dadurch aus der Lösung entfernt. Die Durchflußfraktionen können auf einer CM-Cellulosesäule, wie unten gezeigt, konzentriert werden.
Die Durchflußfraktion aus der Anionenaustauschersäule wurde durch Zufügen von 5 N HCl auf pH 7,5 titriert. Diese Lösung wurde auf eine CM-Cellulosesäule (25·130 mm), die zuvor mit 600 mM Harnstoff und 50 mM Tris, pH 7,5, equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis die Elution von Protein spektrophotometrisch nicht mehr beobachtet werden konnte. FIBAC wurde dann mit dem o.g. Puffer, der 250 mM an NaCl gemacht worden war, eluiert. Der Protein-Peak wurde gesammelt und gegen 50 mM Tris, pH 7,5, ins Gleichgewicht dialysiert.
Die elektrophoretischen, immunologischen und funktionellen Tests des resultierenden FIBAC's zeigen einen aktiven, wieder gefalteten Kollagenase-Inhibitor von mehr als 90%-iger Reinheit. Die einzige, nachweisbare Kontaminante ist ein FIBAC-Abbauprodukt, wie in der Reinigung aus dem Zell-Lysat-Pellet. Wegen der identischen Amino-terminalen Sequenz dieser Kontaminanten und ihrer apparenten Molekularmasse ist geschlossen worden, daß nahe am Carboxy-Terminus eine proteolytische Spaltung aufgetreten ist. Dieses Material kann in weiteren Reinigungsschritten (z. B. höher auflösender Ionenaustauscher- Chromatographie oder Affinitätschromatographie des wieder gefalteten FIBAC's) entfernt werden.

BEISPIEL 11

Konstruktion eines Hefe-FIBAC-Expressions-Klones

Ein weiterer Organismus, in dem Genexpressions- und Proteinexportvektoren konstruiert worden sind, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Der Hefe-α-Faktor ist ein "Mating"-Hormon (Paarungshormon), das intrazellulär erzeugt, und in das Wachstumsmedium exportiert wird. Eine einzelne Peptidsequenz steuert diesen Transport. Die für FIBAC kodierende Sequenz ist in einen Hefeexpressionsvektor kloniert worden, um eine Fusion der Hefe-α-Faktor-Leitsequenz mit FIBAC zu erzeugen. Ein Konstrukt wurde zuerst als Derivat von pGS385 gemacht. Das Plasmid pGS385 hat die folgenden Merkmale:
(a) Es enthält Teile des Hefe-α-Faktorgenes einschließlich des Promotors, des Leitpeptides, des Polyadenylierungssignals und der Transkriptionsterminationssignale;
(b) der Teil des α-Faktorgenes zwischen den beiden entferntesten HindIII-Stellen ist deletiert, wodurch eine einzelne HindIII-Stelle geschaffen wird;
(c) es enthält eine einzelne SalI-Stelle 3' von der HindIII-Stelle; und
(d) es enthält Replikationsstartstelle und das Ampicillinresistenzgen aus pBR322, um Replikation und Selektion in E. coli zu erlauben.
Das Plasmid pGS385 wurde mit HindIII und SalI verdaut. Die HindIII-Stelle definiert den Carboxy-Terminus der α-Faktor- Leitsequenz. Das synthetische Oktanukleotid 5'-AGCTTGCA-3' wurde verwendet, um eine Brücke zwischen dem α-Faktor-C-Terminus zum N-Terminus von FIBAC zu bilden. Die Transkriptions- Translations-Sequenzen des α-Faktors treiben die Genexpression in diesen Vektor. Die gesamte α-Faktor-FIBAC-Fusion wurde dann durch Verdau mit EcoRI entfernt und in das Plasmid YiP5, ein Derivat des Plasmids pBR322, das das Hefe ura3-Gen enthält, insertiert. Dieses Plasmid ist für die Verwendung als Expressionsvektor nach Verdau an einer einzelnen StuI-Stelle im ura3 und Transformation in S. cerevisiae, um die Integration des gesamten Plasmides in den chromosomalen ura3-Locus zu steuern, geeignet. Solche Integranten eines α-FIBAC-Fusions-Derivates von YiP5 sind erhalten worden, und haben immunreaktives Material erzeugt und sezerniert, wie durch Verfahren zur Überprüfung der Kolonien bestimmt wurde.

BEISPIEL 12

Expression von rekombinantem FIBAC in Animalzellen

Zwei Expressionssysteme für die Produktion von FIBAC in Animalzellen werden vorgeschlagen. Das erste enthält den späten SV40-Promotor zur Steuerung der Transkription in COS-1-Zellen. Dieses Expressionssystem ist in erster Linie für die Untersuchung der Expression, der Proteinsynthese, der post-translationalen Modifikation und des Transportes von FIBAC in COS-1- Zellen nützlich. Obwohl das System schnell und bequem ist, ist es auf die COS-1-Affenzellinie beschränkt. Das SV40-Expressionsplasmid wird ein Derivat von pJC119 sein, dessen Konstruktion im Detail von Sprague, J., Condra, J.H., Arnheiter, H. und Lazzarini, R.A., in J. Virol., 45:773-781 (1983) beschrieben wird; diese Literaturstelle wird durch Verweis hier einbezogen. Der vollständige für FIBAC kodierende Bereich, einschließlich der natürlich auftretenden Signalsequenz, ist aus Partial-cDNA-Klonen zusammengesetzt worden. Die mit dem Initiatormethionin zusammenfallende NcoI-Stelle für das Leitpeptid wird über ein kurzes synthetisches Oligonukleotid mit der einzelnen XhoI-Stelle in pJC119 verbunden. Der gesamte für FIBAC kodierende Bereich und die 3'-nicht-translatierten Sequenzen werden in diese Stelle insertiert, wo die Transkription durch den späten SV40-Promotor gesteuert wird. Das Plasmid würde daher die SV40-Replikations-Startstelle, die pBR322-Replikations-Startstelle und den selektierbaren Marker Ampicillinresistenz enthalten.
Das zweite System wäre für die Erzeugung von FIBAC in Animalzellen bevorzugt, weil es zur stabilen und kontinuierlichen Expression von FIBAC in einer Humanzellinie führt. Dieser Vektor wird ein Derivat von pBPV52-1 sein, beschrieben von Florkiewicz, R.Z., Smith, A., Bergmann, J.E., und Rose, J.K. in Cell Biol, 97:1381-1388 (1983); diese Literaturstelle wird durch Verweis hier ausdrücklich einbezogen. Dieses Plasmid enthält die Replikations-Startstelle des Rinder-Papilloma- Virus, die pBR322-Replikations-Startstelle, das β-Lactamasegen und das 69% transformierende Fragment aus BPV-DNA. Die SV40- Replikations-Startstelle und der frühe SV40-Promotor werden in dieses Plasmid kloniert werden. pBR322-Sequenzen, die die Replikation des Vektors in Humanzellen stören, werden entfernt werden. Wie beim vorhergehenden Plasmid wird der gesamte kodierende Bereich der FIBAC-cDNA insertiert werden, um seine Transkription unter Kontrolle des frühen SV40-Promotors zu bringen.
Es wird erwartet, daß die Reinigung von FIBAC aus dem Medium nach Expression und Sekretion aus diesen Zellen im wesentlichen wie zuvor in den Beispielen 4 und 5 beschrieben möglich sein wird.

BEISPIEL 13

Falten von FIBAC

Zum Verfolgen des Faltens von FIBAC sind zwei Tests verwendet worden. Beide Tests messen das Auftreten der funktionellen Kapazität von FIBAC in seiner nativen Struktur. Der erste Test ist ein Inhibitionstest, der den inhibierenden Effekt der Probe auf die Fähigkeit von Humanfibroblasten-Kollagenase zum Abbau von ¹&sup4;C-markiertem Kollagen mißt. Der zweite Test ist ein modifizierter ELISA, der die Bindung des wieder gefalteten FIBAC an Humankollagenase mißt.
Der Kollagenase-Bindungs-ELISA ist der primäre Test, durch den FIBAC-Aktivität nachgewiesen worden ist. Dafür werden Immulon II-Platten mit 96 Vertiefungen über Nacht bei 4ºC mit Kollagenase beschichtet (1,0 ug/ml in 50 mM Tris, pH 8,2, 5 mM CaCl&sub2;; 100 ul pro Vertiefung). Nach 45 minütigem Blockieren der Vertiefungen mit 150 ul/Vertiefung 3% BSA in Waschpuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM CaCl&sub2;, 0,02% Tween-20), werden variierende Verdünnungen von FIBAC Standards oder unbekannte Proben in Blockpuffer verdünnt in die Vertiefungen pipettiert (100 ul/Vertiefung). Nach einer Inkubationsperiode von 45 min (37ºC) werden die Vertiefungen dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Affinitäts-gereinigte Kaninchen- und anti-FIBAC- Antikörper werden den Vertiefungen zugefügt (verdünnt 1/100, 100 ul/Vertiefung) und 45 min bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen werden dann wiederum gewaschen und es wird mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Sigma, verdünnt 1:1000 in Waschpuffer) zu den Vertiefungen zugesetzt (100 ul/Vertiefung). Nach einer 1 Std. -Inkubationsperiode bei 37ºC werden die Vertiefungen ein letztes Mal gewaschen und Substrat für alkalische Phosphatase (Sigma #104-105, 1 mg/ml in 10% Diethanolamin, 100 mM MgCl&sub2;, pH 9,8) zu den Vertiefungen zugefügt. Die Farbentwicklung wird bei 495 nm unter Verwendung eines Titertek Multiskan MC ELISA Lesegerätes (Flow Laboratories) verfolgt. Das native FIBAC dient als Standardkurve, gegen die unbekannte Proben quantifiziert werden können.
Im Kollagenase-Inhibitionstest werden mit ¹&sup4;C-markierte Kollagenpellets aus Meerschweinchenhaut (25 ul/Pellet = 2100 cpm) mit 50 ul Trypsin-aktivierter Kollagenase (ungefähr 75 ug/ml in 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) verdaut, was zur Freisetzung von ¹&sup4;C in die Lösung führt. Nach 1 bis 3 Std. Inkubieren der Pellets (abhängig von der Geschwindigkeit des Verdaus) wird die Reaktion durch Zufügen von 100 ul Tris-Puffer und 10 min Zentrifugieren bei 10000 rpm beendet. Der Überstand wird dann in Szintillationgefäße pipettiert, die 3 ml einer Szintillationsflüssigkeit enthalten, und gezählt. Eine Vorinkubation der Kollagenase mit 50 ul variierender Verdünnungen des Standards oder gereinigten FIBAC's vor dem Zufügen der Lösung zu dem Kollagenpellet sollte den Verdau des Kollagens und die anschließende Freisetzung von ¹&sup4;C in die Lösung inhibieren. Die Quantifizierung der inhibierenden Aktivität einer unbekannten Probe hängt von der Menge der in dem Test verwendeten aktiven Kollagenase ab. Daraus kann die Aktivität der unbekannten Probe unter Annahme eines molaren Verhältnisses von 1:1 zwischen Inhibitor und Enzym berechnet werden.
Unter Verwendung dieser Tests ist die Effizienz des Faltungsprozesses unter Berücksichtigung der Proteinkonzentration, der Konzentration oxidierten Gluthathions, des pH's und der Temperatur untersucht worden. Obwohl nicht alle Kombinationen dieser Parameter im einzelnen untersucht worden sind, ist ein Verfahren entwickelt worden, das eine effiziente Renaturierung erlaubt.
Die Faltung von FIBAC hängt stark von der Konzentration von FIBAC ab, bei der die Faltung durchgeführt wird. Unter oxidierenden Bedingungen verhindern verdünnte Lösungen die Bildung von Disulfiden zwischen den Ketten, die möglicherweise zur Präzipitation von Aggregaten führen.
Gereinigtes rekombinantes FIBAC kann gefaltet werden und bleibt bei 100% Gewinnung des Proteins löslich, wenn dem unten beschriebenen Protokoll gefolgt wird:
1) Verdünntes, gereinigtes FIBAC (weniger als 300 ug/ml) in 6 M Harnstoff, 50 MES, pH 6,0, 14 mM 2-Mercaptoethanol wird in Gegenwart von 70 mM oxidiertem Gluthathion inkubiert.
2) Nach einer Inkubationsperiode von 10 min bei Raumtemperatur wird die Probe 10-fach mit 50 mM Tris, pH 9,0 verdünnt.
3) Die Probe wird dann über Nacht bei 4ºC inkubiert.
Die SDS-PAGE-Analyse des reaktivierten Materials weist auf die Gegenwart von sowohl intakten als auch abgebauten FIBAC hin. Das abgebaute FIBAC wird aus dem Reinigungsverfahren mitgeschleppt und scheint während des Reaktivierungsverfahrens nicht weiter abgebaut zu werden.
Von diesem solubilisierten FIBAC konnte gezeigt werdend daß es sowohl Kollagenase-Bindungsaktivität (ELISA) als auch Kollagenase-inhibierende Aktivität hat. Die Menge der Aktivität im Verhältnis zur Menge des Proteins scheint größer als 90% zu sein, wie durch Kollagenase-Inhibitionstests festgestellt wurde. Dies Zahl wurde aus Berechnungen auf der Grundlage der geschätzten Menge von Kollagenase im Test abgeleitet.
Obwohl es sich dabei um eine Schätzung handelt, wird nicht angenommen, daß sie um mehr als 50% abweicht. Die Bindungsaktivität, gemessen gegen den FIBAC-Standard, hat uns befähigt, die relative Reaktivierung der verschiedenen Proben zu verfolgen.
Vom Faltungsprozeß konnte außerdem gezeigt werden, daß er mit 50% reinen FIBAC-Konzentrationen abläuft. Die Natur und die Menge des kontaminierenden Proteins, das toleriert werden kann, ist immer noch ungewiß, es ist jedoch etwas aktives FIBAC in Gesamtzell-Lysaten ohne Reinigung nachgewiesen worden, was zeigt, daß zumindest einige Ausbeute bei weniger als 5% Reinheit erhältlich ist.
Dem Fachmann wird offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Variationen an den erfindungsgemäßen Verfahren und Produkten vorgenommen werden können. Es ist daher beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen der Erfindung einschließt, vorausgesetzt, daß sie innerhalb des Schutzbereiches der angefügten Ansprüche und deren Äquivalenzbereich liegen.

Claims

1. Tragbare DNA-Sequenz, die zur Steuerung der intrazellulären Erzeugung von Metalloproteinase-Inhibitoren, die die folgende Sequenz umfassen, fähig ist:

2. Rekombinanter DNA-Klonierungsvektor, der zur Expression in einem bakteriellen System fähig ist, umfassend eine Nukleotidsequenz, die zum Steuern der intrazellulären Erzeugung von Metalloproteinase-Inhibitoren mit einem Cysteinrest am N-Terminus fähig ist, wobei der Vektor eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mindestens einen Teil der folgenden, für einen aktiven Metallproteinase-Inhibitor kodierenden Nukleotide enthält:

3. Vektor pUC9-F5/237P10, hinterlegt unter ATCC 53003.

4. Verfahren zur bakteriellen Erzeugung eines Metalloproteinase-Inhibitors mit einem Cysteinrest am N-Terminus mittels rekombinanter DNA, umfassend:

(a) das Herstellen einer tragbaren DNA-Sequenz, die fähig ist, ein Wirtsbakterium zu steuern, so daß es eine Proteinsequenz mit dem Potential für eine Metalloproteinase-Inhibitoraktivität erzeugt;

(b) das Klonieren der tragbaren DNA-Sequenz in einem Vektor, der in ein Wirtsbakterium übertragen werden und darin replizieren kann, wobei der Vektor Steuerungselemente für die tragbare DNA-Sequenz enthält;

(c) das Übertragen des die tragbare DNA-Sequenz und die Steuerungselemente enthaltenden Vektors in ein Wirtsbakterium, das zum Exprimieren des Metalloproteinase-Inhibitorproteins fähig ist;

(d) das Kultivieren des Wirtsbakteriums unter Bedingungen, die für die Amplifikation des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind; und

(e) in beliebiger Reihenfolge:

(i) das Ernten des Inhibitors; und

(ii) das den Inhibitor Veranlassen, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wodurch er Metallproteinase-Inhibitoraktivität besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Metalloproteinase-Inhibitor ein Collagenase-Inhibitor ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die tragbare DNA-Sequenz einen Teil der folgenden Sequenz enthält:

7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Vektor gemäß Anspruch 4 verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Wirtsbakterium ein Mitglied der Gattung Bacillus ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bakterium Bacillus subtilis ist.

10. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Bakterium Escherichia coli ist.

11. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Bakterium ein Mitglied der Gattung Pseudomonas ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Bakterium ein Pseudomonas aeruainosa ist.

13. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor geerntet wird, bevor er dazu veranlaßt wird, die aktive Tertiärstruktur anzunehmen.

14. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor veranlaßt wird, die aktive, tertiäre Struktur anzunehmen, bevor er geerntet wird.

15. Metalloproteinase-Inhibitor, der biologisch dem gemäß dem Verfahren nach Anspruch 4 aus humanen Hautfibroblasten erzeugten Collagenase-Inhibitor äquivalent ist.

16. Mikroorganismus C600/pUC9-F5/237P10 mit der ATCC- Hinterlegungs Nr. 53003.

17. Tragbare DNA-Sequenz, die zur Steuerung der intrazellulären Produktion von Metalloproteinase-Inhibitoren fähig ist, umfassend die folgende Nukleotidsequenz:

18. Verfahren zum Herstellen eines Metalloproteinase- Inhibitors aus Tierzellen mit einem Cysteinrest am N-Terminus mittels rekombinanter DNA, umfassend:

(a) das Herstellen einer tragbaren DNA-Sequenz, die fähig ist, eine Wirtstierzelle zu steuern, so daß sie ein Protein mit Metalloproteinase-Inhibitoraktivität erzeugt;

(b) das Klonieren der tragbaren DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine Wirtstierzelle übertragen werden und darin replizieren kann, wobei der Vektor Steuerungselemente für die tragbare DNA-Sequenz enthält;

(c) das Amplifizieren des die tragbare DNA-Sequenz und die Steuerungselemente enthaltenden Vektors in einem bakteriellen Wirt;

(d) das Übertragen des amplifizierten rekombinanten Vektors in eine Wirtstierzelle, die zur Expression des Metalloproteinase-Inhibitorproteins fähig ist;

(e) das Kultivieren der Wirtstierzelle unter zur Expression des Inhibitors geeigneten Bedingungen; und

(f) in beliebiger Reihenfolge:

(i) das Ernten des Inhibitors; und

(ii) das den Inhibitor Veranlassen, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wodurch er Metalloproteinase-Inhibitoraktivität besitzt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Vektor einen Teil der folgenden, für einen aktiven Metalloproteinase- Inhibitor kodierenden Sequenz enthält: